CN109666684A - 一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统及其应用。本发明综合利用生物化学、分子生物学和细胞生物学等手段，从多种不同细菌中筛选鉴定了一种新的、具有核酸内切酶活性的LiCas12a蛋白。以LiCas12a为基础分别在真核细胞和原核细胞中建立了一套高编辑效率且高特异性的CRISPR/LiCas12a基因编辑系统，实现了基因的敲除、插入和点突变等遗传操作；并揭示了TERT基因启动子的突变促进膀胱癌和肝癌细胞增殖的分子机制。本发明建立了一种以CRISPR‑LiCas12a为基础的基因编辑系统，为疾病发病机理和代谢工程改造等研究领域提供了更精确和高效的基因组编辑方法。

Description

一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及基因编辑系统，特别涉及一种全新的高特异性CRISPR/Cas12a系统。

背景技术

第一代基因编辑技术就是同源重组建立动物基因敲除，基因敲入的基因突变模型。基因敲除和基因敲入是通过DNA同源重组技术来完成的。这是一个非常复杂的技术，一般用于建立遗传疾病的动物模型，很难用于临床或农业畜牧业。第二代基因编辑技术是锌指核酸酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术。这两个技术的原理都是通过DNA核酸结合蛋白和核酸内切酶结合在一起建立的基因编辑系统。因为这些蛋白可以识别特定的核苷酸序列，该系统可以对特定的基因进行基因敲除和基因突变。

第三代基因编辑技术是CRISPR-Cas系统。CRISPR(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌的基因组，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务。细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统。利用该系统，细菌可以将病毒基因组特异的切除破坏。CRISPR-Cas系统有两大类型：Ⅰ类和Ⅱ类。其中，Ⅰ类需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ类CRISPR-Cas系统只需要一个Cas蛋白来切割DNA双链。正因为Ⅱ类CRISPR-Cas系统的这个特点，其被改造后，广泛应用于原核和真核细胞的基因组编辑。

已有的原核细胞基因组编辑方法周期长，同源重组效率低，且受到抗性标记及同源臂的限制，并不能很好的满足基因组编辑的需要；而基于人工内切酶ZEN和TALAN的真核基因的编辑方法，则需要构建庞大而复杂的文库，过程耗时耗力且效率不高，并不能对任意基因进行遗传操作。与传统的基因组编辑方法相比，CRISPR-Cas作为新一代的基因组编辑技术，具有以下优势：一、更多的可编辑位点。理论上，在基因组中每8bp就有一个适合CRISPR-Cas编辑的位点；而对于ZFN和TALEN，在基因组中平均500bp和125bp才分别会有一个合适的编辑位点。二、同时编辑多个位点。原核生物中，依赖于ssDNA，由λ-Red介导的基因修饰方法MAGE(multiplex automated genome engineering)可以做到多基因编辑，但其仅在等位基因交换中有一定优势，插入超过一定长度(>1kb)的DNA片段就很困难。CRISPR-Cas技术一次操作可同时获得含3个突变位点的大肠杆菌或哺乳动物细胞，这对于ZFN和TALEN两项技术而言是难以实现的。三、载体构建更简单。在CRISPR-Cas系统中，想要改变靶序列识别位点只需改变一段短的RNA序列即可，一周内可完成多轮编辑过程。而ZFN和TALEN则需要根据不同的识别序列组装和构建十分复杂的蛋白识别域。所以，CRISPR-Cas因其操作简单、实验周期短和成本低等优势，在不同物种中得到广泛应用。

但CRISPR/Cas9也存在不足：1、脱靶效应(off-target effect)：Cas9对靶序列的识别主要是依靠一段20bp的短RNA，当存在单个甚至多达5个碱基错配时，切割仍能正常发生，造成脱靶效应；2、PAM的识别限制：如果靶序列3’端没有PAM序列(3’-NGG-5’)，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点；3、Cas9蛋白对一些物种有着明显的细胞毒性，这些直接影响CRISPR/Cas9系统的编辑效率和适用范围。4、不适合用于DNA的点突变：由于CRISPR/Cas9具有较高的脱靶效应，即使DNA突变形成，但Cas9依然可以切割靶序列，易造成DNA的不稳定和突变丢失。因此，改良现有CRISPR/Cas9系统，鉴定和开发新的CRISPR系统，是基因组编辑领域亟需开展的研究工作。

