CN109688805A - 产生灰叶斑病抗性玉蜀黍的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了在鉴定和选择具有增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物中有用的组合物和方法。所述方法使用位于4号染色体上QTL区域内的分子遗传标记来鉴定和选择具有增加的灰叶斑病抗性的植物，并且可以将包含与增加的灰叶斑病抗性相关联的QTL等位基因的植物与其他玉蜀黍植物杂交从而将增加的抗性掺入到其他玉蜀黍品系或品种中。

Description

产生灰叶斑病抗性玉蜀黍的方法

技术领域

本公开涉及在玉蜀黍植物中增强对灰叶斑病的抗性中有用的组合物和方法。

相关申请的交叉引用

本申请是2016年7月11日提交的美国临时申请号62/360,585的继续申请，将其内容通过引用以其全文并入本文。

对通过EFS-Web以文本文件

提交的序列表的引用

按照美国信息交换标准码(ASCII)，该序列表的官方副本经由EFS-Web作为文本文件与本说明书同时提交，其中文件名为BB2457WOPCT_SequenceListing_ST25.txt，创建日期为2017年5月22日，并且大小为14.1Kb。经由EFS-Web提交的该序列表是说明书的一部分并通过引用以其全文并入本文。

背景技术

玉蜀黍是人类和动物最重要的食物来源之一。许多环境压力因素影响玉蜀黍植物，影响玉蜀黍生产和可用性。例如，玉蜀黍作物通常受到由真菌性病原体玉米灰斑病菌(Cercospora zeae-maydis)或玉米尾孢菌(Cercospora zeina)(本文中被称为尾孢菌属物种(Cercospora spp.))引起的灰叶斑病(GLS)的严重影响。

GLS是一个全球性问题，普遍存在于非洲；北美洲、中美洲和南美洲；和亚洲。尾孢菌属物种在田间残渣中过冬，并且需要水分(通常以大雾、露水或雨水的形式)来扩散其孢子并感染玉蜀黍。玉蜀黍中尾孢菌属物种感染引起植物资源的更多地分配给受损的叶组织进行保护，导致根和茎腐烂的风险增加；以及更少地分配给籽粒灌浆，最终导致更高的作物损失。症状通常包括叶材料上发生的细长的、灰色病变，宽度为约1mm-3mm并且长度范围为从5mm至70mm。在严重感染的病例中，还发现病变发生在茎上。此外，尾孢菌属物种感染降低了谷物产量和青贮饲料质量。GLS可能导致产量损失高达68％。因此，降低玉蜀黍对GLS的敏感性具有可以理解的重要性。

一些常用的GLS控制方法是杀真菌剂、轮作、耕作和田间卫生。这些方法的一些缺点是它们相对昂贵、无效或对环境有害。然而，控制GLS的最有效和最优选的方法是种植抗性杂交种。

使用表型选择将GLS性状从抗性品种渗入易感品种可能是耗时且困难的。GLS对环境条件敏感并需要高湿度和长时间的叶片润湿。这种敏感性使得每年仅基于表型难以可靠地选择对GLS的抗性(Lehmensiek等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]103：797-803(2001))。专门的疾病筛查场所的运营成本可能很高，并且植物必须长到成熟才能对抗性水平进行分类。

通过使用与GLS抗性相关联的分子标记进行的选择具有允许至少一些仅基于后代的遗传组成进行选择的优点。因此，GLS抗性可以在植物生命周期的早期(甚至早在种子阶段)测量。通过使用与GLS抗性性状相关联的分子标记可以获得增加的选择率，这意味着GLS抗性的植物育种可以按更快的速率发生，并且可以更快地开发商业上可接受的GLS抗性植物。

存在对商业上可接受的杂交系和近交系的需要，该杂交系和近交系对与玉米尾孢菌相关联的GLS显示出相对高水平的抗性。因此，引人关注的是用于鉴定对GLS具有抗性的玉蜀黍植物的方法，使用上述方法可以克服前述缺点或至少使前述缺点最小化。还引人关注的是用于筛选显示对GLS的不同抗性水平的玉蜀黍植物的分子遗传标记。

发明内容

本文提供了组合物以及用于鉴定和/或选择(即，获得)具有增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法。

在一个实施例中，本文提出了鉴定和/或选择具有增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)筛选具有标记的群体，该标记位于4号染色体的包含并侧接PHM6764-7和PHM289-1的区间内，来确定来自该群体的一个或多个玉蜀黍植物是否包含与增加的灰叶斑病抗性相关联的QTL等位基因，其中该QTL等位基因包含在PHM1963-15处的“C”，以及以下项中的一种或多种：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”；和(b)从所述群体中选择包含所述QTL等位基因的至少一个玉蜀黍植物。该标记可以位于4号染色体的包含并侧接PHM521-8和PHM18451-2的区间内。该方法可以进一步包括：(c)将该玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；和(d)获得具有有利的QTL等位基因的后代植物。该方法可以包括如果该QTL等位基因被检测出则从育种程序中选择玉蜀黍植物，或如果该QTL等位基因未被检测出则反向选择玉蜀黍植物。在一方面，与增加的灰叶斑病抗性相关联的QTL等位基因包含：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”。

在另一个实施例中，本文提出了鉴定和/或选择具有增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法。该方法包括以下步骤：(a)在玉蜀黍植物中检测标记基因座的等位基因，其中所述标记基因座位于4号染色体上的包含并侧接PHM6764-7和PHM289-1的染色体区间内，并且所述等位基因与包含以下的单倍型相关联：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”；和(b)选择具有与单倍型相关联的标记基因座的等位基因的玉蜀黍植物，该单倍型包含：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”。该标记基因座可以被进一步精确到4号染色体上的包含并侧接PHM521-8和PHM18451-2的染色体区间。该方法可以进一步包括：(c)将该玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；和(d)获得具有与单倍型相关联的等位基因的后代植物，该单倍型包含：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”。

在另一个实施例中，本文提出了鉴定和/或选择具有增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法。该方法包括以下步骤：(a)在玉蜀黍植物中检测QTL等位基因，该QTL等位基因包含在PHM1963-15处的“C”以及以下项中的一种或多种：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”；其中所述QTL等位基因位于4号染色体上由PHM6764-7和PHM289-1限定并包括PHM6764-7和PHM289-1的区间中；和(b)选择具有QTL等位基因的玉蜀黍植物。该QTL等位基因可以位于4号染色体上由PHM521-8和PHM18451-2限定并包括PHM521-8和PHM18451-2的区间中。该方法可以进一步包括：(c)将该玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；和(d)获得具有QTL等位基因的后代植物。该QTL等位基因可以进一步包含在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”。

在另一个实施例中，本文提出了鉴定和/或选择具有增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法。该方法包括以下步骤：(a)在玉蜀黍植物中检测在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”；和(b)选择玉蜀黍植物，其具有在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”，其中所述玉蜀黍植物具有增加的灰叶斑病抗性。该方法可以进一步包括：(c)将该玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；和(d)获得后代植物，其具有在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”。

还提供了使用本文所述方法鉴定和/或选择的植物。

序列表简述

从形成本申请的一部分的以下详细说明和序列表中可以更全面地理解本披露。

这些序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.8211.825所列出的管理专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开内容的规定。如遵循描述于以下文献中的IUPAC IUBMB标准所定义的，序列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的三字母代码：NucleicAcids Res.[核酸研究]13：30213030(1985)和Biochemical J.[生物化学杂志]219(2)：345373(1984)，以上文献通过引用并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中列出的规定。

SEQ ID NO：1是针对标记PHM6764-7的参考序列。

SEQ ID NO：2是针对标记PHM16360-9的参考序列。

SEQ ID NO：3是针对标记PHM521-8的参考序列。

SEQ ID NO：4是针对标记PHM586-10的参考序列。

SEQ ID NO：5是针对标记PHM289-20的参考序列。

SEQ ID NO：6是针对标记PHM12024-9的参考序列。

SEQ ID NO：7是针对标记PHM199-23的参考序列。

SEQ ID NO：8是针对标记PHM1963-15的参考序列。

SEQ ID NO：9是针对标记PHM18451-2的参考序列。

SEQ ID NO：10是针对标记PZE-104068674的参考序列。

SEQ ID NO：11是针对标记SYN25809的参考序列。

SEQ ID NO：12是针对标记PZE-104069351的参考序列。

SEQ ID NO：13是针对标记PZE-104069548的参考序列。

SEQ ID NO：14是针对标记PZE-104069570的参考序列。

SEQ ID NO：15是针对标记PZE-104069652的参考序列。

SEQ ID NO：16是针对标记SYN21168的参考序列。

SEQ ID NO：17是针对标记SYN4720的参考序列。

SEQ ID NO：18是针对标记SYN4714的参考序列。

SEQ ID NO：19是针对标记PZE-104070450的参考序列。

SEQ ID NO：20是针对标记PHMGLS_01的参考序列。

SEQ ID NO：21是针对标记PHMGLS_07的参考序列。

SEQ ID NO：22是针对标记PHMGLS_14的参考序列。

SEQ ID NO：23是针对标记PHMGLS_19的参考序列。

SEQ ID NO：24是针对标记PHMGLS_21的参考序列。

SEQ ID NO：25是针对标记PHMGLS_45的参考序列。

SEQ ID NO：26是针对标记PHMC001YAR的参考序列。

SEQ ID NO：27是针对标记PHM5013-12的参考序列。

SEQ ID NO：28是针对标记PHM15534-13的参考序列。

具体实施方式

本文提供了显示与灰叶斑病抗性性状统计学上显著的共分离的玉蜀黍标记座位。这些座位或附加的连锁座位的检测可以作为玉蜀黍育种程序的一部分用于标记辅助选择中，以产生对灰叶斑病具有抗性的玉蜀黍植物。

