CN109536525B

CN109536525B - 一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用

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Publication number: CN109536525B
Application number: CN201910125884.6A
Authority: CN
Inventors: 崔玉琳; 林彬; 秦松; 初金玲; 焦绪栋
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2019-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-02-20
Also published as: LU101834A1; LU101834B1; WO2020168659A1; CN109536525A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用。载体包括启动子、终止子，所述重组空载体含SEQ ID NO:1所示碱基序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示碱基序列的下游同源臂，同源臂之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:5所示的碱基序列。采用本发明的杜氏盐藻叶绿体稳定表达系统,可实现多个外源基因在叶绿体中稳定表达。

Description

一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用。

背景技术

在进行光合作用的真核微藻中，细胞核、叶绿体和线粒体中均含有DNA，其构成了既独立又相互联系的遗传体系。自基因工程技术诞生以来，以细胞核为目标的外源基因转化技术已经得到了普遍的应用。然而随着研究的进展，人们发现核基因组基因工程具有难以克服的困难：1.外源基因插入核基因组效率低，且随机插入，导致不同克隆之间有很大的变异性，因此需要进行广泛的筛选；2.核基因组结构功能复杂，外源基因的插入有时会造成其它性状的变异；3.外源基因表达效率低，且表达不稳定；4.安全稳定性不高，外源基因容易扩散。以上这些问题严重制约了外源基因转化技术的应用。

1988年，Boynton等通过基因枪法第一次使用衣藻实现了叶绿体转化，使人们认识到叶绿体可以作为基因工程中新的转化表达受体。叶绿体转化利用 DNA 同源重组的机制，在外源基因两个旁翼加入受体细胞叶绿体基因组同源序列，将外源 DNA 插入叶绿体功能基因之间，从而较精确地控制外源基因的插入。在烟草等高等植物中，叶绿体转化已经得到广泛运用。叶绿体转化系统与细胞核转化系统相比有很多优势：能够实现外源基因定向整合、无基因沉默现象、外源基因表达效率更高且变异更小等。

杜氏盐藻（Dunaliella salina）是一种嗜盐的绿色微藻，在分类学上属于绿藻门（Chlorophyta），绿藻纲（Chlorophyceae），盐藻属（Halophila）。它可以通过调节细胞内甘油的代谢，从而降低细胞内氯化钠浓度。在适当的胁迫条件下，该藻株可以积累β-胡萝卜素含量，使得β-胡萝卜素含量占总干有机质重的10%以上；同时它还含有大量蛋白质、多糖、Ca、P、Zn等矿物质，可见该藻株具有一定的应用价值。目前杜氏盐藻叶绿体基因组已进行全基因组测序，为杜氏盐藻叶绿体基因改造提供了充足的依据，但至目前为止，杜氏盐藻叶绿体转化的研究才刚刚起步，缺少高效稳定的叶绿体插入位点以及内源性高效调控序列，制约着该藻的基础研究和应用开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体，包括启动子、终止子，所述重组空载体含SEQ ID NO:1 所示碱基序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示碱基序列的下游同源臂，同源臂之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:5所示的碱基序列。

所述同源臂间插入选择标记基因。

所述上游同源臂与下游同源臂间插入至少一个启动子和终止子；其中，终止子为叶绿体原核性质的终止子。

所述重组空载体依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:5所示的碱基序列、终止子、和下游同源臂。

所述启动子为调控外源基因的启动子；

或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。上述记载SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列分别可调控外源基因，也可分别调控选择标记基因。

所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:1所示的序列3’端开始，向5’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；

所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:2所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；

所述启动子为SEQ ID NO:3所示的序列的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:3所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 800 bp 的连续片段；

所述启动子为SEQ ID NO:4所示的序列的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:4所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 510 bp 的连续片段；

所述连接序列为SEQ ID NO:5所示的序列的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:5所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 15 bp 的连续片段；

