CN109633140A - 一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法。对全氟化合物急性暴露后转基因斑马鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量(显微观察)、野生型斑马鱼仔鱼的运动行为、神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、3,4‑二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺)、神经发育相关基因(chrna7，ache，mbp，a1‑tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b)及蛋白表达水平进行测定。将转基因斑马鱼与野生斑马鱼相结合，阐述上述指标和神经发育毒性的联系，能够全面、准确的评价全氟化合物的神经发育毒性水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，属于毒理学检测技术领域。
背景技术
全氟化合物(perfluorinated compounds，PFCs)是一类新型有机污染物，主要包括全氟羧酸(perfluorocarboxylic acids，PFCAs)、全氟磺酸(Perfluorinated sulfonicacids，PFSAs)等。自20世纪50年代被3M公司研制以来，凭借其显著的疏水、疏油性以及较好的表面活性和稳定性而被广泛应用(Ahrens，2011)。然而，大量含PFCs商品的研发、生产、使用和处置，使得PFCs通过多种途径迁移至环境介质及生物体内，对生态环境及人类健康构成威胁。毒理学研究证实，PFCs具有肝脏毒性、心血管毒性、甲状腺毒性、神经系统毒性、免疫系统毒性及潜在致癌性等。因此，PFCs的环境污染问题成为环境科学领域中的一个研究热点。
斑马鱼是一种新颖的模式生物，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长3～4cm，一次交配能获得100～200个胚胎，每周产卵一次，这样中等规模的鱼缸每年就能养殖成鱼数百万只，成本仅为养小鼠的0.1％-1％。斑马鱼基因组序列与人类基因组高度相似，包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，使其作为一种理想的脊椎模式生物，在发育生物学、化合物毒性评价和人类疾病模型研究等领域迅速得到广泛应用。
中国发明专利CN108251508A，提出了一种利用M1受体的相对表达来评估水中污染物(溴氰菊酯毒性)对人类健康的潜在危害的方法。但由于M1受体只是毒蕈碱型乙酰胆碱受体的一个亚型，分布范围较窄，缺乏广泛的适用性。
胡芹的论文《全氟辛烷磺酸(PFOS)对斑马鱼胚胎发育及成鱼的毒性效应研究》从斑马鱼胚胎的死亡率、孵化率、心率、畸形率来判断全氟化物对斑马鱼胚胎的毒性，但是该方法未考虑到斑马鱼幼鱼本身发育的个体差异问题，以及主观对畸形判断的偏差问题，导致实验结果的误差较大。
本发明对全氟化合物急性暴露后，转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量(显微观察)、野生型斑马鱼仔鱼运动行为、神经递质(乙酰胆碱、多巴胺3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺)、神经发育相关基因(chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b)及蛋白表达水平进行测定。将转基因斑马鱼与野生斑马鱼相结合，阐述上述指标和神经发育毒性的联系，能够全面、准确的评价全氟化合物的神经发育毒性水平。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种操作简单、快速、准确度高、适用广泛的利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，包括如下步骤：
1)采用色谱纯的DMSO作为溶剂将PFHxA(全氟己烷羧酸)配制成浓度为30mg/mL的高浓度化合物储备液，于4℃避光保存；
2)将预先配置的高浓度储备液经胚胎培养液梯度稀释获得浓度分别为0.48mg/L，2.4mg/L和12mg/L的培养液，溶液即配即用，各浓度培养液中助溶剂DMSO的浓度控制在≤0.1％(v/v)；
3)将步骤2)中同一浓度的培养液注入6个10cm平行培养皿中，将储备液浓度为0mg/L的培养液也注入6个10cm平行培养皿中，每皿的工作液体积为50mL；
4)选发育良好的、由斑马鱼成鱼自然交配产生的斑马鱼胚胎(2hpf)进行暴露实验，每个培养皿中放入200枚胚胎；
5)将培养皿置于28±1℃培养箱中培养，光照/黑暗周期控制为14h/10h，暴露期间及时清除残渣或死亡个体，每隔24h将1/2体积培养液更换为新鲜配置的同等浓度溶液，暴露时长为120h；
在暴露实验结束后，进行如下步骤：
6)测定全氟化合物急性暴露后，转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量(显微观察)、野生型斑马鱼仔鱼的运动行为、神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺)、神经发育相关基因(chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b)表达水平以及蛋白表达水平的相关数据并分析。