提供以下定义以帮助理解本披露。

应当理解，本披露不限于特定实施例，这些实施例当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。当在本说明书和所附权利要求中使用时，单数和单数形式的术语例如“一个/一种(a/an)”以及“该(the)”包括复数指代物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如术语“植物(plant)、所述植物(theplant)、或一个植物(a plant)”也包括多个植物；也取决于上下文，使用的术语“植物”也可包括该植物遗传相似或相同的后代；使用的术语“核酸”实际上任选地包括该核酸分子的多个拷贝；同样地，术语“探针”任选地(并且通常)涵盖许多相似或相同的探针分子。

除非另外指明，否则核酸从左向右以5′至3′方向书写。说明书中所述的数值范围包括限定范围的数字并且包括在限定范围内的每个整数或任何非整数的分数。除非另有定义，否则在此使用的所有技术和科学术语都具有本披露所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。虽然与在此所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于测试当前披露中所述的主题，但在此描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护当前披露的主题时，将根据以下陈述的定义使用以下术语。

术语“等位基因”是指在特定座位处出现的两个或更多个不同核苷酸序列中的一个。

“等位基因频率”是指等位基因在个体内、品系内或品系的群体内的座位处存在的频率(比例或百分比)。例如，对于等位基因“A”，基因型“AA”、“Aa”或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5或0.0的等位基因频率。可以通过对来自一个品系的个体样本的等位基因频率取平均值来估计该品系内的等位基因频率。类似地，可以通过对组成群体的品系的等位基因频率取平均值来计算该群体内的等位基因频率。对于具有有限数目的个体或品系的群体，等位基因频率可以表示为包含所述等位基因的个体或品系(或任何其他指定的分组)的计数。

“扩增子”是扩增的核酸，例如通过任何可用的扩增方法(如，PCR、LCR、转录等)扩增模板核酸所产生的核酸。

在核酸扩增的上下文中的术语“扩增”是任何借以产生所选择的核酸(或其转录形式)的附加拷贝的方法。典型的扩增方法包括各种基于聚合酶的复制方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶介导的方法(如连接酶链式反应(LCR))和基于RNA聚合酶的扩增(如，通过转录)方法。

术语“组装”适用于BAC及其聚集在一起形成DNA的连续延伸的倾向。如果对BAC进行测序，或通过将其BAC指纹与其他BAC的指纹比对，那么该BAC“组装”至基于序列比对的叠连群。可以使用互联网上公开可利用的玉蜀黍基因组浏览器(Maize Genome Browser)找到公共组装。

当等位基因是影响性状表达的DNA序列或等位基因的一部分或与其连锁时，该等位基因与该性状“相关”。所述等位基因的存在是所述性状将如何表达的指标。

“BAC”或细菌人工染色体是衍生自大肠杆菌天然存在的F因子的克隆载体，其本身是可以作为环状质粒存在或可以整合到该细菌染色体中的DNA元件。BAC可以接受DNA序列的大插入片段。在玉蜀黍中，许多BAC，其各自含有来自玉蜀黍近交系B73的玉蜀黍基因组DNA的大插入片段，已经组装到叠连群(重叠的连续遗传片段或“连续DNA”)中，并且该组装可在互联网上公开获得。

BAC指纹是基于存在或不存在特异性限制性位点(限制性位点是被切割或“限制”DNA的酶所识别的核苷酸序列)分析几种DNA样品之间的相似性的方法。用相同的一组限制酶消化两个或更多个BAC样品，并且通常使用凝胶分离来比较形成的片段的大小。

“回交”是指杂交体后代借以反复与亲本中之一杂交的方法。在回交方案中，“供体”亲本是指待渗入的具有所需的一种或多种基因、座位或特定表型的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或座位被渗入到其中的亲本植物。例如，参见Ragot，M.等人，(1995)Marker-assisted backcrossing：a practicalexample，in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires LesColloques[标记辅助回交：实践范例，分子标记技术和应用专题讨论会]第72卷，第45-56页，以及Openshaw等人，(1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding，Analysis of Molecular Marker Data[回交育种中的标记辅助选择，分子标记数据分析]，第41-43页。最初的杂交产生F₁代；术语“BC₁”则是指第二次使用所述轮回亲本，“BC₂”是指第三次使用所述轮回亲本，等等。

厘摩(“cM”)是重组频率的度量单位。一个cM等于有1％的机会，一个遗传座位处的标记会由于单代中的杂交而与第二座位处的标记分离。

如本文所使用的，术语“染色体区间”是指存在于植物单一染色体上的基因组DNA的连续线性跨度。位于单条染色体区间上的遗传元件或基因是物理连锁的。染色体区间的大小没有特别的限制。在一些方面，位于单条染色体区间内的遗传元件是遗传连锁的，通常具有例如小于或等于20cM，或者可替代地，小于或等于10cM的遗传重组距离。也就是说，单条染色体区间内的两个遗传元件以小于或等于20％或10％的频率进行重组。

“染色体”是单块含有许多基因的螺旋DNA，所述基因在细胞分裂过程中作为一个整体发挥作用和移动并且因此可以认为是连锁的。也可以称之为“连锁群”。

在本申请中，短语“紧密连锁”是指两个连锁的座位之间的重组以等于或小于约10％(即，在遗传图谱上分隔不超过10cM)的频率发生。换言之，该紧密连锁的座位有至少90％的机会发生共分离。当标记座位显示与所需的性状(例如，对灰叶斑病的抗性)发生共分离(连锁)的显著概率时，所述标记座位对于本公开内容的主题是特别有用的。紧密连锁的座位(例如标记座位和第二座位)可以显示10％或更低、优选约9％或更低、还更优选约8％或更低、又更优选约7％或更低、还更优选约6％或更低、又更优选约5％或更低、还更优选约4％或更低、又更优选约3％或更低、以及还更优选约2％或更低的座位间重组频率。在非常优选的实施例中，相关座位显示约1％或更低，例如约0.75％或更低、更优选约0.5％或更低、或又更优选约0.25％或更低的重组频率。定位于相同染色体并且具有使得两个座位之间的重组以小于10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更少)的频率发生的距离的所述两个座位也被认为是彼此“邻近的”。在某些情况下，两个不同的标记可以具有相同的遗传图谱坐标。在这种情况下，所述两个标记彼此非常邻近，以至于二者之间的重组以不可检测的这种低频发生。

术语“互补序列”是指与给定的核苷酸序列互补的核苷酸序列，即沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对法则涉及的序列。

术语“连续DNA”是指由部分重叠的碎片或叠连群表示的基因组DNA的不间断延伸。

当提及两个遗传元件(例如有助于灰叶斑病抗性的遗传元件和近端标记)之间的关系时，“偶联”相连锁(“coupling”phase linkage)指示下述状态：其中灰叶斑病抗性座位处的“有利”等位基因在与相应的连锁标记座位的“有利”等位基因相同的染色体链上是物理上相关联的。在偶联阶段，两个有利的等位基因由继承该染色体链的后代一起继承。

术语“杂交的”或“杂交”是指有性杂交，并且涉及通过授粉将两种单倍体配子融合以产生二倍体后代(例如细胞、种子或植物)。该术语涵盖一株植物被另一株植物授粉和自交(或自体授粉，例如当花粉和胚珠来自同一植物时)二者。

本文中称为“二倍体”的植物具有两组染色体(基因组)。

通过使单倍体染色体组(即，染色体的正常数量的一半)加倍来开发本文中称为“双单倍体”的植物。双单倍体植物具有两组相同的染色体，并且所有座位都被认为是纯合的。

“良种系”是针对优良农艺性状表现的选育而产生的任何品系。

“外来玉蜀黍品种”或“外来玉蜀黍种质”是衍生自不属于可利用的优良玉蜀黍品系或种质品种的玉蜀黍植物的品种。在两个玉蜀黍植物或种质品种之间杂交的情况下，外来种质的后代与它杂交的优良种质不是密切相关的。最普遍的是，所述外来种质不是衍生自任何已知的优良玉蜀黍品系，而是被选择用来将新的遗传元件(通常是新的等位基因)引入育种程序中。

“有利的等位基因”是特定座位处的等位基因(标记、QTL等)，所述等位基因赋予或有助于农学上所需的表型(例如灰叶斑病抗性)，并且允许鉴定具有该农学上所需表型的植物。标记的有利等位基因是与所述有利表型分离的标记等位基因。

“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文中所公开的方法可以将片段用作杂交探针或PCR引物。

“遗传图谱”是对给定物种内的一个或多个染色体(或连锁群)上的座位之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描述。对于每个遗传图谱，座位之间的距离通过所述座位的等位基因在群体中一起出现的频率(座位的重组频率)来测量。可以使用DNA或蛋白质标记或者可观察到的表型来检测等位基因。遗传图谱是用来作图的群体、所用标记的类型以及不同群体之间每个标记的多态性潜力的产物。对于不同的遗传图谱，座位之间的遗传距离可以是不同的。但是，使用通用标记可以将信息从一张图谱关联到另一张图谱上。本领域的普通技术人员可以使用通用标记位置来鉴定每个单独的遗传图谱上的标记和其他目的座位的位置。尽管由于例如在不同群体中检测交替重复座位的标记、在用于排序这些标记的统计学方法上的差异、新的突变或实验室错误，经常在标记顺序上有小的变化，但是座位顺序在图谱之间不应该改变。

