CN109734793B - 一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明通过分析筛选目的片段、优化编码序列和载体，转染Expi 293真核细胞，稳定表达具有抗原活性的蛋白，提供了一种既能保留天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的制备方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

锌转运蛋白8(Zinc transporter 8，ZnT8)，是SLC30家族(ZnTs蛋白)中的一个成员，SLC30家族是负责将细胞内的锌离子转运到细胞外基质或胞内囊泡中。ZnT8特异表达于胰腺组织，且主要位于胰岛β细胞，ZnT8过表达可以通过增加胰岛素分泌通道上的密度进一步使β细胞对葡萄糖刺激所接到的胰岛素分泌增加，从而调节胰岛素的合成，储存和分泌过程。ZnT8自身抗体可能是一种重要的Ⅰ型糖尿病标记物，成为目前诊断试剂的重要补充，ZnT8在TIDM检测中的特异性高达98％，并且在糖尿病检测阴性样本中仍有37.5％阳性率，从而有效避免漏诊发生。

ZnT8蛋白以二聚体形式定位于β细胞胰岛素分泌/储存性囊泡膜上调节胞浆和囊泡减的锌转运。ZnT8蛋白单体由369个氨基酸组成，其编码基因SLC30A8全长1100bp，蛋白相对分子量40kD，含有6个跨膜α螺旋(I-VI)，其中第IV和第V结构域之间的环富含组氨酸。蛋白C和N端均位于胞浆中，C端由两个α螺旋(aa284-292、aa327-341)，三个β折叠(aa299-308、aa313-321、aa345-352)组成，其中前两个β折叠构成发卡结构。2004年学者首次从人胰岛细胞中克隆获得了SLC30A8基因，并在HeLa细胞中表达了ZnT8蛋白，但由于ZnT8分子结构复杂，难以在原核系统大量表达，现在利用网织红细胞体外无细胞表达体系制备抗原蛋白的主要方法，但是该方法制备的ZnT8蛋白含量少，成本高昂，制约临床上大规模开展应用。CN102250242A公开了一种特异性表达于胰腺胰岛β细胞的ZnT-8蛋白，涉及编码上述的与胰岛素成熟及外排相关的蛋白质的多核苷酸，并涉及它们的应用，例如在分选及研究β细胞和筛选治疗糖尿病和高胰岛素血症的药物上的应用。但上述现有技术的蛋白表达总量较低，制备过程复杂。

目前用于体外合成蛋白质的系统主要有原核表达系统，酵母表达系统，哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统。原核表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核表达系统具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。酵母蛋白表达系统具有表达量高、可诱导、糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点，但蛋白产物易降解，表达量不可控。哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，生产成本高。

用于捕获自身抗体的抗原蛋白活性直接取决于该抗原蛋白的构象，当ZnT8抗原蛋白的活性与人体内天然ZnT8蛋白构象一致时才能捕获低浓度的ZnT8自身抗体。天然ZnT8蛋白为动物源跨膜蛋白，其分子结构中含有一段富含组氨酸区域，即锌离子的结合位点，包含了6个跨膜区和一个在Ⅳ和Ⅴ区域间的组氨酸环，其中50％的分子嵌埋于磷脂双分子层中，分子结构复杂，难以异源表达。

因此，寻找和摸索制备既有天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的蛋白表达方法是目前需要解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用，本发明通过分析筛选目的片段、优化编码序列和载体，转染Expi293真核细胞，稳定表达具有抗原活性的蛋白，提供了一种既有天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的制备方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种ZnT8重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1如下：

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAHQRCLGHNHKEVQANASVRAAFVHALGDLFQSISVLISALIIYFKPEYKIADPICTFIFSILVLASTITILKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDGGSHHHHHHDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.