优选的，所述转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量的采集是通过荧光显微镜采集转基因斑马鱼仔鱼的2D图像；通过ImageJ软件计算绿色荧光蛋白的发光面积。
优选的，所述的乙酰胆碱、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺的样品采集与检测方法为：每个平行随机收集100尾幼鱼，每组3个平行，每个样品加入1ng的DHB作为内标。样品称量后加入400μL含1％甲酸的预冷乙腈中匀浆，样品于-20℃孵育15min后，4℃12000rpm离心20min。上清冷冻干燥后在50μL 50％乙腈/水(v/v)重新震荡溶解。样品再次在4℃12000rpm离心20min，收集上清液，用Agilent 1200三重串联四极杆液/质联用仪(LC/MS,USA)检测。样品中乙酰胆碱酯酶活性的样品采集与检测方法为：每个平行随机收集100尾幼鱼，每组3个平行，加入预冷的0.9％生理盐水在冰上进行匀浆(g/ml＝1:4)，匀浆的样品经3,500rpm(4℃)离心10min，收集上清液，样品中乙酰胆碱酯酶活性采用相应的试剂盒(本实验使用南京凯基公司的AChE酶活性试剂盒)进行检测；根据布拉德福德法，选牛血清白蛋白作为标准，测定样品中的蛋白含量。
优选的，所述的神经发育相关基因(chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b)表达水平的采集方法为：每组设置6个平行，每个平行收集30尾幼鱼，加入400μLTRIzol试剂；经过总RNA的离析、纯化及浓度测定、cDNA的合成、RT-PCR后，采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平变化。
优选的，所述RNA的提取及浓度检测包括以下步骤：
1)实验前将所需EP管等实验物品均用0.1％的DEPC水浸泡，并进行灭菌处理；
2)每组平行收集30尾斑马鱼放入1.5mL EP管中，用PBS清洗2次，随后加入400μL的Trizol，置于冰上匀浆，匀浆液转入新的1.5mL EP管中，室温静置5-10min；
3)转移至4℃离心机，12000rpm离心5min，上清移到新的1.5mL EP管中；
4)加入80μL的氯仿，剧烈震荡15s，静置5min，转移至4℃离心机，12000rpm离心20min；
5)吸取60μL上清液至新的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，上下反复颠倒混匀，室温静置10min后，12000rpm、4℃离心10min；
6)倒掉上清液，沿管壁缓慢加入200μLDEPC水配制的75％酒精的清洗一次，转移到4℃离心机，12000rpm离心5min，重复操作两次；
7)倒尽酒精，将EP管倒置，室温干燥5min，然后加入20μLDEPC水溶解，用移液枪反复吹打，直至混匀；
8)吸取1μL样品进行RNA含量测定用蛋白核酸测定仪测定样品中总RNA浓度，并记录260nm和280nm处的吸光值。
优选的，所述cDNA的制备包括以下步骤：
1)选择OD260/280在1.8-2.2之间的RNA样品用DEPC水稀释至100ng/ml；
2)根据反转录试剂盒说明书，向200μL标记的EP管中依次加入5μL总RNA，5μL配置好的Mix，用移液枪混匀后，上机进行反转；
3)将反转好的cDNA样品放于-80℃冰箱备用。
优选的，荧光定量实时PCR包括以下步骤：热循环设置为95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，40个循环；72℃延伸45s；采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平变化。
优选的，所述的蛋白表达水平采集方法为：各组平行收集100尾幼鱼，加入含有磷酸酶抑制剂(1％，v/v)、蛋白酶抑制剂(1％，v/v)和苯甲基磺酰抑制剂(1％，v/v)的裂解液进行匀浆，然后将匀浆液转移至1.5ml的离心管中，置于冰上裂解30min，此过程中用移液枪反复吹打若干次，以保证细胞完全裂解，随后后将匀浆液1000rpm、4℃离心10min，吸取上清液，使用蛋白测定试剂盒进行总蛋白浓度测定，每个样本取10μg的蛋白，加入蛋白缓冲液95℃金属浴煮10min，清洗玻璃板后灌胶与上样，按实验设计先配制10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，15min之后，将胶上层的水倒去并将剩余的水用吸水纸吸干，随后，将所有样品依次加入电泳孔中，设置浓缩胶电压为75V，分离胶电压为120V，直至前端溴酚蓝刚好跑出泳道，转膜之前要先将PVDF膜用甲醇浸泡30min，将分离胶剥下并盖于滤纸之上，然后将膜盖在胶上，去除气泡，设置转膜条件为200mA，1h，转膜完成后，用5％的脱脂牛奶封闭1h，弃掉脱脂奶粉，加入Elavl3、α1-tubulin和Gap43蛋白对应的一抗(抗体用含有5％的BSA的TBST溶液稀释，稀释比例为1:1000)，4℃孵育过夜，收集一抗，加入10mLTBST洗膜3次，每次5min，随后加入稀释比为1:3000的二抗室温摇床孵育1h，再用TBST，清膜3次，每次5min，使用Pierce ECL免疫印迹底物显影，最后，将胶片进行扫描存档，用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
