CN109517054B

CN109517054B - SIRPα变体或其融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN109517054B
Application number: CN201811474372.2A
Authority: CN
Inventors: 魏化伟; 黄亚杰; 陈春巧
Original assignee: Jiangsu Dongkang Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Dongkang Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109517054A

Abstract

本发明公开了SIRPα变体或其融合蛋白及其应用，所述SIRPα变体具有如SEQ ID NO.2～3所示的氨基酸序列；所述融合蛋白包括SIRPα或其变体，以及第二蛋白；所述第二蛋白为IgG Fc或His6；本发明的变体和融合蛋白对CD47具有较高的亲和力，可以阻断SIRPα与CD47的结合，进而实现肿瘤的治疗。

Description

SIRPα变体或其融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及SIRPα变体或其融合蛋白及其用途。

背景技术

巨噬细胞是人体固有的免疫系统的主要成员，巨噬细胞通过吞噬作用识别和清除外来的、受损的或老化的细胞，以保持内环境的稳定，而CD47在肿瘤细胞表面的高表达，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，进而导致肿瘤患者体内，巨噬细胞无法清除杀灭肿瘤细胞。以CD47-SIRPα相互作用为靶点拮抗剂(抗CD47抗体、抗SIRPα-抗体以及SIRPα-Fc融合蛋白等)，可通过封闭CD47和SIRPα结合而激活巨噬细胞吞噬作用，使固有免疫反应系统发挥作用，增强抗肿瘤免疫反应。

抗CD47抗体或SIRPα-Fc融合蛋白可通过Fc效应子功能发挥作用，实现对肿瘤细胞的杀伤。如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)；同时抗CD47抗体可以通过阻断肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞或树突状细胞上的SIRPα结合而增强两种细胞对肿瘤细胞吞噬并加工提呈给T细胞，从而激活肿瘤细胞特异性的适应性免疫；抗CD47抗体还可通过诱导凋亡而直接清除肿瘤细胞，以上说明CD47可以通过多种途径参与和调节机体对肿瘤细胞的识别和清除，是一个很有潜力的抗肿瘤靶点。

由于CD47表达广泛，在正常细胞如红细胞、血小板、白细胞等血细胞上均表达，是细胞进化出的一种自我保护机制，保护正常细胞不被巨噬细胞清除。这同时导致了CD47与健康组织的结合需要施用更大的治疗剂量才能实现癌细胞上足够的受体占据，以及直接抑制“不要吃我”的信号会引入潜在的脱靶毒性的问题。目前国内外有多家企业在开发基于CD47的药物，且发现SIRPαFc具有穿透性和组织分布性好、安全性高的特点，但是目前的SIRPα分子设计在有效性与生产成本等方面仍存在局限性。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种具有更高靶点结合活性的SIRPα变体及其融合蛋白。

本发明的目的之二在于提供一种检测CD47存在或水平的方法和产品。

本发明的目的之三在于提供一种阻断SIRPα与CD47的结合的方法和产品。

本发明的目的之四在于提供一种治疗具有CD47上调的疾病细胞为特点的方法和产品。

本发明的第一方面提供了一种SIRPα变体，其特征在于，所述SIRPα变体包括与SEQID NO.1具有至少80％、至少85％、至少90％一致性的氨基酸序列。所述SIRPα变体与CD47的亲和力与野生型SIRPα相比提高至少3倍、至少5倍。

进一步，所述SIRPα变体包含对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、31、42、45、50、51、52、61、63、64、66、68、75、77或100的一个或多个位点上的修饰，其中，所述修饰可以是氨基酸的插入、缺失或取代。

进一步，所述修饰是取代。

进一步，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、42、45、50、51、52、61、63、64、66、68、75、77位中的至少一个被置换为SEQ ID NO.2所示的第29、42、45、50、51、52、61、63、64、66、68、75、77位的相应氨基酸。

进一步，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、31、45、51、52、63、64、68、75、77、100位中的至少一个被置换为SEQ ID NO.3所示的第29、31、45、51、52、63、64、68、75、77、100位的相应氨基酸。