CRISPR/Cas12a同样属于Ⅱ类CRISPR/Cas系统，与酿脓链球菌Streptococcuspyogenes Cas9(SpCas9)一样，Cas12a也具有核酸内切酶活性。目前已经在人、小鼠、水稻与烟草和蓝藻中实现了基因组编辑。除具有与Cas9相同的优势之外，Cas12a具有如下特点：1、切割效率高，脱靶效应低：Cas12a由单一的crRNA引导，对DNA切割的效率更高、更精确，因此更适用于基因组编辑，尤其是DNA的点突变，而Cas9需要crRNA和tracrRNA两个分子，对DNA切割的效率较低；2、识别富含T的PAM序列：Cas12a识别富含T的PAM序列(3’-TTN-5’)，而Cas9偏好富含G的PAM序列(3’-NGG-5’)，与Cas9不同的PAM位点偏好性大大扩展了CRISPR系统可以操作的基因范围；3、构建简单，转化效率高：Cas12a(3687bp)分子量较小，更容易构建载体，也更易于被转入细胞内；4、切割方式：Cas12a切割双链DNA产生交错的末端，而Cas9切割双链DNA产生平末端。切口偏移留下的短悬端(overhang)有助于目的片段的精切插入。目前，仅有Francisella novicida Cas12a(FnCas12a)、Acidaminococcus sp.BV3L6Cas12a(AsCas12a)与Lachnospiraceae bacterium ND2006Cas12a(LbCas12a)三种Cas12a蛋白被报道具有核酸内切酶功能和基因组编辑的能力，并不能满足对不同物种、不同目的基因进行基因组编辑的需求。鉴定新的Cas12a蛋白，建立不同的CRIPSPR/Cas12a系统有助于CRISPR基因组编辑系统的完善。

发明内容

针对传统同源重组系统重组频率低，成本高，在操作过程中周期长、工作量大，以及Cas9存在脱靶效应、对PAM的识别限制，不适合用于点突变等问题，本发明对CRISPR/Cas12a系统进行了优化，发明了一种高效、特异的遗传操作方法，并将其应用于哺乳动物细胞和大肠杆菌的基因组编辑，为基因的功能研究和代谢工程改造提供了有力工具。

本发明首先提供了一种用于CRISPR/Cas12a系统优化的LiCas12a基因，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

本发明提供了用于构建单质粒或双质粒CRISPR/LiCas12a系统的重组载体，为携带上述筛选的LiCas12a基因的重组载体phCas或pCas。所述LiCas12a基因为编码LiCas12a蛋白的基因。

上述重组载体phCas运用于哺乳动物细胞，且所述重组载体是在pCas载体上插入了CMV启动子驱动表达的所述筛选的LiCas12a基因，同时包含U6启动子驱动表达的crRNA+N23序列，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示。

所述的载体pCas运用于大肠杆菌，所述重组载体是在pTarget载体上插入了pJ23119启动子驱动表达的crRNA+N22序列，其序列如序列表中SEQ ID No:3所示

本发明进而构建了一种携带重组载体phCas和pcrRNA的单质粒CRISPR/LiCas12a系统，和携带重组载体pCas和pcrRNA的双质粒CRISPR/LiCas12a系统。

上述的单质粒和双质粒CRISPR/LiCas12a系统，和全新的高特异性CRISPR/LiCas12a系统，其特征在于，所述靶序列连入位点是包含两个或更多个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点。

进一步的，上述的单质粒和双质粒CRISPR/LiCas12a系统，其特征在于，所述pCas质粒上含有选择标记基因，并包含温度敏感性复制子repA101ts。

本发明构建了一种全新的高特异性CRISPR/LiCas12a基因编辑系统，包括权利上述的携带筛选的LiCas12a基因的重组载体。

利用本发明的全新的高特异性CRISPR/LiCas12a系统，可以在哺乳动物细胞中进行CRISPR/LiCas12a介导的基因编辑，具体包括基因的敲除和点突变等遗传操作。上述应用靶序列是单链DNA或线性双链DNA。