“遗传图谱定位”是遗传图谱上相对于相同连锁群上的周围遗传标记的定位，其中在给定物种内可以找到指定的标记。

“遗传作图”是通过使用遗传标记、针对这些标记的群体分离和重组频率的标准遗传原理来定义座位的连锁关系的方法。

“遗传标记”是在群体中多态的核酸，并且所述遗传标记的等位基因可以通过一种或多种分析方法(例如RFLP、AFLP、同工酶、SNP、SSR等)来检测和区分。该术语还指与用作探针的基因组序列(例如核酸)互补的核酸序列。可以通过本领域中公认的方法检测对应于群体成员之间的遗传多态性的标记。这些方法包括，例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已知公认的方法也用于检测表达的序列标签(EST)和衍生自EST序列的SSR标记，以及随机扩增多态性DNA(RAPD)。

“遗传重组频率”是两个基因座位之间的杂交事件(重组)的频率。重组频率可以通过遵循减数分裂后的标记和/或性状的分离来观察。

“基因组”是指由染色体或染色体组携带的总DNA或整套基因。

术语“基因型”是个体(或个体的组)在一个或多个基因座位处的遗传组成。基因型由所述个体遗传自其亲本的一个或多个已知座位的一个或多个等位基因定义。术语基因型可以用来指单个座位处、多个座位处的个体的遗传组成，或者更普遍地，术语基因型可以用来指其基因组中所有基因的个体遗传构成。

“种质”是指遗传物质，其属于或来自于个体(例如，植株)、个体的组(例如，植物品系、品种或家族)或者来自品系、品种、物种或培养物的克隆，或者更概括地，某一物种或多个物种的全部个体(例如，玉蜀黍种质集合(maize germplasm collection)或Andean种质集合(Andean germplasmcollection))。所述种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以分离自所述生物体或细胞。一般而言，种质提供了具有特定的分子构成的遗传物质，所述特定的分子构成为生物体或细胞培养物的某些或全部遗传品质提供物理基础。如本文所使用的，种质包括由此可以生长出新植物的细胞、种子或组织，或者可以培养成完整植物的植物部分，例如叶、茎、花粉或细胞。

被称为“单倍体”的植物具有单一染色体组(基因组)。

“单倍型”是个体在多个基因座位处的基因型，即等位基因的组合。典型地，由单倍型描述的基因座位在物理和遗传上是连锁的，即在同一染色体区段上。

术语“异质性”用于指示所述群组内的个体在一个或多个特定座位处的基因型不同。

材料的杂种优势应答或“杂种优势”可以通过当与其他不相似或不相关的群组杂交时超过亲本(或高亲本(high parent))的平均值的表现来定义。

“杂种优势组”包括一组当与来自不同的杂种优势组的基因型杂交时表现良好的基因型(Hallauer等人，(1998)Corn breeding[玉米育种]，第463-564页，G.F.Sprague和J.W.Dudley编辑，Corn and corn improvement[玉米和玉米的改良])。近交系分为杂交体优势组，并根据几个标准(如谱系、基于分子标记的关联和杂交体组合中的表现)进一步细分为杂交体优势组中的家族(Smith等人，(1990)Theor.Appl.Gen.[理论与应用遗传学]80：833-840)。在美国，两个应用最广泛的杂种优势群组称为“爱荷华刚性茎秆合成群(IowaStiff Stalk Synthetic)”(本文中也称为“刚性茎杆”)和“兰卡斯特(Lancaster)”或“兰卡斯特修尔作物(Lancaster Sure Crop)”(有时称为NSS或非刚性茎杆)。

有些杂种优势群组具备成为母本所需的性状，并且另一些具备成为父本所需的性状。例如，在玉蜀黍中，来自称为BSSS(爱荷华刚性茎秆合成群体)的群体释放的公开近交系的产量结果导致这些近交系及其衍生物成为中部玉米带中的雌性库。BSSS近交系已经与其他近交系(例如，SD 105和玉蜀黍阿曼巴(Maiz Amargo))杂交，而这个材料的一般组已经以刚性茎秆合成(Stiff Stalk Synthetics，SSS)闻名，即使并非所有的近交系都来源于原始的BSSS群体(Mikel和Dudley，(2006)Crop Sci[作物科学]：46：1193-1205)。默认情况下，所有与所述SSS近交系良好结合的其他近交系被分配到雄性库，因缺乏更好的名称而被命名为NSS，即非刚性茎秆。这个群组包括几个主要的杂种优势群组，例如兰卡斯特修尔作物(Lancaster Surecrop)、艾顿(Iodent)和利明玉米(Leaming Corn)。

如果在给定座位处存在超过一种等位基因类型(例如，具有两个不同等位基因中的各一个的一个拷贝的二倍体个体)，则该个体是“杂合的”。

术语“同质性”表示群组的成员在一个或多个特定座位处具有相同的基因型。

如果个体在给定座位处仅具有一种类型的等位基因(例如，二倍体个体在两个同源染色体中的每一个的座位处具有同一等位基因的拷贝)，则该个体是“纯合的”。

术语“杂交体”是指在至少两个遗传上不同的亲本的杂交之间获得的后代。

“杂交”或“核酸杂交”是指互补的RNA和DNA链的配对以及互补的DNA单链的配对。

术语“杂交”意指在核酸链的互补区域之间形成碱基对。

“IBM遗传图谱”可以指以下图谱中的任一项：IBM、IBM2、IBM2邻接、IBM2FPC0507、IBM22004邻接、IBM22005邻接、IBM22005邻接框、IBM22008邻接、IBM22008邻接框、或玉蜀黍GDB网站的最新版本。IBM遗传图谱基于B73×Mo17群体，其中使来自初始杂交的后代在构建重组近交系用于作图之前随机交配多代。较新的版本反映了遗传和BAC标测的座位的添加以及由于从其他遗传图谱或物理图谱、经过清理的数据或新算法的使用获得的信息的整合而提高的图谱精度。

术语“近交系”是指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。

术语“插入缺失(indel)”是指插入或缺失，其中一个品系可以称为相对于第二品系具有插入的核苷酸或DNA碎片，或所述第二品系可以称为相对于所述第一品系具有缺失的核苷酸或DNA碎片。

术语“渗入”是指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如，可以经由相同物种的两个亲本之间的有性杂交将指定座位处的所需等位基因的渗入传递给至少一个后代，其中所述亲本中的至少一个在其基因组内具有所述所需的等位基因。可替代地，例如等位基因的传递可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有所希望的等位基因。所需的等位基因可以，例如通过与表型相关联的标记，在QTL、转基因等处进行检测。在任何情况下，包含所述所需等位基因的后代可以反复与具有所需遗传背景的品系回交并选择所需等位基因，以产生固定在选择的遗传背景中的等位基因。

当“渗入”重复两次或更多次时，该方法通常被称为“回交”。

“品系”或“品种”是一组具有相同亲本的个体，其通常在一定程度上是近交的，并且在大多数座位处通常是纯合和同质的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”是指遗传上不同于起源于相同祖先的其他类似近交系亚群的近交系亚群。

如本文所使用的，术语“连锁”用于描述一种标记座位与另一种标记座位或一些其他座位的相关联程度。分子标记与影响表型的座位之间的连锁关系以“概率”或“调整的概率”表示。连锁可以表示为所需的限制或范围。例如，在一些实施例中，当任何标记与任何其它标记在单次减数分裂图谱(基于已经进行一轮减数分裂的群体(例如，F₂)的遗传图谱；IRM2图谱由多次减数分裂组成)上分隔小于50、40、30、25、20或15个图距单位(或cM)时，所述标记是连锁的(遗传上或物理上)。在一些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如，在10cM和20cM之间、在10cM和30cM之间、或在10cM和40cM之间。标记与第二座位的连锁越紧密，标记对第二座位的指示效果越好。因此，“紧密连锁的座位”，例如标记座位和第二座位显示10％或更低、优选约9％或更低、还更优选约8％或更低、又更优选约7％或更低、还更优选约6％或更低、又更优选约5％或更低、还更优选约4％或更低、又更优选约3％或更低、以及还更优选约2％或更低的座位间重组频率。在非常优选的实施例中，相关座位显示约1％或更低，例如约0.75％或更低、更优选约0.5％或更低、或又更优选约0.25％或更低的重组频率。定位于相同染色体并且具有使得两个座位之间的重组以小于10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更少)的频率发生的距离的所述两个座位也被认为是彼此“邻近”。因为一个cM是显示1％的重组频率的两个标记之间的距离，因此任何标记与紧密相邻(例如，以等于或小于10cM的距离)的任何其他标记紧密连锁(遗传上和物理上)。在同一染色体上的两个紧密连锁的标记可以相互定位为9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更近。

术语“连锁不平衡”是指基因座位或性状(或两者)的非随机分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的座位沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁的座位有超过50％的机会(例如约51％至约100％的机会)发生共分离。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％(并且根据定义，在相同连锁群上分隔小于50cM)的重组频率。如本文所使用的，连锁可以存在于两个标记之间，或可替代地，标记和影响表型的座位之间。标记座位可以与性状“相关联”(连锁)。标记座位和影响表型性状的座位的连锁程度例如通过该分子标记与所述表型共分离的统计学概率(例如，F统计或LOD评分)进行测量。

连锁不平衡最常见地用量度r²评估，所述量度r²使用以下文献中的公式计算：Hill，W.G.And和Robertson，A，Theor.Appl.Genet.[理论和应用遗传学]38：226-231(1968)。当r²＝1时，两个标记座位间存在完全的LD，意味着所述标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。所述r²值依赖于所使用的群体。r²值大于1/3显示了用于作图的足够强的LD(Ardlie等人，Nature Reviews Genetics[遗传学自然评论]3：299-309(2002))。因此，当成对标记座位间的r²值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。