本发明的第二方面提供了一种融合蛋白，包含SIRPα或其变体，以及第二蛋白；所述变体为本发明第一方面所述的变体。

作为一种实施方式，所述第二蛋白为免疫球蛋白或其片段。

进一步，所述免疫球蛋白或片段选自IgG。

进一步，所述IgG选自亚型IgG1或IgG4。

进一步，所述第二蛋白选自IgG1或IgG4的Fc片段及其突变型。

进一步，IgG1的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID.6所示，IgG4的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID.7所示。

进一步，所述第二蛋白为6×His，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步，SIRPα或其变体通过连接子与免疫球蛋白或其片段相连。

进一步，所述连接子(linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三方面提供了一种编码本发明第一方面所述的SIRPα变体或本发明第二方面所述的融合蛋白的核酸分子。

本发明的第四方面提供了一种包含本发明第三方面所述的核酸分子的表达载体。

进一步，所述SIRPα变体的N段连接有信号肽。

进一步，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第五方面提供了一种包含本发明第三方面所述的核酸分子或包含本发明第四方面所述的表达载体的宿主细胞。

本发明的第六方面提供了一种试剂盒，包含本发明第一方面所述的SIRPα变体或本发明第二方面所述的融合蛋白。

本发明的第七方面提供了一种药物组合物，包含本发明第一方面所述的SIRPα变体或本发明第二方面所述的融合蛋白。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的第八方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明第一方面所述的SIRPα变体、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的试剂盒在制备检测CD47的产品中的应用；

2)本发明第一方面所述的SIRPα变体、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的药物组合物在制备阻断SIRPα与CD47结合的产品中的应用；

3)本发明第一方面所述的SIRPα变体、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗过表达CD47的疾病的产品中的应用；优选的，所述疾病为肿瘤；更为优选的，所述肿瘤为血液肿瘤或实体肿瘤；更为优选的，所述肿瘤选自急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征；

4)本发明第一方面所述的SIRPα变体或本发明第二方面所述的融合蛋白在筛选过表达CD47抗原的疾病细胞中的应用，其中，当受试者中的癌细胞高密度呈现CD47抗原时，可使用本发明第一方面所述的SIRPα变体或本发明第二方面所述的融合蛋白来进行治疗。

本发明第九方面提供了一种阻断SIRPα与CD47结合的方法，包括施用有效量的本发明第一方面所述的SIRPα变体或本发明第二方面所述的融合蛋白。

本发明第十方面提供了一种用于制备SIRPα融合蛋白的方法，包括本发明第五方面所述的宿主细胞。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了高亲和力的SIRPα变体及其融合蛋白，所述SIRPα变体及其融合蛋白能有效的与CD47结合，抑制CD47-SIRPα信号通路，重新激活被抑制的免疫系统，进行肿瘤的治疗。

本发明提供了一种筛选过表达CD47抗原的疾病细胞的方法，通过筛选出过表达CD47抗原的疾病细胞的受试者，从而使用本发明的变体或融合蛋白来进行治疗，从而实现治疗的精准化。

附图说明

图1是SIRPα及其变体融合蛋白结构示意图，其中，图A是与IgG1Fc融合；图B是与IgG4Fc融合；图C是与His6融合；

图2是SIRPα及其变体融合蛋白编码DNA结构示意图；其中图A是与IgG Fc融合；图B是与His6融合；

图3是PTT5载体图谱；

图4是SIRPα及其变体融合蛋白与CD47的ELISA结合活性图，其中图A是变体B2F6融合蛋白与CD47的ELISA结合活性图；图B是变体D1H4融合蛋白与CD47的ELISA结合活性图。

具体实施方式

本发明基于SIRPα膜外端第一个区域与人免疫球蛋白的Fc片段连接而成融合蛋白，比SIRPα的整个膜外端与人免疫球蛋白的Fc片段连接而成的融合蛋白具有更高的靶点结合活性，制备出具有更高结合活性的SIRPα变体及融合蛋白。

本发明的SIRPα变体及其融合蛋白具有对肿瘤细胞上的肿瘤特异性抗原CD47的高结合亲和力；通过阻断CD47“别吃我”信号和免疫效应细胞的Fc依赖性激活的组合引起有效的抗体依赖的细胞吞噬(ADCP)作用。