利用本发明的全新的高特异性CRISPR/LiCas12a系统，可以在大肠杆菌中进行CRISPR/LiCas12a辅助的同源重组操作实现基因编辑，具体包括基因的敲除、插入和点突变等遗传操作。

将本发明构建的CRISPR/LiCas12a辅助的同源重组系统应用于哺乳动物细胞和大肠杆菌中，无论是CRISPR/LiCas12a辅助单链DNA寡核苷酸同源重组，还是CRISPR/Cas12a辅助双链DNA片段同源重组，都能实现所需突变。实验结果证明该系统能够在大肠杆菌和哺乳动物中正常工作并显示高特异性且不能检测到脱靶效应。

附图说明

图1.Cas12a蛋白同源物的系统发育树。

图2.LiCas12a体外功能验证。

图3.LiCas12a介导的293T细胞的DNMT1基因敲除。

图4.Western Blot检测293T细胞的DNMT1蛋白。

图5. 293T细胞中LiCas12a和SpCas9的脱靶效应检测。

图6.LiCas12a介导的肿瘤细胞的TERT基因启动子突变

图7.T24和Huh7细胞中TERT基因启动子突变调控肿瘤细胞中TERT基因的表达和细胞增殖。

图8.pLiCas12a和pcrRNA的双质粒系统。

图9.cadA，meaA，meaB和lacZ缺失的PCR分析；LiCas12a编辑克隆中的cadA，meaA，meaB和lacZ的代表性Sanger测序。

图10.在大肠杆菌中由LiCas12a和SpCas9介导的预测的lacZ脱靶位点的Sanger测序。

图11.gfpmut3a插入的PCR分析；EC3004中gfpmut3a表达的流式细胞术分析。

图12.在含有链霉素的LB琼脂上筛选突变菌株；通过测试链霉素抗性和DNA测序验证突变菌株EC3013。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

人细胞系293T(CRL-3216)和膀胱癌细胞系T24(HTB-4)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，MA，USA)。HCC细胞系Huh7(JCRB JCRB0403)来自Health Science ResearchResources Bank(HSRRB，Osaka，Japan)。FBS、青霉素、DMEM培养基、链霉素来自ThermoFisher Scientific(MA，USA)。分离质粒和基因组DNA的方案来自制造商Qiagen(中国北京)。PCR使用的Taq DNA聚合酶来自Thermo Fisher Scientific(MA，USA)，Q5High-Fidelity DNAPolymerase来自New England Biolabs(MA，USA)。限制性内切核酸酶和T4DNA连接酶购自Takara。NEBuilder来自New England Biolabs(MA，USA)。质粒pCas9为Addgene公司产品，产品目录号为#62225。用于生化反应的所有crRNA和sgRNA由HiScribe T7HighYield RNASynthesis Kit(New England Biolabs，MA，USA)合成。对应于靶RNA序列的反向互补序列的ssDNA寡核苷酸由Invitrogen(中国上海)合成。MEGAclear TranscriptionClean-Up Kit来自Ambion(MA，USA)。裂解缓冲液来自Cutsmart(New England Biolabs，MA，USA)。PCR纯化柱来自Qiagen(Beijing，China)。FACSCalibur流式细胞仪来自BD(New York，USA)。RNA分离试剂盒为Qiagen产品(Beijing，China)。M-MLV逆转录酶来自Promega(Madison，Wisconsin，USA)。ABI 7300分析仪来自Applied Biosystems(MA，USA)。SYBRGreen来自Qiagen(Beijing，China)。TERT抗体(C-12)为Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品号为sc-377511。DNMT1抗体(D63A6)为Cell Signaling Technology公司产品，产品号为#5032。Pierce TM ECL Western Blotting Substrate来自Thermo FisherScientific公司(MA，USA)。细胞计数试剂盒-8(CCK-)来自Dojindo(Kumamoto，Japan)。平板读数器(Multiskan GO Microplate Spectrophotometer)来自Thermo Fisher Scientific(MA，USA)。