如本文所使用的，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在后代中随机分配。显示连锁平衡的标记被认为是不连锁的(无论它们是否位于相同染色体上)。

“座位”是在染色体上的位置，例如，核苷酸、基因、序列或标记所处的位置。

“优势对数(LOD)值”或“LOD评分”(Risch，Science[科学]255：803-804(1992))用于遗传区间作图以描述两个标记座位之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率比无连锁的概率高1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率比无连锁的概率高100倍。大于或等于二的LOD评分可以用于检测连锁。LOD评分还可以用于在“数量性状座位”作图中显示标记座位和数量性状之间的关联强度。在这一情况下，LOD评分大小取决于所述标记座位与影响所述数量性状的座位之间的紧密度，以及所述数量性状效应的大小。

“玉蜀黍(maize)”是指玉蜀黍(Zea mays L.ssp.mays)植物，并且也称为“玉米”。

术语“玉蜀黍植物”包括整个玉蜀黍植株、玉蜀黍植物细胞、玉蜀黍植物原生质体、可从其中再生玉蜀黍植株的玉蜀黍植物细胞或玉蜀黍组织培养物、玉蜀黍植物愈伤组织、玉蜀黍植物丛生物和玉蜀黍植物中的完整玉蜀黍植物细胞或玉蜀黍植物部分，如玉蜀黍种子、玉蜀黍芯、玉蜀黍花、玉蜀黍子叶、玉蜀黍叶、玉蜀黍茎、玉蜀黍芽、玉蜀黍根、玉蜀黍根尖等。

“标记”是发现遗传或物理图谱上的位置或发现标记与性状座位(影响性状的座位)之间的连锁的方式。标记所检测的位置可通过检测多态性等位基因及其基因作图而获知，或通过对已经进行物理标测的序列进行杂交、序列匹配或扩增而获知。标记可以是DNA标记(检测DNA多态性)、蛋白质(检测编码的多肽的变异)或简单遗传的表型(诸如“腊质”表型)。可从基因组核苷酸序列或从表达的核苷酸序列(例如，从剪接的RNA或cDNA)开发DNA标记。根据DNA标记技术，所述标记由侧翼于所述座位的互补性引物和/或与所述座位处的多态性等位基因杂交的互补性探针组成。DNA标记或遗传标记还可用于描述该染色体自身上的基因、DNA序列或核苷酸(而非用于检测该基因或DNA序列的组分)，并且其通常在该DNA标记与人遗传学中的特定性状相关联时使用(例如乳腺癌标记)。术语标记座位是该标记所检测的座位(基因、序列或核苷酸)。

检测群体成员之间的遗传多态性的标记在本领域中是公认的。标记可由其所检测的多态性的类型以及用于检测所述多态性的标记技术所定义。标记类型包括但不限于：限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性检测(AFLP)、简单重复序列检测(SSR)、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、或单核苷酸多态性检测(SNP)。SNP可以，例如，通过DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、动态等位基因特异性杂交(DASH)、分子信标、微阵列杂交、寡核苷酸连接酶分析、Flap核酸内切酶、5′核酸内切酶、引物延伸、单链构象多态性(SSCP)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)进行检测。DNA测序(诸如焦磷酸测序技术)具有能够检测组成单倍型的一系列连锁SNP等位基因的优点。单倍型倾向于比SNP更具信息性(检测更高水平的多态性)。

“标记等位基因”，可替代地“标记座位的等位基因”可以指群体中标记座位处发现的多个多态性核苷酸序列中之一。

“标记辅助选择”(MAS)是基于标记基因型选择个体植物的方法。

“标记辅助反选择”是借以使用标记基因型鉴定将不被选择的植物的方法，使得所述植物从育种程序或种植中去除。

“标记单倍型”是指标记座位处的等位基因的组合。

“标记座位”是物种基因组中的特定染色体定位，在该定位处可发现特异标记。“标记座位”可用于追踪第二连锁座位(例如影响表型性状表达的连锁座位)的存在。例如，标记座位能够用于监控在遗传上或物理上连锁的座位处的等位基因的分离。

“标记探针”是可以用于通过核酸杂交鉴定标记座位存在的核酸序列或分子，例如与标记座位序列互补的核酸探针。包含所述标记座位的30个或更多个连续核苷酸(该标记座位序列的“全部或部分”)的标记探针可用于核酸杂交。可替代地，在某些方面，标记探针是指能够区别存在于标记座位处的特定等位基因的任何类型(即基因型)的探针。

如上所述，当鉴定连锁座位时，术语“分子标记”可以用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或与其侧接的核酸序列，如用作探针或能够扩增所述标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可以用于鉴定标记座位存在与否的核酸序列或分子，例如与标记座位序列互补的核酸探针。可替代地，在某些方面，标记探针是指能够区别存在于标记座位处的特定等位基因的任何类型(即基因型)的探针。当核酸，例如根据沃森-克里克碱基配对原则，在溶液中特异性杂交时，所述核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述标记中的一些也称为杂交标记。这是因为，根据定义，所述插入区域是关于无所述插入的植物的多态性。因此，该标记仅需要指示所述插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可以用于鉴定此类杂交标记，例如在本文提供的实例中使用SNP技术。

当等位基因与性状连锁时，以及当等位基因的存在是所需性状或性状形式将不出现在包含所述等位基因的植物中的指示时，所述等位基因与所述性状“负”相关。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互换使用并且是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，所述核苷酸由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、和磷酸基团组成。核苷酸(通常以其5′-单磷酸酯形式发现)以其单字母名称表示如下：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

术语“表型”、“表型性状”或“性状”可以指基因或基因系列的可观测表达。表型对于肉眼、或通过本领域已知的任何其他评估方式(例如称重、计数、测量(长度、宽度、角度等)、显微法、生化分析或机电测定)可以是可观测的。在某些情况下，表型直接受控于单个基因或基因座位，即，“单基因性状”或“简单遗传性状”。在缺少大水平环境变化的情况下，单基因性状可以在群体中分离，以给出“质量”或“离散”分布，即，所述表型归于离散的类别。在其他情况下，表型是多种基因的结果并且可以被认为是“多基因性状”或“复杂性状”。多基因性状在群体中分离以给出“数量”或“连续”分布，即，所述表型不能分离成离散的类别。单基因性状和多基因性状均可受到其表达所处的环境的影响，但是多基因性状倾向于具有更大的环境组分。

基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可鉴定的标志(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而，与遗传图谱相比，标志间的距离是绝对的(例如以碱基对或者分离的和重叠的连续基因片段测量)并且不基于基因重组(所述基因重组可在不同的群体中有所变化)。

“植物”可为整个植株、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以指以下中的任一项：整个植株、植物组成或器官(例如叶片、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞、和/或以上各项的后代。植物细胞是植物的细胞，其取自植物或来源于取自植物的细胞培养物。

“来自刚性茎秆合成群体中的近交系”的玉蜀黍植物可以是杂交体。

“多态性”是群体内2个或更多个个体之间的DNA中的变异。多态性在群体中优选地具有至少1％的频率。有用的多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)、简单重复序列(SSR)、或插入/缺失多态性(本文中也称为“插入缺失”)。

当等位基因与性状连锁时，以及当所述等位基因的存在是所述所需性状或性状形式将出现在包含所述等位基因的植物中的指示时，所述等位基因与所述性状“正”相关。

“概率值”或“p-值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率计分越低，座位和表型相关联的可能性就越高。概率计分可受到所述第一座位(通常是标记座位)与影响该表型的座位的邻近度以及表型效应的量级(由等位基因取代导致的表型变化)的影响。在某些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施例中，认为随机分配的概率评分为0.05(p＝0.05，或5％的概率)是关联的显著性指示。然而，可接受的概率可以为小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著的概率可以小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。

“生产标记”或“生产SNP标记”是已经为高通量目的而开发的标记。生产SNP标记被开发用于检测特异性多态性，并且被设计与多种化学反应和平台一起使用。本文所使用的标记名称，以前缀PHM开始以表示“先锋良种标记(Pioneer Hi-Bred Marker)”，然后是针对标记由此被设计的序列的数字，之后是“.”或“-”，并且然后是针对DNA多态性的后缀。标记的版本也能够按照(A、B、C等)表示针对该特异性多态性的标记的版本的方式。

术语“后代”是指杂交产生的后代。

“后代植物”是通过两个植物间的杂交所产生的植物。

术语“数量性状座位”或“QTL”是指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种群体中)，与数量表型性状的差异表达关联的DNA区域。QTL的区域涵盖或紧密地连锁于影响所考虑的性状的一个或多个基因。

“参考序列”或“共有序列”是用作序列比对基础的定义的序列。通过对在该座位处的多个品系进行测序，在序列比对程序(例如Sequencher)中比对这些核苷酸序列并且然后获得所述比对的最通用核苷酸序列来获得PHM标记的参考序列。见于这些个体序列中的多态性标注于所述共有序列中。参考序列通常并非任何个体DNA序列的精确复制，而是代表可用序列的混合并且用于设计针对该序列内的多态性的引物和探针。

在“相斥”相连锁(“repulsion”phase linkage)中，目的座位处的“有利”等位基因与邻近的标记座位处的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个座位彼此“异相”)。