本发明的“SIRPα”是指野生型、内源的成熟形式的SIRPα，以及SIRPα变体。

SIRPα的“变体”定义为与野生型SIRPα相比具有一个或多个氨基酸修饰的SIRPα氨基酸序列。所述修饰可以是删除、插入或取代。作为一种优选的实施方式，所述修饰是取代。本发明的变体可以具有“保守”修饰，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。较为罕见地，变体可以具有“非保守”修饰，例如，用色氨酸替换甘氨酸。

在一些实施方案中，与野生型SIRPα相比，SIRPα变体在胞外结构域的可变结构域中包含一个或多个突变。

作为优选的实施方案中，本发明的SIRPα变体包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第第29、31、42、45、50、51、52、61、63、64、66、68、75、77或100的一个或多个位点上的修饰。所述修饰可以是删除、取代或插入；优选的，所述修饰是取代。

作为可选择的实施方案，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、42、45、50、51、52、61、63、64、66、68、75、77位中的至少一个被置换为SEQ ID NO.2所示的第29、42、45、50、51、52、61、63、64、66、68、75、77位的相应氨基酸。

作为可选择的实施方案，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第29、31、45、51、52、63、64、68、75、77、100位中的至少一个被置换为SEQ ID NO.3所示的第29、31、45、51、52、63、64、68、75、77、100位的相应氨基酸。

作为一种优选的实施方案，SIRPα变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为另外一种优选的实施方案，SIRPα变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

免疫球蛋白

“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白分子”是指如本文定义的抗体或抗体的抗原结合片段，但也包括抗体的部分，例如重链或轻链可变或恒定区。免疫球蛋白的部分例如CH1，CH2，CH3，铰链(hinge)，VH1，CL和VL结构域以及Fc片段。此外，“免疫球蛋白”包括已经改造以包括抗原结合位点(“Fcab”)的Fc片段或区域。在一些实施方案中，“免疫球蛋白”可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgE，IgD或IgA，优选的免疫球蛋白是IgG1，IgG4。

作为可选择的实施方案，Fc片段引入一个或多个改变，通常不多于约5个这样的改变，包括影响某些Fc特性的氨基酸置换。

作为可选择的实施方案，Fc片段具有IgG1恒定区的野生型序列或共有序列。在可选的实施方案中，融合蛋白中引入的Fc区来源于具有典型效应子活性恒定区的任意IgG1抗体。

作为可选择的实施方案，Fc片段具有IgG4恒定区的野生型序列或共有序列。

作为一种具体并优选的实施方案中，Fc片段在第228位引入改变，其中该位的丝氨酸被脯氨酸置换(S²²⁸P)，由此稳定Fc二聚体内的二硫键。Fc片段内的其他改变可以包括改变糖基化的置换，如用甘氨酸或丙氨酸置换Asn²⁹⁷；半衰期增强的改变，T²⁵²L、T²⁵³S和T²⁵⁶F；以及许多其他的改变。特别有用的是在保持构象不变(例如保持Fc受体结合性)的同时能增强Fc特性的那些改变。

在一种具体的实施方案中，在Fc成分为IgG4Fc的情况中，Fc至少引入了S²²⁸P突变。

连接子

本发明的融合蛋白可包括将SIRPα或其变体与第二蛋白连接的连接子(linker)；优选的所述连接子为柔性氨基酸，从而使SIRPα和第二蛋白成分能够采取其活性构象。允许这样的柔性的残基通常为Gly、Asn和Ser，连接子中的这些残基(特别是Gly和Ser)的任意组合都可能提供期望的连接效果。

作为一种可选择的实施方式，所述连接子为(G4S)n，其中n为1、2、3或更多；或为Gn(n＝6～8)；或为G4SG3、G5S、(EAAAK)n(n＝1～3)、GSTSGGGSGGGSGGGGSS、GSTSGSGKPGSSEGSTKG、VEGGSGGSGGSGGSGGVD。

在本发明的具体实施方式中，所述连接子为G5S。

表达载体

本发明对表达载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。

宿主细胞

本发明中的用于导入载体的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，上述细胞包含(但并不限于)细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇或夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞，SP2/0，人淋巴样母细胞，COS，NSO，293T，Bowes黑素瘤细胞，HT-1080，BHK(幼仓鼠肾细胞)，HEK(人胚肾细胞)，PERC.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