优选地，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2如下：

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGAACCTGACCCAGCCGCAGCCCACCAGCGGTGCCTGGGCCACAATCACAAAGAGGTGCAGGCCAACGCTTCTGTGCGGGCTGCTTTTGTTCACGCCCTGGGCGATCTGTTCCAGTCCATCTCCGTGCTGATCTCTGCCCTGATCATCTACTTCAAGCCCGAGTACAAGATCGCTGACCCCATCTGCACCTTCATCTTCTCCATCCTGGTGCTGGCCTCTACCATCACAATCCTGAAGGACTTCAGCATCCTGCTGATGGAAGGCGTGCCCAAGAGCCTGAACTACTCCGGCGTGAAAGAACTGATCCTGGCCGTGGATGGCGTGCTGTCTGTGCACTCTCTGCACATCTGGTCCCTGACCATGAATCAAGTGATCCTGAGCGCCCACGTGGCCACCGCTGCTTCTAGAGATTCTCAGGTCGTGCGGAGAGAGATCGCCAAGGCTCTGTCCAAGAGCTTCACCATGCACAGCCTGACCATCCAGATGGAAAGCCCCGTGGATCAGGACCCCGACTGTCTGTTTTGCGAGGACCCTTGCGACGGCGGCTCTCACCACCACCATCACCACGACTACAAGGACCACGACGGCGATTACAAGGATCATGACATCGACTATAAGGACGATGACGACAAGTGA.

本发明中，发明人在长期的科研实践过程中，为研发一种既有天然蛋白的生物活性又能显著降低生产成本的蛋白及制备方法，深入研究目的蛋白的理化特性和蛋白表达的技术方法，广泛分析筛选有效的手段和途径，通过分析筛选目的片段、优化编码序列和载体、选择转染特定的Expi 293真核细胞，各步骤各条件协同增效，相互配合，最终实现了稳定表达具有抗原活性的蛋白，提供了一种既有天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的制备方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

由于ZnT8蛋白为动物源跨膜蛋白，包含了6个跨膜区和一个在Ⅳ和Ⅴ区域间的组氨酸环，其中50％的分子嵌埋于磷脂双分子层中，分子结构复杂，所以很难大量表达并且表达之后难以外排到培养基中，不利于该蛋白质的纯化和应用，因此需要改进该蛋白质表达系统。首先，蛋白质无法外排溶解在培养基中，发明人在目的蛋白的编码序列前端串联上一段信号肽编码序列，有助于目的蛋白表达后能穿过细胞膜外排到细胞液中，方便纯化收集；其次，由于蛋白的表达产量低，可以通过优化表达载体来实现，发明人在CMV启动子下游和多克隆位点下游各添加一个CAG增强子原件以增强目的蛋白的转录水平。

第二方面，本发明提供一种重组质粒，包括表达载体和目的基因，所述目的基因包括第一方面所述蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述重组质粒的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

原pcDNA3.1(+)质粒为5428bp，插入两个增强子序列后为6004bp

SEQ ID NO.3如下：

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGA CGTC.

优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4如下：

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCCGGCCACCATGATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGAACCTGACCCAGCCGCAGCCCACCAGCGGTGCCTGGGCCACAATCACAAAGAGGTGCAGGCCAACGCTTCTGTGCGGGCTGCTTTTGTTCACGCCCTGGGCGATCTGTTCCAGTCCATCTCCGTGCTGATCTCTGCCCTGATCATCTACTTCAAGCCCGAGTACAAGATCGCTGACCCCATCTGCACCTTCATCTTCTCCATCCTGGTGCTGGCCTCTACCATCACAATCCTGAAGGACTTCAGCATCCTGCTGATGGAAGGCGTGCCCAAGAGCCTGAACTACTCCGGCGTGAAAGAACTGATCCTGGCCGTGGATGGCGTGCTGTCTGTGCACTCTCTGCACATCTGGTCCCTGACCATGAATCAAGTGATCCTGAGCGCCCACGTGGCCACCGCTGCTTCTAGAGATTCTCAGGTCGTGCGGAGAGAGATCGCCAAGGCTCTGTCCAAGAGCTTCACCATGCACAGCCTGACCATCCAGATGGAAAGCCCCGTGGATCAGGACCCCGACTGTCTGTTTTGCGAGGACCCTTGCGACGGCGGCTCTCACCACCACCATCACCACGACTACAAGGACCACGACGGCGATTACAAGGATCATGACATCGACTATAAGGACGATGACGACAAGTGACCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC.