优选的，实验制图和数据处理使用Graphpad Prism 5.0和Origin 8.0统计软件对数据进行分析；用One-way ANOVA的分析法检验处理组与对照组之间的差异显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001被认为是统计学显著),试验数据以平均值±标准差(SEM)给出，所有数据采用Origin 8.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据作图。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明对转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量(显微观察)、野生型斑马鱼仔鱼的运动行为、神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺)、神经发育相关基因(chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b)及蛋白表达水平测定和分析，更具有代表性和普遍性。
(2)本研究中实验制图和数据处理使用Graphpad Prism 5.0和Origin 8.0统计软件对数据进行分析。用One-way ANOVA的分析法检验处理组与对照组之间的差异显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001被认为是统计学显著)。试验数据以平均值±标准差(SEM)给出，所有数据采用Origin 8.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据作图。数据处理高效，分析结果明晰。
(3)本发明中所用的模式生物斑马鱼，既具有体外细胞株可快速筛选的优点，又具有活体动物体内验证的优势，利用斑马鱼胚胎进行大规模全氟化物神经发育毒性评价，有助于提高实验效率和降低实验成本。
附图说明
图1为暴露实验后转基因斑马鱼仔鱼的神经特异性绿色荧光蛋白表达对比图。
图2为暴露实验后斑马鱼仔鱼运动行为对比图。
图3为暴露实验后斑马鱼仔鱼神经递质对比图。
图4为暴露实验后斑马鱼仔鱼样品中的乙酰胆碱酯酶活性对比图。
图5为暴露实验后斑马鱼仔鱼蛋白表达水平对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，包括如下步骤：
1)采用色谱纯的DMSO作为溶剂将PFHxA(全氟己烷羧酸)配制成浓度为30mg/mL的高浓度化合物储备液，于4℃避光保存；
2)将预先配置的高浓度储备液经胚胎培养液梯度稀释获得浓度分别为0.48mg/L，2.4mg/L和12mg/L的培养液，溶液即配即用，各浓度培养液中助溶剂DMSO的浓度控制在≤0.1％(v/v)；
3)将步骤2)中同一浓度的培养液注入6个10cm平行培养皿中，将储备液浓度为0mg/L的培养液也注入6个10cm平行培养皿中，每皿的工作液体积为50mL；
4)选发育良好的、由斑马鱼成鱼自然交配产生的斑马鱼胚胎(2hpf)进行暴露实验，每个培养皿中放入200枚胚胎；
5)将培养皿置于28±1℃培养箱中培养，光照/黑暗周期控制为14h/10h，暴露期间及时清除残渣或死亡个体，每隔24h将1/2体积培养液更换为新鲜配置的同等浓度溶液，暴露时长为120h；
在暴露实验结束后，进行如下步骤：
6)测定全氟化合物急性暴露后，转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量(显微观察)、野生型斑马鱼仔鱼的运动行为、神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺)、神经发育相关基因(chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b)表达水平以及蛋白表达水平的相关数据并分析。
优选的，所述转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量的采集是通过荧光显微镜采集转基因斑马鱼仔鱼的2D图像；通过ImageJ软件计算绿色荧光蛋白的发光面积。
优选的，所述的乙酰胆碱、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺的样品采集和检测方法为：每个平行随机收集100尾幼鱼，每组3个平行，每个样品加入1ng的DHB作为内标。样品称量后加入400μL含1％甲酸的预冷乙腈中匀浆，样品于-20℃孵育15min后，4℃12000rpm离心20min。上清冷冻干燥后在50μL 50％乙腈/水(v/v)重新震荡溶解。样品再次在4℃12000rpm离心20min，收集上清液，用Agilent 1200三重串联四极杆液/质联用仪(LC/MS,USA)检测。样品中乙酰胆碱酯酶活性的样品采集与检测方法为：每个平行随机收集100尾幼鱼，每组3个平行，加入预冷的0.9％生理盐水在冰上进行匀浆(g/ml＝1:4)，匀浆的样品经3,500rpm(4℃)离心10min，收集上清液，样品中乙酰胆碱酯酶活性采用相应的试剂盒(本实验使用南京凯基公司的AChE酶活性试剂盒)进行检测；根据布拉德福德法，选牛血清白蛋白作为标准，测定样品中的蛋白含量。