所述选择标记基因为草丁膦抗性基因bar基因。

一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体的应用，所述载体在杜氏盐藻叶绿体转化中的应用。

将外源基因导入至所述构建的同源重组空载体再导入杜氏盐藻细胞，经培养筛选获得转基因杜氏盐藻

所述外源基因为功能蛋白基因、结构性蛋白基因以及营养型蛋白基因等；其中，功能蛋白基因如脂肪酸合成蛋白基因、光合作用相关蛋白基因等，结构性蛋白基因如细胞膜蛋白基因钙调蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等。

本发明所具有的优点：

本发明成功构建了杜氏盐藻的叶绿体稳定表达系统。通过本发明能够有效地将多个外源基因重组到杜氏盐藻的叶绿体基因组中，并通过筛选获得转基因藻株。与现有技术相比，本发明实现了杜氏盐藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：

1.本发明提供用于杜氏盐藻叶绿体转化的叶绿体基因组同源重组位点；

2.本发明提供串联多个外源基因构成多顺反子的杜氏盐藻叶绿体内源序列；

3.本发明提供高效的杜氏盐藻内源调控序列。

附图说明

图1为发明实施例提供的pMD-BKT-CRTR质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL2000;泳道wt为野生株；泳道bar为阳性转基因藻株）。

图3为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL5000;泳道wt为野生株；泳道tf为阳性转基因藻株）。

图4为本发明实施例提供的转基因杜氏盐藻southern杂交图（其中泳道wt为野生株；泳道tf为阳性转基因藻株），1为基因组经过XhoI 和EcoRI双酶切的杂交结果；2为基因组经过BamHI和HindIII双酶切的杂交结果。

图5为本发明实施例提供的转基因杜氏盐藻western杂交图（其中泳道wt为野生株；泳道tf为阳性转基因藻株）。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步描述。

实施例1 杜氏盐藻叶绿体同源重组片段的克隆

设计并合成如下两对引物：

P1: 5’-TTACCAGGGTTTGACATGTCTAGAA-3’

P2: 5’-TGGGCTATAGAAGATTTGAAC-3’

P3: 5’-GGGAATGTAGCTCAGTTGGTAGAGC-3’

P4: 5’-TTCAGCTGTTTCGTTTTTAGAAAACT-3’

其中引物Pl和P2的扩增产物是SEQ ID NO: 1，即片段16S-TrnA;引物P3和P4的扩增产物是SEQ ID NO: 2，即片段TrnI-23S(参见图1)。

以杜氏盐藻基因组总DNA为模板，经引物Pl和P2进行PCR扩增，反应程序为:94℃10min预变性;94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为901bp，即为片段16S-trnI，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段16S-trnI的重组质粒pMD16I。

以杜氏盐藻基因组总DNA为模板，经引物P3和P4进行PCR扩增，反应程序为:94℃10min预变性;94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为731bp，即为片段trnA-23S，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段trnA-23S的重组质粒pMD23A。

实施例2 杜氏盐藻两个叶绿体启动子片段的扩增与克隆

设计并合成如下两对引物：

P5: 5’-ATCCGCGTAGAGTAATAGG-3’

P6: 5’-GAGCACCATTTTTACTTCTGGTGTA-3’

P7: 5’-GGATCCGCCGATCCGTGGTTTAGAGTT-3’

P8: 5’-ACGTGCCCAAAGGCTAGTATTT-3’

其中引物P5和P6的扩增产物是SEQ ID NO: 3，即片段5’atpA，为来源于杜氏盐藻叶绿体的具有叶绿体启动功能的启动子;引物P7和P8的扩增产物是SEQ ID NO: 4，即片段5’psbA，为来源于杜氏盐藻叶绿体的具有叶绿体启动功能的启动子(参见图2)。

以杜氏盐藻基因组总DNA为模板，经引物P5和P6进行PCR扩增，反应程序为：94℃10min预变性；94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为943bp，即为片段5’atpA，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段5’atpA的重组质粒pMDatpA。

以杜氏盐藻基因组总DNA为模板，经引物P7和P8进行PCR扩增，反应程序为:94℃10min预变性；94℃ 1min， 60℃ 90sec，72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为511bp，即为片段5’psbA，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段5’psbA的重组质粒pMDpsbA。