第三方面，本发明提供一种重组菌株，所述菌株包括第二方面所述的重组质粒。

第四方面，本发明提供一种Expi 293细胞表达系统，所述表达系统包括第二方面所述的重组质粒。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组蛋白用于制备免疫印迹试剂盒和/或药物的应用。

第六方面，本发明提供一种制备如第一方面所述ZnT8重组蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)从ZnT8全长基因编码序列中分析筛选初始目的基因序列；

(2)在步骤(1)的目的基因N端融合信号肽序列和C端融合标签序列，得到优化后的目的基因；

(3)在表达载体pcDNA 3.1(+)的CMV启动子下游的多克隆位点两端各添加一个CAG增强子序列，得到优化后的表达载体；

(4)合成步骤(2)优化后的目的基因序列和步骤(3)优化后的表达载体序列，构建重组质粒，转化至原核细胞保存；

(5)将步骤(4)的重组质粒转染Expi 293真核表达系统进行表达，得到所述ZnT8重组蛋白。

优选地，步骤(1)所述初始目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

SEQ ID NO.5如下：

初始目的基因的核苷酸序列：

CACCAGCGGTGCCTGGGCCACAATCACAAAGAGGTGCAGGCCAACGCTTCTGTGCGGGCTGCTTTTGTTCACGCCCTGGGCGATCTGTTCCAGTCCATCTCCGTGCTGATCTCTGCCCTGATCATCTACTTCAAGCCCGAGTACAAGATCGCTGACCCCATCTGCACCTTCATCTTCTCCATCCTGGTGCTGGCCTCTACCATCACAATCCTGAAGGACTTCAGCATCCTGCTGATGGAAGGCGTGCCCAAGAGCCTGAACTACTCCGGCGTGAAAGAACTGATCCTGGCCGTGGATGGCGTGCTGTCTGTGCACTCTCTGCACATCTGGTCCCTGACCATGAATCAAGTGATCCTGAGCGCCCACGTGGCCACCGCTGCTTCTAGAGATTCTCAGGTCGTGCGGAGAGAGATCGCCAAGGCTCTGTCCAAGAGCTTCACCATGCACAGCCTGACCATCCAGATGGAAAGCCCCGTGGATCAGGACCCCGACTGTCTGTTTTGCGAGGACCCTTGCGAC.

优选地，步骤(2)所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

SEQ ID NO.6如下：

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGAACCTGACCCAGCCGCAGCC.

优选地，步骤(2)所述标签包括6×his tag标签、GST标签、c-Myc标签或荧光蛋白标签中的任意一种或至少两种的组合，优选为6×his tag标签。

常用的蛋白标签包括：6×his tag标签，GST标签，c-Myc标签和荧光蛋白标签等，6×his tag标签倍广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究等相关技术领域。

优选地，步骤(2)所述优化的目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，步骤(3)所述增强子序列的插入位置为：在CMV启动子下游、T7启动子上游3bp处和多克隆位点下游BGH poly(A)位点之后各添加一个CAG增强子。

增强子插入的位点：在CMV启动子下游，T7启动子上游3bp处和多克隆位点下游BGHpoly(A)位点之后各添加一个CAG增强子以增强目的蛋白的转录水平。

优选地，步骤(3)所述优化后的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，步骤(4)所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，步骤(4)所述原核细胞包括DH5α、BL21、TOP10或Rosetta中的任意一种，优选为E.coli DH5α菌株。

常用的原核宿主菌有DH5α，BL21，TOP10，Rosetta等，而本研究中的原核菌种主要用于重组质粒的保存和克隆，通常选用DH5α。

作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述ZnT8重组蛋白的方法，具体包括如下步骤：

(1)从ZnT8全长基因编码序列中分析筛选如SEQ ID NO.5所示的初始目的基因序列；

(2)在步骤(1)的目的基因N端融合如SEQ ID NO.6所示的信号肽序列和C端融合标签序列，得到如SEQ ID NO.2所示的优化后的目的基因；

(3)在表达载体pcDNA 3.1(+)的CMV启动子下游的多克隆位点两端各添加一个CAG增强子序列，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的优化后的表达载体；

(4)合成步骤(2)优化后的目的基因序列和步骤(3)优化后的表达载体序列，构建核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的重组质粒，转化至原核细胞E.coli DH5α菌株；

