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CN109476750A - 抗cd40抗体及其用途 - Google Patents

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CN109476750A CN201780046023.8A CN201780046023A CN109476750A CN 109476750 A CN109476750 A CN 109476750A CN 201780046023 A CN201780046023 A CN 201780046023A CN 109476750 A CN109476750 A CN 109476750A
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Abstract

本发明提供新颖抗CD40抗体、包括这些新颖抗体的组合物、编码这些抗体的核酸、及制造与使用其的方法。

Description

抗CD40抗体及其用途
1.相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2016年5月27日申请的美国临时申请号62/342,417的权益,其内容通过引用以其整体并入本文中。
2.序列表
本申请含有序列表,该序列表已以ASCII格式以电子方式提交且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII复本创建于2017年5月17日,命名为381493-285WO_SL.txt且大小为108,670字节。
3.技术领域
本申请尤其是关于新颖抗CD40抗体、包括这些新抗体的组合物、编码这些抗体的核酸及制造与使用其的方法。
4.背景技术
癌症疗法包含广泛范围的治疗性方法,包括手术、放射及化学疗法。尽管各种方法容许医师广泛选择可用治疗来治疗癌症,但现有治疗剂存在许多缺点,例如缺乏靶向癌细胞超过正常健康细胞的选择性及癌症对治疗产生抗性。
与非靶向疗法(例如辐射治疗)相比,基于靶向治疗剂(其相对于正常细胞优先干扰癌细胞的细胞过程)的最近方法已产生具有较少副作用的化学治疗方案。
癌症免疫治疗,特别是活化宿主的免疫系统的T细胞以预防癌细胞的增殖或杀死癌细胞的试剂的发展,已作为补充现有护理的标准的有前景的治疗性方法出现。参见例如,Miller等人Cancer Cell[癌症细胞],27,439-449(2015)。这些免疫治疗方法包括研发用于调节免疫系统以杀死癌细胞的抗体。例如,抗PD-1阻断抗体派姆单抗(pembrolizumab)及尼沃鲁单抗(nivolumab)已在美国及欧盟经批准用以治疗诸如不可切除性或转移性黑素瘤及转移性非小细胞肺癌的疾病。抑制免疫抑制性蛋白(例如CTLA-4)的努力已导致抗CTLA-4抗体(例如曲美目单抗(tremelimumab)及伊匹单抗(ipilimumab))的研发及临床评估。
仍需要替代方法及额外癌症治疗以补充现存的治疗性护理标准。
5.发明内容
人类CD40(SEQ ID NO:40)为在抗原呈递细胞上表达的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员(TNF超家族成员5),这些抗原呈递细胞诸如,B细胞、树突状细胞(DC)及单核细胞以及非免疫细胞,包括某些类型的肿瘤细胞。当由人类CD40配体(SEQ ID NO:41)活化时,人类CD40活化抗原呈递细胞且诱导来自固有免疫系统及适应性免疫系统两者的反应。激动性CD40试剂可用于诱导免疫系统以预防肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞,且因此提供实体瘤的有效治疗性治疗。
本发明提供与人类CD40(SEQ ID NO:40)特异性结合的抗CD40抗体及其结合片段。例示性CDR的氨基酸序列以及例示性抗CD40抗体的重链及轻链的VH区及VL区的氨基酸序列提供于下文具体实施方式中。
本文所描述的抗CD40抗体的VH链及VL链提供可在存在或不存在CD40配体(CD40L)时活化人类CD40而不与CD40L-CD40结合相互作用竞争的变构激动性受体反应。此外,本发明抗CD40抗体通过与CD40的相互作用可增强CD40L与CD40结合。
抗CD40抗体可包括更改抗体的特性的修饰和/或突变,这些特性诸如,延长半衰期、增加或减少ADCC、或增加激动性活性,如本领域中已知。
本文提供包含编码本发明的抗CD40抗体的核苷酸序列的核酸,以及包含核酸的载体。另外,本文提供用包含编码所披露的抗CD40抗体的核苷酸序列的载体转化的原核及真核宿主细胞,以及经工程化以表达核苷酸序列的真核(诸如,哺乳动物)宿主细胞。还提供通过培养宿主细胞及回收抗体来制造抗体的方法,且进一步在下文具体实施方式中论述。
在另一方面中,本发明提供包括本文所描述的抗CD40抗体的组合物。组合物通常包含一种或多种如本文所描述的抗CD40抗体和/或其盐、及一种或多种赋形剂、运载体或稀释剂。
本发明提供用抗CD40抗体治疗经诊断具有实体瘤的受试者(诸如,人类受试者)的方法。该方法通常涉及向受试者施用一定量的本文所描述的可有效地提供治疗益处的抗CD40抗体。受试者可经诊断患有多种实体瘤中的任一种,这些实体瘤可以是新近诊断的、复发的、或复发且难治的。通常以静脉内输注或瘤内注射在介于约0.001mg/kg至约4mg/kg的范围内的剂量下来施用抗CD40抗体。通常以一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次或每八周一次静脉内输注或瘤内注射来施用抗CD40抗体。
可施用抗CD40抗体作为单一治疗剂(单药疗法)或辅助通常(但非必需)用于治疗实体瘤的那些的其他治疗剂,或与这些其他治疗剂一起施用。治疗剂通常应以其经批准的剂量、施用途径及施用频率来使用,但可以更低的剂量来使用。
抗CD40抗体可经由各种施用途径或模式来施用,这些施用途径或模式包括但不限于静脉内输注和/或注射、皮下注射及瘤内注射。施用的量将取决于施用途径、给药时间表、所治疗的癌症类型、所治疗的癌症的阶段、以及如本领域熟知的其他参数,例如患者的年龄和体重。经预测以提供治疗益处的具体例示性给药时间表在具体实施方式中提供。
基于本文提供的数据,预期本文所描述的抗CD40抗体将向诊断为具有实体瘤的受试者提供治疗益处。
6.附图说明
图1展示人类CD40受体(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列及人类CD40配体(SEQ IDNO:41)的氨基酸序列。
图2A至图2G提供例示性小鼠抗CD40抗体及人源化抗CD40抗体的VH及VL的氨基酸序列。图2A展示muAb1至muAb3的VH氨基酸序列及VI氨基酸序列;图2B展示muAb4至muAb7的VH氨基酸序列及VL氨基酸序列;图2C展示muAb8至muAb10的VH氨基酸序列及VL氨基酸序列;图2D展示muAb6及muAb8的人源化抗体的VH氨基酸序列及VL氨基酸序列;图2E展示muAb8及muAb9的人源化抗体的VH氨基酸序列及VL氨基酸序列;图2F展示muAb9的其他人源化抗体的VH氨基酸序列及VL氨基酸序列;及图2G展示muAb9的另外人源化抗体的VH氨基酸序列及VL氨基酸序列。
图3提供竞争实验对于人类CD40在CD40L与例示性抗CD40抗体之间的结果。左上方展示与CD40L竞争的例示性抗CD40抗体;右上方展示并不与CD40L显著竞争的抗体;左下方展示增强CD40-CD40L相互作用的抗体;右下方展示抗CD40抗体huAb9 A2I及CP-870,893的效果。Y轴描绘在650nm下的光学密度(OD);x轴描绘以μg/mL为单位的抗体剂量(“样品”)。
图4展示结合荧光染料的人类CD40在1μg/mL的固定浓度下在增加抗体huAb9 A2I、CP-870,893、人类IgG1(“huIgG1”)同种型或人类IgG2(“huIgG2”)同种型的量的存在下在表达人类CD40L的Jurkat细胞上的结合。Y轴描绘表示结合的平均荧光强度(“MFI”);x轴描绘以μg/mL为单位的抗体剂量(“样品”)。
图5A至图5B展示在3μg/mL下的抗体剂量(“样品”)或仅培养基对于来自HEK293蓝色CD40 NFκB报导细胞(与Jurkat D1.1细胞混合(1∶1比率))的NFκB信号的效果。将抗体huAb9 A2I、CP-870,893、人类IgG1(“huIgG1”)同种型或人类IgG2(“huIgG2”)同种型或仅培养基添加至单个样品。图5A描绘含有CD40L阴性(“CD40L-”)Jurkat D1.1细胞的培养物中的NFκB信号。图5B描绘含有CD40L阳性(“CD40L+”)Jurkat D1.1细胞的培养物中的NFκB信号。Y轴描绘在625nm下的OD;x轴描绘抗体或仅培养基治疗(“样品”)。
图6A至图6B展示表达CD16F、CD16V、CD32a、CD32b或CD64的CHO细胞中的抗体剂量(“样品”)(以μg/mL为单位)的huAb9-5与野生型huIgG1或与V273Y或V273E变体、或CP-870,893的结合。图6A展示表达CD16F(左上方)、CD16V(右上方)、CD32a(左下方)或CD32b(右下方)的CHO细胞上的抗CD40抗体的结合。图6B展示表达CD64的CHO细胞上的抗CD40抗体的结合。Y轴描绘表示结合的平均荧光强度(MFI);x轴描绘以μg/mL为单位的抗体剂量(“样品”)。
图7展示如与具有野生型人类IgG1的huAb9-5相比,抗体huAb9-5的恒定区变体V273E或V273Y在RL细胞中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。Y轴描绘RL细胞中的细胞毒性百分比;x轴描绘以μg/mL为单位的抗体剂量(“样品”)。
图8展示具有野生型人类IgG1、或恒定区变体V273E或V273Y的抗体huAb6-1(左上方)、huAb9-5(左下方)、huAb8-1(右上方)对于B细胞增殖的效果。右下方曲线展示具有人类IgG1 V273E变体或CP-870,893的huAb9 A2I的B细胞增殖效果。Y轴描绘以每分钟计数(CPM)为单位的B细胞增殖;x轴描绘以μg/mL为单位的抗体剂量(“样品”)。
图9展示具有野生型人类IgG1、或恒定区变体V273E或V273Y的抗体huAb6-1(左上方)、huAb9-5(左下方)及huAb8-1(右上方)对于树突状细胞(DC)活化的效果,如通过以pg/mL为单位的IL-12p70产量所量测。右下方曲线展示具有人类IgG1 V273E变体或CP-870,893的huAb9 A2I的DC活化。Y轴描绘以pg/mL为单位的IL-12p70;x轴描绘以μg/mL为单位的抗体剂量(“样品”)。
图10展示huAb6-1、huAb8-1或huAb9-5的V273Y变体对于DC及T细胞共培养物的效果,如通过以pg/mL为单位的干扰素-γ(IFN-γ)产量所量测。
图11展示抗体huAb6-1(上方)、huAb9-5(中间)或huAb9 A2I(下方)对于预防性PC3小鼠模型中的肿瘤体积(mm3)的效果。
图12展示在瘤内(IT)或腹膜内(IP)递送抗CD40抗体1C10或mIgG1同种型之后在携带两侧建立CT26同系肿瘤的小鼠模型中的活体内效果。在一侧向一个肿瘤施用IT给药,其中在肿瘤另一侧不注射。
图13展示在一周给药两次抗CD40抗体1C10(以0.6mg/kg)、抗PD-1抗体(以10mg/kg)或1C10及抗PD-1抗体两者的组合治疗之后,在CT26小鼠同系模型中对于肿瘤体积(mm3)的效果。
图14展示在给药抗CD40抗体1C10(“抗CD40”)、抗PD-1抗体(“抗PD-1”)或组合治疗(“抗CD40+抗PD-1”)24小时之后,CT26小鼠同系模型中的ALT(左上方)水平、TNFα(“TNFa”,左下方)水平或IL-6(右下方)水平。右上方曲线展示给药4天后脾重量。
7.具体实施方式
本发明是关于特异性结合人类CD40(SEQ ID NO:40)的抗体及片段、包含抗体的组合物、编码抗CD40抗体的聚核苷酸、能够制造抗体的宿主细胞、适用于制造抗体及结合片段的方法及组合物,及使用其的各种方法。
如本领域普通技术人员应了解,抗体在本质上为“模块化”的。在本发明中,描述构成抗体的各种“模块”的各种具体实施例。作为具体非限制性实例,描述VH CDR、VH链、VL CDR及VL链的各种具体实施例。希望所有具体实施例可彼此组合,如同明确单独地描述各具体组合。
7.1.缩写
本文所描述的抗体、结合片段、ADC及聚核苷酸在多个实施例中是借助于其各别多肽或聚核苷酸序列来描述。除非另外指明,否则多肽序列是以N→C取向提供;聚核苷酸序列以5’→3’取向。对于多肽序列,针对基因编码的氨基酸可使用常规三个字母缩写或一个字母缩写,如以下表1中所指出。
某些序列是用指定氨基酸残基属于某些类别(例如,脂族、疏水性的等)的结构化学式来定义。如本文所使用的基因编码的氨基酸属于的各种类别在以下表2中指出。一些氨基酸可能属于多于一种类别。半胱氨酸(其含有硫氢基)及脯氨酸(其构形上受限)并未指定类别。
用于本文披露的各种例示性抗体的缩写提供于以下表3中:
7.2.定义
除非本文中另外定义,否则结合本发明使用的科学与技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。
7.3.抗CD40抗体及结合片段
在一个方面中,本发明是关于特异性结合人类CD40受体(还称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5、TNFRSF5、Bp50及CD40L受体)的抗体和/或其结合片段。
如本文所使用,术语“抗体”(Ab)是指与特定抗原(此处为CD40)特异性结合的免疫球蛋白分子。在一些实施例中,本发明的抗CD40抗体与人类CD40结合且因此调节(例如,活化)免疫系统。所得免疫系统反应抑制诸如肿瘤细胞的细胞的增殖,且在一些例子中对于肿瘤细胞为细胞毒性的。本发明的抗CD40抗体包含轻链可变域及重链可变域两者中的互补决定区(CDR),还称为高变区。可变域的更高度保守部分称为框架(FR)。如本领域中已知,描绘抗体的高变区的氨基酸位置/边界可取决于上下文及本领域中已知的各种定义而变化。可变域内的一些位置可视为杂交高变位置,原因在于这些位置可根据一组标准认为在高变区内而根据一组不同的标准认为在高变区外部。这些位置中的一个或多个还可在延伸的高变区中找到。本发明提供包含这些杂交高变位置中的修饰的抗体。天然重链及轻链的可变域各自包含由三个CDR连接的四个FR区(大部分通过采用β片层构形),这三个CDR形成连接(且在一些情况下形成β片层结构的一部分)β片层结构的环。各链中的CDR由FR区紧密结合在一起,且与来自另一链的CDR一起促使形成抗体的靶结合位点。参见Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列](美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达(National Institute of Health,Bethesda,Md.)1987)。如本文所使用,除非另外指明,否则免疫球蛋白氨基酸残基的编号是根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统来进行。
本发明的抗体可为多克隆、单克隆、基因工程化和/或在本质上另外修饰的,包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、灵长类化抗体、单链抗体等。在各种实施例中,抗体包含抗体的恒定区的全部或一部分。在一些实施例中,恒定区为选自以下各项的同种型:IgA(例如,IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)及IgM。在具体实施例中,本文所描述的抗CD40抗体包含IgG1。在其他实施例中,抗CD40抗体包含IgG2。在其他具体实例中,抗CD40抗体包含IgG4。如本文所使用,抗体的“恒定区”包括天然恒定区、同种异型或天然变体,诸如D356E及L358M、或人类IgG1中的A431G。参见例如,Jefferis及Lefranc,MAbs,1(4):332-338(2009年7月-8月)。
抗CD40抗体的轻链恒定区可为κ(kappa)轻链区或λ(lambda)区。λ轻链区可为已知亚型中的任一者,例如,λ1、λ2、λ3或λ4。在一些实施例中,抗CD40抗体包含κ(kappa)轻链区。