术语“导入”是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。

本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的，用于大量药物生产的抗体表达。还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。

试剂盒

作为一种可选择的实施方式，本发明中的试剂盒包括本发明所制备的SIRPα变体或融合蛋白。作为另外一种可选择的实施方式，本发明的试剂盒包括诊断组合物，所述诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分/试剂。标签可非共价地缀合至本发明的SIRPα变体或其融合蛋白。标签还可通过共价键直接缀合至SIRPα变体或其融合蛋白。可选择地，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至上述SIRPα变体或其融合蛋白。缀合标签的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自(但并不限于)由酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。

本发明的试剂盒可用于CD47的检测，例如用于检测CD47的水平或在膜表面含有CD47的细胞的水平，可以通过例如在允许SIRPα变体或融合蛋白与CD47之间形成复合物的条件下，将样品(如体外样品)和对照样品与融合蛋白接触来实现利用SIRPα融合蛋白检测CD47。检测样品和对照中的融合蛋白与CD47之间所形成的任意复合物，并进行比较。可以对本发明的试剂盒或检测产品进行(例如)本领域公知的标准检测方法，例如ELISA和流式细胞法检验。

为了上述目的，从患者中取出组织标本，并且对其施用标记形式的变体或融合蛋白，优选将抗体覆盖在生物样品上。该过程还使分布的CD47抗原在活检肿瘤组织中被检测。对本领域技术人员显而易见的是，广泛的各种组织学方法都可用于原位检测。

更具体而言，利用标准检测分析，本发明的SIRPα变体或融合蛋白可用于监测在生物样品(如组织活检样品、细胞或体液)中融合蛋白的反应性存在与否。免疫学检验可包括直接检测，并且特别适合筛选大量的样品以检测CD47过表达的癌细胞的存在。例如，所述SIRPα变体或融合蛋白可在任意标准免疫检验形式(如ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、流式细胞检验或RIA检验)中用作任何抗体，从而检测复合物的形成。可用于这些检验分析中的直接或间接可视的任何合适的标记物包括但不限于：任何放射性标记、荧光标记、发色标记(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、或化学发光标记、或可利用标记的半抗原特异性抗体可视化的半抗原(例如毛地黄毒苷或生物素)或其他结合伴侣(如亲和素)。例如，利用本文所述的融合蛋白，利用标准流式细胞法可在细胞表面容易地检测到高密度的CD47。将发现含有标记的复合物的样品与合适的对照样品比较以指示高密度CD47的存在，由此指示可用本发明的SIRPα变体或融合蛋白治疗的疾病。

药物组合物

本发明中的药物组合物包括本发明的SIRPα变体及本发明所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物有利于抑制SIRPα和CD47之间的相互作用，从而阻断通过该轴的信号传递。已知SIRPα通过CD47对巨噬细胞的刺激作用能够通过使肌球蛋白-II和收缩性细胞骨架活性失活来抑制巨噬细胞介导的吞噬作用，所述肌球蛋白-II和收缩性细胞骨架活性参与将目标拉入巨噬细胞。因此，该级联反应的激活对于CD47过表达的疾病细胞的存活是重要的，并且阻断该通路能使巨噬细胞吞噬CD47过表达疾病细胞群，从而用于CD47过表达疾病的治疗。

本发明的药物组合物的活性成分(SIRPα变体或融合蛋白)可与合适的试剂缀合以形成药物缀合物。适合用于治疗疾病的试剂包括细胞毒试剂，如化疗剂和放疗剂。细胞毒素可通过非共价相互作用与活性成分缀合。在一个优选的实施方案中，所述缀合物包括细胞毒素和融合蛋白。细胞毒素成分可以为化疗剂、治疗抗体、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段、或小分子毒素)、或放射性同位素(如²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、¹¹¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re)、或能够抑制癌细胞生长或增殖的任意其他试剂。化疗剂包括美登素类化合物、调控或抑制荷尔蒙对肿瘤的作用的激素类试剂等。