(5)将步骤(4)的重组质粒转染Expi 293真核表达系统进行表达，得到所述ZnT8重组蛋白。

技术方案如下：

1)软件分析ZnT8全长基因编码序列，选取出免疫原性好的基因片段；

2)优化编码序列，融合标记序列，信号肽序列；

3)优化载体，添加增强子重复序列；

4)基因工程技术合成目的基因，构建重组表达质粒；

5)提取质粒，转染进Expi 293真核细胞中进行表达；

6)检测目的蛋白产物的表达情况；

7)亲和纯化出目的蛋白；

8)检测抗原性。

ZnT8蛋白是锌离子转运蛋白家族中的一员，主要负责将细胞内的锌离子转运到细胞外基质，ZnT8特异表达于胰腺组织，是胰岛β细胞的膜结构蛋白，其分子结构中含有一段富含组氨酸区域，即锌离子的结合位点，包含了6个跨膜区和一个在Ⅳ和Ⅴ区域间的组氨酸环，其中50％的分子嵌埋于磷脂双分子层中，分子结构复杂，表达量低且很难进行异源表达，并且ZnT8蛋白不属于外泌蛋白，ZnT8蛋白基因中并不含有信号肽序列，因此所表达的蛋白分子很难通过细胞膜外排到细胞培养基质中，这无疑增加细胞的负担，不利于细胞的蛋白表达。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过对原有的表达载体pcDNA3.1(+)进行优化，在CMV启动子下游的多克隆位点两端各添加一个CAG增强子序列，提高转录水平，使后续的蛋白表达量增加；

(2)本发明将免疫球蛋白基因的信号肽序列融合到目的基因的N端，促进了所表达的目蛋白的细胞外排效率，减少细胞负担并有利于后续目的蛋白的收集和纯化；

(3)本发明采用的Expi 293真核表达系统能在高细胞浓度条件下进行表达，Expi293真核表达系统进行，操作方法简便，表达周期短，并能保证所表达的目的蛋白具有天然抗原蛋白的天然构象和抗原性。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2为本发明的ZnT8重组质粒酶切琼脂糖凝胶电泳结果图；

图3(A)-图3(B)为本发明的表达重组ZnT8蛋白的SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色图，图3(A)为培养基细胞上清液，图3(B)为细胞；

图3(C)-图3(D)为本发明的表达重组ZnT8蛋白的SDS-PAGE电泳Western Blot检测图，其中图3(C)为培养基细胞上清液，图3(D)为细胞；

图4为本发明的纯化后重组ZnT8蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图5为本发明的糖尿病患者血清免疫印迹膜条检测图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例

1)筛选目的基因序列

对GenBank公布的ZnT8全长基因编码序列进行分析，通过生物信息学分析软件对ZnT8蛋白的二级结构，亲水性，柔韧性，表面可及性及抗原性做综合分析预测，从预测结果中筛选出具有强免疫原性的编码序列，C端aa 197-369，见SEQ ID NO.5；

2)优化编码序列

通过软件SignalP4.0预测分析，ZnT8基因序列不含有信号肽编码序列，为保证所表达的蛋白能够跨膜表达到细胞外，在选取的编码序列N端融合一段长度为72bp的胰岛素信号肽编码序列(见SEQ ID NO.6)，在C端融合6×his tag标签序列，然后在目的基因序列两端添加保护碱基和EcoR I和Xho I酶切位点序列；

3)优化载体

本发名所用表达载体为pcDNA 3.1(+)，载体本身含有CMV启动子和上游的增强子，为更大程度提高核酸的转录水平，在CMV启动子下游的多克隆位点两端各多添加一个CAG增强子序列。

增强子能大大增强启动子的活性，增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动，它能在两个方向产生相互作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。pcDNA3.1(+)质粒本身含有一个CMV增强子，位于CMV启动子上游，为增加转录水平，因此在T7启动子上游和多克隆位点下游BGH poly(A)位点之后各添加一个CAG增强子序列。