如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于经由杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域中可用的或已知的任何方式自单一克隆获得,包括任何真核、原核或噬菌体克隆。用于本发明的单克隆抗体可使用本领域中已知的广泛多种技术来制备,包括杂交瘤技术、重组技术及噬菌体展示技术或其组合的使用。在本发明的多种使用(包括人类中的抗CD40抗体在活体内的使用)中,可适当地使用嵌合抗体、灵长类化抗体、人源化抗体或人类抗体。
如本文所使用,术语“嵌合”抗体是指具有源自非人类免疫球蛋白(诸如,大鼠或小鼠抗体)的可变序列及通常选自人类免疫球蛋白模板的人类免疫球蛋白恒定区的抗体。用于制造嵌合抗体的方法为本领域中已知的。参见例如,Morrison,1985,Science[科学]229(4719):1202-7;Oi等人,1986,BioTechniques[生物技术]4:214-221;Gillies等人,1985,J.Immunol.Methods[免疫学方法期刊]125:191-202;美国专利号5,807,715;4,816,567;和4,816,397中。
非人类(例如,鼠类)抗体的“人源化”形式为含有源自非人类免疫球蛋白的极少序列的嵌合免疫球蛋白。通常,人源化抗体将包含实质上所有至少一个及典型地两个可变域,其中所有或实质上所有CDR区与非人类免疫球蛋白的那些区相对应且所有或实质上所有FR区为人类免疫球蛋白序列的那些区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常为人类免疫球蛋白共同序列的那部分。抗体人源化方法为本领域中已知。参见例如,Riechmann等人,1988,Nature[自然]332:323-7;授予Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762、及6,180,370;EP239400;PCT公开WO 91/09967;美国专利号5,225,539;EP592106;EP519596;Padlan,1991,Mol.Immunol.[分子免疫学],28:489-498;Studnicka等人,1994,Prot.Eng.[蛋白质工程]7:805-814;Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]91:969-973;及美国专利号5,565,332。
“人类抗体”包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体,且包括自人类免疫球蛋白库或自针对一种或多种人类免疫球蛋白转基因且并不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体。人类抗体可利用各种本领域中已知的方法(包括噬菌体展示方法)使用源自人类免疫球蛋白序列的抗体库来制备。参见美国专利号4,444,887及4,716,111;PCT公开WO98/46645;WO 98/50433;WO 98/24893;WO 98/16654;WO 96/34096;WO 96/33735;和WO 91/10741。人类抗体还可使用不能表达功能内源性免疫球蛋白但可表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠来制造。参见例如,PCT公开WO 98/24893;WO 92/01047;WO 96/34096;WO 96/33735;美国专利号5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,885,793;5,916,771;和5,939,598中。另外,诸如LakePharma,Inc.(Belmont,CA)或Creative BioLabs(Shirley,NY)的公司可参与以使用类似于上文所描述的技术提供针对所选择的抗原的人类抗体。识别所选择表位的全人类抗体可使用被称作“定向选择”的技术来产生。在此方法中,所选择非人类单克隆抗体(例如,小鼠抗体)用于引导识别相同表位的完全人类抗体的选择(参见Jespers等人,1988,Biotechnology[生物技术]12:899-903)。
“灵长类化抗体”包含猴可变区及人类恒定区。用于制造灵长类化抗体的方法为本领域中已知。参见,例如美国专利号5,658,570;5,681,722;和5,693,780中。
本发明的抗CD40抗体包括能够特异性地结合CD40(例如,人类CD40(SEQ ID NO:40))的全长(完整)抗体分子。
还披露能够特异性地结合人类CD40的抗CD40结合片段。抗体结合片段的实例包括(借助于实例且非限制的)Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、单链Fv片段及单一域片段。
Fab片段含有轻链的恒定域及可变域以及重链的第一恒定域(CH1)及可变域。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于:在重链CH1域的羧基端处的几个残基的添加,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)片段是通过裂解在F(ab’)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的双硫键来制造。抗体片段的其他化学偶联法为本领域普通技术人员已知。Fab及F(ab’)2片段缺乏完整抗体的Fc片段,从动物的循环更快速清除,且具有比完整抗体更低的非特异性组织结合性(参见例如,Wahl等人,1983,J.Nucl.Med.[核医学杂志]24:316)。
“Fv”片段为含有完全靶识别及结合位点的抗体的最小片段。此区由紧密非共价缔合的一个重链可变域及一个轻链可变域的二聚体(VH-VL二聚体)构成。在此构型中,各可变域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常,六个CDR赋予抗体以靶结合特异性。然而,在一些情况下,即使单一可变域(或仅包含对标靶具有特异性的三个CDR的Fv的一半)可具有识别及结合标靶的能力,但其比完整结合位点具有更低的亲和力。
“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH域及VL域,其中这些域存在于单一多肽链中。通常,Fv多肽进一步包含在VH域与VL域之间的多肽连接体,该多肽连接体使得scFv能够形成用于靶结合的所需结构。
“单一域片段”是由对人类CD40具有足够亲和力的单一VH域或VL域构成。在一具体实施例中,单一域片段为驼峰化片段(参见例如,Riechmann,1999,Journal ofImmunological Methods[免疫学方法杂志]231:25-38)。
本发明的抗CD40抗体包括衍生抗体。例如,但并非限制性的,衍生抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、利用已知保护/阻断基团衍化、蛋白质分解性裂解、连接至细胞配体或其他蛋白质来修饰。可利用已知技术来进行诸多化学修饰中的任一者,这些技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素(tunicamycin)的代谢合成等。另外,衍生物例如使用Ambryx技术(参见例如,Wolfson,2006,Chem.Biol[化学生物学].13(10):1011-2)可含有一个或多个非天然氨基酸。
抗CD40抗体或结合片段可为其序列已经修饰以更改至少一个恒定区介导的生物效应功能的抗体或片段。例如,在一些实施例中,抗CD40抗体可经修饰以相对于未经修饰的抗体减少至少一个恒定区介导的生物效应功能,例如,减少与Fc受体(FcγR)(诸如,FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB)中的一个或多个的结合。FcγR结合可通过使抗体在对于FcγR相互作用必需的特定区处的免疫球蛋白恒定区区段突变来减少(参见例如,Canfield及Morrison,1991,J.Exp.Med.[实验医学杂志]173:1483-1491;及Lund等人,1991,J.Immunol[免疫学杂志].147:2657-2662)。抗体的FcγR结合能力的减少还可减少依赖于FcγR相互作用的其他效应功能,诸如,调理作用(opsonization)、吞噬及抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。
本文所描述的抗CD40抗体或结合片段包括已经修饰以相对于未经修饰的抗体获得或改良至少一个恒定区介导的生物效应功能例如以增强FcγR相互作用的抗体(参见例如,美国专利申请号2006/0134709)。例如,本发明的抗CD40抗体可具有以比对应野生型恒定区更大亲和力结合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB的恒定区。
因此,本发明的抗体可具有使调理作用、吞噬或ADCC增加或减少的生物活性的更改。此类更改为本领域中已知。例如,减少ADCC活性的抗体中的修饰描述于美国专利号5,834,597中。例示性ADCC降低变体对应于“突变3”(还称为“M3”,展示于美国专利号5,834,597的图4中),其中残基234及残基237(使用EU编号)经丙氨酸取代。突变3(还称为“M3”)变异可用于多种抗体同种型,例如,IgG2
在一些实施例中,本发明的抗CD40抗体具有较低水平的海藻糖或缺乏海藻糖。缺乏海藻糖的抗体已与增强的ADCC活性相关,尤其在较低剂量的抗体下。参见Shields等人,2002,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740;Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]278:3466-73。制备较低海藻糖抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中生长。YB2/0细胞表达较低水平的编码α-1,6-海藻糖基转移酶(一种对于多肽的海藻糖基化必需的酶)的FUT8 mRNA。
本发明的抗CD40抗体可包含经修饰(或变体)CH2域或完整Fc域,这些经修饰(或变体)CH2域或完整Fc域包括如相比于对应野生型CH2或Fc区的结合增加与FcγRIIB结合和/或减少与FcγRIIIA结合的氨基酸取代。变体CH2域或变体Fc域已描述于美国专利申请号2014/0377253中。变体CH2或变体Fc域通常包括在位置263、位置266、位置273及位置305处的一个或多个取代,其中Fc域中的残基的编号为如Kabat中的EU指数的彼编号。在一些实施例中,抗CD40抗体包含选自以下各项的一个或多个取代:相对于野生型CH2域的V263L、V266L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S、V273Y、V305K及V305W。在具体实施例中,CH2域的一个或多个取代是选自相对于人类IgG1的CH2域的V263L、V273E、V273F、V273M、V273S及V273Y。例如,IgG1 CH2域的一个或多个取代可为V273E。在另一具体实施例中,本发明的抗CD40抗体包含变体IgG1 CH2区,该变体IgG1 CH2区包含氨基酸取代V263L。
可提供如相比于对应野生型CH2或Fc区的结合而增加与FcγRIIB的结合和/或减少与FcγRIIIA的结合的变体CH2或变体Fc域的其他实例包括在Vonderheide等人Clin.Cancer Res.[临床癌症研究],19(5),1035-1043(2013)中发现的那些域,这些域诸如人类IgG1中的S267E或S267E/L328F。
在一些实施例中,抗CD40抗体或结合片段包括例如通过突变在涉及FcRn相互作用的特定区处的免疫球蛋白恒定区区段增加或减少其针对胎儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力的修饰(参见例如,WO 2005/123780)。在特定实施例中,IgG类别的抗CD40抗体经突变使得重链恒定区的氨基酸残基250、314及428中的至少一者单独经取代或以其任何组合经取代,这些组合诸如,在位置250及位置428处、或在位置250及位置314处、或在位置314及位置428处、或在位置250、位置314及位置428处,其中位置250及位置428为特定组合。对于位置250,取代氨基酸残基可为除苏氨酸以外的任何氨基酸残基,该氨基酸残基包括但不限于:丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314,取代氨基酸残基可为除亮氨酸以外的任何氨基酸残基,该氨基酸残基包括但不限于:丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428,取代氨基酸残基可为除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基,该氨基酸残基包括但不限于:丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。已知修饰Fc效应功能的例示性取代为Fc取代M428L,其可结合Fc取代T250Q发生。合适氨基酸取代的额外特定组合是在美国专利号7,217,797的表1中鉴别出。此类突变增加与FcRn的结合,此保护抗体免遭降解且延长其半衰期。
抗CD40抗体可具有插入至其CDR中的一个或多个中的一个或多个氨基酸,例如如Jung及Plückthun,1997,Protein Engineering[蛋白质工程]10:9,959-966;Yazaki等人,2004,Protein Eng.Des Sel.[蛋白质工程设计与选择]17(5):481-9.2004年8月17日电子出版;及美国专利申请号2007/0280931中所描述。
具有针对人类CD40的亲和力的抗CD40抗体可能为治疗性及诊断用途所需的。因此,本发明涵盖具有针对人类CD40的结合亲和力的抗体。在具体实施例中,结合人类CD40的抗CD40抗体具有至少约1000nM的亲和力但可呈现更高亲和力,例如,至少约900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或甚至更高。在一些实施例中,抗体以在约1pM至约1000nM范围内的亲和力或范围在前述值中的任一者之间的亲和力结合人类CD40。
抗CD40抗体针对人类CD40的亲和力可使用本领域中熟知或本文所描述的技术来测定,诸如但非限制性的,ELISA、等温滴定热量测定(ITC)、表面等离子共振或荧光偏振测定。
抗CD40抗体通常包含重链及轻链,该重链包含具有在本文中被称为(以N→C次序)VH CDR#1、VH CDR#2及VH CDR#3的三个互补决定区(“CDR”)的可变区(VH),该轻链包含具有在本文中被称为(以N→C次序)VL CDR#1、VL CDR#2及VL CDR#3的三个互补决定区的可变区(VL)。本文提供例示性CDR的氨基酸序列以及例示性抗CD40的重链及轻链的VH区及VL区的氨基酸序列。抗CD40抗体的具体实施例包括这些例示性CDR和/或VH和/或VL序列,以及与此类抗体竞争结合人类CD40的抗体。
在一些实施例中,抗CD40抗体的CDR的氨基酸序列是选自以下序列:
在一些实施例中,抗CD40抗体的各CDR彼此独立地经选择以在序列上对应于提供于表3中的抗体的各CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体为IgG,且具有在序列上对应于提供于表3中的抗体的VH及VL的VH及VL