实施例3 杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体的构建

以上述克隆载体pMD16I、pMD23A、pMDatpA、pMDpsbA为基础，通过同源重组方法构建杜氏盐藻叶绿体同源重组载体。

设计并合成如下六对引物:

P9: tagcctttgggcacgtATGAGCCCAGAACGACGCC

P10: ctgagctacattcccTCATCAAATCTCGGTGACGGG

P15: tgctcctcgagCTGCTTGTGAAGTTTGGAAAGAAA

P16: tgctcctcgagCTGCTTGTGAAGTTTGGAAAGAAA

P17: catgattacgaattcggatccTTACCAGGGTTTGACATGTCTAGAA

P18: gcggatTGGGCTATAGAAGATTTGAAC

P19: gatgaGGGAATGTAGCTCAGTTGGTAGAGC

P20: acgacggccagtgccaagcttTTCAGCTGTTTCGTTTTTAGAAAACT

P21: tatagcccaATCCGCGTAGAGTAATAGG

P22: aagcagctcgagGAGCACCATTTTTACTTCTGGTGTA

P23: tatgaccatgattacgaattcGGATCCGCCGATCCGTGGTTTAGAGTT

P24: tcatACGTGCCCAAAGGCTAGTATTT

其中引物P9和P10的扩增产物是片段bar，为草丁膦抗性基因；引物P15和P16的扩增产物是片段rbcL，为来源于杜氏盐藻叶绿体的具有叶绿体终止功能的终止子；引物P17和P18的扩增产物是片段16S-TrnA上游；引物P19和P20的扩增产物是片段TrnI-23S下游；引物P21和P22的扩增产物是片段5’atpA；引物P23和P24的扩增产物是片段5’psbA。

以质粒PSVB (Cui Yulin, Jiang Peng, Wang Jinfeng, Li Fuchao, ChenYingjie, Zheng Guoting, Qin Song. 2012. Chinese Journal of Oceanology andLimnology, 30(3):471-475.)为模板，经引物P9和P10进行PCR扩增，反应程序为:94℃10min预变性;94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为570bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段bar。

以杜氏盐藻基因组总DNA为模板，经引物P15和P16进行PCR扩增，反应程序为:94℃10min预变性;94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为272bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段rbcL。

以质粒pMD16I为模板，经引物P17和P18进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 10min预变性;94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为901bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段16S-TrnA。

以质粒pMD23A为模板，经引物P19和P20进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 10min预变性;94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为731bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段TrnI-23S。

以质粒pMDatpA为模板，经引物P21和P22进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 10min预变性;94℃ 1min，60℃ 90sec， 72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为943bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段5’atpA。

以质粒pMDpsbA为模板，经引物P23和P24进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 10min预变性;94℃ 1min，60℃ 90sec， 72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为511bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段5’psbA。

pMD-18T载体用EcoRI和HindIII酶切后，与获得的5’psdA、bar、16S-TrnA连接，获得含有杜氏盐藻启动子、草丁膦抗性基因、同源臂基因的重组质粒pPBI。将上述获得重组质粒pPBI用BamHI酶切，酶切后再与获得的trnA-23S、5’atpA、rbcL连接，获得含有杜氏盐藻启动子、同源臂、草丁膦抗性基因的重组质粒pSARPBI。

在此载体pSARPBI上插入能够和至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ IDNO:5所示的碱基序列，即获得重组空载体；一个或多个外源基因，导入杜氏盐藻叶绿体后即可实现外源基因的表达。其中，SEQ ID NO:5所示的碱基序列通过引入的外源基因插入载体中；例如两个外源基因之间添加序列5构成多顺反子的结构即可实现多个外源基因的共表达。

另外，重组空载体中的选择性抗性基因可以按照上述实施例记载方式插入，还可在插入外源基因时插入。

实施例4

依照上述实施例获得载体在杜氏盐藻叶绿体转化中的应用；下面以雨生红球藻中的两个虾青素合成的关键基因作为外源基因，将其插入该载体导入杜氏盐藻中，通过检测这两个外源基因的表达和功能来检测该载体的活性。

虾青素合成关键基因在杜氏盐藻叶绿体中的表达

1.载体的构建

设计并合成如下两对引物:

P11: gtaaaaatggtgctcctcgagATGCATCATCACCATCACCACGTCGCATCGGCACTAA

P12: tgatggtgatgatgcat TAAATTTCCCTCCCT TCATGCCAAGGCAGGCAC（斜体为SEQID NO: 5所示序列）

P13: atgcatcatcaccatcaccatCTGTCGAAGCTGCAGTCAATCA

P14: aaacttcacaagcagctcgagCTACCGCTTGGACCAGTCCA

引物P11和P12的扩增产物是片段bkt，为外源基因β-胡萝卜素酮化酶；引物P13和P14的扩增产物是片段crtr-b，为外源基因β-胡萝卜素羟化酶。

以雨生红球藻基因组为模板，经引物P11和P12进行PCR扩增，反应程序为:94℃10min预变性;94℃ 1min，60℃ 90sec， 72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为978bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段bkt。

以雨生红球藻基因组为模板，经引物P13和P14进行PCR扩增，反应程序为:94℃10min预变性;94℃ 1min，60℃ 90sec,，72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为900bp，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 获得纯化PCR产物，即为片段crtr-b。

将杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体pSARPBI载体用XhoI酶切后，与获得的bkt、crtr-b连接，获得杜氏盐藻叶绿体表达载体pMD-BKT-CRTR（质粒图谱见图1）。

2.杜氏盐藻的转化

在转化前1h，取浓度约为5.0×105 cell ml^-1的对数生长期的杜氏盐藻藻液，离心力6000g离心5min，弃上清，用盐藻培养液调整浓度到1×10⁸cell ml^-1。然后取0. 2m1藻液涂在固体培养平板的中央，呈直径约3cm的圆形。涂好的平板置于超净工作台中备用。

微粒子弹的制备:取50 µl金粉悬浮液(约含3mg金粉)边涡旋边加入5µl质粒pMD-BKT-CRTR (质粒浓度>=1µg µl^-1) , 50µl 2.5M CaCl₂, 20µl 0.1M亚精胺。然后继续涡旋3min。离心5-6sec，弃上清。然后用250µl无水乙醇洗两次，最后用60µl无水乙醇重悬。这样一管包被了质粒的微粒子弹可用于5-6次轰击。

在无菌条件下(超净工作台中)，用高压氦气式基因枪进行轰击。

轰击后，藻细胞先在固体培养平板上黑暗条件下培养8h，然后再转到盐藻培养液中继续培养40h，使细胞生长状态得以恢复。

3.杜氏盐藻的筛选及鉴定

经过恢复培养的杜氏盐藻细胞，转到选择性培养液中，以杀死未转化的藻细胞。选择性培养液即为含有15µg ml^-1草丁膦的盐藻培养液。15d后将培养液以6000g离心5min，弃上清。收集到的藻体涂布到含有15µ g ml^-1草丁膦固体培养平板上，使抗性的藻细胞分散生长，得到抗性单藻落。约培养20d后，平板上长出单藻落。再将单藻落挑出，并划线到含有5 µg ml^-1草丁嶙的固体培养平板上，使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。20d后，挑取单藻落至培养液中继续培养约20d，6000g离心5min，收集藻体，每个藻体湿重>= 100mg，然后置于液氮中冷冻备用。

提取转基因杜氏盐藻的基因组总DNA，用以进行分子鉴定。首先用PCR方法来鉴定质粒的整合情况。PCR中使用的上游引物为bar for，下游引物为bar rev，产物为bar基因。94℃ 1min，60℃ 90sec，72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR产物约570bp（参见图2）。在一部分抗性杜氏盐藻基因组中扩增到了这个片段，在未转化的杜氏盐藻中均未发现该片段。

然后在SEQ ID NO:1 3’端附近和SEQ ID NO:2 5’端附近分别设计并合成引物，引物序列如下:

con-16s for: TTACCAGGGTTTGACATGTCTAGAA;

con-23s rev: TTCAGCTGTTTCGTTTTTAGAAAACT。

这对引物con-16s for和con-23s rev在野生型杜氏盐藻基因组总DNA中扩增到包括16S-23S的片段，长度约为1630bp；在实现同质化的转基因杜氏盐藻基因组总DNA中，扩增到16S-TrnA-atpA-bkt-crtr-b-rbcL-psbA-bar-TrnI-23S的片段，长度约为5800bp。