短语“灰叶斑病”或“GLS”是指由真菌性病原体玉米灰斑病菌引起的谷物疾病，该真菌性病原体玉米灰斑病菌特征性地产生平行于叶脉的长的、矩形、浅灰褐色叶病变。

玉蜀黍植物中对GLS的“新赋予的抗性”或“增强的抗性”或“增加的抗性”表明玉蜀黍植物在引入该疾病(例如，玉米灰斑病菌)的治病物时对产量和/或生存力或其他相关农艺措施的影响较小。“增加的抗性”表明受感染的植物比另一种类似处理的、更易感植物产生更高的玉蜀黍产量。即，与易感玉蜀黍植物相比，所述病症导致具有增加的抗性(或耐受性)的玉蜀黍植物中玉蜀黍存活和/或产量的降低的减少。

技术人员将理解，对GLS抗性变化很大的玉蜀黍植物可以代表一系列更多抗性或更少抗性的表型，并且可以根据感染的严重程度而变化。然而，通过简单观察，技术人员可以确定不同植物、植物品系或植物家族对GLS的相对抗性或敏感性，并且此外还将识别“抗性”的表型等级。例如，可以使用表示对GLS的抗性的1至9个视觉等级。分数越高表明抗性越高。只有在测量的实验中存在足够的选择压力时才应收集数据。

“顶交测试”是通过将各个体(例如，选择物、近交系、克隆或后代个体)与相同的花粉亲本或“测试物(tester)”(通常是纯合品系)杂交而进行的测试。

短语“在严格条件下”指在探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交的条件，所述杂交通常在核酸复杂混合物中进行，但是基本上无其他序列。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。一般来讲，在限定离子强度、pH下，针对特定序列，严格条件通常选择比热熔点(Tm)低约5℃-10℃。Tm是(在限定离子强度、pH和核酸浓度的情况下)50％与靶标互补的探针在平衡状态下(因为存在的靶序列过多，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)与靶序列杂交的温度。严格条件应为如下条件：在pH 7.0至8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)，温度为至少约30℃，并且对于长探针(例如多于50个核苷酸)，温度为至少约60℃。添加去稳定剂例如甲酰胺也可以实现严格条件。就选择性杂交或特异性杂交而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性严格杂交条件通常为：50％的甲酰胺，5x SSC，和1％SDS，在42℃下孵育，或者5x SSC，1％SDS，在65℃下孵育，并用0.2x SSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。就PCR而言，约36℃的温度是典型的低严格扩增，而退火温度取决于引物长度，可在约32℃和48℃之间变化。决定杂交参数的附加准则在多个参考文献中提供。

标记的“不利等位基因”是与所述不利植物表型分离的标记等位基因，因此提供了鉴定能从育种程序或种植中移除的植物的益处。

术语“产量”指具有商业价值的特定植物产品每单位面积的生产力。例如，玉蜀黍产量一般以每季每英亩种子蒲式耳数或每公顷种子公吨数来测量。产量受遗传和环境因素二者的影响。“农学”、“农艺性状”、和“农艺性状表现”是指给定植物品种的性状(以及潜在遗传元件)，所述性状在生长期过程中有助于产量。个体农艺性状包括出苗活力、营养势、胁迫耐受性、疾病抗性或耐受性、除草剂抗性、发生分枝、开花、种子形成、种子大小、种子密度、抗倒伏性、脱粒性等。因此产量是所有农艺性状的最终顶点。

序列比对和同一性百分比计算可以使用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对使用CLUSTAL V比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151 153(1989))和默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行。使用CLUSTAL V方法进行逐对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5、并且存储的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、并且存储的对角线＝4。使用CLUSTAL W程序比对序列后，通过查看相同程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“散度”值是可能的。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和散度是以该方式计算的。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域是已知的，并且在以下文献中进行了更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册]；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989[冷泉港实验室出版社：冷泉港，1989](以下称为“Sambrook”)。

遗传作图

已经认识到，在相当一些情况下可在生物体的基因组中标测与特定表型(例如对灰叶斑病的抗性)相关联的特定遗传座位。植物育种人员可以有利地使用分子标记通过检测标记等位基因来鉴定所需的个体，所述标记等位基因显示与所需表型共分离的统计学上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与目的性状共分离的分子标记或分子标记簇，所述植物育种人员能够通过选择合适的分子标记等位基因(称为标记辅助选择或MAS的方法)来迅速选择所需表型。

本领域中已知的多种方法可用于检测与目的性状(例如灰叶斑病抗性性状)共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本理念是检测具有显著不同平均表型的可替代的基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记座位之间的可替代的基因型(或等位基因)之间的差异大小或所述差异的显著性水平。推断性状基因位于最靠近具有最大相关性的基因型差异的一个或多个标记的位置。这样两种用于检测目的性状座位的方法是：1)基于群体的关联分析(即关联作图)和2)传统的连锁分析。

关联作图

了解基因组中连锁不平衡(LD)的程度和模式是开发有效的、用以鉴定和绘制数量性状座位(QTL)的关联方法的先决条件。连锁不平衡(LD)是指个体集合中等位基因的非随机关联。当在连锁的座位处的等位基因中观察到LD时，LD被测量为跨越染色体的特定区域的LD衰减。LD的范围反映了该区域的重组历史。基因组中LD衰减的平均速率可以帮助预测进行全基因组关联研究所需的标记的数量和密度，并提供可预期的分辨率的估计值。

关联或LD作图旨在鉴定显著的基因型-表型关联。它已作为在异交如下物种中用于精细作图的强大工具而被开发利用：人类(Corder等人，(1994)“Protective effeet ofapolipoprotein-E type-2allele for late-onset Alzheimer-disease[载脂蛋白E2型等位基因对迟发型阿尔茨海默病的保护作用]”，Nat Genet[自然遗传学]7：180-184；Hastbacka等人，(1992)“Linkage disequilibrium mapping in isolated founderpopulations：diastrophic dysplasia in Finland[在孤立的建立者群体中的连锁不平衡绘图：芬兰的畸型发育不良]”，Nat Genet[自然遗传学]2：204-211；Kerem等人，(1989)“Identification ofthe cystic fibrosis gene：genetic analysis[鉴定囊性纤维化基因：遗传分析]”，Science[科学]245：1073-1080)和玉蜀黍(Remington等人，(2001)“Structure of linkage disequilibrium and phenotype associations in the maizegenome[玉蜀黍基因组中连锁不平衡和表型关联的结构]”，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]98：11479-11484；Thornsberry等人，(2001)“Dwarf8 polymorphismsassociate with variation in flowering time[矮秆8多态性与开花时间的变化相关联]”，Nat Genet[自然遗传学]28：286-289；由Flint-Garcia等人综述，(2003)“Structureof linkage disequilibrium in plants[植物中连锁不平衡的结构]”，Annu RevPlantBiol.[植物生物学年评]54：357-374)，其中杂合子之间的重组频繁并导致LD的快速衰减。在近交物种中，纯合基因型之间的重组不是遗传学上可检测的，LD的程度更大(即，较大的连锁标记块一起遗传)并且这大大提高了关联作图的检测能力(Wall和Pritchard，(2003)“Haplotype blocks and linkage disequilibriumin the human genome[人类基因组中的单倍型阻断和连锁不平衡]”，Nat Rev Genet[自然遗传学综述]4：587-597)。

群体的重组和突变历史是交配习惯以及群体的有效大小和年龄的函数。较大的群体大小为检测重组提供了增强的可能性，而较老的群体通常与较高水平的多态性相关，这两者都促进可观察到的LD衰退速率的显著增加。另一方面，较小的有效群体大小，例如那些已经经历了最近遗传瓶颈的群体，倾向于表现出较慢的LD衰退速率，导致更广泛的单倍型保守性(Flint-Garcia等人，(2003)“Structure of linkage disequilibriumin plants[植物连锁不平衡的结构]”，Annu Rev Plant Biol.[植物生物学年评]54：357-374)。

优良育种品系为关联分析提供了宝贵的起点。关联分析在该分析中使用定量表型评分(例如，对于每个玉蜀黍品系，疾病耐受性等级从一至九)(而不是在分析的组间等位基因分布类型中只考虑耐受性与抗性等位基因频率分布)。多年来通过育种程序收集的详细表型性能数据的可用性和大量优良品系的环境为遗传标记关联作图分析提供了有价值的数据集。这为研究和应用之间的无缝整合铺平了道路，并利用了历史积累的数据集。然而，了解多态性与重组之间的关系对于开发用于从这些资源中有效提取最大信息的适当策略是有用的。

这种类型的关联分析既不产生也不需要任何图谱数据，而是独立于图谱位置。这种分析将植物的表型评分与不同座位处的基因型进行比较。随后，使用先前确定的这些标记的图谱定位，可以任选地使用任何合适的玉蜀黍图谱(例如，复合图谱)来帮助观察经鉴定的QTL标记和/或QTL标记簇的分布。

传统连锁分析

传统的连锁分析基于相同的原理；然而，LD通过从少量建立者创建群体而生成。选择创建者以最大化结构化群体内的多态性水平，并且评估多态性位点与给定表型的共分离水平。已经使用大量统计学方法来鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander和Botstein，Genetics[遗传学]121：185-199(1989)，其中针对控制目的性状的基因位于该位置的概率来测试沿遗传图谱(比如说以1cM的区间)的许多位置中的每一个位置。基因型/表型数据用于计算每个测试位置的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制目的性状的基因位于遗传图谱上的该定位处的显著证据(将位于两个特定标记座位之间)。

本文提供了如通过传统的连锁分析和全基因组关联分析确定的、显示与灰叶斑病抗性性状的统计学上显著的共分离的玉蜀黍标记座位。这些座位或附加连锁的座位的检测可以用于标记辅助玉蜀黍育种程序，以产生具有灰叶斑病抗性的植物。