在一些实施例中,抗CD40抗体包含VH链及VL链,该VH链在序列上对应于以下SEQ IDNO中的任一者:SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:109,该VL链在序列上对应于以下SEQ ID NO中的任一者:SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:160。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:101的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:151的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:102的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:152的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:103的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:153的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:104的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:154的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:105的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:155的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:106的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:156的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:106的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:157的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:107的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:158的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQID NO:108的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:159的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:109的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:160的VL链。
本文描述具有以上CDR的抗CD40抗体的具体例示性实施例。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:81的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQID NO:32、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62及SEQ ID NO:82的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63及SEQ IDNO:83的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:84的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:85的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQID NO:56、SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:86的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:86的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:87的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:87的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQID NO:68及SEQ ID NO:88的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:88的CDR。在一些实施例中,抗CD40抗体具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:68及SEQ ID NO:88的CDR。
在一些实施例中,抗CD40抗体适合于向人类施用。在一具体实施例中,抗CD40抗体为人源化。在另一具体实施例中,抗CD40抗体的CDR的氨基酸序列是选自:
在一些实施例中,抗CD40抗体包含VH链及VL链,该VH链在序列上对应于以下SEQ IDNO中的任一者:SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123,该VL链在序列上对应于以下SEQ ID NO中的任一者:SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQID NO:170或SEQ ID NO:171。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ IDNO:110的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:161的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:111的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:161的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:112的VH链及在序列上对应于SEQ IDNO:161的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:113的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:162的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:114的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:162的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:115的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:162的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:116的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:163的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:117的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:163的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:118的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:163的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:116的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:164的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:117的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:164的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ IDNO:119的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:165的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:120的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:165的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:121的VH链及在序列上对应于SEQ IDNO:166的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:117的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:167的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:117的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:168的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:117的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:169的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:117的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:170的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:117的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:171的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:118的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:164的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:122的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:167的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ ID NO:122的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:168的VL链。在一些实施例中,抗CD40抗体包含在序列上对应于SEQ IDNO:123的VH链及在序列上对应于SEQ ID NO:169的VL链。
在一些实施例中,抗CD40抗体与参考抗体在活体外分析中竞争结合人类CD40。在一些实施例中,抗CD40抗体竞争结合表达人类CD40的细胞上的人类CD40。参考抗体可为本文所描述的抗CD40抗体中的任一者。在一些实施例中,参考抗体为提供于表3中的抗体。在具体实施例中,参考抗体是选自:抗体AD163.9.3(“muAb1”)、抗体AD166.4.4(“muAb2”)、抗体AD175.14.11(“muAb3”)、抗体AD163.10.7(“muAb4”)、抗体AD165.1.2(“muAb5”)、抗体AD163.162.1(“muAb6”)、抗体AD163.27.12(“muAb7”)、抗体AD163.7.2(“muAb8”)、抗体AD164.14.6(“muAb9”)及抗体AD164.76.2(“muAb10”)。在一些实施例中,参考抗体为提供于表3中的抗体的人源化版本。在一些实施例中,参考抗体为muAb6、muAb8或muAb9的人源化版本。在一具体实施例中,参考抗体为huAb9-2。在另一实施例中,参考抗体为huAb9-5。在另一具体实施例中,参考抗体为huAb9 A2I。
抗CD40抗体的序列的翻译后修饰可发生诸如抗体重链的C端末端上的一个或多个(例如,1、2、3个或更多个)氨基酸残基的裂解。
在一些实施例中,抗CD40抗体包含根据SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:135中任一者的重链及根据SEQ ID NO:140至SEQ ID NO:142的轻链。在某些实施例中,抗CD40抗体包含根据SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131的重链及根据SEQ ID NO:140的轻链。在某些实施例中,抗CD40抗体包含根据SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133的重链及根据SEQ ID NO:140的轻链。在某些实施例中,抗CD40抗体包含根据SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的重链及根据SEQ ID NO:140的轻链。在某些实施例中,抗CD40抗体包含根据SEQ ID NO:132或SEQ IDNO:133的重链及根据SEQ ID NO:141的轻链。在某些实施例中,抗CD40抗体包含根据SEQ IDNO:132或SEQ ID NO:133的重链及根据SEQ ID NO:142的轻链。
本文所描述的抗CD40抗体通常与人类CD40特异性地结合。用于与来自其他物种(例如,来自猴,例如,食蟹猴)的CD40结合的抗体的交叉反应性可提供诸如能够在猴动物模型中针对生物活性进行测试的优势。此类动物模型测试可用于筛选抗CD40抗体以选择例如有利药物动力学的特性。在一些实施例中,抗CD40抗体与食蟹猴CD40结合。
竞争分析包括但不限于:放射性物质标记免疫分析(RIA)、酶联结免疫吸附分析(ELISA)、夹心ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析及表面等离子共振分析。
在于参考抗体与测试抗体(无论物种或同种型)之间进行抗体竞争分析中,可用可检测标记(诸如,荧光团、生物素或酶学(或甚至放射性)标记)将参考物首先标记以使得随后能够进行识别。在此情况下,与未标记的测试抗体一起孵育表达人类CD40的细胞,添加经标记的参考抗体,且量测结合标记的强度。若测试抗体与经标记的参考抗体竞争与重叠表位结合,则强度将相对于在无测试抗体的情况下进行的对照反应而减少。
在此分析的一具体实施例中,首先测定在分析条件(例如,指定细胞密度)下产生80%最大结合的经标记的参考抗体的浓度(“conc80%”),且在10×conc80%的未标记测试抗体及conc80%的标记参考抗体的情况下进行竞争分析。
抑制可表达为抑制常数或Ki,其根据以下式来计算:
Ki=IC50/(1+[参考Ab浓度]/Kd),
其中IC50为产生参考抗体的结合减少50%的测试抗体的浓度,且Kd为参考抗体的解离常数(一种其针对人类CD40的亲和力的量测值)。与本文披露的抗CD40抗体竞争的抗体在本文所描述的分析条件下可具有10pM至1000nM的Ki
在各种实施例中,若在于所使用的特异性分析条件下80%最大结合的参考抗体浓度下及在比参考抗体浓度高10倍的测试抗体浓度下,测试抗体使参考抗体的结合减少至少约20%或更多,例如,至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更多,或在前述值中的任一者之间变化的百分比,则测试抗体被认为与参考抗体竞争。
本文所描述的抗CD40抗体能够通过经由至少两种作用机制活化人类CD40来激动人类CD40(SEQ ID NO:40)。在一些实施例中,抗CD40抗体在不存在CD40L(SEQ ID NO:41)的情况下结合人类CD40,且增强人类CD40的信号传导。在一些实施例中,抗CD40抗体结合人类CD40L-CD40结合复合物,且增强人类CD40的信号传导。在一些实施例中,抗CD40抗体与选自列于表3中的人源化抗体的对照抗体竞争结合人类CD40(SEQ ID NO:40),且不依赖于人类CD40配体(SEQ ID NO:41)(即,在不存在或存在CD40L的情况下)活化人类CD40。