以阳性转基因藻的全基因组DNA为模板，以引物con-16s for和con-23s-rev进行PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃ 1min, 60℃ 90sec, 72℃ 90sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR产物经电泳分离有两条带，一条约为1630bp，另一条约为5800bp(参见图3)。较长的条带说明bar基因和两个外源基因已通过同源重组方式插入到杜氏盐藻叶绿体基因组中，插入位点为片段SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2之间的间隔区位置。

PCR有阳性结果的转基因杜氏盐藻样品，要继续进行Southern杂交鉴定。每个样品的基因组总DNA至少4µg。基因组DNA首先进行随机双酶切，共两组：XhoI 和EcoRI双酶切，37^oC 2h；BamHI和HindIII双酶切，37^oC 2h。Southern杂交探针是来源于地高辛标记的质粒pMD-BKT-CRTR bar、bkt、crtr-b基因内部的一段序列。杂交结果显示，一部分草丁膦抗性藻株的基因组，bar杂交后出现了一条约1300bp的条带和1000bp的条带，bkt杂交后出现了一条约1800bp的条带和4000bp的条带，crtr-b杂交后出现了一条约1800bp的条带和4000bp的条带，与质粒酶切后的条带大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图4)，这表明在一些阳性藻株中，质粒pMD-BKT-CRTR已经整合到叶绿体基因组中。

PCR有阳性结果的转基因杜氏盐藻样品，要继续进行western杂交鉴定。Western杂交使用小鼠抗His IgG和羊抗鼠IgG与辣根过氧化物酶(HRP)结合的方法对表达蛋白进行鉴定。杂交结果显示，杂交后出现了一条约39.85 kDa的条带和32.85 kDa的条带，与外源基因蛋白大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图5)，这表明在一些阳性藻株中，外源蛋白已经表达。

上述实施例表明利用本发明的载体成功实现了虾青素合成的两个关键基因在杜氏盐藻叶绿体中共表达，证明了本发明载体调控外源基因在杜氏盐藻叶绿体中表达外源基因的能力，可以实现各种蛋白基因的表达。

同时将外源基因通过下述功能蛋白基因、结构性蛋白基因以及营养型蛋白基因替换也可实现上述特点，所述功能蛋白基因如脂肪酸合成蛋白基因、光合作用相关蛋白基因等，结构性蛋白基因如细胞膜蛋白基因钙调蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等，营养型蛋白基因如神经肽基因等。

序列表

SEQ ID NO:1

TTACCAGGGTTTGACATGTCTAGAATTTTTCAGAAATGGAAAAGTGCTTCCTTTTTATGAAAGGAAGAACTAGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCGTTGACGTGTATGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTCGTCTTTAGTTACTTTCCAAGTTCTCTAAAGAGACTGCGCGCGCAAGCGCTGAGGAAGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACACCCTGGGCGACACGCGTAATACAATGGTTGGGACAATCAGAAGCTACCCCGTAAGGGCACGCCAATCTGCTAAACTCAACCCTAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCTATAGTAATCGCCAGTCAGCTATATGGCGGTGAATACGTTCCTGGTCTCTGTACACACCGCCCGTCACATCAAGAAAGGTGGTAGTGGATTAAGCTACTAGTAACCTCTCTGAGGAAGACGGTATCCACTCCAAGACTACTGATCATGATGAAGTCGTAACAAGGTAGGGGTACTGGAAGGTGTCCCTGGATCACCTCCTTCTTTTTAGGAATTTTCTATCTGACCCTCCTACCAGGAGACTAGGACCTTTGGTCCTAGCCTCACGGTAAACCCAAAGGGTTTAGGCTTACCTTCTCGTGAGGGGAGCTGACGCGTTAGATGGAAAAATAAAAGTTTTTCCATCTATAAAGCGTAATGAGATAGAATCAATAAAATTATTTAAAAGGTGACCTTAACCGAACGTAAATTTACGTTCGGTTAAGGTCACCCTTATATATTCTTATCCAAAAGAATTTTAATGGGCTATTAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCAGAAGTTCAAATCTTCTATAGCCCA