标记辅助玉蜀黍育种程序中的活动可能包括，但不限于：根据历史基因型和农艺性状关联在新的育种群体中选择以鉴定哪个群体具有最高的有利核酸序列频率、在育种群体中的后代中选择有利的核酸序列、基于后代性能的预测在亲本品系中进行选择、以及根据有利的核酸序列的存在在种质改良活动中推进品系。

QTL定位

使用传统的连锁作图法并然后验证(实例1和2)，将4号染色体上的QTL鉴定为与灰叶斑病抗性性状相关联。虽然QTL位于与US 2009172845中所述的位置相同的位置，但通过世代研究的标记分析和鉴定显示出本文所述的QTL等位基因来自不同的来源。

染色体区间

提供了与灰叶斑病抗性性状相关联的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界扩展到涵盖将与控制目的性状的一个或多个基因连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间，这样使得位于该区间内的任何标记(包括限定该区间的边界的末端标记)可以用作灰叶斑病抗性性状的标记。表1和表3鉴定了所述4号染色体QTL区域内的标记，本文显示所述标记与灰叶斑病抗性性状相关联，并与控制灰叶斑病抗性的一个或多个基因连锁。这些标记中的每个的参考序列由SEQ ID NO：1-9表示。

每个区间包含至少一个QTL，并且此外可以包含超过一个QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可以搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示与多于一个QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，则有时分不清楚是否那些标记中的每一个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。无论如何，关于在特定区间内有多少个QTL的知识对于制定或实践在本公开中呈现的QTL是不必要的。

4号染色体区间可以涵盖本文所鉴定的与灰叶斑病抗性性状相关联的标记中的任一个，包括：PHM6764-7、PHM16360-9、PHM521-8、PHM586-10、PHM289-20、PHM12024-9、PHM199-23、PHMGLS_01、PHMGLS_07、PHMGLS_14、PHMGLS_19、PHMGLS_21、PHMGLS_45、PHMC001YAR、PHM5013-12、PHM1963-15和PHM18451-2。该4号染色体区间可以被标记PHM6764-7和PHM289-1限定(实例1)，这两者在物理图谱上以最大距离分开。该区域的子区间可以进一步被标记PHM521-8和PHM185451-2限定。位于这些区间内的任何标记可以用作灰叶斑病抗性的标记，并且可以用于本文呈现的方法的上下文中以鉴定和/或选择对灰叶斑病具有抗性的玉蜀黍植物，不管所述抗性与对照植物相比是否是新赋予的或增强的。

染色体区间也可以由与QTL标记连锁的标记(与其表现出连锁不平衡)所限定，并且r²是关联性研究的上下文中连锁不平衡(LD)的常见量度。如果本文中提供的4号染色体标记座位与另一个紧密相邻的4号染色体标记座位之间的LD的r²值大于1/3(Ardlie等人，Nature Reviews Genetics[遗传学自然评论]3：299-309(2002))，则这两个座位彼此连锁不平衡。

标记和连锁关系

连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以以共分离百分比(重组频率)表示，或以厘摩(cM)表示。cM是遗传重组频率的量度单位。一个cM等于有1％的机会，一个遗传座位处的性状会由于单代中的杂交而与另一个座位处的性状分离(意味着这些性状总共有99％的机会发生分离)。由于染色体距离与性状之间的杂交事件的频率大致成正比，因此存在与重组频率相关联的近似物理距离。

标记座位本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪该标记座位、根据标准连锁分析对其进行评估。因此，一个cM等于有1％的机会，一个标记座位会由于单代中的杂交而与另一个座位分离。

标记距离控制目的性状的基因越近，则该标记作为所述所需性状的指示越有效和有利。紧密连锁的座位显示约10％或更低、优选约9％或更低、还更优选约8％或更低、又更优选约7％或更低、还更优选约6％或更低、又更优选约5％或更低、还更优选约4％或更低、又更优选约3％或更低、以及还更优选约2％或更低的座位间杂交频率。在高度优选的实施例中，相关座位(例如标记座位和靶标座位)显示约1％或更低、例如约0.75％或更低、更优选地约0.5％或更低、或又更优选地约0.25％或更低的重组频率。因此，所述座位分开约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更少。换言之，定位于相同染色体并且具有使得两个座位之间的重组以小于10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更少)的频率发生的距离的所述两个座位被认为是彼此“邻近的”。

尽管特定的标记等位基因可以与灰叶斑病抗性性状共分离，重要的是注意所述标记座位不一定引起所述灰叶斑病抗性表型的表达。例如，该标记多核苷酸序列是产生灰叶斑病抗性表型的基因的一部分(例如，是基因可读框的一部分)不是必需条件。特异标记等位基因与灰叶斑病抗性性状之间的关联性，是由于在所述等位基因所起源的祖先玉蜀黍品系中，所述标记等位基因和所述等位基因之间的初始“偶联”相连锁。最后通过反复重组，所述标记和基因座位之间的杂交事件能够改变这种取向。由于这个原因，所述有利的标记等位基因可以根据存在于具有灰叶斑病抗性的亲本中的用于创建分离群体的连锁相发生改变。这不改变可以使用所述标记来监测表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离群体中哪个标记等位基因被认为是有利的。

本文提出的方法包括检测玉蜀黍植物中与灰叶斑病抗性相关联的一个或多个标记等位基因的存在，并且然后鉴定和/或选择在那些标记座位处具有有利等位基因的玉蜀黍植物。表1、2和3中列出的标记已经在本文中被鉴定为与灰叶斑病抗性性状相关联，并且因此可以用于预测玉蜀黍植物中的灰叶斑病抗性。在表1和表3的标记中，任何在50cM、40cM、30cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM(根据基于单次减数分裂的遗传图谱)内的标记都可以用于预测玉蜀黍植物中的灰叶斑病抗性。

标记辅助诜择

分子标记可以用于多种植物育种应用(如参见Staub等人，(1996)Hortscience[园艺科学]31：729-741；Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter.[植物分子生物学导报]1：3-8)。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响所需表型性状的座位连锁的分子标记为在植物群体中选择性状提供了有用工具。在表型难以测定的情况下尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的群体，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶区段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于所述标记和引起该性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。

当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域(Gepts.(2002).Crop Sci[作物科学]；42：1780-1790)。这称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物极不相关的情况下，这些侧接区域携带可以编码农艺学上不需要的性状的附加基因。即便与优良玉蜀黍品系回交多个周期后，该“连锁累赘”也可能导致产量下降或其他负面农艺学特征。这有时也称为“产量累赘”。侧接区域的大小可以通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小(Young等人，(1998)Genetics[遗传学]120：579-585)。在经典育种中，通常只是偶然地，选择了有助于减小供体区段大小的重组(Tanksley等人，(1989).Biotechnology[生物技术]7：257-264)。即使在20次此类型的回交后，可以预期找到相当大的仍然与所述基因连锁的供体染色体碎片被选择。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植物中，有95％的机会，至少一株植物将经历该基因的1cM(基于单次减数分裂图距)内的杂交。标记使得能够明确鉴定这些个体。使用300株植物的一次附加回交，在该基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的杂交概率，从而产生在基于单次减数分裂图距的小于2cM的靶基因附近的区段。这用标记可以在两代中实现，而不用标记时则需要平均100代(参见Tanksley等人，同上)。当基因的确切定位已知时，围绕该基因的侧接标记可用于在不同的群体大小中对重组进行选择。例如，在更小的群体中，预期重组可以进一步远离该基因，因此需要更远端的侧接标记来检测该重组。

包含密度增强的公开玉蜀黍标记的玉蜀黍基因组的整合连锁图谱的可用性促进了玉蜀黍遗传作图和MAS。参见，例如IBM2邻接(IBM2 Neighbors)图谱，该图谱可在玉蜀黍GDB网站上在线获得。

实施MAS的主要组成是：(i)限定在其中标记-性状关联性将被测定的群体，其可以是分离群体、或随机的或结构化的群体；(ii)监测多态性标记相对于该性状的分离或关联性，并使用统计学方法确定连锁或关联性；(iii)基于统计学分析的结果限定一组所需标记，以及(iv)使用和/或外推该信息至当前的育种种质组中，以使得能够作出基于标记的选择决定。本公开中描述的标记，以及其他标记类型，例如SSR和FLP，可以用于标记辅助选择方案中。

SSR可以定义为长度为6bp或更短的串联重复DNA的相对较短的运行(Tautz(1989)Nucleic Acid Research[核酸研究]17：6463-6471；Wang等人，(1994)Theoretical andApplied Genetics[理论与应用遗传学]，88：1-6)。多态性由于重复单元数量的变化而出现，所述重复单元数量的变化可能是由DNA复制过程中的滑动所引起的(Levinson和Gutman(1987)Mol Biol Evol[分子生物学与进化]4：203-221)。重复长度的变化可以通过设计PCR引物至保守的非重复侧翼区域来检测(Weber和May(1989)Am J Hum Genet.[美国人类遗传学]44：388-396)。因为SSR是多等位基因的、共显性的、可再生的、并适合于高通量自动化，所以非常适合作图和MAS(Rafalski等人，(1996)Generating and using DNA markers inplants[在植物中生成和使用DNA标记].Non-mammalian genomic ahalysis：a practicalguide.Academic press.pp 75-135[非哺乳动物基因组分析：实用指南，学术出版社，第75-135页])。

可以产生各种类型的SSR标记，并且可以通过扩增产物的凝胶电泳获得SSR谱。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。由加拿大魁北克省圣让河畔黎塞留大专学院的DNALandmarks公司依据合同规定向公众提供玉蜀黍的SSR服务。