抗CD40抗体对于人类CD40-CD40L相互作用的效果可利用本领域中已知的分析来测定,这些分析诸如描述于实例2中的CD40L竞争分析。在含有抗CD40抗体的样品中量测的OD450与获自同种型对照抗体样品的OD450的比率(“OD450比率”)可用于测定抗CD40抗体对于与人类CD40结合的人类CD40L的效果。OD450比率为1指示无效果;小于1指示与CD40L竞争;大于1指示CD40L与CD40结合增强。在一些实施例中,抗CD40抗体增加(即,增强)人类CD40L(SEQ ID NO:41)针对人类CD40(SEQ ID NO:40)的结合,如由OD450比率所测定。利用OD450比率的CD40L与CD40结合的增强至少约为1.2,诸如约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.0或更大。
适用于评定抗体是否与如本文所描述的参考抗体竞争结合人类CD40的特异性分析及分析条件提供于实例2中。抗体竞争可利用如实例2中或描述于8.4.3部分中的竞争结合方案中所描述的表面等离子共振分析来测定。
尽管激动性CD40抗体活化免疫系统以发挥抗肿瘤效果,但跨越所有细胞类型的广泛全身性免疫活化可导致非所需的副效应。因此,在一些实施例中,如相比于参考抗CD40抗体,抗CD40抗体优于B细胞免疫反应选择性地活化树突状细胞介导的免疫反应。在一些实施例中,参考抗CD40抗体为CP-870,893。在一些实施例中,如相比于在描述于8.1.3部分中的分析中的相同剂量的参考抗CD40抗体下的IL-12p70的产量,在活化树突状细胞中抗CD40抗体具有类似活性,例如,在给定剂量下在约200%内的IL-12p70的产量,诸如,在约180%、150%、130%、110%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%或约5%内。在一些实施例中,如相比于参考抗CD40抗体,在活化B细胞中抗CD40抗体具有更低效能。在描述于8.5.3部分中的分析中,抗CD40抗体与参考抗CD40抗体的B细胞EC50比率可大于约1.5,诸如约2、3、4、5、6、8、10、15、20、30、40、50或更大。在一些实施例中,如相比于参考抗CD40抗体,抗CD40抗体在活化树突状细胞中具有类似活性且在活化B细胞中具有更低效能。
7.4.编码抗CD40抗体的聚核苷酸、制备抗体的表达系统及方法
本发明涵盖编码抗CD40抗体的免疫球蛋白轻链基因及重链基因的核酸分子、包含此类核酸的载体及能够制造本发明的抗CD40抗体的宿主细胞。
本发明的抗CD40抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链基因及重链基因来制备。为以重组方式表达抗体,用携带编码抗体的免疫球蛋白轻链及重链的DNA片段的一个或多个重组表达载体来转染宿主细胞,使得在宿主细胞中表达轻链及重链且任选地分泌至培养宿主细胞的培养基中,可从该培养基回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重链及轻链基因,将这些基因并入至重组表达载体中且将载体引入至宿主细胞中,这些宿主细胞诸如描述于Molecular Cloning;A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],第二版(Sambrook,Fritsch及Maniatis(编),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor),N.Y.,1989),Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方案](Ausubel,F.M.等人,编,格林出版联合公司(Greene Publishing Associates),1989)中及美国专利号4,816,397中的那些。
为产生编码此类抗CD40抗体的核酸,首先获得编码轻链可变区及重链可变区的DNA片段。这些DNA可通过扩增及修饰编码轻链可变序列及重链可变序列的种系DNA或cDNA来获得,例如使用聚合酶链反应(PCR)。人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列为本领域中已知(参见例如,“VBASE”人类种系序列数据库;还参见Kabat,E.A.等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学重要性蛋白质序列],第五版,U.S.Department of Health and Human Services[美国健康与公共事业部],NIH公开号91-3242;Tomlinson等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]22T:116-198;及Cox等人,1994,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]24:827-836;其各自的内容通过引用并入本文中)。
一旦获得编码抗CD40抗体相关的VH区段及VL区段的DNA片段,则可进一步利用标准重组DNA技术操纵这些DNA片段例如以将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中,编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质(诸如抗体恒定区或挠性连接体)的另一DNA片段。如用于此情况下,术语“可操作地连接”意指两个DNA片段接合使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保留于框内。
编码VH区的经分离DNA可通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2、CH3及任选地CH4)的另一DNA分子来转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列为本领域中已知(参见例如,Kabat,E.A.,等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列],第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services[美国健康与公共事业部],NIH公开号91-3242)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但在某些实施例中为IgG1或IgG4。对于Fab片段重链基因,编码VH的DNA可以可操作地连接到仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
编码VL区的经分离DNA可通过将编码VL的DNA可操作地连接于编码轻链恒定区CL的另一DNA分子来转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列为本领域中已知(参见例如,Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列],第五版,U.S.Department of Health andHuman Services[美国健康与公共事业部],NIH公开号91-3242)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区,但在某些实施例中为κ恒定区。为建立scFv基因,将编码VH及VL的DNA片段可操作地连接于编码挠性连接体(例如,编码氨基酸序列(Gly4~Ser)3(SEQ ID NO:200))的另一片段,使得VH及VL序列可被表达为邻接单链蛋白质,其中VL区及VH区由挠性连接体接合(参见例如,Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426;Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883;McCafferty等人,1990,Nature[自然]348:552-554。
为表达本发明的抗CD40抗体,将如上文所描述获得的编码部分或全长轻链及重链的DNA插入至表达载体中,使得基因可操作地连接于转录及翻译控制序列。在此上下文中,术语“可操作地连接”意指,将抗体基因接合至载体中使得在载体内的转录及翻译控制序列提供调整抗体基因的转录及翻译的其预定功能。选择表达载体及表达控制序列以与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因及抗体重链基因插入至独立载体中,或更通常将两个基因插入至同一表达载体中。
利用标准方法(例如,抗体基因片段及载体上的互补限制位点的接合,或在不存在限制位点时平头端接合)将抗体基因插入至表达载体中。在插入抗CD40抗体相关的轻链或重链序列之前,表达载体可能已经携带抗体恒定区序列。例如,将抗CD40单克隆抗体相关的VH序列及VL序列转化成全长抗体基因的一种方法是分别地将其插入至已经编码重链恒定区及轻链恒定区的表达载体中,使得VH区段可操作地连接于在载体内的一个或多个CH区段,且VL区段可操作地连接于在载体内的CL区段。另外或可替代地,重组表达载体可编码促进抗体链自宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可克隆至载体中,使得信号肽在框内连接于抗体链基因的氨基端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即,来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因以外,本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、强化子及控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如,聚腺苷酸化信号)。此类调节序列,例如,描述于Goeddel,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology[基因表达技术:酶学方法]185,学术出版社(Academic Press),圣地亚哥(San Diego),加利福尼亚州(CA),1990中。本领域普通技术人员应了解,表达载体的设计(包括调节序列的选择)可能视诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达量等因素而定。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调节序列包括在哺乳动物细胞中引导较高蛋白质表达量的病毒元件,诸如,源自巨细胞病毒(CMV)(诸如,CMV启动子/强化子)、猴病毒40(SV40)(诸如,SV40启动子/强化子)、腺病毒(例如,腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒的启动子和/或强化子。对于病毒调节元件及其序列的进一步描述,参见例如,Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等人的美国专利号4,510,245及Schaffner等人的美国专利号4,968,615。
除抗体链基因及调节序列以外,本发明的重组表达载体可携带额外序列,这些额外序列诸如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如,复制起点)及可选标记基因。可选标记基因有助于已引入载体的宿主细胞的选择(参见例如,均为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665及5,179,017)。例如,在已引入载体的宿主细胞上,可选择标记基因通常赋予对诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的药物的抗性。合适可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(适用于用甲氨蝶呤选择/扩增DHFR-宿主细胞)及neo基因(用于G418选择)。对于轻链及重链的表达,利用标准技术将编码重链及轻链的一个或多个表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意在涵盖通常用于将外源性DNA引入至原核或真核宿主细胞中的广泛多种技术,例如,电穿孔、脂质体转染、磷酸钙沉淀、DEAE-聚葡萄糖转染及类似者。
有可能在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。在某些实施例中,抗体的表达是在最佳分泌正确地折叠及免疫主动抗体的真核细胞(例如,哺乳动物宿主细胞)中进行。用于表达本发明的重组抗体的例示性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括DHFR-CHO细胞,其描述于Urlaub及Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216-4220中,与DHFR可选标记一起使用,例如,如Kaufman及Sharp,1982,Mol.Biol.[分子生物学]159:601-621中所描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入至哺乳动物宿主细胞中时,抗体是通过培养宿主细胞持续足以允许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌至生长宿主细胞的培养基中的时间段来制造。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。宿主细胞还可用于制造完整抗体的部分,诸如,Fab片段或scFv分子。应了解,以上程序上的变化形式是在本发明的范畴内。例如,可能需要用编码本发明的抗CD40抗体的轻链或重链(但并非两者)的DNA转染宿主细胞。
重组DNA技术还可用于将编码对于与人类CD40结合不必需的轻链及重链中的任一者或两者的DNA的一些或所有移除。自此类截断DNA分子表达的分子还由本发明的抗体涵盖。
对于本发明的抗CD40抗体的重组表达,可用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞,第一载体编码源自多肽的重链且第二载体编码源自多肽的轻链。两种载体可含有相同可选标记,或其可各自含有独立可选标记。可替代地,可使用编码重链多肽及轻链多肽两者的单一载体。
一旦核酸编码抗CD40抗体的一个或多个部分,则可将其他更改或突变引入至编码序列中,例如以产生编码具有不同CDR序列的抗体、具有针对Fc受体亲和力减少的抗体或不同亚类的抗体的核酸。
本发明的抗CD40抗体还可利用化学合成法(例如,利用描述于Solid PhasePeptide Synthesis[固相肽合成],第2版,1984皮尔斯化学公司(The Pierce ChemicalCo.),罗克福德(Rockford),伊利诺伊州(Ill)中的方法)来制造。变体抗体还可使用无细胞平台来产生(参见例如,Chu等人,Biochemia[生物化学]第2期,2001(罗氏分子生物公司(Roche Molecular Biologicals))及Murray等人,2013,Currem Opinion in ChemicalBiology[化学生物学新见],17:420-426。
一旦已利用重组表达制造本发明的抗CD40抗体,则其可通过本领域中已知的任何纯化免疫球蛋白分子的方法来纯化,例如,通过层析(例如,离子交换、亲和层析及尺寸分级柱层析)、离心、不同可溶性、或通过纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外,可将本发明的抗CD40抗体融合至本文所描述或本领域中另外已知便于纯化的异源多肽序列。