SEQ ID NO:2

GGGAATGTAGCTCAGTTGGTAGAGCATCGCATTTGCATTGCGAGGGTCGCGGGTTCGAAACCTGTCATTTCCACAATTATGAATTGAAAGTTAAAAAAAGGAGATAAATTTTATCTCCTTTTTTAGCGATTTTAAAAAGAAAAAAAAATAAATAAAAGAAACAAGAAACAAAAATTATAGGTCAAATGAACTTAGGCTTACGGTGGAGACCTAGGCACCCAGAGACGAAGAAGGGCGCAGATACCGGCGAAACGCTCCGGGGAGTTGGCAACAAACTTTGATCCGGAGATCCCCGAATAGGGCAACCTGTACAACTTCCAACAGAATTCATAAGTTGGAAAGAGGCAACCCAGTGAATTGAAACATCTTAGTAGCTGGAGGAAAAGAAAGCAAACGCGATTCCCGTAGTAGCGGCGAGCGAACCGGGAACAGCCTAAACCCATTTCCATTAGGGAATGGGGGTAGTGGGAAGACATTATAATTATAAAAAAAATAGAAAATAAGAGAAATTATCGAATAAAATTCTTTTACGAGGCGCCCGCAGACATCGTCGAGGACGACGAGTCTAGGTCGCCTCGTAGAGCTCGCCTCGCAGAGGCGACCTACAGAATTTTATTCGAGAATTCTCGAAGATTTTCAATATCCATAGGATATTGAAAACTTCGATAATTTATAATCTTTGTTTATAGATTTATTCTCTTTTAGAGTTTTCTAAAAACGAAACAGCTGAA

SEQ ID NO:3

ATCCGCGTAGAGTAATAGGAGAATGTTTTTTGGTATCCAATTATAAATTGATTTTTTATATTTTTTATAATATAGTTATATTTATAGGCAATAACTAAAAAACCAAATAAAATTTTCTTAAATAAAAATTTTCTCCTTAATTGAAATGAAAAGTTCGTATATAAGGGAATGAATAATAACTTTTGTTAAAGTTATTAACAAAATAACAAATAGGTGCGTCCGTTAAAAAAAAAAAAAATTTAGCGGAAAAAAACAAAGCGGAAAAAACAAAGCGGAAAAAACAAAGCGGAAAAAAAAAAGTTTTTTTCCTTAGAAACAACTTTAGTTAATATCGAAGTTTTCAATATCCTTTAGGATATTGAAAATCTTATAGATTTCTATAAGAAAATTCTAATAGAGAAGAAAATTTACGAAGTAAATTTTCTATTTTCTTCGATAAATTCTGAAAGAGAAGAAAATTTACTTTGTAAATGTTCTATTTTCTTCCGAAAATTTTTTTCGCGGAAAAAACAAAAGAAAAATTTTTTTTACGAAAAAAATTTTCCCGGACAAAACTTTGTTTTGTCCTAAGGAAAAAACAACAAAGAAAATTCTGAAAGAATTTTCTTTGTTGTTTTGTCCGGCATAAAAAAATTTTCTTTGTGGTTTTGTCCTAGGAAAACCCGTCCCCAAGGCGGGTCCGTTCGTCCGGCGTGAGGAGGGGGGCACCTTTGGTTTTTTCCGCTGATGGTTTGTGTACGAGGTCAGCTTCCATGGGCGGGGCGGCTGTTTGCGATGCTCTTACGGGCTTAACACATGTATCTTGTATAGACCTATTTGTTTGTATCATTTATCTTAAAAGAACAAAAAAAAAATTTTTATGGCAATGCGCACACCAGAAGAATTAAGTAATCTAATTAAAGATTTAATTGAAGAATATACACCAGAAGTAAAAATGGTGCTC