也可以生成各种类型的FLP标记。最常见地，使用扩增引物来生成片段长度多态性。除了通过引物扩增的区域通常不是高度重复的区域之外，这样的FLP标记在许多方面与SSR标记相似。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间仍具有足够的可变性，使得由扩增引物产生的片段能够在多态性个体中被区分，并且已知此类插入缺失常常发生于玉蜀黍中(Bhattramakki等人，(2002).PlantMol Biol[植物分子生物学]48，539-547；Rafalski(2002b)，同上)。

SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型中，SNP是最丰富的，因此具有提供最高遗传图谱分辨率的潜力(Bhattramakki等人，2002 Plant MolecularBiology[植物分子生物学]48：539-547)。由于SNP不需要大量的DNA并且测定的自动化可以是直接的，所以可以以所谓的“超高通量”方式，以甚至比SSR更高的通量水平测定SNP。SNP也有可能成为相对低成本的系统。这三个因素一起使得将SNP用于MAS中具有高度的吸引力。可利用如下几种方法用于SNP基因分型，包括但不限于：杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶切割、微测序和编码球(coded sphere)。如下文献中已经对这些方法进行了综述：Gut(2001)Hum Mutat[人类基因突变]17，第475-492页；Shi(2001)Clin Chem[临床化学]47，第164-172页；Kwok(2000)Pharmacogenomics1[药物基因组学1]，第95-100页；以及Bhattramakki和Rafalski(2001)，Discovery and application of single nucleotidepolymorphism markers in plants[单核苷酸多态性标记在植物中的发现与应用]，R.J.Henry编辑，Plant Genotyping：The DNA Fingerprinting of Plants，CABIPublishing，Wallingford[植物基因分型：植物的DNA指纹识别，CABI出版社，瓦林福德]。广泛的可商购的技术利用这些和其他方法来检测SNP，所述可商购的技术包括：Masscode.TM.(凯杰公司(Qiagen))、(第三波技术公司(Third Wave Technologies))和Invader(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))、(美国应用生物系统公司)以及(依诺米那公司(Illumina))。

可以使用序列内或跨连锁序列的许多SNP来描述任何特定基因型的单倍型(Ching等人，(2002)，BMC Genet.[BMC遗传学]3：19，Gupta等人，2001，Rafalski(2002b)，PlantScience[植物科学]162：329-333)。单倍型可以比单个SNP更具信息性，并且可以更详细地描述任何特定的基因型。例如，单一的SNP可能是具有灰叶斑病抗性的特定品系或品种的等位基因“T”，但在用于轮回亲本的玉蜀黍育种群体中也可能出现等位基因“T”。在这种情况下，单倍型(例如连锁的SNP标记处的等位基因的组合)可能更具信息性。一旦将独特的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可以用于该群体或其任何亚群中以确定个体是否具有特定的基因。参见，例如，WO 2003054229。使用本领域普通技术人员已知的自动化高通量标记检测平台使得该方法高效且有效。

由于插入/缺失多态性的存在，本文中提出的PHM标记中的许多可以容易地用作FLP标记来选择4号染色体上的基因座位。PHM标记的引物也可以用于在相同的区域中将这些标记转化为SNP或者其他结构相似或功能等效的标记(SSR、CAP、插入缺失等)。以下文献中描述了一种非常富有成效的SNP转换方法：Rafalski(2002a)Current opmion in plantbiology[当代植物生物学观点]5(2)：94-100以及Rafalski(2002b)Plant Science[植物科学]162：329-333。利用PCR，将引物用于扩增代表目的群体多样性的个体(优选近交系)的DNA区段。将PCR产物直接在一个或两个方向上测序。将得到的序列进行比对并鉴定多态性。所述多态性不限于单核苷酸多态性(SNP)，而且包括插入缺失、CAPS、SSR和VNTR(可变数量的串联重复序列)。具体而言，关于本文所述的精细图谱信息，可以容易地使用本文提供的信息来获得由本公开内容中列出的引物扩增的区域内的附加的多态性SNP(和其他标记)。所描述的图谱区域内的标记可以与BAC或其他基因组文库杂交，或者与基因组序列进行电子比对，以在与所述标记相同的大致定位中找到新的序列。

除上述的SSR、FLP和SNP外，其他类型的分子标记也被广泛使用，包括但不限于：表达的序列标签(EST)、源自EST序列的SSR标记、随机扩增的多态性DNA(RAPD)和其他基于核酸的标记。

同工酶谱和连锁形态特征在某些情况下也可以间接用作标记。尽管它们不直接检测DNA差异，但它们往往受到特定遗传差异的影响。然而，检测DNA变异的标记比同工酶或形态学标记多得多且更多态(Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter[植物分子生物学导报]1：3-8)。

序列比对或叠连群还可以用于发现本文所列特异标记的上游或下游的序列。然后使用接近于本文所述的标记的这些新序列来发现和开发功能上等效的标记。例如，对不同的物理和/或遗传图谱进行比对以定位未在本披露中描述但位于相似区域内的等效标记。这些图谱可能在玉蜀黍物种内，或者甚至跨越与玉蜀黍进行遗传上或物理上比对的其他物种，如水稻、小麦、大麦或高粱。

一般来说，MAS使用多态性标记，这些标记已被鉴定为具有与灰叶斑病抗性性状等性状共分离的显著可能性。推测这样的标记在图谱上位于给予植物灰叶斑病抗性表型的一个或多个基因附近，并被认为是所需性状或标记的指示。测试植物中标记中所需的等位基因的存在，并且预期在一个或多个座位处含有所需基因型的植物将所需基因型连同所需表型一起转移至其后代。因此，可以通过检测一个或多个标记等位基因来选择具有灰叶斑病抗性的植物，并且此外，还可以选择来自这些植物的后代植物。因此，获得在给定染色体区域中含有所需基因型(即与灰叶斑病抗性相关联的基因型)的植物，并且然后与另一植物杂交。然后使用一种或多种标记对这种杂交的后代进行基因型评估，并且然后将在给定染色体区域中具有相同基因型的后代植物选择为具有灰叶斑病抗性。

从连锁作图法和关联分析二者中鉴定出与灰叶斑病抗性性状相关联的标记。这些标记的参考序列由SEQ ID NO：1-9表示。在这些标记序列内鉴定SNP位置。

鉴定和/或选择对灰叶斑病具有增加抗性的玉蜀黍植物的方法可以包括：(a)筛选具有QTL区间中的标记的群体以确定来自该群体的玉蜀黍植物是否具有本文所限定的QTL等位基因；(b)检测具有与本文所限定的单倍型相关联的标记等位基因的玉蜀黍植物；(c)检测具有QTL等位基因的玉蜀黍植物，其中所述QTL等位基因包含在PHM1963-15处的“C”和本文提供的任何其他的等位基因；或(d)检测在PHM521-8处具有“T”的玉蜀黍植物；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”。然后可以选择经鉴定的玉蜀黍植物用于进一步开发，可以包括将该玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交并产生后代植物。

本领域技术人员会预期在本文所鉴定的4号染色体标记中及其附近的标记座位处可能存在附加的多态性位点，其中一个或多个多态性位点与该单倍型中的多态性位点中的一个或多个处的等位基因处于连锁不平衡(LD)，并且因此可以用于标记辅助选择程序中以渗入目的QTL等位基因。如果这些位点中的一个处的等位基因的存在倾向于预测同一染色体上其他位点处的等位基因存在，则认为不同多态性位点处的两个特定等位基因处于LD(Stevens，Mol.Diag.[分子诊断]4：309-17(1999))。该标记座位可以位于灰叶斑病抗性性状QTL的5cM、2cM、或1cM内(在基于单次减数分裂的遗传图谱上)。

本领域技术人员将理解，等位基因频率(以及因此，单倍型频率)在质库间可以不同。由于成熟度差异、杂种优势分组、地理分布等原因，种质库存在差异。因此，某些种质库中的SNP和其他多态性可能不具有信息性。

植物组合物

通过上述方法中的任何一种鉴定和/或选择的玉蜀黍植物也是令人感兴趣的。这包括来自物种玉蜀黍的任何植物，所述植物在其基因组内在4号染色体上具有包含以下的单倍型：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”；并且当与在基因组中不具有所述单倍型的玉蜀黍植物相比时，展示出灰叶斑病抗性(抗性可以是新赋予的或增强的)。

种子处理

为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以针对昆虫、杂草和疾病提供另外的作物计划灵活性和成本有效的控制，从而进一步增强本文所述的主题。种子材料可以用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物进行处理，通常进行表面处理。这些化合物通常与制剂领域中通常使用的其他载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起配制。这些包衣可通过用液体制剂浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干制剂进行涂覆来施加。在以下提供了可用作种子处理的各种类型的化合物的实例：The Pesticide Manual：A World Compendium，C.D.S.Tomlin Ed.，Published by the British Crop Production Council[农药手册：世界纲要，C.D.S.汤姆林编辑，由英国作物生产委员会出版]，其通过引用结合在此。

可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯-S-甲基、阿维菌素、杀草强、阿扎康唑、固氮螺菌属、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌，坚果芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)、短根瘤菌属物种(包括甜菜慢生根瘤菌(bradyrhizobium betae)、香炉盘慢生根瘤菌(bradyrhizobium canariense)、埃氏慢生根瘤菌、西表岛慢生根瘤菌、慢生型大豆根瘤菌、bradyrhizobium liaonigense、bradyrhizobium pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌)、克菌丹、萎锈灵、壳聚糖、噻虫胺、铜、溴氰虫酰胺、苯醚甲环唑、氯唑灵、氟虫腈、咯菌腈、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、isoflavenoids、脂质几丁寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、PCNB、氟唑菌苯胺、青霉菌属、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氯虫苯甲酰胺、精异丙甲草胺、皂苷、氟唑环菌胺、TCMTB、戊唑醇、噻苯咪唑、噻苯哒唑、硫威、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉属、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。PCNB种皮是指包含喹硫磷和氯唑灵的EPA注册号00293500419。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。