药学上可接受的载体是指适合用于与人和动物的组织接触而不会造成过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的缓冲液、载体和赋形剂，其具有合理的益处/风险比。所述载体应该是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容并且对接受者无害。药学上可接受的载体包括与药物施用相容的缓冲液、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。

本发明中的药物组合物可以以剂量单位形式提供，并且可以通过任何合适的方法制备。药物组合物应当配制成与其预期的给药途径相容。给药途径例如：静脉内(IV)、皮内、吸入、经皮、局部、经粘膜、和直肠给药。所述药物组合物可用于肠胃外、鼻内、局部、口服或局部施用，例如通过透皮方式，用于治疗性治疗。所述药物组合物可在受血管或癌症状况影响的区域通过肠胃外施用(例如，通过静脉内、肌内、或皮下注射)，或通过口服，或通过局部施用或关节内注射施用。其它施用途径包括血管内、动脉内、肿瘤内，腹膜内、心室内、硬膜内、以及鼻、眼、眼内、眶内、直肠、局部或气雾剂吸入给药。

本发明提供了用于胃肠外施用的药物组合物，其包含溶解或悬浮在可接受的载体(优选水性载体例如水、缓冲水、盐水、PBS等)中的上述试剂。根据需要，所述组合物可以包含接近生理条件的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去污剂等。本发明还提供了用于口服递送的药物组合物，其可以含有惰性成分，例如用于配制片剂、胶囊等的粘合剂或填充剂。此外，本发明提供了用于局部给药的组合物，其可以含有惰性成分，例如用于配制霜剂、软膏等的溶剂或乳化剂。

本发明的适合于肠胃外给药的制剂组分包括：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如EDTA；缓冲剂，例如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。

对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体应在制造和储存条件下稳定，并应防止微生物。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。

本发明的药物组合物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，真空干燥和冷冻干燥从活性成分和其它期望成分的预先无菌过滤过的溶液产生活性成分和其它期望成分的粉末。可选择地，本发明的组合物可在溶液中，且在递送之前或递送时可加入和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂以提供可注射的单位剂型。优选地，本发明中使用的药学上可接受的赋形剂适用于高药物浓度，可保持适当的流动性，且如果需要可延迟吸收。

本发明的药物组合物可以药学有效量施用。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药物组合物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明中的“治疗”是指治疗哺乳动物，例如人的疾病。这包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)缓解疾病，即引起疾病状态的消退。

在一些实施方案中，所述药物组合物可用于抑制哺乳动物(例如人)中的肿瘤生长；在另外一些实施方案中，所述药物组合物可用于抑制肿瘤细胞的生长。

本发明的药物组合物可用于治疗任何CD47过表达的疾病，所述疾病包括血液肿瘤和实体肿瘤，例如急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。

融合蛋白的生产

一般来说，本发明的融合蛋白使用含有经改造以表达所述融合蛋白的核酸的哺乳动物细胞重组产生。如果本发明的免疫球蛋白融合蛋白需要表达两条或多条多肽链以装配所述融合蛋白，则本发明考虑编码每条多肽链的核酸包含在一个或多个细胞内，以重组生产所述融合蛋白。例如，在一个实施方案中，一个核酸编码本发明的融合蛋白的重链或其部分，而另一个核酸编码本发明的融合蛋白的轻链或其部分。编码重链或其部分的核酸或编码轻链或其部分的核酸也包括编码CD47结合部分的核酸序列，例如本文所述的SIRPα部分。在另一个实施方案中，细胞含有编码本发明的融合蛋白的重链或其部分的核酸，并且含有编码本发明的融合蛋白的轻链或其部分的核酸。编码本发明的免疫球蛋白融合蛋白的重链或其部分的核酸或编码轻链或其部分的核酸也含有编码CD47结合部分的核酸，例如本文所述的SIRPα部分。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 SIRPα变体-Fc融合蛋白的表达载体构建

本发明制备的野生型SIRPα及其变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，其中野生型SIRPα即SIRPα母本的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；变体B2F6的氨基酸序列为SEQID NO.2；变体D1H4氨基酸的序列为SEQ ID NO.3。