一旦分离,则抗CD40抗体可(若需要)例如通过高效液相层析(参见例如,Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology[生物化学和分子生物学实验室技术],Work及Burdon,编,爱思唯尔出版公司(Elsevier),1980)或通过SuperdexTM75管柱凝胶过滤层析(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech AB),乌普萨拉(Uppsala),瑞典(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden))来进一步纯化。
7.5.药物组合物
本文所描述的抗CD40抗体可呈组合物形式,这些组合物包含抗体及一种或多种运载体、赋形剂和/或稀释剂。可以将组合物配制用于特定用途,例如用于兽医用途或人类的药物用途。组合物的形式(例如干粉、液体配制品等)和使用的赋形剂、稀释剂和/或运载体将取决于ADC的预期用途,以及针对治疗用途的给药方式。
对于治疗性用途,组合物可作为包括药学上可接受的运载体的无菌、药物组合物的一部分来提供。此组合物可呈任何合适的形式(视向例如人类受试者的受试者(即,患者)施用其的所需方法而定)。药物组合物可利用各种途径来向受试者施用,这些途径诸如,经口、经皮、皮下、鼻内、经静脉内、肌内、瘤内、鞘内、表面或局部。在任何给定情况下的最合适施用途径将视特定抗体、受试者、及疾病的性质与严重程度以及受试者的生理条件而定。通常,药物组合物应经静脉内或皮下施用。
药物组合物可宜以每剂量含有预定量的本文所描述的抗CD40抗体的单位剂量形式存在。包括于单位剂量中的抗CD40抗体的数量将视所治疗的疾病以及如本领域中所熟知的其他因素而定。此类单位剂量可呈含有适合于单次施用的一定量的抗体的冻干干粉形式,或呈液体形式。干燥粉单位剂型可以与注射器、适量的稀释剂和/或其他可用于给予的组分包装在试剂盒中。呈液态形式的单位剂量可宜呈预填有适合于单次施用的一定量的抗CD40抗体的注射器形式来提供。
药物组合物还可呈含有适合于多次施用的一定量的抗CD40抗体的块体形式来提供。
可通过使具有所需纯度的抗体与任选地选用的本领域中通常采用的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(以上所有在均本文中均被称为“运载体”),即,缓冲剂、稳定剂、防腐剂、离子等张剂、非离子清洁剂、抗氧化剂及其他混杂添加剂混合来制备用于储存为冻干配制品或水溶液的药物组合物。参见,Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第16版(Osol编辑,1980)。这样的添加剂在所用的剂量和浓度下应对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围内。其可在广泛多种浓度下存在,但应通常以介于约2mM至约50mM范围内的浓度存在。适用于与本披露一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者及其盐,如柠檬酸盐缓冲液(例如,柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如,琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如,酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲液(例如,富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如,葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如,草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如,乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钾混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸盐缓冲液(例如,乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外,可使用富马酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液及三甲胺盐,诸如,2-氨基-2-羟甲基-丙-1,3-二醇(即,Tris、THAM或三(羟甲基)氨基甲烷)。
可添加有时被称为“稳定剂”的等张剂以确保本发明的液体组合物的等张性,且这些等张剂包括多羟基糖醇、例如三元醇或更高糖醇,诸如,丙三醇、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂,其就功能而言范围从膨胀剂到溶解治疗剂或者有助于防止变性或粘附到容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上面列举的);氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)、有机糖或糖醇(如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇)、甘油等,包括环多醇(如肌醇);聚乙二醇;氨基酸聚合物;含硫还原剂,诸如,尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油及硫代硫酸钠;低分子量多肽(例如,具有10个残基或更少残基的肽);亲水性聚合物,诸如,聚乙烯吡咯啶酮单糖,诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖;双糖,诸如,乳糖、麦芽糖、蔗糖及海藻糖;及三糖,诸如,棉子糖;以及多糖如右旋糖酐。稳定剂可以介于每重量的抗CD40抗体0.5重量%至10重量%范围内的量存在。
可添加非离子表面活性剂或清洁剂(还称为“润湿剂”)以帮助溶解糖蛋白以及保护糖蛋白免于搅拌诱发的聚集,其还准许配制品暴露于剪切应力表面而不导致蛋白质的变性。合适非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(poloxamer)(184、188等)及普洛尼克(pluronic)多元醇。非离子表面活性剂可以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL的范围存在。
适合于经由静脉内输注施用的水性组合物的具体例示性实施例包含10mg/mL的抗CD40抗体,15mM组氨酸缓冲液,pH 6.0,8.0%(w/v)蔗糖及0.05%(w/v)聚山梨醇酯80。在某些实施例中,抗CD40抗体为描述于表3中的人源化抗体中的任一者。组合物可呈冻干粉末形式,该冻干粉末在用2.0mL无菌水或其他适合于注射或输注的溶液(例如,0.9%盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、乳酸化林格氏溶液等)复水后,提供上文水性组合物。组合物或其他实施例的组合物还可呈预填有一定量的适合于单次施用抗CD40抗体的组合物的注射器或其他适合于注射和/或输注的器件形式。
7.6.使用方法
7.6.1.治疗益处
本文所提供的数据表明,本文所描述的在肿瘤细胞存在下激动CD40的抗CD40抗体在活体内针对这些实体瘤发挥强效抗肿瘤活性。因此,抗CD40抗体、结合片段和/或包含抗CD40抗体的药物组合物可用于治疗学上治疗实体瘤。
通常,这些方法涉及向具有实体瘤的人类患者施用有效量的激动CD40的抗CD40抗体,且杀死肿瘤细胞和/或降低肿瘤细胞的增殖以提供治疗益处。可用抗CD40抗体治疗的实体瘤包括但不限于:肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳癌、结肠直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾脏癌、肝癌、肺癌(例如,非小细胞肺癌、间皮瘤)、头颈癌(例如,头部及颈部的鳞状细胞癌)、淋巴瘤(例如,B细胞淋巴瘤)、黑素瘤(例如,晚期恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤)、口腔癌、卵巢癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中,实体瘤为头颈癌、肺癌、黑素瘤或胰腺癌。
癌症可为最新诊断的且未经治疗,或可为复发的、难治性、或复发及难治性、或转移性形式的实体瘤。实际上,小鼠PC3预防性模型中的活体内资料(图12)展示,相比于用同种型抗体给药,抗CD40抗体在减少肿瘤大小上是有效的。
不希望被理论所束缚,据信,抗CD40抗体通过激动CD40活化免疫系统。接着,后续免疫反应对邻接肿瘤细胞发挥抗肿瘤效果,而与CD40表达量无关。因此,预测本发明的抗CD40抗体针对CD40阳性实体瘤或CD40阴性实体瘤有效。
本发明的抗CD40抗体可单独施用(单药疗法)或辅助其他抗癌疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂,或与其他抗癌疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂一起施用。无论是作为单药疗法施用或辅助其他疗法或试剂,抑或与其他疗法或试剂一起施用,施用一定量的抗CD40抗体,使得整体治疗方案提供治疗益处。
治疗益处意思是,与无疗法(当合适时)或已知护理标准相比,使用抗CD40抗体以治疗患者体内的癌症,产生任何经证实的临床益处。临床益处可利用本领域普通技术人员已知的任何方法来评定。在一个实施例中,临床益处是根据客观反应率(ORR)(使用RECIST版本1.1测定)、反应持续时间(DOR)、无进展存活(PFS)和/或整体存活(OS)来评定。在一些实施例中,完全反应指示治疗益处。在一些实施例中,部分反应指示治疗益处。在一些实施例中,稳定疾病指示治疗益处。在一些实施例中,增加整体存活指示治疗益处。在一些实施例中,治疗益处可构成疾病进展的及时改善和/或症状或生活质量的改善。在其他实施例中,治疗益处不能解释为疾病控制的时间段增加,而是显著地减少症状负荷,从而使得生活质量改善。如对本领域普通技术人员显而易见的是,治疗益处可使用单独抗CD40抗体(单药疗法)或辅助其他抗癌疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂,或与其他抗癌疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂一起来观测。
通常,治疗益处是使用经设计以量测新治疗针对癌症的反应的标准临床测试来评定。为分析本文所描述的抗CD40抗体的治疗性益处,可使用以下测试的一个或组合:(1)实体瘤的反应评价标准(the Response Evaluation Criteria In Solid Tumors,RECIST)版本1.1;(2)美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态(the Eastern CooperativeOncologyGroup(ECOG)Performance Status);(3)免疫相关反应准则(irRC);(4)由肿瘤抗原的评定可评估的疾病;(5)经验证患者报导结果量表;和/或(6)针对整体存活及无进展存活的Kaplan-Meier估计。
肿瘤负荷改变的评定是癌症疗法的临床评价的重要特征。肿瘤缩小(目标反应)及疾病进展的发展的时间两者均为癌症临床试验中的重要端点。标准化反应准则,被称为RECIST(实体瘤的反应评价标准),在2000年出版。在2009年发布更新(RECIST 1.1)。RECIST准则通常用于目标反应为初级研究端点的临床试验,以及进行稳定疾病的评定、肿瘤进展或进展分析的时间的试验,这是因为,这些结果量测是基于解剖肿瘤负荷的评定及其对于试验疗程的改变。表4提供用于测定研究药物(诸如,本文所描述的抗CD40抗体)的目标肿瘤反应的反应准则的定义。
可用于测定本文所描述的抗CD40抗体的治疗益处的二级结果量测包括:客观反应率(ORR)、无进展存活(PFS)、整体存活(OS)、整体反应持续时间(DOR)及反应深度(DpR)。ORR被定义为达成完全反应(CR)或部分反应(PR)的参与者的比例。PFS被定义为自抗CD40抗体的第一次给药日至疾病进展或死亡(以先发生者为准)的时间。OS被定义为自诊断之日或针对疾病的治疗开始起诊断具有疾病的患者仍存活的时间长度。DOR被定义为自参与者的初始CR或PR至疾病进展的时间的时间。DpR被定义为在最大反应点处观测到的肿瘤缩小相比于基线肿瘤负荷的百分比。ORR及PFS两者的临床端点可根据上文所描述的RECIST 1.1准则来测定。
展示于表5中的体能状态的ECOG等级用于描述患者在其护理自身的能力、日常活动及生理能力方面的功能水平。这些级是由美国东部肿瘤协作组(ECOG)(现今ECOG-ACRIN癌症研究组的一部分)研发,且在1982年公开。
可用于完全表征及测定针对免疫治疗试剂的反应(例如,基于抗体的癌症疗法)的另一组准则是免疫相关反应准则(irRC),该准则是针对实体瘤的量测在2009年研发,且在2013年更新(Wolchok,等人Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]2009;15(23):7412-7420及Nishino,等人Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]2013;19(14):3936-3943,将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文中)。经更新irRC准则通常用于评估免疫治疗剂(诸如,本文所描述的抗CD40抗体)对于肿瘤负荷的效果,且根据表6定义反应。
由使用本文所描述的抗CD40抗体治疗实体瘤(无论是作为单药疗法施用或辅助其他疗法或试剂,抑或与其他疗法或试剂一起施用)产生的一例示性治疗益处为完全反应。由使用本文所描述的抗CD40抗体治疗实体瘤(无论是作为单药疗法施用或辅助其他疗法或试剂,抑或与其他疗法或试剂一起施用)产生的另一例示性治疗益处为部分反应。
经验证患者报导结果量表还可用于指由各患者经由特定报导系统提供的反应。这类结果量表不是以疾病为焦点,而是与管理慢性病症时的保留的功能有关。经验证患者报导结果量表的一个非限制性实例为来自美国国家卫生研究院(the United StatesNational Institutes of Health)的(患者报导结果量测信息系统)。例如,用于成年癌症患者的生理功能仪器可评估针对上肢(例如,灵巧性)、下肢(例如,步行或运动性)及中枢区(例如,颈部、背部运动性)的功能的自身报导能力,且包括常规日常活动,诸如日常杂务。
Kaplan-Meier曲线(Kaplan及Meier,J.Am.Stat.Assoc.[美国统计学会杂志]1958;53(282):457-481)还可用于估计经历抗CD40抗体疗法的癌症患者相比于标准护理法的整体存活及无进展存活。
7.6.2.辅助疗法
抗CD40抗体可用于辅助或并与具有抗癌特性的其他药剂或治疗法一起使用。当辅助使用时,抗CD40抗体及一种或多种其他药剂可共同配制成单一的组合药物配制品,或可在单一协同给药方案上或在不同给药方案上分开配制及施用。辅助或与抗CD40抗体一起施用的药剂通常具有针对抗CD40抗体的互补活性,使得抗体与其他药剂彼此没有不利影响。