神经相关基因表达的测定
(1)引物的设计
实验所用的引物序列的设计使用软件Primer V3进行，其序列见表1。
表1实时荧光定量PCR引物序列
(2)荧光定量RT-PCR考察mRNA水平
优选的，所述的神经发育相关基因(chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b)表达水平的采集方法为：每组设置6个平行，每个平行收集30尾幼鱼，加入400μLTRIzol试剂；经过总RNA的离析、纯化及浓度测定、cDNA的合成、RT-PCR后，采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平变化。
优选的，所述RNA的提取及浓度检测包括以下步骤：
1)实验前将所需EP管等实验物品均用0.1％的DEPC水浸泡，并进行灭菌处理；
2)每组平行收集30尾斑马鱼放入1.5mL EP管中，用PBS清洗2次，随后加入400μL的Trizol，置于冰上匀浆，匀浆液转入新的1.5mL EP管中，室温静置5-10min；
3)转移至4℃离心机，12000rpm离心5min，上清移到新的1.5mL EP管中；
4)加入80μL的氯仿，剧烈震荡15s，静置5min，转移至4℃离心机，12000rpm离心20min；
5)吸取60μL上清液至新的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，上下反复颠倒混匀，室温静置10min后，12000rpm、4℃离心10min；
6)倒掉上清液，沿管壁缓慢加入200μLDEPC水配制的75％酒精的清洗一次，转移到4℃离心机，12000rpm离心5min，重复操作两次；
7)倒尽酒精，将EP管倒置，室温干燥5min，然后加入20μLDEPC水溶解，用移液枪反复吹打，直至混匀；
8)吸取1μL样品进行RNA含量测定用蛋白核酸测定仪测定样品中总RNA浓度，并记录260nm和280nm处的吸光值。
优选的，所述cDNA的制备包括以下步骤：
1)选择OD260/280在1.8-2.2之间的RNA样品用DEPC水稀释至100ng/ml；
2)根据反转录试剂盒说明书，向200μL标记的EP管中依次加入5μL总RNA，5μL配置好的Mix，用移液枪混匀后，上机进行反转；
3)将反转好的cDNA样品放于-80℃冰箱备用。
优选的，荧光定量实时PCR包括以下步骤：热循环设置为95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，40个循环；72℃延伸45s；采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平变化，见表2：
表2暴露实验后斑马鱼仔鱼基因表达水平对比表
优选的，所述的蛋白表达水平采集方法为：各组平行收集100尾幼鱼，加入含有磷酸酶抑制剂(1％，v/v)、蛋白酶抑制剂(1％，v/v)和苯甲基磺酰抑制剂(1％，v/v)的裂解液进行匀浆，然后将匀浆液转移至1.5ml的离心管中，置于冰上裂解30min，此过程中用移液枪反复吹打若干次，以保证细胞完全裂解，随后将匀浆液1000rpm、4℃离心10min，吸取上清液，使用蛋白测定试剂盒进行总蛋白浓度测定，每个样本取10μg的蛋白，加入蛋白缓冲液95℃金属浴煮10min，清洗玻璃板后灌胶与上样，按实验设计先配制10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，15min之后，将胶上层的水倒去并将剩余的水用吸水纸吸干，随后，将所有样品依次加入电泳孔中，设置浓缩胶电压为75V，分离胶电压为120V，直至前端溴酚蓝刚好跑出泳道，转膜之前要先将PVDF膜用甲醇浸泡30min，将分离胶剥下并盖于滤纸之上，然后将膜盖在胶上，去除气泡，设置转膜条件为200mA，1h，转膜完成后，用5％的脱脂牛奶封闭1h，弃掉脱脂奶粉，加入Elavl3、α1-tubulin和Gap43蛋白对应的一抗(抗体用含有5％的BSA的TBST溶液稀释，稀释比例为1:1000)，4℃孵育过夜，收集一抗，加入10mLTBST洗膜3次，每次5min，随后加入稀释比为1:3000的二抗室温摇床孵育1h，再用TBST，清膜3次，每次5min，使用Pierce ECL免疫印迹底物显影，最后，将胶片进行扫描存档，用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
优选的，实验制图和数据处理使用Graphpad Prism 5.0和Origin 8.0统计软件对数据进行分析；用One-way ANOVA的分析法检验处理组与对照组之间的差异显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001被认为是统计学显著),试验数据以平均值±标准差(SEM)给出，所有数据采用Origin 8.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据作图。