SIRPα及其变体通过连接子(linker)(氨基酸序列：SEQ ID NO.4)与IgG1Fc(氨基酸序列：SEQ ID NO.6)、IgG4Fc(氨基酸序列：SEQ ID NO.7)或6×His(氨基酸序列：SEQ IDNO.8)等连接形成融合蛋白，其蛋白结构示意图如图1所示。

为在哺乳动物细胞中分泌表达SIRPα及其变体，在构建表达载体时需在其N段加上分泌表达的信号肽(氨基酸序列：SEQ ID NO.5)，其编码DNA结构如图2所示。

采用pTT5作为表达载体(图3)，分别合成编码的DNA序列(SEQ ID NO.9～SEQ IDNO.15)，通过常规PCR在5’端引入EcoRI酶切位点，在3’端引入NotI酶切位点，插入到PTT5载体的EcoRI和NotI之间，构建获得真核表达载体。本发明中的SIRPα及其变体融合蛋白的氨基酸和DNA序列如表1所示。

表1 SIRPα及其变体融合蛋白的氨基酸和DNA序列

实施例2 SIRPα变体-Fc融合蛋白的表达和纯化

通过293E细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。

将处于对数生长期的293E细胞以4×10⁵/ml密度接种于摇瓶中，置于37℃、5％CO₂摇床，125r/min培养24小时后进行转染。

每100ml的293E细胞，取5mL的OPTI-MEM加入200μg的质粒，震荡混匀室温孵育5min，得到质粒溶液；另取5mL的OPTI-MEM加入600μg的PEI，震荡混匀室温孵育5min，得到PEI溶液；将质粒和PEI溶液混合，震荡混匀室温孵育20min，将反应混合物滴加入细胞中，置37℃、5％CO₂的摇床，125r/min培养，第4、6天流加补料，第8天收获上清。

以14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液。采用AKTA(GE公司)进行分离纯化，表达的Fc融合蛋白过Protein A亲和层析柱(MabSelect SuRe)，pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调节pH值至6.0，超滤浓缩后获得SIRPα及其变体的融合蛋白；表达的6×His融合蛋白过镍柱(HisTrap HP)，通过200mM咪唑洗脱，超滤置换缓冲液并浓缩后获得的6×His融合蛋白。

实施例3 SIRPα变体-Fc融合蛋白与CD47结合活性分析

包被液稀释CD47抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1×PBS稀释SIRPα及其变体的融合蛋白至5μg/mL，并以4倍梯度稀释后，以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h。清洗酶联板3次，加入羊抗人Fc-HRP二抗室温反应45min。清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。

以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。使用Graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中B代表斜率，C代表EC₅₀。

SIRPα及其变体与IgG1-Fc的融合蛋白与CD47的ELISA结合活性如图4和表2所示，SIRPα变体(B2F6、D1H4)与CD47结合活性高于野生型的SIRPα；同时，与IgG1-Fc的融合蛋白相比，与IgG4-Fc和6×His形成融合蛋白与CD47的结合活性基本一致。

表2 SIRPα变体-Fc融合蛋白与CD47的结合活性

融合蛋白	EC<sub>50</sub>(ng/mL)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	8.971
B2F6-IgG1Fc	4.283
		D1H4-IgG1Fc	3.209
野生型SIRPα-IgG4Fc	10.538
		B2F6-IgG4Fc	3.962
D1H4-IgG4Fc	3.405

实施例4 SIRPα变体-Fc融合蛋白与CD47亲和力检测

使用Fortebio生物膜层干涉技术测量样品与CD47抗原的结合动力学和亲合力。

用Anti-Human IgG Fc Capture(AHC)芯片捕获待测样品，将待测抗体的浓度用运行缓冲液(PBS+0.1％吐温20+0.02％BSA)稀释至10μg/mL，上样时间为90s；分析物CD47同样用运行缓冲液梯度稀释至相应的浓度(10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.3125nM、0.15625nM和0nM)，待测抗体与分析物结合时间300s，解离时间600s；芯片用10mM甘氨酸-HCl、pH 1.7溶液5s脉冲重复3次进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定平衡解离常数KD。