可辅助或与抗CD40抗体一起施用的药剂包括但不限于:烷基化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增生剂、抗病毒剂、极光(aurora)激酶抑制剂、细胞凋亡启动子(例如,Bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路的活化剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞衔接剂)抗体、抗体药物结合物、生物反应调节剂、周期素依赖型激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环加氧酶-2抑制剂、DVD、白血病病毒瘤基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白质(HSP)-90抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫药物、细胞凋亡蛋白质的抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、雷帕霉素的哺乳动物标靶(mTor)抑制剂、微RNA、有丝分裂原活化胞外信号调节的激酶抑制剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、聚ADP(腺苷二磷酸)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂化学治疗剂、布鲁顿氏(Bruton’s)酪氨酸激酶(BTK)抑制剂(例如,依鲁替尼(ibrutinib)、阿卡拉如替尼(acalabrutinib))、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄素/类维生素D植物碱(retinoid/deltoids plant alkaloid)、小型抑制性核糖核酸(siRNA)、拓朴异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂及类似者,以及这些药剂中的一个或多个的组合。
免疫药物的实例包括但不限于干扰素、免疫检查点抑制剂及其他免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a、(干扰素γ-1b)或干扰素γ-n1、其组合及类似者。免疫检查点抑制剂包括靶向PD-1(例如,派姆单抗及尼沃鲁单抗)、PD-L1(例如,德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、MEDI4736、MSB0010718C及MPDL3280A)及CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4;例如,伊匹单抗、曲美目单抗)的抗体。免疫增强试剂包括活化T细胞的抗OX40激动性抗体。在某些实施例中,展示于表3中的人源化抗CD40抗体辅助派姆单抗来施用。在其他某些实施例中,展示于表3中的人源化抗CD40抗体辅助尼沃鲁单抗来施用。
抗CD40抗体还可用于增强放射疗法的疗效。放射疗法的实例包括外部光束放射疗法、内部放射疗法(即,近接疗法)及全身性放射疗法。
7.7.剂量及施用方案
所施用抗CD40抗体的量将视各种因素而定,这些因素包括但不限于:所治疗实体瘤的特定类型、所治疗实体瘤的阶段、施用模式、施用频率、所需治疗益处及其他参数(诸如,患者的年龄、体重及其他特征等)。针对特定模式及施用频率的有效提供治疗益处的剂量的测定是在本领域普通技术人员的能力内。
有效提供治疗益处的剂量可首先自活体内动物模型或临床来估计。用于广泛多种疾病的合适动物模型为本领域中已知。
本文披露的抗CD40抗体可利用适合于待治疗的病状的任何途径来施用。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体通常应非经肠施用,即,输注、皮下、肌内、静脉内(IV)、皮内、鞘内、推注、瘤内(IT)注射或硬膜外施用((Shire等人,2004,J.Pharm.Sciences[药物科学杂志]93(6):1390-1402))。在一个实施例中,抗CD40抗体作为小瓶中的冻干粉末提供。小瓶可含有21mg的抗CD40抗体。在施用之前,用注射用无菌水(SWFI)或其他合适介质复水冻干粉末以得到含有10mg/mL抗CD40抗体的溶液。在一些实施例中,所得复水溶液进一步用盐水或其他合适介质稀释,且经由每7天两次、每7天一次、每14天一次、每21天一次、每28天一次、每35天一次、每42天一次、每49天一次或每56天一次IV输注来施用。在一些实施例中,对于第一循环,输注历经90分钟进行。在一些实施例中,后续输注历经60分钟。在其他实施例中,所得复水溶液进一步用盐水或其他合适介质稀释,且经由每7天两次、每7天一次、每14天一次、每21天一次、每28天一次、每35天一次、每42天一次、每49天一次或每56天一次IT注射来施用。
在一例示性实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每7天一次IV输注形式按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。
在另一例示性实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每14天一次IV输注形式按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。
在另一例示性实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每28天一次IV输注形式按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。
在另一例示性实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每7天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。
在另一例示性实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每14天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。
在另一例示性实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每28天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。
当辅助其他试剂(诸如,其他化学治疗剂)施用或与这些一种或多种其他试剂一起施用时,抗CD40抗体可能以与其他药剂相同的时间表或以不同时间表施用。当以相同时间表施用时,抗CD40抗体可在其他药剂之前、之后施用,或与这些其他药剂一起同时施用。在抗CD40抗体辅助护理标准施用或与护理标准一起施用的一些实施例中,抗CD40抗体可在开始标准疗法之前起始,例如,在开始护理标准疗法之前一天、若干天、一周、若干周、一月或甚至若干月起始。
在一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助尼沃鲁单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体经由每7天一次IV输注按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。尼沃鲁单抗通过每两周一次以3mg/kg的剂量经60分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/尼沃鲁单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助尼沃鲁单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体经由每14天一次IV输注按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。尼沃鲁单抗通过每两周一次以3mg/kg的剂量经60分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/尼沃鲁单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助尼沃鲁单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体经由每28天一次IV输注按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。尼沃鲁单抗通过每两周一次以3mg/kg的剂量经60分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/尼沃鲁单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助尼沃鲁单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每7天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。尼沃鲁单抗通过每两周一次以3mg/kg的剂量经60分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/尼沃鲁单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助尼沃鲁单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每14天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。尼沃鲁单抗通过每两周一次以3mg/kg的剂量经60分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/尼沃鲁单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助尼沃鲁单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每28天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.0 15mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。尼沃鲁单抗通过每两周一次以3mg/kg的剂量经60分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/尼沃鲁单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助派姆单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体经由每7天一次IV输注按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。派姆单抗通过每三周一次以2mg/kg的剂量经30分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/派姆单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助派姆单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体经由每14天一次IV输注按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。派姆单抗通过每三周一次以2mg/kg的剂量经30分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/派姆单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助派姆单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体经由每28天一次IV输注按以下剂量来施用:0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg或4.0mg/kg。派姆单抗通过每三周一次以2mg/kg的剂量经30分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/派姆单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助派姆单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每7天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。派姆单抗通过每三周一次以2mg/kg的剂量经30分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/派姆单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助派姆单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每14天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。派姆单抗通过每三周一次以2mg/kg的剂量经30分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/派姆单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一例示性实施例中,将抗CD40抗体辅助派姆单抗使用以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中,抗CD40抗体为列于表3中的人源化抗体中的任一者。抗CD40抗体以每28天一次IT注射形式按以下剂量来施用:0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg或2.0mg/kg。派姆单抗通过每三周一次以2mg/kg的剂量经30分钟静脉内输注来施用。辅助抗CD40抗体/派姆单抗疗法持续直至疾病进展或患者不再耐受。
如本领域普通技术人员应了解,上文所描述的各种试剂的建议剂量可能需要调整以使患者反应优化且使治疗益处最大化。
8.实例
出于说明而非限制的目的提供了以下实例,所述实例突出了本文所描述的抗CD40抗体的例示性实施例的某些特征及特性。
实例1:小鼠抗人CD40抗体的产生
单克隆抗体是通过用过度表达人类CD40的小鼠3T12细胞腹膜内免疫Balb/C小鼠或SJL小鼠来产生。收集脾,且使脾细胞与多发性骨髓瘤细胞株NS0融合。使用氨基喋呤选择杂交瘤。筛选且亚克隆表达具有激动性活性的抗CD40抗体的所选择杂交瘤,以分离单独克隆。
为筛选具有激动性活性的抗体,研发出一组功能分析,其包括NFκB通路刺激、单核细胞活化、树突状细胞(DC)活化及CD40配体(CD40L)竞争。在这些分析中,包括抗人CD40G28-5(小鼠IgG1)(Biolegend)作为阳性对照,且同种型匹配小鼠抗体(mIgG1)作为阴性对照。
8.1.1.HEK293蓝色CD40 NFκB报导分析
将稳定表达人类CD40及NFκB报导基因的HEK293蓝色CD40细胞株(InVivogen)维持在补充有30μg/mL杀稻瘟菌素及100μg/mL吉欧霉素(Zeocin)的DMEM、10%热灭活的胎牛血清(FBS)中。在HEK293蓝色CD40细胞的表面上的CD40的活化触发导致NFκB活化及后续分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的信号级联。将含有激动性抗CD40的杂交瘤上清液与2.5×105个/mL的HEK293蓝色CD40细胞一起孵育刺激SEAP产生,SEAP利用比色酶分析来量测。因此,SEAP的含量对应于杂交瘤上清液中的抗CD40的活性。
8.1.2.单核细胞活化分析
单核细胞活性分析是使用单核细胞细胞株THP1-XBlue细胞(InVivogen)来进行。此细胞株稳定地表达NFκB及AP-1-诱导性SEAP报导基因,且维持在具有10%热灭活的FBS及200μg/mL吉欧霉素的RPMI 1640中。在该分析中,5×105个/mLTHP1-XBlue细胞首先用40ng/mL IFNγ预致敏24小时,且随后与测试样品一起再孵育24小时。激动性抗CD40诱导的SEAP活性是利用酶促分析来监测。
8.1.3.原代树突状细胞IL-12p70产量分析