4)构建重组质粒

将优化过的目的基因和载体送往生物公司，合成目的基因和载体序列，分别用内切酶EcoR I和Xho I双酶切载体pcDNA3.1(+)后和同样ZnT8目的基因片段，生成相同的粘性末端，将载体和目的基因连接构建重组质粒，将重组质粒送往华大基因进行测序，将测序结果比对正确的ZnT8重组质粒转化进染进E.coli DH5α菌株中进行保存；

将合成的重组质粒分别进行酶切，见图2，结果可见大小为723bp目的基因片段，经测序证实结果正确，表明重组表达质粒构建成功。

5)ZnT8重组蛋白的制备与鉴定

采用去内毒素质粒抽提试剂盒提取重组质粒，转染进Expi 293真核表达系统中进行表达，表达72h后的细胞进行离心，将细胞上清培养基和细胞分离开，分别进行电泳，SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色和Western Blot检测抗原蛋白的表达情况，见图3(A)-图3(D)；

SDS-PAGE电泳结果显示，优化过的质粒表达的ZnT8蛋白大量富集在细胞培养基上清液中，目的蛋白分子量约为25kD(图3(A))，未优化过的质粒只在细胞内有表达蛋白且表达量非常少(图3(B))。

采用anti-his antibody(HRP标记)对目的蛋白进行检测，结果显示，表达到细胞培养基上清中的蛋白几乎检测不到杂蛋白条带，未优化组在细胞培养基上清中能检测的蛋白含量非常少，优化组能检测到明显的蛋白条带，与未优化组相比差异较大(图3(C))，细胞的检测图(图3(D))也显示优化组和未优化组胞内都有蛋白表达，但是表达量都很少，并且细胞中存在大量的杂蛋白条带，这对于后续蛋白纯化会产生很大干扰。

6)纯化ZnT8蛋白

由于ZnT8的重组DNA在C端融合表达了一个6×His-tag的氨基酸序列，采用常规的Ni离子亲和层析柱进行纯化，收集细胞上清液，用孔径为0.45μm的针头过滤器过滤之后进行Ni离子亲和纯化，收集洗脱下的目的蛋白并用PBS溶液进行过夜透析，SDS-PAGE电泳的银染结果见图4，显示重组CRP蛋白的纯度较高。

7)采用免疫印迹法鉴定抗原活性

7.1)将纯化好的重组抗原蛋白进行SDS-PAGE电泳，将PAGE胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，用10％脱脂奶粉4℃过夜封闭，在湿润条件下将膜切成宽度约为0.5cm的膜条；

7.2)胎牛血清为阴性对照，随机挑选15个糖尿病患者血清为实验组，将血清分别用样品稀释液稀释100倍后加入到对应的膜条孵育槽中室温孵育30min，用洗涤液洗膜1min，重复洗3次；

7.3)用样品稀释液稀释抗人IgG后加入到对应的膜条孵育槽中室温孵育30min，用洗涤液洗膜1min，重复洗3次；

7.4)加入显色溶液室温孵育15min，用去离子水冲洗并终止反应，将膜条取出晾干，观察膜条上是否出现特异性条带；

通过免疫印迹膜条对随机选取的15个糖尿病患者血清进行检测(图5)，胎牛血清为阴性，15个随机血清中有9个呈现阴性反应，2个弱阳反应，4个强阳反应，抗原性鉴定结果证明表达的重组抗原蛋白具有抗原活性。

综上所述，本发明提供的重组蛋白及其制备方法，蛋白具有抗原活性且表达稳定，制备方法简洁高效，具有推广应用的价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）