SEQ ID NO:4

GCCGATCCGTGGTTTAGAGTTTCCCATAAGACAAATCTGTACCTACATACGAATTAGAATATTTAAATTTTTATGACTTATATTGCCAACAATGATGTTCATAAAATTATATAGTACAGACTAAATAAAATTTTTTCTTTTTTAGCGGAAAAAACAACAAATAAATTTTTTTTTCCGGACAAAACGTTGTTTTGTCCTAAGAAAAAAACCGAAGGTGCTCCCCCCACGCGACGGACGTAGTCCTAGCCCTTAGGGGTTTCCGCTAAAGTTGTTTTGTCCGTTACACAATTTTAAAATTATTTAAAAGTTGTTGTTTATAAAAAAGATGCTCTTGCTTTTGAAAAATTATCTGGTATTATAATAATACCAGGTTTTAATGAAAAAGCTTGAATAATATAAAAAATAAAAAAGTTAAAAAACTTTTTTTCGGAGAAAATCAAAAATTAATAAAAAATTACAAATT ATGACAGCAATTTTAGAACGTCGTGAAAATACTAGCCTTTGGGCACGT

SEQ ID NO:5

AGGGAGGGAAATTTA。

序列表

<110> 中国科学院烟台海岸带研究所

<120> 一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 901

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaccagggt ttgacatgtc tagaattttt cagaaatgga aaagtgcttc ctttttatga 60

aaggaagaac tagaacacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgcgt tgacgtgtat 120

ggttaagtcc tgcaacgagc gcaaccctcg tctttagtta ctttccaagt tctctaaaga 180

gactgcgcgc gcaagcgctg aggaaggtga ggatgacgtc aagtcagcat gccccttaca 240

ccctgggcga cacgcgtaat acaatggttg ggacaatcag aagctacccc gtaagggcac 300

gccaatctgc taaactcaac cctagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc 360

cggaatctat agtaatcgcc agtcagctat atggcggtga atacgttcct ggtctctgta 420

cacaccgccc gtcacatcaa gaaaggtggt agtggattaa gctactagta acctctctga 480

ggaagacggt atccactcca agactactga tcatgatgaa gtcgtaacaa ggtaggggta 540

ctggaaggtg tccctggatc acctccttct ttttaggaat tttctatctg accctcctac 600

caggagacta ggacctttgg tcctagcctc acggtaaacc caaagggttt aggcttacct 660

tctcgtgagg ggagctgacg cgttagatgg aaaaataaaa gtttttccat ctataaagcg 720

taatgagata gaatcaataa aattatttaa aaggtgacct taaccgaacg taaatttacg 780

ttcggttaag gtcaccctta tatattctta tccaaaagaa ttttaatggg ctattagctc 840

agttggttag agcgcacccc tgataagggt gaggtcagaa gttcaaatct tctatagccc 900

a 901

<210> 2

<211> 731

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggaatgtag ctcagttggt agagcatcgc atttgcattg cgagggtcgc gggttcgaaa 60

cctgtcattt ccacaattat gaattgaaag ttaaaaaaag gagataaatt ttatctcctt 120

ttttagcgat tttaaaaaga aaaaaaaata aataaaagaa acaagaaaca aaaattatag 180

gtcaaatgaa cttaggctta cggtggagac ctaggcaccc agagacgaag aagggcgcag 240

ataccggcga aacgctccgg ggagttggca acaaactttg atccggagat ccccgaatag 300

ggcaacctgt acaacttcca acagaattca taagttggaa agaggcaacc cagtgaattg 360

aaacatctta gtagctggag gaaaagaaag caaacgcgat tcccgtagta gcggcgagcg 420

aaccgggaac agcctaaacc catttccatt agggaatggg ggtagtggga agacattata 480

attataaaaa aaatagaaaa taagagaaat tatcgaataa aattctttta cgaggcgccc 540

gcagacatcg tcgaggacga cgagtctagg tcgcctcgta gagctcgcct cgcagaggcg 600

acctacagaa ttttattcga gaattctcga agattttcaa tatccatagg atattgaaaa 660

cttcgataat ttataatctt tgtttataga tttattctct tttagagttt tctaaaaacg 720

aaacagctga a 731

<210> 3

<211> 943

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atccgcgtag agtaatagga gaatgttttt tggtatccaa ttataaattg attttttata 60