还针对其活化源自单核细胞的树突状细胞(moDC)的能力来筛选抗CD40克隆。活化是利用IL-12p70产量来监测。以Ficoll梯度来首先分离人类外周血单核细胞(PBMC)。简言之,将来自健康人类供体,用相同体积的PBS稀释的全血添加至Leucosep(Greiner BioOne)管,该管在玻璃料下含有Ficoll-Paque Plus(15mL)。接着,在1,000g下将血液离心15分钟而无制动。采集PBMC且用PBS洗涤一次,在室温下在1,300rpm下离心5分钟,并用RPMI1640洗涤一次。将细胞再悬浮于培养基(RPMI1640+10%热灭活的FBS)中。随后,自PBMC用来自StemCell的富集套组分离单核细胞,且将这些单核细胞在补充有10ng/mL GM-CSF及20ng/mL IL-4的StemSep无血清培养基中在37℃、5%CO2下培养6天。在第3天将新鲜GM-CSF及IL-4添加至培养物以帮助维持DC分化。在培养物中6天之后,源自单核细胞的不成熟DC经受FACS分析以验证不成熟DC表型:Lin-、CD80/CD86+、HLA-DR+或CD11c+。不成熟moDC用IFNγ来预致敏,且用含有抗CD40抗体的样品在补充有GM-CSF及IL-4的StemSep无血清培养基中刺激48小时。收集培养物上清液,且利用市售ELISA套组分析IL-12p70产量。筛选结果及代表性活性概述于表1-1中。
表1-1展示跨越经分离杂交瘤的激动性抗CD40活性的范围。所有新克隆均证实与文献CD40抗体G28-5(参见例如,Bishop,G.A.Journal of Immunology[免疫学杂志]188,4127-4129(2012))相当的单核细胞活化。克隆AD166.4.4及AD175.14.11证实,单核细胞活化但并不展示树突状细胞活化。其余克隆显示与G28-5相当的单核细胞活化,以及如与G28-5相比增强的树突状细胞活化。
1单核细胞活化为在OD655处记录自THP1-XBlue细胞所释放的SEAP活性
使用标准PCR技术,自杂交瘤AD163.9.3、AD1 66.4.4、AD175.14.11、AD163.10.7、AD165.1.2、AD163.162.1、AD163.27.12、AD163.7.2、AD164.14.6及AD164.76.3,分别克隆编码十种单克隆抗体的重链及轻链可变区的cDNA序列,且使用标准DNA测序技术对这些cDNA序列进行测序。由DNA编码的完全对应抗体氨基酸序列展示于图2A至图2C中。
实例2:小鼠抗人CD40抗体的表位分类
BIAcore分析及ELISA方法用于根据其与彼此或CD40配体(CD40L)竞争与CD40结合的能力来对小鼠抗人CD40激动性抗体进行分类。
BIAcore分析是使用BIAcore T100仪器在12℃下来进行。首先将山羊抗小鼠Fc抗体(Pierce,目录号31170)固定在CM5传感器芯片上,随后在表面上俘获第一测试抗体。在利用50μg/mL的小鼠同种型抗体混合物进行阻断之后,用人类CD40的细胞外域的可溶形式(Creative BioMart,目录号CD402221H)来注射流动细胞。随后,注射第二测试抗体或CD40L(PeproTech,目录号0308145)以量测其与CD40及第一测试抗体的复合物的结合。如表2-1中所展示,将本发明的抗CD40抗体分类成三个表位组。表位组1由AD163.7.2(“muAb8”)及AD175.14.11(“muAb3”)例示,其阻断CD40L与CD40结合。表位组2是自克隆AD163.162.1(“muAb6”)及AD163.27.12(“muAb7”)测定,其并不与CD40L或表位组1中的抗体竞争。第三表位组由克隆AD163.9.3(“muAb1”)、AD166.4.4(“muAb2”)及AD165.1.2(“muAb5”)例示,其并不与CD40L竞争与CD40结合,而与表位组1及组2中的抗体竞争。
X:不能结合的第二抗体;Y:同时结合
研发ELISA分析以量测抗CD40抗体对于人类CD40-CD40L相互作用的效果。简言之,将CD40-人类Fc(huFc)融合蛋白质(Creative BioMart)与抗CD40抗体或同种型对照抗体混合,且将其添加至涂布有HA标记的CD40L(R&D Systems)的96孔板。CD40-huFc复合物对板结合的CD40L的结合是利用结合HRP的抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch)来检测。在用TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)底物显色之后,在OD450处读取板。
抗CD40抗体对于CD40-CD40L相互作用的效果是通过计算含有抗CD40抗体的样品中的OD450与含有同种型对照抗体的样品中的OD450的比率(“OD450比率”)来测定。OD450比率≤0.1,展示抑制人类CD40L与人类CD40结合。OD450比率在0.1与1之间,展示部分抑制CD40L与CD40结合。OD450比率>1,展示增强的人类CD40L针对人类CD40的结合,由此增强CD40信号传导。
资料概述于表2-2中。阻断CD40与CD40L结合的抗体muAb8及muAb3显示少于0.1的比率。抗体muAb6及muAb7展示约0.5的比率,从而表明对于CD40-CD40L相互作用的适度效果。抗体muAb1、muAb2、muAb4、muAb5、muAb9及muAb10显示约1或大于1的OD450比率,从而指示无效果或促进CD40与CD40L结合的效果。
实例3:小鼠抗人CD40抗体的人源化
抗体V区的人源化是如由Queen,C.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],1989;86:10029-10033)所概述来进行。CDR的典型结构是根据Huang等人(Methods[方法],2005;36:35-42)来测定。鉴别具有相同或最类似CDR典型结构的人类可变种系序列,且选择合适人类VH、VL及J区段序列以提供抗CD40可变区的框架。在框架位置(在其中计算机模型表明与CDR显著接触)处,用来自鼠类抗CD40V区的氨基酸取代原始人类框架氨基酸(回复突变)。除非另外规定,否则使用在重链中具有天然变体D356E及L358M的人类IgG1的恒定区与κ轻链。人源化抗体的VH区及VL区的完整氨基酸序列展示于图2D至图2G中。
根据上文所描述的方法将抗CD40克隆AD163.162.1(“muAb6”)人源化。muAb6的人源化版本为huAb6-1、huAb6-2及huAb6-3。抗体huAb6-1携带VH(SEQ ID NO:110)框架回复突变:M48I、V67A、I69L及A71V。抗体huAb6-2携带VH(SEQ ID NO:111)框架回复突变M48I及A71V。抗体huAb6-3携带VH(SEQ ID NO:112)框架回复突变M48I及A71V,以及VH CDR种系改变N60A、K64Q及D65G,以增加与人类种系序列的同一性。抗体huAb6-1、huAb6-2及huAb6-3携带VL(SEQ ID NO:161)框架回复突变:A43S、L46R、L47W及F71Y。
抗CD40克隆AD163.7.2(“muAb8”)的人源化版本为huAb8-1、huAb8-2及huAb8-3(图2D至图2E)。抗体huAb8-1携带VH(SEQ ID NO:113)框架回复突变:M48I、V67A、I69L、A71V、K73R、Y91F及R94S。抗体huAb8-2携带VH(SEQ ID NO:114)框架回复突变:M48I、V67A、I69L、A71V、K73R、Y91F及R94S;以及VH CDR C59S突变。抗体huAb8-3携带VH(SEQ ID NO:115)框架回复突变:M48I、A71V及R94S。抗体huAb8-1、huAb8-2及huAb8-3均携带VL(SEQ ID NO:162)框架回复突变:A43S及Y87F。
抗CD40克隆AD164.14.6(“muAb9”)经人源化以提供huAb9-1、huAb9-2、huAb9-3、huAb9-4、huAb9-5及huAb9-6。抗体huAb9-1及huAb9-4展示VH(SEQ ID NO:116)框架回复突变:I48M、V67I及V71R。抗体huAb9-2及huAb9-5携带VH(SEQ ID NO:117)框架回复突变:I48M及V71R。抗体huAb9-3及huAb9-6携带VH(SEQ ID NO:118)框架回复突变:I48M及V71R,以及额外两个CDR种系改变T30S及N65S,以改善与人类种系序列的同一性。抗体huAb9-1、huAb9-2及huAb9-3携带VL(SEQ ID NO:163)框架回复突变:I2A、Y36F及Y87F。抗体huAb9-4、huAb9-5及huAb9-6携带VL(SEQ ID NO:164)框架回复突变I2A。克隆AD164.14.6进一步经修饰以通过恢复VL的框架回复突变I2A来移除在轻链的第二位置处发现的信号肽裂解位点。抗体huAb9 A2I及huAb9 A2V携带VH(SEQ ID NO:117)及分别地含有框架回复突变A2I(SEQ IDNO:170)及A2V(SEQ ID NO:171)的VL,防止非所需裂解产物的形成。
产生具有人类IgG1重链恒定区及κ轻链恒定区的本发明实例中的人源化抗体。C端赖氨酸可通过在人类IgG1重链的蛋白质表达之后进行翻译后加工来部分裂解。因此,huAb9-5具有根据SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131的重链及根据SEQ ID NO:140的轻链。抗体huAb9-5还被产生为具有在重链恒定区中的V273E及V273Y氨基酸突变,分别地对应于根据SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133及SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135的重链,以及具有根据SEQ ID NO:140的轻链。产生具有人类IgG1 V273E重链恒定区的抗体huAb9 A2I及huAb9A2V。因此,huAb9 A2I具有根据SEQ ID NO:132或SEQ ID NO 133的重链及根据SEQ ID NO:141的轻链。类似地,huAb9 A2V具有根据SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133的重链及根据SEQID NO:142的轻链。
实例4:人源化抗人CD40抗体的表征
为确保人源化抗CD40抗体保留亲本鼠类抗体的激动特性及其他所需特性,进行一组表征分析以测定本发明的人源化抗体的NFκB活化、CD40结合动力学、物种交叉反应性及表位类别。
8.4.1.NFκB活化
利用本发明的人源化抗CD40抗体的NFκB活化是在HEK293蓝色CD40 NFκB报导细胞中评价。将活化表示为在OD655处量测的SEAP(所分泌胚胎碱性磷酸酶)报导基因活性。所量测最大OD655及半最大活化的浓度(EC50)概述于表4-1中。
8.4.2.CD40结合动力学及物种交叉反应性
所披露人源化抗CD40抗体的结合亲和力是利用BIAcore及流式细胞测量术分析两者来分析。
CD40结合动力学是利用BIAcore分析用BIAcore T200仪器来分析。简言之,将山羊抗小鼠Fc抗体(Pierce,目录号31170)或山羊抗人Fc(Pierce,目录号31125)固定在CM5传感器芯片上,随后在测试表面上俘获抗CD40抗体。随后,注射人类CD40的细胞外域的可溶形式(Creative BioMart,目录号CD402221H)或食蟹猴(cynomolgus/cyno)CD40(CreativeBioMart,目录号CD40-8824C),且量测结合及解离。
表面等离子共振资料指示,人源化huAb8-1、huAb9-5、huAb9 A2I及huAb9 A2V抗体保留与其亲本克隆AD163.7.2(“muAb8”)或克隆AD164.14.6(“muAb9”)类似的结合亲和力(KD),且展示与人类或食蟹猴CD40的类似结合(表4-2)。
*数目是指科学记数法,例如,3.0E-09=3.0×10-9
还在用人类或食蟹猴CD40稳定地转染的HEK293细胞以及源自食蟹猴或人类PBMC的B细胞上针对与细胞表面CD40的结合,来评价人源化抗CD40抗体。将人源化抗CD40抗体与HEK293转染物在冰上一起孵育15分钟,且用结合荧光的抗人二级抗体(JacksonImmunoResearch公司)来检测结合。细胞的FACS分析确认,人源化抗体与人类及食蟹猴CD40稳定细胞株结合。对比而言,在用小鼠、大鼠或狗CD40进行的类似实验中未观测到结合。
还针对其与表达人类及食蟹猴CD40的原代细胞结合的能力来评定抗CD40抗体。将自人类或食蟹猴血液分离的PBMC与同荧光染料CF640R结合的抗CD40抗体一起孵育。在FACS分析之后,利用FlowJo(FlowJo,LLC)软件对数据进行分析。这些结果表明,人源化抗体与源自人类及食蟹猴PBMC两者的原代CD40阳性细胞结合。
8.4.3.表位分类
流式细胞测量术分析及ELISA方法用于根据其与彼此或CD40配体(CD40L)竞争与CD40结合的能力来将人源化激动性抗CD40抗体分类。
研发流式细胞测量术分析以分析抗体是否与另一抗体竞争结合人类CD40。在此分析中,将自完全人类IgG2抗人CD40抗体克隆21.4.1制备(参见Gladue,RP.等人,CancerImmunol.Immunother.[癌症免疫学,免疫疗法]2011;60:1009-17及美国专利号7,618,633)的CP-870,893用作参考抗体。CP-870,893的重链及轻链分别为:
所有抗CD40人类或人源化抗体(包括huAb6-1、huAb8-1、huAb9 A2I及CP-870,893)均用Alexa Fluor(AF)-488来标记。将具有1μg/mL的固定浓度的各荧光标记抗体分别地与递增量的其他未标记的抗CD40抗体(介于0.5ng/mL直至50μg/mL范围内)混合,且与稳定表达人类CD40的HEK293细胞一起孵育。接着,利用流式细胞测量术来监测荧光标记抗体的结合。
在表4-3中概述由平均荧光强度(MFI)的剂量依赖性减少鉴别的竞争抗体及由恒定MFI鉴别的非竞争性抗体。尽管huAb6-1并不与huAb8-1竞争结合人类CD40,但huAb9 A2I及CP-870,893两者均与huAb6-1及huAb8-1竞争。另外,huAb9 A2I及CP-870,893与彼此竞争。
X:相互竞争;Y:相互不竞争
本发明的人源化抗体的表位分类还由量测抗CD40抗体及CD40复合物与如实例2中所描述的板结合的CD40L的结合的ELISA分析来确认。在此分析中,如上文制备的CP-870,893用作参考抗CD40抗体。将递增量的抗CD40抗体或人类IgG1(huIgG1)对照抗体与1μg/mL的CD40-huFc融合蛋白质一起孵育,且添加至涂布有CD40L的板。如图3中所展示,人源化抗体huAb8-1及huAb8-3阻断CD40及CD40L的相互作用(左上方);huAb6-1及huAb6-2展示对于CD40-CD40L相互作用的极小效果(右上方);且huAb9-5及huAb9-6促进CD40与CD40L结合(左下方)。如相比于展示对于CD40-CD40L相互作用极小效果的CP-870,893,人源化抗体huAb9A2I还促进CD40与CD40L结合(右下方)。
结果与在使用表达CD40L的细胞的基于流式细胞测量术的分析中获得的那些结果一致(图4)。将CD40L+Jurkat细胞与在1μg/mL的恒定浓度下的结合荧光染料Alexa Fluor488的可溶人类CD40蛋白质一起孵育。结合荧光染料的CD40针对Jurkat细胞表面CD40L的结合是在人源化抗体huAb9 A2I及参考抗CD40抗体CP-870,893存在下利用流式细胞测量术分析来量测。在样品中的huAb9 A2I的量增加时,检测到荧光强度增强;但参考抗体CP-870,893则不。这些结果表明,huAb9 A2I促进CD40与CD40L+Jurkat细胞结合,而参考CP-870,893则不。
huAb9 A2I对于由CD40L驱动的CD40信号传导的功能影响还是以包含表达CD40及CD40L两者的细胞的分析来测定。将表达CD40的细胞(描述于8.1.1部分中的HEK293蓝色CD40 NFκB报导细胞)与CD40L-或CD40L+ Jurkat细胞以1∶1的比率混合,且与在3μg/mL下的huAb9 A2I、CP-870,893或对照抗体一起孵育。CD40信号传导是利用SEAP报导活性经由如8.4.1部分中所描述的比色分析来量测。当将CD40报导细胞与CD40L-Jurkat细胞共培养(图5A)时,CD40信号传导仅在添加huAb9 A2I或CP-870,893之后显著增强,但在用对照抗体处理或不添加时则不。尽管两种抗体均活化CD40,但在于这些条件下刺激CD40方面,huAb9A2I并不比CP-870,893显著更强效。当将CD40报导细胞与CD40L+Jurkat细胞共培养(图5B)时,细胞表面CD40L活化CD40,如由SEAP报导活性所指示。使用CP-870,893的处理并不进一步增强CD40活性信号传导,其中SEAP报导活性类似于对照huIgG1或huIgG2同种型或无抗体(仅培养基)处理。对比而言,用huAb9 A2I的处理进一步增加CD40信号传导,其中报导活性显著大于CP-870,893及对照处理(p<0.001)。