<120> 一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用

<130> 2019年

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn

20 25 30

His Lys Glu Val Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His

35 40 45

Ala Leu Gly Asp Leu Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu

50 55 60

Ile Ile Tyr Phe Lys Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr

65 70 75 80

Phe Ile Phe Ser Ile Leu Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys

85 90 95

Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr

100 105 110

Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val

115 120 125

His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser

130 135 140

Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg

145 150 155 160

Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr

165 170 175

Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys

180 185 190

Glu Asp Pro Cys Asp Gly Gly Ser His His His His His His Asp Tyr

195 200 205

Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp

210 215 220

Asp Asp Asp Lys

225

<210> 2

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg ggaacctgac 60

ccagccgcag cccaccagcg gtgcctgggc cacaatcaca aagaggtgca ggccaacgct 120

tctgtgcggg ctgcttttgt tcacgccctg ggcgatctgt tccagtccat ctccgtgctg 180

atctctgccc tgatcatcta cttcaagccc gagtacaaga tcgctgaccc catctgcacc 240

ttcatcttct ccatcctggt gctggcctct accatcacaa tcctgaagga cttcagcatc 300

ctgctgatgg aaggcgtgcc caagagcctg aactactccg gcgtgaaaga actgatcctg 360

gccgtggatg gcgtgctgtc tgtgcactct ctgcacatct ggtccctgac catgaatcaa 420

gtgatcctga gcgcccacgt ggccaccgct gcttctagag attctcaggt cgtgcggaga 480

gagatcgcca aggctctgtc caagagcttc accatgcaca gcctgaccat ccagatggaa 540

agccccgtgg atcaggaccc cgactgtctg ttttgcgagg acccttgcga cggcggctct 600

caccaccacc atcaccacga ctacaaggac cacgacggcg attacaagga tcatgacatc 660

gactataagg acgatgacga caagtga 687

<210> 3

<211> 6004

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 900

gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 960

ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 1020

gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 1080

cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 1140

gtcatcaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa 1200

gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag atatccagca 1260

cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg 1320

ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 1380

ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 1440

aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 1500

gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatga cataacttac ggtaaatggc 1560

ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 1620

atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 1680

gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 1740

gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 1800

tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct 1860

agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 1920

cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 1980

tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 2040

gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 2100

tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 2160

ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 2220

tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 2280

taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt 2340

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 2400

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 2460

agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 2520

ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 2580

cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 2640

gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcaagag acaggatgag 2700

gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg 2760

agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt 2820

tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc 2880

tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt 2940

gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag 3000

tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg 3060

ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag 3120

cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg 3180

atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc 3240

gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca 3300

tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc 3360

gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg 3420

ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct 3480

atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc 3540

gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg 3600

cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct 3660

ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 3720

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 3780

caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc 3840

gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 3900

catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 3960

attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 4020

ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 4080

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 4140

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 4200

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 4260

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 4320

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 4380

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 4440

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 4500

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 4560

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 4620

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 4680

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 4740

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtt tttttgtttg 4800

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 4860

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 4920

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 4980

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 5040

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 5100

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 5160

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 5220

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 5280

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 5340

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 5400

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 5460

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 5520

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 5580

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 5640

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 5700

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 5760

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 5820

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 5880

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 5940

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 6000

cgtc 6004

<210> 4

<211> 6679

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 900

gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 960

ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 1020

gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 1080

cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 1140

gtcatcaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa 1200

gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattcccggc caccatgatg 1260

gccctgtgga tgcgcctcct gcccctgctg gcgctgctgg ccctctggga acctgaccca 1320

gccgcagccc accagcggtg cctgggccac aatcacaaag aggtgcaggc caacgcttct 1380

gtgcgggctg cttttgttca cgccctgggc gatctgttcc agtccatctc cgtgctgatc 1440

tctgccctga tcatctactt caagcccgag tacaagatcg ctgaccccat ctgcaccttc 1500

atcttctcca tcctggtgct ggcctctacc atcacaatcc tgaaggactt cagcatcctg 1560

ctgatggaag gcgtgcccaa gagcctgaac tactccggcg tgaaagaact gatcctggcc 1620

gtggatggcg tgctgtctgt gcactctctg cacatctggt ccctgaccat gaatcaagtg 1680

atcctgagcg cccacgtggc caccgctgct tctagagatt ctcaggtcgt gcggagagag 1740

atcgccaagg ctctgtccaa gagcttcacc atgcacagcc tgaccatcca gatggaaagc 1800

cccgtggatc aggaccccga ctgtctgttt tgcgaggacc cttgcgacgg cggctctcac 1860

caccaccatc accacgacta caaggaccac gacggcgatt acaaggatca tgacatcgac 1920

tataaggacg atgacgacaa gtgaccgctc gagtctagag ggcccgttta aacccgctga 1980

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 2040

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 2100

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 2160

ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgacataa 2220

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 2280

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 2340

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 2400

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 2460

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgcttctga ggcggaaaga 2520

accagctggg gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg 2580

ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct 2640

ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat 2700

cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt 2760

gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 2820

acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac 2880

cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta 2940

aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt 3000

tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca 3060

attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 3120

gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 3180

taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 3240

cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 3300

gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat atccattttc ggatctgatc 3360

aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc 3420

cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct 3480

ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg 3540

acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca 3600

cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc 3660

tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga 3720

aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc 3780

cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc 3840

ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg 3900

ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct 3960

gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc 4020

tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc 4080

ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc 4140

agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga 4200

aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt 4260

ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg 4320

cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag cttataatgg 4380

ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 4440

tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc 4500

tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 4560

cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 4620

agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 4680

gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 4740

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 4800

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 4860

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 4920

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 4980

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 5040

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5100

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5160

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5220

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5280

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5340

gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5400

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 5460

cggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 5520

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 5580

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 5640

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 5700

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 5760

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 5820

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 5880

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 5940

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 6000

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 6060

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 6120

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 6180

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 6240

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 6300

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 6360

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 6420

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 6480

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 6540

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 6600

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 6660

aaaagtgcca cctgacgtc 6679

<210> 5

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caccagcggt gcctgggcca caatcacaaa gaggtgcagg ccaacgcttc tgtgcgggct 60

gcttttgttc acgccctggg cgatctgttc cagtccatct ccgtgctgat ctctgccctg 120

atcatctact tcaagcccga gtacaagatc gctgacccca tctgcacctt catcttctcc 180

atcctggtgc tggcctctac catcacaatc ctgaaggact tcagcatcct gctgatggaa 240

ggcgtgccca agagcctgaa ctactccggc gtgaaagaac tgatcctggc cgtggatggc 300

gtgctgtctg tgcactctct gcacatctgg tccctgacca tgaatcaagt gatcctgagc 360

gcccacgtgg ccaccgctgc ttctagagat tctcaggtcg tgcggagaga gatcgccaag 420

gctctgtcca agagcttcac catgcacagc ctgaccatcc agatggaaag ccccgtggat 480

caggaccccg actgtctgtt ttgcgaggac ccttgcgac 519

<210> 6

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg ggaacctgac 60

ccagccgcag cc 72

Claims (4)

1.一种制备ZnT8重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从ZnT8全长基因编码序列中分析筛选初始目的基因序列；

（2）在步骤（1）的目的基因N端融合信号肽序列和C端融合标签序列，得到优化后的目的基因；

（3）在表达载体pcDNA 3.1(+)的CMV启动子下游的多克隆位点两端各添加一个CAG增强子序列，得到优化后的表达载体；

（4）合成步骤（2）优化后的目的基因序列和步骤（3）优化后的表达载体序列，并分别用内切酶EcoR I和Xho I双酶切，生成相同的粘性末端，将载体和目的基因连接构建重组质粒，转化至原核细胞保存；

（5）将步骤（4）的重组质粒转染Expi 293真核表达系统进行表达，得到所述ZnT8重组蛋白；

步骤（1）所述初始目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

步骤（2）所述优化后的目的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤（2）所述标签为6×his tag标签；

步骤（3）所述优化后的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述原核细胞包括DH5α、BL21、TOP10或Rosetta中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述原核细胞为E.coli DH5α菌株。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）从ZnT8全长基因编码序列中分析筛选如SEQ ID NO.5所示的初始目的基因序列；

（2）在步骤（1）的目的基因N端融合信号肽序列和C端融合标签序列，得到优化后的目的基因，所述优化后的目的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（3）在表达载体pcDNA 3.1(+)的CMV启动子下游的多克隆位点两端各添加一个CAG增强子序列，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的优化后的表达载体；

（4）合成步骤（2）优化后的目的基因序列和步骤（3）优化后的表达载体序列，并分别用内切酶EcoR I和Xho I双酶切，生成相同的粘性末端，将载体和目的基因连接构建重组质粒，转化至原核细胞E.coli DH5α菌株；

（5）将步骤（4）的重组质粒转染Expi 293真核表达系统进行表达，得到所述ZnT8重组蛋白。

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