CN109628460A

CN109628460A - 一种超深渊来源抗菌肽hydramacin及其制备方法

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Publication number: CN109628460A
Application number: CN201910047681.XA
Authority: CN
Inventors: 阮灵伟; 陈丹; 施泓
Original assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2019-04-16

Abstract

一种超深渊来源抗菌肽hydramacin及其制备方法，涉及Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因的核苷酸序列以及其所编码的氨基酸序列。根据获得的序列信息，通过基因合成hydramacin基因的核苷酸序列，在pET‑HIS载体构建了适用于原核表达的重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)PLySs中进行重组蛋白表达，经纯化后的蛋白纯度高，为该蛋白的实际应用提供了基础。通过异源重组表达的hydramacin，可以克服原料来源难以获取，分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于临床医学、食品、禽畜、水产养殖业等领域奠定基础。

Description

一种超深渊来源抗菌肽hydramacin及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种超深渊来源的海参Peniagone sp.抗菌肽hydramacin，尤其是涉及一种Peniagone sp.抗菌肽hydramacin及其制备方法。

技术背景

在生物体免疫过程中，由特定基因编码产生一类具有抗菌活性的小分子蛋白，称为抗菌肽(1、Hancock R E W,Chapple D S.Peptide Antibiotics[J].Lancet,1999,349(9049):418.)。抗菌肽具有分子量小、抑菌谱广、在自然环境中广泛且稳定存在等特点。抗菌肽一般由10～60个氨基酸组成，广泛存在于细菌、真菌、病毒、植物、昆虫、两栖类动物、水生动物、哺乳动物体内(2、He J,Anderson M,Shi W,et al.Design and activity of a‘dual-targeted’antimicrobial peptide[J].International Journal ofAntimicrobial Agents,2009,33(6):532-537.)，能够强选择性地抑制、杀灭细菌或真菌(3、Park C B,Kim H S,Kim S C.Mechanism of action of the antimicrobial peptidebuforin II:buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membraneand inhibiting cellular functions.[J].Biochemical&Biophysical ResearchCommunications,1998,244(1):253-257.)，还具有抗病毒(4、Jr R W,Mcdougall B,TranD,et al.Anti-HIV-1activity of indolicidin,an antimicrobial peptide fromneutrophils[J].Journal of Leukocyte Biology,1998,63(1):94-100.)、抑制肿瘤细胞生长(5、Liu S,Yang H,Cai H,et al.[Enhancement of cytotoxicity of cantionicantimicrobial peptide in tumor cells by conjugation to cell-penetratingpeptide].[J].Journal of Biomedical Engineering,2011,28(1):110.)、促进细胞愈合和免疫调节等作用。

现如今，抗菌肽在多个领域都具有应用价值，具有极大的研究意义。

抗菌肽不仅具有广谱抗菌性，能杀灭细菌、真菌和病毒，而且具抑制肿瘤细胞生长、促进细胞愈合、免疫调节等作用，对人体及其它动物、植物生理损害作用很小，在先天性获得免疫方面还发挥着重要作用，易被蛋白酶水解，在生物体内的半衰期较短。最重要的是，抗菌肽对细菌的作用机制多样，作用靶点不特定不单一，不易产生耐受性，在临床医学中，是极具潜力的抗生素替代药物(6、Hancock R.The therapeutic potential ofcationic peptides.[J].Expert Opinion on Investigational Drugs,1998,7(2):167-74.)。目前抗菌肽在临床上己有多方面的应用：(1)发挥消炎抗感染的功效，例如多黏菌素B(polymyxin B)和短杆菌肽S(gramicidin S)已成功在临床上用于治疗皮肤烧伤感染、手术伤口感染及眼睛表面感染等(7、Ledson M J,Gallagher M J,Cowperthwaite C,etal.Four years'experience of intravenous colomycin in an adult cystic fibrosisunit.[J].European Respiratory Journal,1998,12(3):592-594.)；(2)昆虫抗菌肽pyrrochoricm作为免疫调节剂发挥作用，pyrrochoricm及其衍生物具有运载抗原依赖性疫苗的潜力(8、Jr O L,Cudic M,Chua B Y,et al.An insect antibacterial peptide-based drug delivery system.[J].Molecular Pharmaceutics,2015,1(1):220-232.)；(3)治疗恶性肿瘤，例如由抗菌肽magainin开发的药品MA1278已在临床上显示出对肿瘤细胞有良好的杀伤效果(9、胡荣贵,李改瑞,陆家海.抗菌肽在抗肿瘤方面的研究进展[J].实用肿瘤杂志,2010,25(2):227-230.)。