这些资料指示,当细胞表面CD40由饱和量的细胞表面CD40L活化时,huAb9 A2I通过如与等效量的已知抗CD40抗体CP-870,893相比对下游NFκB信号传导影响更大来进一步增强CD40活化。
实例5:抗CD40抗体的Fc区变体
CD40的较大激动性活性可经由修饰Fc区以增强FcγRIIB结合来达成(Li及Ravetch,Science[科学],2011;333:1030-1034;及White,等人,J.Immunol[免疫学杂志],2011;187:1754-1763)。将在人类IgG1恒定区中的位置273处的两个突变(V273E及V273Y)引入至人源化抗CD40抗体huAb6-1、huAb8-1、huAb9-5及huAb9 A2I中。Fc突变对于与Fcγ受体结合的影响是利用FACS分析及利用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来监测。具有Fc修饰的人源化抗CD40的激动性活性是经由NF-kB报导体、B细胞、源自单核细胞的DC及T细胞的活化来监测。
8.5.1.Fcγ受体结合及ADCC功能
将递增量的抗CD40人类IgG1抗体及其Fc变体与稳定表达不同人类Fcγ受体的CHO细胞一起孵育,这些受体包括具有F或V多形现象的FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)及FcγRIIIA(CD16)。用结合荧光的抗人F(ab’)2特异性二级抗体(JacksonImmunoResearch公司)来检测结合。突变V273E或V273Y减少与FcγRIIIA(CD16F或V)结合,同时维持FcγRI(CD64)结合且增强FcγRIIA(CD32a)或FcγRIIB(CD32b)结合(图6A至图6B)。
使用标准方案来量测人源化抗CD40抗体的Fc变体的ADCC(Law等人,2005,CancerRes.[癌症研究]65:8331-8)。在一说明性实例中,针对RL细胞中的抗体huAb9-5,如与野生型IgG1相比,在恒定区变体V273E或V273Y的情况下ADCC减少(图7)。
8.5.2.在Fc R结合时,激动性活性增强
为评估Fcγ受体结合对于抗CD40的激动性活性的影响,具有huIgG1 V273E突变的huAb9 A2I用于处理与稳定表达不同人类Fcγ受体的CHO细胞共培养的HEK293蓝色CD40 NFκB报导细胞,且监测NFκB活性。如表5-1中所展示,刺激NFκB活化中的CP-870,893的激动性活性不依赖于Fcγ受体结合,而发现huAb9 A2I的激动性活性则依赖于Fcγ受体结合。当将报导细胞与表达CD32a、CD32b或CD64的CHO细胞共培养时刺激NFκB活性中的huAb9 A2I的效能,比当与不表达Fcγ受体,或表达CD16V或CD16F的CHO细胞共培养时的高十倍。
8.5.3.Fc变体对于B细胞增殖
Fc V273E或V273Y突变对于抗CD40的激动性活性的影响还用B细胞增殖分析来评价。在此分析中,人类B细胞利用B细胞富集套组(StemCell Technologies)经由阴性选择来富集。将经纯化B细胞以5×105个/ml,200μL/孔接种至96孔板的AIM-V无血清培养基(GIBCO)中。添加经连续稀释的抗CD40抗体,并与B细胞一起培养6天。在培养的最后16小时中,将1μCi的H3TdR添加至培养物的各孔,且通过H3TdR并入来测定B细胞增殖。利用闪烁计数器以每分钟计数(CPM)来记录与H3TdR并入相关联的放射性。相比于对应人类IgG1野生型抗体,抗CD40(huAb6-1、huAb8-1及huAb9-5)人类IgG1 Fc变体V273E及V273Y展示增强B细胞活化(图8)。然而,当相比于CP-870,893时,huAb9 A2I(人类IgG1 V273E)在刺激B细胞增殖上展示约降低十倍的效能(右下方曲线)。
8.5.4.Fc变体对于DC IL-12p70产生
Fc V273E或V273Y突变对于抗CD40的激动性活性的影响进一步用DC活化分析使用如读出的IL-12p70来评价。在此分析中,不成熟DC首先是源自从人类PBMC纯化且用IL4及GM-CSF处理的单核细胞。DC成熟及IL-12p70产生是在用IFNγ预致敏之后由抗CD40诱导。V273E或V273Y Fc突变的版本通过增强IL-12p70产生而增强DC活化的效能。如图9所说明,如与具有野生型huIgG1的其对应抗体相比,具有huIgG1 Fc变体V273E或V273Y的huAb6-1(左上方)、huAb8-1(右上方)及huAb9-5(左下方)展示增加的IL-12p70产生。对于huAb6-1及huAb8-1,具有huIgG1 V273Y突变的变体比具有V273E突变的变体在增强活体外IL-12p70产生时更有效。对于huAb9-5,具有huIgG1 V273E或V273Y的变体展示类似效能。在huAb9 A2I(右下方曲线)的情况下,具有huIgG1 V273E突变的变体在刺激DC以产生IL-12p70上表明与CP-870,893类似的效能。
8.5.5.Fc变体对于同种异体DC及T细胞共培养中的T细胞活化
为证实抗CD40可经由刺激诸如DC的抗原呈递细胞来驱动T细胞活化,在同种异体DC及T细胞共培养中测试抗CD40Fc变体。在此分析中,使用上文所描述的方法,树突状细胞(5×103个)首先源自单核细胞,接着与自不同供体纯化的1×105个T细胞混合。将各种量的具有野生型人类IgG1恒定区或其Fc变体V273Y的抗CD40抗体huAb6-1、huAb8-1或huAb9-5添加至DC及T细胞共培养物。在孵育4天之后,采集上清液,且利用ELISA量测IFN-γ。
图10说明在与自两种不同供体对的细胞共培养中展示增强IFN-γ产生的例示性抗体。在各情况下,huAb6-1、huAb8-1及huAb9-5的V273Y变体证实T细胞活化,如通过如与同种型对照huIgG1抗体相比IFN-γ显著增加所证明。
实例6:抗CD40抗体的活体内抗肿瘤活性
针对具有野生型人类IgG1或Fc变体的人源化抗CD40抗体huAb6-1、huAb9-5及huAb9 A2I对于在人类免疫细胞存在下抑制带有前列腺PC3肿瘤的NSG小鼠中的肿瘤生长的能力,对这些抗体进行评定。
用PC3细胞(1×106个)、经纯化T细胞(5×105个)及自体DC(1×105个)的混合物对NSG小鼠进行皮下接种。紧接在接种之后,以1mg/kg的抗CD40抗体或对照抗体的单一剂量进行腹膜内注射。用测径规每隔一天量测肿瘤体积。如相比于同种型对照抗体,包括huAb6-1、huAb9-5、huAb9 A2I及其Fc变体V273E或V273Y的抗CD40抗体在PC3模型中减少肿瘤生长,如图11中所展示。
实例7:小鼠同系肿瘤模型中的概念验证研究
归因于本发明的例示性抗CD40抗体的小鼠CD40结合的缺乏,使用鼠类CD40激动性抗体1C10muIgG1来进行小鼠中的药理学效果的评价。类似于上文所论述的huIgG1 Fc V273E突变,具有鼠类IgG1(muIgG1)Fc的1C10证实与muFcγRIIB的强结合及与muFcγRI及muFcγRIV的极小结合,功能性等效于人类FcγRIII。类似于本发明的抗CD40抗体,1C10muIgG1证实在活体外及活体内刺激小鼠脾B细胞活化上的效能。因此,具有鼠类IgG1恒定区的抗鼠类CD40抗体1C10用作概念验证分子以探究可能临床发展路径,这些路径包括使用瘤内递送或与抗PD-1抗体的共同施用的组合疗法。
8.7.1.瘤内施用
其中小鼠具有两侧皮下肿瘤的CT26同系模型用于研究瘤内施用。在第0天,将每小鼠的活细胞(1×105个)皮下接种至雌性Balb/c小鼠的右后及左后侧腹中。在第12天,将动物随机分组,其中每组十只小鼠。在给药开始时,右侧腹的平均肿瘤体积约为85mm3。在第一次给药24小时之后,将来自各组中的三只动物处死以用于进行血清ALT评定。针对两个肿瘤的生长,对剩余动物进行监测。每周两次对肿瘤体积进行测定。经由电子测径规获取肿瘤的长(L)、宽(W)及高(H)的量测值,且根据以下方程序来计算体积:L×W×H/2。紧接着在随机分组之后,开始抗体给药。
当将抗CD40抗体1C10直接注射至一个肿瘤中(3mg/kg,一周2至3次)时,在注射位点(“IT给药”)以及在远程部位(“未IT给药”)两处的肿瘤的生长减少,从而表明全身性抗肿瘤免疫力的建立(图12)。利用由VetScan(Abaxis Inc.,Union City,CA)量测的肝酶ALT来监测肝毒性。抗CD40抗体1C10的瘤内(IT)给药引起ALT升高比全身性腹膜内(IP)给药低。
8.7.2.与抗PD-1抗体的共同施用的组合疗法
通过在第0天将每小鼠1×105个活细胞皮下接种至雌性BALB/c小鼠的右侧腹中来建立CT26肿瘤。在第15天将动物随机分组。在同系CT26小鼠模型中,将抗CD40抗体1C10(0.6mg/kg)结合专用抗PD1 muIgG2a抗体(10mg/kg)一周两次进行IP给药。组合施用方案显示显著抗肿瘤活性(10只小鼠中的7只展示肿瘤消退,对比于对照中的0只及在抗PD1或抗CD40处理组中的每个中10只中的1只),从而支持该组合的发展(图13)。
抗CD40抗体1C10的处理是以0.6mg/kg进行,该剂量为用于此模型中的单药疗法的亚治疗性剂量。在一些情况下,在各单克隆抗体的此类剂量下维持抗肿瘤疗效的水平可提供减少的毒性,如例如由肝酶水平所证明。在此实验中,组合治疗并不增加肝酶水平、脾重量或细胞因子(诸如,TNFα或IL-6)水平(图14)。利用VetScan量测肝酶水平,且用MILLIPLEXMap小鼠细胞因子套组(EMD Millipore)量测细胞因子水平。
在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献出于所有目的通过引用以其整体特此并入,在程度上就像每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独地指出以出于所有目的通过引用而并入一般。
尽管已说明及描述各种具体实施例,但应了解,在不脱离本发明的精神及范畴的情况下,可进行各种改变。

Claims (23)

1.一种抗CD40抗体或结合片段,其包含(i)包含三个CDR的VH链;及(ii)包含三个CDR的VL链,其中:
VHCDR#1是选自:
GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:6),
GYTFTDYYIN(SEQ ID NO:7),
GYSITSNYYWN(SEQ ID NO:8),
GYSISSNYYWN(SEQ ID NO:9),
GYDITSNYYWN(SEQ ID NO:10);
VHCDR#2是选自:
WIFPGSGSVYCNEQFKG(SEQ ID NO:17),
YIRYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID NO:18),
NIDPSNGETHYAQKFQG(SEQ ID NO:19),
WIFPGSGSVYSNEQFKG(SEQ ID NO:20),
YIRYDGSNNYNPSLKS(SEQ ID NO:21),及
YIRYDGSNNYNPSLKG(SEQ ID NO:22);
VHCDR#3是选自:
LDY(SEQ ID NO:35),
ERIYYSGSTYDGYFDV(SEQ ID NO:36),及
SLGKFAY(SEQ ID NO:37);
VLCDR#1是选自:
SASSSLSYMH(SEQ ID NO:56),
KASQSVVTAVA(SEQ ID NO:57),及
RSSQSLENTNGNTFLN(SEQ ID NO:58);
VLCDR#2是选自:
DTSKLAS(SEQ ID NO:66),
SASNRYT(SEQ ID NO:67),及
RVSNRFS(SEQ ID NO:68);
VLCDR#3是选自:
QQWSSNPWT(SEQ ID NO:86),
QQYSSYPYT(SEQ ID NO:87),及
LQVTHVPFT(SEQ ID NO:88)。
2.如权利要求1所述的抗CD40抗体或结合片段,其包含具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:88的序列的CDR。
3.如权利要求1所述的抗CD40抗体或结合片段,其为人类或人源化的。
4.如权利要求1所述的抗CD40抗体或结合片段,其包含VH链及VL链,该VH链在序列上对应于SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123中的任一者;且该VL链在序列上对应于SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170或SEQ ID NO:171中的任一者。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗CD40抗体或结合片段,其包含对应于SEQ ID NO:117的序列的VH链及对应于SEQ ID NO:170的序列的VL链。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或结合片段,其为IgG,任选地是IgG1
7.如权利要求6所述的抗CD40抗体,其为IgG1且包含变体CH2区,该变体CH2区包含氨基酸取代V273E或V273Y。
8.如权利要求6或7所述的抗CD40抗体,其为IgG1且包含变体Fc区,该变体Fc区包含氨基酸取代D356E及L358M。
9.如权利要求6至8中任一项所述的抗CD40抗体,其包含κ轻链恒定区。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗CD40抗体,其具有根据SEQ ID NO:130至SEQ IDNO:135中的任一者的重链序列及根据SEQ ID NO:140至SEQ ID NO:142中的任一者的轻链序列。
11.如权利要求10所述的抗CD40抗体,其具有根据SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131的重链序列及根据SEQ ID NO:140的轻链序列。
12.如权利要求10所述的抗CD40抗体,其具有根据SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133的重链序列及根据SEQ ID NO:141的轻链序列。
13.如权利要求10所述的抗CD40抗体,其具有根据SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133的重链序列及根据SEQ ID NO:142的轻链序列。
14.一种药物组合物,其包含如权利要求1至13中任一项所述的抗CD40抗体或结合片段及药学上可接受的运载体。
15.一种治疗癌症的方法,其包括向有需要的患者施用如权利要求1至13中任一项所述的抗CD40抗体或结合片段或如权利要求14所述的药物组合物。
16.一种核酸,其包含编码如权利要求1至13中任一项所述的抗CD40抗体或结合片段的核苷酸序列。
17.一种载体,其包含如权利要求16所述的核酸。
18.一种原核宿主细胞,其用如权利要求17所述的载体转化。
19.一种真核宿主细胞,其用如权利要求17所述的载体转化。
20.一种真核宿主细胞,其经工程化以表达如权利要求16所述的核酸。
21.如权利要求20所述的真核宿主细胞,其为哺乳动物宿主细胞。
22.一种产生抗CD40抗体或其结合片段的方法,该方法包括:(a)培养如权利要求19或权利要求20所述的宿主细胞及(b)回收该抗体或结合片段。
23.一种活化免疫系统的方法,该方法包括向有需要的患者施用如权利要求1至13中任一项所述的抗CD40抗体或结合片段或如权利要求14所述的药物组合物。
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