SIRPα变体(B2F6和D1H4)的平衡解离常数KD测定结果如表3所示，SIRPα变体与CD47的亲和力都高于野生型的SIRPα。

表3 SIRPα变体-Fc融合蛋白与CD47的亲和力

融合蛋白	KD(M)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	4.88×10<sup>-10</sup>
B2F6-IgG1Fc	7.55×10<sup>-11</sup>
		D1H4-IgG1Fc	7.04×10<sup>-11</sup>
野生型SIRPα-IgG4Fc	5.53×10<sup>-10</sup>
		B2F6-IgG4Fc	8.67×10<sup>-11</sup>
D1H4-IgG4Fc	6.91×10<sup>-11</sup>

实施例5 SIRPα变体-Fc融合蛋白竞争活性分析

包被液稀释CD47抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。用1×PBS稀释的SIRP-Fc-Biotin至3μg/mL，以上述溶液作为稀释液，以3倍浓度梯度稀释SIRPα变体-Fc融合蛋白，共获得12个浓度梯度。100μL每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应5min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数并计算IC₅₀值。

SIRPα变体(B2F6和D1H4)的IC₅₀值测定结果如表4所示，SIRPα变体的竞争活性高于野生型的SIRPα。

表4 SIRPα变体-Fc融合蛋白竞争活性

融合蛋白	IC<sub>50</sub>(μg/mL)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	2.81
B2F6-IgG1Fc	0.52
		D1H4-IgG1Fc	0.37

实施例6 SIRPα变体-Fc融合蛋白增强ADCP的作用

复苏冻存的PBMC细胞用无血清RPIM-1640重悬，37℃，5％CO₂贴壁2h。洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入重组人M-CSF(50ng/ml)。RPIM-1640完全培养基，置于培养箱诱导单核细胞向巨噬细胞分化。每2-3天半换液，第10天将诱导分化的巨噬细胞用无胰酶消化液消化，无血清1640洗两遍，计数调整细胞密度为4×10⁵个/ml。

用5mM CSFE标记Raji细胞，37℃标记15min，并加入40％血清终止反应。离心计数，将巨噬细胞和标记的Raji按照1:10比例混合，同时加入10μg/mL待测样品，37℃反应3h，加入FACS清洗一遍。加入APC-Anti-human CD14抗体，4℃标记30min。FACS洗液清洗细胞两次最终用1％多聚甲醛固定细胞，流式细胞仪上样检测。

SIRPα变体(B2F6和D1H4)的吞噬活性测定结果如表5所示，SIRPα变体的吞噬活性高于野生型的SIRPα。

表5 SIRPα变体-Fc融合蛋白的吞噬活性

融合蛋白	吞噬活性(％)
		野生型SIRPα-IgG1Fc	55.5％
B2F6-IgG1Fc	76.9％
		D1H4-IgG1Fc	91.2％

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 江苏东抗生物医药科技有限公司

<120> SIRPα变体或其融合蛋白及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

20 25 30

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

50 55 60

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly

20 25 30

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Thr Gly Arg Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Ser Arg Ser Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Leu Ser Gln Thr

50 55 60

Thr Arg Arg Asp Asn Met Asp Phe Ser Ile Lys Ile Gln Asn Ile Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Phe Pro Ile Gly

20 25 30

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Gln Arg Ser Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Thr

50 55 60

Thr Lys Arg Asp Asn Met Asp Phe Ser Ile Gln Ile Ser Asn Ile Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Ile Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 6

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 7

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

His His His His His His

1 5

<210> 9

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgatcccc gtgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc gggagctgat ctacaaccag aaggagggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttcagca tccggatcgg caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 420

cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 480

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacgcc 600

agcacctacc gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 720

aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 780

atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 900

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 960

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1020

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 1050

<210> 10

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc gtgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggcaccggcc ggagcctgat ctacaacagc cggagcggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

ctgagccaga ccacccggcg ggacaacatg gacttcagca tcaagatcca gaacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 420

cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 480

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacgcc 600

agcacctacc gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 720

aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 780

atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 900

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 960

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1020

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 1050

<210> 11

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc atcggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggctgctgat ctacaaccag cggagcggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgaga ccaccaagcg ggacaacatg gacttcagca tccagatcag caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacatc 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 420

cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 480

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacgcc 600

agcacctacc gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 720

aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 780

atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 900

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 960

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1020

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 1050

<210> 12

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgatcccc gtgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc gggagctgat ctacaaccag aaggagggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttcagca tccggatcgg caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 420

ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 480

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 540

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag 600

ttcaacagca cctaccgggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 660

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 720

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 780

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 840

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 900

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc 960

cggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1020

tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggcaag 1056

<210> 13

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc gtgggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggcaccggcc ggagcctgat ctacaacagc cggagcggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

ctgagccaga ccacccggcg ggacaacatg gacttcagca tcaagatcca gaacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacgtg 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 420

ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 480

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 540

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag 600

ttcaacagca cctaccgggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 660

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 720

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 780

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 840

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 900

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc 960

cggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1020

tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggcaag 1056

<210> 14

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc atcggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggctgctgat ctacaaccag cggagcggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgaga ccaccaagcg ggacaacatg gacttcagca tccagatcag caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacatc 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 420

ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 480

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 540

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag 600

ttcaacagca cctaccgggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 660

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 720

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 780

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 840

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 900

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc 960

cggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1020

tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggcaag 1056

<210> 15

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagctgcagg tgatccagcc cgacaagagc gtgctggtgg ccgccggcga gaccgccacc 60

ctgcggtgca ccgccaccag cctgttcccc atcggcccca tccagtggtt ccggggcgcc 120

ggccccggcc ggctgctgat ctacaaccag cggagcggcc acttcccccg ggtgaccacc 180

gtgagcgaga ccaccaagcg ggacaacatg gacttcagca tccagatcag caacatcacc 240

cccgccgacg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga agggcagccc cgacgacatc 300

gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg agcgtgcggg ccaagcccag cggcggcggc 360

ggcggcagcc accaccacca ccaccac 387

Claims

1.一种SIRPα变体，其特征在于，所述SIRPα变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示。

2.一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的SIRPα变体，以及第二蛋白。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二蛋白为免疫球蛋白或其Fc片段。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白选自IgG。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述IgG选自亚型IgG1或IgG4。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二蛋白选自IgG1或IgG4的Fc片段及其突变型。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，IgG1的Fc片段的氨基酸序列如SEQID.6 所示，IgG4 的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID.7 所示。

8.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二蛋白为6×His，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

9.根据权利要求2-8任一项所述的融合蛋白，其特征在于，SIRPα变体通过连接子与免疫球蛋白或其Fc片段相连。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

11.一种编码权利要求1所述的SIRPα变体或权利要求2-10任一项所述的融合蛋白的核酸分子。

12.一种包含权利要求11所述的核酸分子的表达载体。

13.根据权利要求12所述表达载体，其特征在于，所述SIRPα变体的N端连接有信号肽。

14.根据权利要求13所述的表达载体，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

15.一种包含权利要求11所述的核酸分子或包含权利要求12-14任一项所述的表达载体的宿主细胞。

16.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的SIRPα变体或权利要求2-10任一项所述的融合蛋白。

17.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的SIRPα变体，或权利要求2-10任一项所述的融合蛋白。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

19.如下任一项所述的应用：

1）权利要求1所述的SIRPα变体、权利要求2-10任一项所述的融合蛋白、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12-14任一项所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞或权利要求16所述的试剂盒在制备检测CD47的产品中的应用；

2）权利要求1所述的SIRPα变体、权利要求2-10任一项所述的融合蛋白、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12-14任一项所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞或权利要求17-18任一项所述的药物组合物在制备阻断SIRPα与CD47结合的产品中的应用；

3）权利要求1所述的SIRPα变体、权利要求2-10任一项所述的融合蛋白、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12-14任一项所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞或权利要求17-18任一项所述的药物组合物在制备治疗过表达CD47的疾病的产品中的应用。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，3）中所述疾病为肿瘤。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为血液肿瘤或实体肿瘤。

22.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。

23.一种非治疗目的的阻断SIRPα与CD47结合的方法，其特征在于，施用有效量的权利要求1所述的SIRPα变体或权利要求2-10任一项所述的融合蛋白。

24.一种用于制备SIRPα融合蛋白的方法，其特征在于，包括培养权利要求15所述的宿主细胞。