全氟化合物神经发育毒性的评价方法，即通过将转基因斑马鱼与野生斑马鱼相结合，选择斑马鱼早期发育阶段，多层次分析转基因斑马鱼仔鱼脑部特异性荧光蛋白表达量、野生型斑马鱼仔鱼运动行为、神经递质、神经发育相关基因、蛋白表达水平，阐述上述指标和神经发育毒性的联系，评价全氟化合物神经发育毒性水平。
Claims (10)
1.一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，包括如下步骤：
1)采用色谱纯的二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂将全氟己烷羧酸(PFHxA)配制成浓度为30mg/mL的高浓度化合物储备液，于4℃避光保存；
2)将预先配置的高浓度储备液经胚胎培养液梯度稀释获得浓度分别为0.48mg/L，2.4mg/L和12mg/L的培养液，溶液即配即用，各浓度培养液中助溶剂DMSO的浓度控制在≤0.1％(v/v)；
3)将步骤2)中同一浓度的培养液注入6个10cm平行培养皿中，将储备液浓度为0mg/L的培养液也注入6个10cm平行培养皿中，每皿的工作液体积为50mL；
4)选发育良好的、由斑马鱼成鱼自然交配产生的斑马鱼胚胎(2hpf)进行暴露实验，每个培养皿中放入200枚胚胎；
5)将培养皿置于28±1℃培养箱中培养，光照/黑暗周期控制为14h/10h，暴露期间及时清除残渣或死亡个体，每隔24h将1/2体积培养液更换为新鲜配置同等浓度溶液，暴露时长为120h；
其特征在于，在暴露实验结束后，进行如下步骤：
6)测定全氟化合物急性暴露后，通过采集转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量、野生型斑马鱼仔鱼的运动行为、神经递质：乙酰胆碱、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺、神经发育相关基因：chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b表达水平以及蛋白表达水平的相关数据并分析。
2.如权利要求1所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，所述转基因斑马鱼仔鱼脑部神经特异性荧光蛋白表达量的采集是通过荧光显微镜采集转基因斑马鱼仔鱼的2D图像；通过ImageJ软件计算绿色荧光蛋白的发光面积来获得的。
3.如权利要求1所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，所述的神经递质：乙酰胆碱、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、氨基丁酸和羟色胺的样品采集与检测方法为：每个平行随机收集100尾幼鱼，每组3个平行，每个样品加入1ng的2,4-二羟二苯甲酮(DHB)作为内标；样品称量后将样品加入400μL含1％甲酸的预冷乙腈中匀浆，样品于-20℃孵育15min后，在4℃温度条件下以12000rpm的转速离心20min；取上清液冷冻干燥后，加入50μL 50％乙腈/水(v/v)中重新震荡溶解；在4℃温度条件下以12000rpm的转速离心20min，收集上清液，用三重串联四极杆液/质联用仪(LC/MS,USA)检测。
4.如权利要求3所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，样品中乙酰胆碱酯酶活性的样品采集与检测方法为：每个平行随机收集100尾幼鱼，每组3个平行，加入预冷的0.9％生理盐水在冰上进行匀浆，组织重量：生理盐水体积(g/ml)为1:4，匀浆的样品在4℃温度条件下经3,500rpm离心10min，收集上清液，样品中乙酰胆碱酯酶活性采用相应的试剂盒进行检测；根据布拉德福德法，选牛血清白蛋白作为标准，测定样品中的蛋白含量。
5.如权利要求1所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，所述的神经发育相关基因：chrna7，ache，mbp，a1-tubulin，shha，elavl3，gap43syn2a，gfap，bdnf，TH2，htr1ab，htr1b，htr2a，htr1aa，htr5a，DAT，Nr4a2b的表达水平的采集方法为：每组设置6个平行，每个平行收集30尾幼鱼，加入400μL总RNA提取试剂(TRIzol)；经过总RNA的离析、纯化及浓度测定、cDNA的合成、RT-PCR后，采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平变化。
6.如权利要求5所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，所述RNA的提取及浓度检测包括以下步骤：
1)实验前将所需EP管等实验物品均用0.1％的不含RNA酶的无核酸酶纯水(DEPC)浸泡，并进行灭菌处理；
2)每组平行收集30尾斑马鱼放入1.5mL离心管中，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗2次，随后加入400μL的总RNA提取试剂(TRIzol)，置于冰上匀浆，匀浆液转入新的1.5mL离心管中，室温静置5-10min；
3)转移至4℃离心机，12000rpm离心5min，将上清移到新的1.5mL离心管中；