抗菌肽由于其天然来源、安全无毒、抗菌性强、抗菌谱广、水溶性好、耐热耐酸碱性强等特点，在食品防腐保鲜领域被作为天然防腐剂的一类得到关注和开发。例如由乳酸链球菌分泌的乳酸链球菌素(nisin)，能够抑制葡萄球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属等革兰氏阳性菌的生长，直接添加于猪、牛、羊、禽类等肉制品中可以有效地延长保质期(10、李增利.Nisin抗菌作用机制及抑菌效力[J].食品科技,2004(10):59-62.)。

抗菌肽具有广谱抗菌性，当抗菌肽替代抗生素作为饲料添加剂时，不仅可以促进禽畜、水产类动物的生长，还可以提高它们对外源病原菌的免疫力，且在动物体内无毒副作用、无残留、不易产生耐药性(11、姜珊,王宝杰,刘梅,等.饲料中添加重组抗菌肽对吉富罗非鱼生长性能及免疫力的影响[J].中国水产科学,2011,18(6):1308-1314.)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因序列。

本发明的第二个目的是提供Peniagone sp.抗菌肽hydramacin蛋白序列。

本发明的第三个目的是提供Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的制备方法。

本发明所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因，其编码Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的核苷酸序列，记作hydramacin。

所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因的分子类型为DNA，序列特征：长度为249bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因的序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

本发明所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因，其核苷酸序列采用以下方法获得，首先根据序列信息人工合成hydramacin的核苷酸序列，序列分析知1～66bp为信号肽序列；切除信号肽后序列为SEQ ID No.2：

随后以人工合成的hydramacin为模板，以合成序列SEQ ID No.4，SEQ ID No.5作为引物，经PCR扩增获得hydramacin基因核苷酸序列SEQ ID No.2(去除信号肽)。然后通过原核重组表达hydramacin基因，纯化hydramacin基因的表达产物；

所述合成序列SEQ ID No.4：CGGGATCCGGTATCGGCGATTGTTGGGC；(下划线为核酸内切酶，酶切位点BamH Ⅰ)

所述合成序列SEQ ID No.5：CGGAATTCTCAGTAGCACTGACATTGCC；(下划线为核酸内切酶，酶切位点EcoR Ⅰ)

所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为60aa，类型为氨基酸，所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的氨基酸序列记为SEQ IDNo.3：

1GIGDCWATWS RCSQWSDWGT GWLWQSCNDR CKELGRRGGS CQDVSSSCPF SSRAWQCQCY

所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin，其蛋白具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽；或将SEQ ID No.3氨基酸序列经过至少1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列相似功能的多肽。

本发明所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的制备方法，包括以下步骤：

1)Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的人工合成和序列分析；

2)Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因的PCR扩增和序列分析；

3)Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的重组表达与纯化。

本发明根据获得的序列信息，通过基因合成hydramacin基因的核苷酸序列，在pET-HIS载体构建了适用于原核表达的重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)PLySs中进行重组蛋白表达，经纯化后的蛋白纯度高，为该蛋白的实际应用提供了基础。通过异源重组表达的hydramacin，可以克服原料来源难以获取，分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于临床医学、食品、禽畜、水产养殖业等领域奠定基础。

附图说明

图1为hydramacin基因重组表达的Tricine-PAGE电泳图谱。在图1中，M:蛋白Marker；1：重组载体pET-HIS-hydramacin在菌株BL21(DE3)PLySs的未诱导表达；2：重组载体pET-HIS-hydramacin在菌株BL21(DE3)PLySs中的诱导表达；3：重组质粒pET-HIS-hydramacin在菌株BL21(DE3)PLySs中诱导表达超声破碎后上清；4：重组载体pET-HIS-hydramacin在菌株BL21(DE3)PLySs中诱导表达超声破碎后包涵体。

图2为pET-HIS-hydramacin纯化的Tricine-PAGE电泳图谱。在图2中，M:蛋白Marker；1：经镍柱介质纯化所得的目的蛋白hydramacin。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(12、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：

1.Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的人工合成和序列分析；

根据获得的Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因序列信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的核酸序列。

2.Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因的PCR扩增和序列分析

以人工合成的hydramacin为模板，用引物F和R扩增hydramacin基因(不含信号肽)：

F：CGGGATCCGGTATCGGCGATTGTTGGGC(SEQ ID No.4)；

R：CGGAATTCTCAGTAGCACTGACATTGCC(SEQ ID No.5)；

其中，划线部分GGATCC代表BamH I酶切位点，GAATTC代表EcoR I酶切位点。

在50μL的反应体系中含0.5μL模板，1μL引物F(10μM)，1μL引物R(10μM),4μL dNTP(各2.5mM)，10μL 5×PrimerSTAR^TM Buffer，0.5μL PrimerSTAR^TM HS DNA Polymerase(2.5U/μL)(TaKaRa公司)，用H₂O将总体积补至50μL。PCR反应条件为：98℃1min；30cycles(98℃10s、58℃30s、72℃30s)；72℃10min；4℃保存。PCR产物经纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，菌落PCR后选取有DNA片段的阳性克隆测序。