实施例一

从Uniprot收集40个Cas12a蛋白质序列，构建系统发育树进行分析，其中LiCas12a被证明具有双链DNA的切割活性。具体方法如下：

为了找到用于基因组编辑的新功能性Cas12a，我们从Uniprot(https://www.uniprot.org)收集了40个Cas12a蛋白质序列，并通过系统发育树将这些序列与AsCas12a，FnCas12a和LbCas12a一起分析(图1)。考虑到Cas12a蛋白的不同进化起源和长度，来自Arcobacter butzleri L348，Eubacterium eligens，Francisella philomiragiasubsp的5种Cas12a蛋白。选择philomiragia，Helcococcus kunzii和Leptospira inadaiserovar Lyme作为候选者。在这五个候选物中，LiCas12a证明具有DNA裂解活性。

首先将LiCas12a克隆到pGEX-6p-1载体中。使用来自大肠杆菌BL21的Ni亲和层析表达并纯化蛋白质LiCas12a。将由合成启动子pJ23119引导的crRNA和N22组装成pTargetF以构建pcrRNA。使用Cas-Designer设计了靶向pMB1复制起点的5种crRNA。通过HiScribe^TMT7高产量RNA合成试剂盒在体外转录crRNA和N22。

为了测试大肠杆菌表达的LiCas12a是否可以在体外37℃切割靶DNA，进行质粒和PCR产物的切割测定。LiCas12a可在体外存在crRNA时使质粒pcrRNA线性化。当在体外提供crRNA时，LiCas12a还可以切割含有pMB1区域的PCR产物。因此，LiCas12a可以用crRNA指导在37℃有效切割双链DNA靶(图2)。

实施例二

为了验证LiCas12a在哺乳动物细胞中的活性，即是否具有剪切DNA的功能，我们通过以下实验进行验证。

首先将筛选出的LiCas12a基因(序列见序列表中SEQ ID No:1)克隆到具有crRNA和N23的质粒pLiCas12a中选择DNMT1基因作为敲除靶点(序列见序列表中SEQ ID No:4)。将构建的靶向DNMT1的LiCas12a质粒转染到293T细胞中，而后分选出GFP阳性细胞单克隆培养，提取单克隆细胞的基因组DNA并用作模板以扩增DNMT1，测序验证。

在10个单克隆细胞系中，9个单克隆细胞系中的DNMT1基因被成功破坏(90％)。图3显示了代表性的测序结果。在蛋白质印迹分析中，与野生型细胞(WT)相比，DNMT1缺失细胞(Mut)中DNMT1的表达被完全破坏(图4)。通过网站预测LiCas2a潜在的脱靶位点，选择了13个位于不同染色体的预测位点进行检测，均没有检测到明显的脱靶效应(图5)。以上结果表明LiCas12a可以有效地敲除哺乳动物细胞中的基因而没有脱靶效应。

实施例三

CRISPR-LiCas12a系统介导的哺乳动物细胞中的点突变和回复突变。

编码端粒酶逆转录酶的TERT是端粒酶的组分，端粒酶是通过添加端粒重复TTAGGG21维持端粒末端的核糖核蛋白聚合酶。TERT启动子经常在许多肿瘤类型中改变，例如黑素瘤，肝细胞癌，神经胶质瘤，尿路上皮癌和肾细胞癌。TERT启动子中chr5,1,295,228C>T和1,295,250 C>T的突变是最主要的突变。我们测试了膀胱癌和肝细胞癌细胞系中TERT的基因组状态，选择T24和Huh7作为编辑靶标。

针对TERT基因的启动子区设计了两个独立的crRNA(序列见序列表中SEQ ID No:5)。选择膀胱癌细胞系T24(chr 5:1295228T)和肝细胞癌细胞系Huh7(chr 5:1295228C)作为编辑对象。将构建的靶向TERT启动子区的pLiCas12s质粒和DNA修复模板共转染到T24和Huh7中，并通过流式细胞术分选出GFP阳性单克隆细胞。PCR测序结果显示，TERT启动子在T24细胞中成功地校正到228C并在Huh7细胞中突变成228T(图6)。当TERT启动子C228T突变后，TERT mRNA和蛋白的表达量都增加，促进了肿瘤细胞的增殖(图7)。