4)在步骤3)中的离心管中加入80μL的氯仿，剧烈震荡15s，静置5min，转移至4℃离心机，12000rpm离心20min；
5)吸取60μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下反复颠倒混匀，室温静置10min后，12000rpm、4℃离心10min；
6)倒掉上清液，沿管壁缓慢加入用200μL不含RNA酶的无核酸酶纯水(DEPC)配制的75％酒精，清洗一次，转移到4℃离心机，12000rpm离心5min，重复操作两次；
7)倒尽酒精，将离心管倒置，室温干燥5min，然后加入20μL不含RNA酶的无核酸酶纯水(DEPC)溶解，用移液枪反复吹打，直至混匀；
8)吸取1μL样品进行RNA含量测定用蛋白核酸测定仪测定样品中总RNA浓度，并记录260nm和280nm处的吸光值。
7.如权利要求6所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，所述cDNA的制备包括以下步骤：
1)选择被吸收光密度值(OD)260/280在1.8-2.2之间的RNA样品用不含RNA酶的无核酸酶纯水(DEPC)稀释至100ng/ml；
2)向200μL标记的离心管中依次加入5μL总RNA，5μL配置好的反应混合液(配方如下)，用移液枪混匀后，上机进行反转；所述混合液由4.00μL5倍缓冲液(5×PrimeScriptBuffer)，1.00μL逆转录酶(PrimeScript RT Enzyme Mix)，1.00μL引物混合物(RT PrimerMix)，4.00μL不含RNA的重水RNase Free dH2O配制而成；
3)将反转好的cDNA样品放于-80℃冰箱备用。
8.如权利要求7所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，荧光定量实时PCR包括以下步骤：热循环设置为95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，进行40个循环后；在72℃温度条件下延伸45s。
9.如权利要求1所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，所述的蛋白表达水平采集方法为：各组平行收集100尾幼鱼，加入含有1％磷酸酶抑制剂(v/v)、1％蛋白酶抑制剂(v/v)和1％苯甲基磺酰抑制剂(v/v)的裂解液进行匀浆，然后将匀浆液转移至1.5ml的离心管中，置于冰上裂解30min，此过程中用移液枪反复吹打若干次，以保证细胞完全裂解，随后后将匀浆液以1000rpm转速、在4℃温度条件下离心10min，吸取上清液，使用蛋白测定试剂盒进行总蛋白浓度测定，每个样本取10μg的蛋白，加入蛋白缓冲液，在95℃温度条件下金属浴煮10min，清洗玻璃板后灌胶与上样，按实验设计先配制10％分离胶，加入四甲基乙二胺(TEMED)后立即摇匀即可灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，15min之后，将胶上层的水倒去并将剩余的水用吸水纸吸干，随后，将所有样品依次加入电泳孔中，设置浓缩胶电压为75V，分离胶电压为120V，直至前端溴酚蓝刚好跑出泳道，转膜之前要先将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用甲醇浸泡30min，将分离胶剥下并盖于滤纸之上，然后将膜盖在胶上，去除气泡，设置转膜条件为200mA，1h，转膜完成后，用5％的脱脂牛奶封闭1h，弃掉脱脂奶粉，加入Elavl3、αlavl3，加入于和Gap43蛋白对应的一抗，抗体用含有5％的BSA的TBST溶液稀释，稀释比例为1:1000，在4℃温度条件下孵育过夜，收集一抗，加入10mL三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸(Hcl)缓冲液(TBST)洗膜3次，每次5min，随后加入稀释比为1:3000的二抗室温摇床孵育1h，再用三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸(Hcl)缓冲液(TBST)，清膜3次，每次5min，使用化学发光试剂(ECL)免疫印迹底物显影，最后，将胶片进行扫描存档，用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
10.如权利要求2-9中任一项所述的一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法，其特征在于，实验制图和数据处理使用Graphpad Prism 5.0和Origin 8.0统计软件对数据进行分析；用One-way ANOVA的分析法检验处理组与对照组之间的差异显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001被认为是统计学显著),试验数据以平均值±标准差(SEM)给出，所有数据采用Origin 8.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据作图。
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