3.Peniagone sp.抗菌肽hydramacin蛋白的表达与纯化

将含有hydramacin基因的质粒用BamH I和EcoR I酶切，胶回收hydramacin基因片段，同时将质粒pET-HIS用相同的酶进行酶切。将两者连接过夜(12～16h)。连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，提取质粒，测序验证。

将测序正确的质粒pET-HIS-hydramacin转化BL21(DE3)PLySs，37℃生长15h后菌落PCR验证质粒转化的正确性。挑选转化正确的菌落，接种到100mL含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇培至A₆₀₀＝0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，37℃诱导4～5h；将菌液收集至200mL的离心管中，8000g离心10min沉淀细菌细胞；将细菌细胞重新悬浮在20mL Binding Buffer缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，300mM氯化钠，pH＝7.4)中，超声波处理至菌液成半透明，再14000rpm离心20min，弃上清；将包涵体沉淀用含8M尿素的Binding Buffer缓冲液混匀溶解；待溶解完全后4000g离心5min，所得上清与平衡后的GE Healthcare Ni sepharose(GE公司)室温结合过夜。纯化过程按照纯化试剂盒说明进行。纯化得到的融合蛋白his-hydramacin经15.5％的Tricine-PAGE电泳分析，其分子量约为9kDa，纯度达90％以上(图1和2)。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

<120> 一种超深渊来源抗菌肽hydramacin及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 249

<212> DNA

<213> Peniagone sp.

<400> 1

atgaggtccg ctattttgct cgttgtgttc gtggttctct acgcgaatgt tcctccagcg 60

tccgcgggta tcggcgattg ttgggctact tggtctcgct gctcccaatg gtccgactgg 120

ggtactggtt ggctctggca aagttgcaac gacagatgca aggagctcgg cagacgtggt 180

ggcagttgtc aagatgtgtc atcttcctgt ccatttagta gtcgtgcatg gcaatgtcag 240

tgctactga 249

<210> 2

<211> 183

<212> DNA

<213> Peniagone sp.

<400> 2

ggtatcggcg attgttgggc tacttggtct cgctgctccc aatggtccga ctggggtact 60

ggttggctct ggcaaagttg caacgacaga tgcaaggagc tcggcagacg tggtggcagt 120

tgtcaagatg tgtcatcttc ctgtccattt agtagtcgtg catggcaatg tcagtgctac 180

tga 183

<210> 3

<211> 60

<212> PRT

<213> Peniagone sp.

<400> 3

Gly Ile Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ser Ala Cys Ser Gly Thr Ser

1 5 10 15

Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Thr Gly Ser Cys Ala Ala Ala Cys Leu

20 25 30

Gly Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ser Cys Gly Ala Val Ser Ser Ser Cys

35 40 45

Pro Pro Ser Ser Ala Ala Thr Gly Cys Gly Cys Thr

50 55 60

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

cgggatccgg tatcggcgat tgttgggc 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

cggaattctc agtagcactg acattgcc 28

Claims

1.Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因，其特征在于编码Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因，其特征在于所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因的分子类型为DNA，序列特征：长度为249bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因的序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

3.如权利要求1所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因，其特征在于核苷酸序列采用以下方法获得：根据获得的序列信息人工合成得到SEQ ID No.1的序列，序列分析知1～66bp为信号肽序列，切除信号肽后序列为SEQ ID No.2：

之后以合成序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物扩增，获得切除信号肽后的hydramacin基因，然后通过原核重组表达hydramacin基因，纯化hydramacin基因的表达产物；

所述合成序列SEQ ID No.4：CGGGATCCGGTATCGGCGATTGTTGGGC；

所述合成序列SEQ ID No.5：CGGAATTCTCAGTAGCACTGACATTGCC。

4.如权利要求3所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因，其特征在于所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为60aa，类型为氨基酸，所述抗菌肽hydramacin的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID No.3：

1GIGDCWATWS RCSQWSDWGT GWLWQSCNDR CKELGRRGGS CQDVSSSCPF SSRAWQCQCY。

5.如权利要求4所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin基因，其特征在于所述蛋白具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽；或将SEQ ID No.3氨基酸序列经过至少1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列相似功能的多肽。

6.如权利要求4所述Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的人工合成和序列分析的步骤；

2)Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的PCR扩增和序列分析的步骤；

3)Peniagone sp.抗菌肽hydramacin的重组表达及纯化的步骤。