因此，LiCas12a可应用于肿瘤细胞的点突变和回复突变，为基因治疗提供了的有力工具。

实施例四

接下来将验证CRISPR/LiCas12a是否能够对大肠杆菌进行基因编辑，该系统将LiCas12a和crRNA作用元件分别构建到两个质粒上进行。即pLiCas12a和pcrRNA的CRISPR-LiCas12a系统。质粒pCas中，利用来自酿脓性链球菌(PspCas9)Cas9的启动子驱动LiCas12a的表达，构建成pLiCas12a。质粒pcrRNA中，插入了pJ23119启动子驱动表达的crRNA+N22序列，靶向目的基因组的靶位点。(图8)。

选择4个基因cadA，lacZ，meaA和meaB进行敲除，分别为每个基因设计两个独立的crRNA(序列见序列表中SEQ ID No:6)，分别构建pcrRNA质粒。首先，将pLiCas12a电转至大肠杆菌W3110，制备W3110-pLiCas12a感受态细胞(制备方法如下)。然后电转入pcrRNA质粒，传代培养和鉴定。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备方法：

第一天：

1.将菌株置于LB培养基上，在37℃下过夜培养，

2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用，

3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。

第二天

4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升摇瓶，

5. 37℃下剧烈振荡培养2-6小时

6.定时监控OD600值(培养1小时后每半小时测定一次)，

7.当OD600值达到0.4-0.6时，从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)，

8.细胞在4℃5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4℃的10％甘油中保存一两天)，

9.用灭菌的冰水重悬浮细胞.先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积，

10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液，

11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞，

12.离心，弃上清液，

13.用20ml灭菌的、冰冷后的10％甘油重悬浮细胞，

14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)，

15.用10％甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml，

16.将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80℃保存。

cadA，lacZ，meaA和meaB 4个基因在W3110中在三个独立实验中被成功删除，编辑效率高达94.45～100％(图9)。

在预测的脱靶位点中，未检测到由LiCas12a介导的脱靶DNA双链断裂DSB(0/1,0.0％)(图10)。

实验同时利用SpCas9对大肠杆菌中cadA，lacZ，meaA和meaB 4个基因进行了敲除实验，平均的敲除效率是38.89～52.78％。在预测的6个脱靶位点中，检测到SpCas9介导的一个明显的脱靶DNA双链断裂(DSBs)(1/6,16.7％)。因此，在大肠杆菌中，LiCas12a是一个更高效、更特异的基因编辑工具。

实施例五

设计以下实验验证CRISPR-LiCas12a系统在大肠杆菌中进行基因插入的可行性。

选择W3110基因组中假基因ECK0694位点用于gfpmut3a的插入，并设计两个独立的crRNA(序列见序列表中SEQ ID No:7)。将含有目标位置ECK0694上下游同源臂的gfpmut3a基因序列，插入crRNA下游，构建pcrRNA质粒，并电转入W3110-pLiCas12a感受态细胞。

通过传代和鉴定，gfpmut3a基因通过CRISPR-LiCas12a系统被成功插入W3110-ECK0694位点，效率高达52.78％。利用类似的方法，同时检测了SpCas9在大肠杆菌中介导gfpmut3a基因插入的编辑效率，其为22.78％。由此可见，CRISPR-LiCas12a系统介导的大肠杆菌基因插入的效率显著高于CRISPR-SpCas9系统(图11)。

实施例六

为了评估使用CRISPR-LiCas12a系统进行精确点突变的可行性，将单碱基突变(A128C)引入编码小亚基核糖体蛋白S12的rpsL基因中，该基因点突变赋予大肠杆菌链霉素抗性。针对rpsL基因，设计两个独立的crRNA，将含有目标位置rpsL上下游同源臂的点突变基因序列，插入crRNA下游，分别构建pcrRNA质粒，并电转入W3110-pLiCas12a感受态细胞。