可以测试产生具有特定性状(例如灰叶斑病抗性)的植物的种子以确定哪些种子处理方案和施用率可以补充这些植物以增加产量。例如，具有良好产量潜力但丝黑穗病易感性的植物可以受益于使用提供针对丝黑穗病的保护的种子处理，具有良好产量潜力但胞囊线虫易感性的植物可以受益于使用提供针对胞囊线虫的保护的种子处理等。此外，当与种子处理组合时，正确使用种子处理所产生的良好根系建立和早期出苗可能导致更有效的氮利用，更好的抗干旱能力以及包含某种性状的一种或多种植物的产量潜力的总体增加。

实例

提供下列实例以说明但不限制所要求保护的主题。应当理解，本文所述实例和实施例仅用于说明目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。

实例1

针对灰叶斑病的QTL的作图和验证

在QTL作图研究中，发现在基于单个减数分裂的遗传图谱上，4号染色体上100-115cM处的玉蜀黍基因组区域与灰叶斑病相关联。为进一步研究QTL区域，将灰叶敏感的专有近交系(本文中被称为“近交系B”)与抗性专有近交系(本文中被称为“近交系A”)杂交以产生约1600株植物的BC₄F₂群体。种子在最后一次回交自交后混合，然后种植。用玉米灰斑病菌接种植物，感染的玉蜀黍种子作为载体。通过将5-10个侵染的种子在V5-6落入的叶轮中并且再次在V8生长阶段进行来完成接种。疾病评分是通过对植物在1-9标度上评分进行的，其中1为最差，9为最佳。使用具有已知疾病响应的检查图作为针对最佳评分时间和评级校准的指南。评分进行了两次。还通过注意每个植物的50％显示花丝的日期并基于该位置的天气数据将其转换为生长度的热单位得分(GDUSLK)来获取开花数据。

在该场所的1633株植物中，其中1607株在4号染色体区域的5个标记上进行了基因分型；三个标记是PHM6764-7(基于单次减数分裂的遗传图谱上94.78cM)、PHM16360-9(104.12cM)、PHM521-8(108.38cM)、PHM586-10(111.72cM)和PHM289-20(113.94cM)。在具有一个或两个拷贝的供体亲本等位基因的植物和没有供体亲本等位基因拷贝的植物之间观察到差异(表1)。在1-9标度上，供体亲本等位基因的两个拷贝显示0.62分的差异，并且其中一个拷贝显示的差异为0.79(表2)。没有供体亲本等位基因拷贝的植物具有的平均得分为4.64(表2)。所述分类之间在开花时间方面没有差异。

表1：在标记PHM6764-7、PHM16360-9、PHM521-8、PHM586-10和PHM289-20处的亲本基因型

表2：QTL区域中每个基因型分类的灰叶斑病得分

实例2

QTL的进一步精确

使用相同的方法评估来自另外3个轮回亲本(PH18F6(参见US 8,766,059)、PH18G5(参见US 8,304,633)和第三专有近交系(本文中被称为“近交系C”))的BC₂个体植物以确定供体亲本(“近交A”)在不同背景下的效果。在所有群体中在108cM-114cM(对于IBM2图谱为299cM-331cM)区域中使用另外的标记。使用的标记和每个轮回亲本和供体的基因型示出在表3中。这些标记中的一些对于一些供体/轮回亲本组合是单型的。该测试再次显示了具有一个供体亲本等位基因拷贝的植物与具有两个轮回亲本等位基因拷贝的植物之间的差异(表4)。在标度1-9上，差异在从1.5分至2.5分的范围内。易感的轮回亲本具有从3.7至4.3范围的得分。

表4：QTL区域中每个基因型分类的灰叶斑病得分

近交系C＜[近交系A]	GLFSPT	得分差异	GDUSLK	计数
					区域内的RP等位基因	4.1		141.1	49
区域内的Het	6.6	2.5	139.8	17
					PH18F6＜[近交系A]
区域内的RP等位基因	3.7		138.7	45
					区域内的Het	5.9	2.2	139.1	39
PH18G5＜[近交系A]
					区域内的RP等位基因	4.3		141.4	64
区域内的Het	5.8	1.5	141.9	22

RP＝轮回亲本

Het＝杂合子

进行了对PHM586-10周围区域的进一步分析，因为它接近专利申请US 2009172845中鉴定的QTL。近交系A和PHJEP(在专利申请US 2009172845中)在111.72cM在PHM1963-15处具有不同多态性(内部图谱，IBM2图谱上的304.3cM)。此外，峰标记附近的进一步标记分析(表5)显示近交系A和PHJEP在该区域是不同的，表明近交系A是新的抗性来源。

表5：峰标记附近的标记分析

表6：当前作图区间中的标记单倍型与每个单倍型和重组体的GLS得分。

Claims (13)

1.一种鉴定和/或选择具有增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：

a.筛选具有位于4号染色体上的包含并侧接PHM6764-7和PHM289-1的区间内的标记的群体，以确定来自该群体的一个或多个玉蜀黍植物是否包含QTL等位基因，该QTL等位基因包含在PHM1963-15处的“C”以及由以下组成的组中的成员：

i.在PHM521-8处的“T”；

ii.在PHM12024-9处的“G”；

iii.在PHM199-23处的“T”；

iv.在PHMGLS_01处的“T”；

v.在PHMGLS_07处的“C”；

vi.在PHMGLS_14处的“G”；

vii.在PHMGLS_19处的“C”；

viii.在PHMGLS_21处的“C”；

ix.在PHMGLS_45处的“C”；

x.在PHMC001YAR处的“A”；

xi.在PHM5013-12处的“C”；

xii.在PHM586-10处的“T”；

xiii.在PHM15534-13处的“A”；

xiv.在PHM18451-2处的“G”；和

xv.在PHM289-20处的“C”；以及

b.从所述群体中选择包含所述QTL等位基因的至少一个玉蜀黍植物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述标记位于4号染色体上的包含并侧接PHM521-8和PHM18451-2的区间内。

3.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：

c.将(b)的玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；以及

d.获得具有所述QTL等位基因的后代植物。

4.如权利要求1或3所述的方法，其中与增加的灰叶斑病抗性相关联的所述QTL等位基因包含：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”。

5.一种鉴定和/或选择展示出增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：

a.在玉蜀黍植物中检测标记基因座的等位基因，其中所述标记基因座位于4号染色体上的包含并侧接PHM6764-7和PHM289-1的染色体区间内，并且所述等位基因与包含以下的单倍型相关联：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”；以及

b.选择具有所述与单倍型相关联的标记基因座的等位基因的玉蜀黍植物，该单倍型包含：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述标记基因座位于4号染色体上的包含并侧接PHM521-8和PHM18451-2的染色体区间内。

7.如权利要求5所述的方法，所述方法进一步包括：

c.将(b)的玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；以及

d.获得具有所述与单倍型相关联的等位基因的后代植物，该单倍型包含：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；以及在PHM289-20处的“C”。

8.一种鉴定和/或选择展示出增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：

a.在玉蜀黍植物中检测QTL等位基因，该QTL等位基因包含在PHM1963-15处的“C”以及以下项中的一种或多种：

i.在PHM521-8处的“T”；

ii.在PHM12024-9处的“G”；

iii.在PHM199-23处的“T”；

iv.在PHMGLS_01处的“T”；

v.在PHMGLS_07处的“C”；

vi.在PHMGLS_14处的“G”；

vii.在PHMGLS_19处的“C”；

viii.在PHMGLS_21处的“C”；

ix.在PHMGLS_45处的“C”；

x.在PHMC001YAR处的“A”；

xi.在PHM5013-12处的“C”；

xii.在PHM586-10处的“T”；

xiii.在PHM15534-13处的“A”；

xiv.在PHM18451-2处的“G”；和

xv.在PHM289-20处的“C”；

其中所述QTL等位基因位于4号染色体上由PHM6764-7和PHM289-1限定并包括PHM6764-7和PHM289-1的区间中；以及

b.选择具有所述QTL等位基因的所述玉蜀黍植物。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述QTL等位基因位于4号染色体上由PHM521-8和PHM18451-2限定并包括PHM521-8和PHM18451-2的区间中。

10.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包括：

c.将(c)的玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；以及

d.获得具有所述QTL等位基因的后代植物。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述QTL等位基因包含：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”。

12.一种鉴定和/或选择展示出增加的灰叶斑病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：

a.在玉蜀黍植物中检测：PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”；以及

b.选择所述玉蜀黍植物，其具有：在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”，其中所述玉蜀黍植物具有增加的灰叶斑病抗性。

13.如权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括：

c.将(c)的玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；

d.获得后代植物，该后代植物具有在PHM521-8处的“T”；在PHM12024-9处的“G”；在PHM199-23处的“T”；在PHMGLS_01处的“T”；在PHMGLS_07处的“C”；在PHMGLS_14处的“G”；在PHMGLS_19处的“C”；在PHMGLS_21处的“C”；在PHMGLS_45处的“C”；在PHMC001YAR处的“A”；在PHM5013-12处的“C”；在PHM586-10处的“T”；在PHM1963-15处的“C”；在PHM15534-13处的“A”；在PHM18451-2处的“G”；和在PHM289-20处的“C”。