ttttttataa tatagttata tttataggca ataactaaaa aaccaaataa aattttctta 120

aataaaaatt ttctccttaa ttgaaatgaa aagttcgtat ataagggaat gaataataac 180

ttttgttaaa gttattaaca aaataacaaa taggtgcgtc cgttaaaaaa aaaaaaaatt 240

tagcggaaaa aaacaaagcg gaaaaaacaa agcggaaaaa acaaagcgga aaaaaaaaag 300

tttttttcct tagaaacaac tttagttaat atcgaagttt tcaatatcct ttaggatatt 360

gaaaatctta tagatttcta taagaaaatt ctaatagaga agaaaattta cgaagtaaat 420

tttctatttt cttcgataaa ttctgaaaga gaagaaaatt tactttgtaa atgttctatt 480

ttcttccgaa aatttttttc gcggaaaaaa caaaagaaaa atttttttta cgaaaaaaat 540

tttcccggac aaaactttgt tttgtcctaa ggaaaaaaca acaaagaaaa ttctgaaaga 600

attttctttg ttgttttgtc cggcataaaa aaattttctt tgtggttttg tcctaggaaa 660

acccgtcccc aaggcgggtc cgttcgtccg gcgtgaggag gggggcacct ttggtttttt 720

ccgctgatgg tttgtgtacg aggtcagctt ccatgggcgg ggcggctgtt tgcgatgctc 780

ttacgggctt aacacatgta tcttgtatag acctatttgt ttgtatcatt tatcttaaaa 840

gaacaaaaaa aaaattttta tggcaatgcg cacaccagaa gaattaagta atctaattaa 900

agatttaatt gaagaatata caccagaagt aaaaatggtg ctc 943

<210> 4

<211> 511

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccgatccgt ggtttagagt ttcccataag acaaatctgt acctacatac gaattagaat 60

atttaaattt ttatgactta tattgccaac aatgatgttc ataaaattat atagtacaga 120

ctaaataaaa ttttttcttt tttagcggaa aaaacaacaa ataaattttt ttttccggac 180

aaaacgttgt tttgtcctaa gaaaaaaacc gaaggtgctc cccccacgcg acggacgtag 240

tcctagccct taggggtttc cgctaaagtt gttttgtccg ttacacaatt ttaaaattat 300

ttaaaagttg ttgtttataa aaaagatgct cttgcttttg aaaaattatc tggtattata 360

ataataccag gttttaatga aaaagcttga ataatataaa aaataaaaaa gttaaaaaac 420

tttttttcgg agaaaatcaa aaattaataa aaaattacaa attatgacag caattttaga 480

acgtcgtgaa aatactagcc tttgggcacg t 511

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agggagggaa attta 15

Claims

1.一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体，包括启动子、终止子，其特征在于：重组空载体含SEQ ID NO:1所示碱基序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示碱基序列的下游同源臂，同源臂之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:5所示的碱基序列；

所述同源臂间插入选择标记基因。

2.按权利要求1所述的杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述上游同源臂与下游同源臂间插入至少一个启动子和终止子；其中，终止子为叶绿体原核性质的终止子。

3.按权利要求2所述的杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述重组空载体依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:5所示的碱基序列、终止子、和下游同源臂。

4.按权利要求3所述的杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述启动子为调控外源基因的启动子；

或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

5.按权利要求1所述的杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：

所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:1所示的序列3’端开始，向5’端延伸至不小于500 bp的连续片段；

所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:2所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于500 bp的连续片段；

所述启动子为SEQ ID NO:3所示的序列的序列所示碱基序列；

所述启动子为SEQ ID NO:4所示的序列的序列所示碱基序列；

所述选择标记基因为草丁膦抗性基因bar基因。

6.一种权利要求1所述的杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体在杜氏盐藻叶绿体转化中的应用。

7.按权利要求6所述的应用，其特征在于：将外源基因导入至所述构建的同源重组空载体再导入杜氏盐藻细胞，经培养筛选获得转基因杜氏盐藻。