在W3110中，通过CRISPR-LiCas12a系统将rpsL基因突变为rpsL^A128C(序列见序列表中SEQ ID No:8)，编辑效率为67.93％(图12)。然而，通过CRISPR-SpCas9系统，W3110中A128C点突变的效率为40.39％，显着低于LiCas12a。因此，LiCas12a在大肠杆菌的基因缺失，插入和点突变中表现出比SpCas9显着更高的基因组编辑效率。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统及其应用

<141> 2018-12-25

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 3792

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

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attccctttt cgaatgggca agatctgaaa cctgaaatat tgaggaagaa tgatgcagta 3480

ttttttaaaa gcctattgtt ttatataaaa accactcttt ctcttaggca gaataatgga 3540

aaaaaggggg aggaggaaaa agattttata ctctctccag tagtggattc caaaggacgg 3600

ttttttaact ctttggaagc aagtgacgat gagccgaaag atgctgatgc caacggtgct 3660

tatcatatcg ctctgaaggg tcttatgaac cttctggttc tgaacgaaac taaagaagaa 3720

aatctgagta ggccgaaatg gaaaatcaaa aacaaagatt ggctggagtt tgtgtgggaa 3780

agaaatcggt aa 3792

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

taatttctac taagtgtaga t 21

<210> 3

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<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

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<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

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<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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tttgaggcag cgctgcgtcc tgctgcg 27

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<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

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<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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tttccggcgc gggtgccgca gcaatc 26

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<212> DNA

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tttattcgct gtaaaaggaa accagg 26

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<212> DNA

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<212> DNA

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tttacgcagc gcggagttcg gtttt 25

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<212> DNA

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tttcgaagtg acttcctaca tcggtg 26

Claims (9)

1.一种用于CRISPR/Cas12a系统优化的LiCas12a基因，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

2.用于构建单质粒或双质粒CRISPR/LiCas12a系统的重组载体，为携带权利1要求所述筛选的LiCas12a基因的重组载体phCas或pCas，所述LiCas12a基因为编码LiCas12a蛋白的基因。

3.一种CRISPR/LiCas12a基因编辑系统，包括权利要求1所述的基因或权利要求2所述的重组载体，且在基因组水平不能检测到脱靶效应。

4.载体phCas，包含U6启动子驱动表达的crRNA序列，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示；载体pCas，包含了pJ23119启动子驱动表达的crRNA序列，其序列如序列表中SEQ ID No:3所示。

5.单质粒或双质粒CRISPR/LiCas12a系统，单质粒系统包括权利要求2或4所述的携带筛选的LiCas12a基因的重组载体phCas；双质粒系统包括权利要求2或4所述的携带筛选的LiCas12a基因的重组载体pCas和pcrRNA质粒。

6.如权利要求5所述的单质粒或双质粒CRISPR/LiCas12a系统，或权利要求3所述的一种CRISPR/LiCas12a基因编辑系统，靶序列连入位点是包含两个或更多个限制性内切酶位点的多克隆位点，同时所述phCas和pCas质粒上含有选择标记基因，并且pCas包含温度敏感性复制子repA101ts。

7.一种CRISPR/LiCas12a基因编辑系统，包括如权利要求5或6所述的单质粒或双质粒CRISPR/LiCas12a系统，在哺乳动物细胞和大肠杆菌基因编辑中的应用。

8.如权利要求7所述的单质粒CRISPR/LiCas12a系统在哺乳动物细胞中的应用，其特征在于，通过在哺乳动物细胞中进行CRISPR/Cas12a介导的基因编辑，具体包括基因的敲除和点突变遗传操作，其中点突变所使用的模板序列是单链DNA或双链DNA。

9.如权利要求7所述的双质粒CRISPR/LiCas12a系统在大肠杆菌基因编辑中的应用，其特征在于，通过在大肠杆菌中进行CRISPR/LiCas12a辅助的同源重组操作实现基因编辑，具体包括基因的敲除、插入和点突变遗传操作，所使用的模板序列是单链DNA或双链DNA。