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CN109415705A - 组合初免:加强免疫疗法 - Google Patents

组合初免:加强免疫疗法 Download PDF

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CN109415705A
CN109415705A CN201780041240.8A CN201780041240A CN109415705A CN 109415705 A CN109415705 A CN 109415705A CN 201780041240 A CN201780041240 A CN 201780041240A CN 109415705 A CN109415705 A CN 109415705A
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凯尔·斯蒂芬森
马修·阿瑟顿
布莱恩·利克蒂
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Turnstone LP
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Abstract

本文描述了组合初免:加强免疫疗法。该组合疗法用于在哺乳动物中诱导免疫应答。该组合包括:腺病毒，其能够表达抗原性蛋白，并且被配制以在哺乳动物中产生对该蛋白的免疫；并且包括Maraba MG1病毒，其能够表达抗原性蛋白，并且被配制以在哺乳动物中诱导免疫应答。所述抗原性蛋白质均基于相同的肿瘤相关抗原，但不必相同。本文还描述了腺病毒、治疗方法和用途。

Description

组合初免:加强免疫疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年05月09日提交的美国临时专利申请号62,333,685和2016年09月30日提交的美国临时专利申请号62/402,670的优先权的权益，其通过引用方式并入本文。
技术领域
本公开文本涉及用于诱导免疫应答的溶瘤病毒。
背景技术
溶瘤病毒(OV)特异性地感染恶性细胞、在其中复制并将其杀灭，而正常组织不受影响。几种OV已经到达了用于治疗各种肿瘤的临床评估的后期阶段(Russell SJ.et al.,(2012)Nat Biotechnol 30:658-670)。一旦被批准，这些病毒制剂即可取代标准癌症疗法或与标准癌症疗法组合，并能降低毒性和改善治疗效果。
除水疱性口炎病毒(VSV)(Stojdl DF.et al.,(2000)Nat Med 6:821-825；StojdlDF.et al.,(2003)Cancer Cell 4:263-275)之外，最近，文献也报道了显示溶瘤活性的其他弹状病毒(Brun J.et al.,(2010)Mol Ther 18:1440-1449；Mahoney DJ.et al.,(2011)Cancer Cell 20:443-456)，其中非-VSV Maraba病毒显示出最广泛的体外趋瘤性(oncotropism)(WO 2009/016433)。该专利中设计了具有改善肿瘤选择性和在正常细胞中降低的毒性的突变的Maraba病毒。该减毒株是含有G蛋白突变(Q242R)和M蛋白突变(L123W)的双突变毒株。在体内，此减毒株(称为MG1或Maraba MG1)在小鼠的异种移植和同源肿瘤模型中展示了有效的抗肿瘤活性，具有比减毒的VSV(VSVΔM51,WO 2011/070440)优越的治疗效果。
过去几年来积累的数据已经揭示，溶瘤病毒的抗肿瘤效力不仅取决于它们的直接溶瘤作用，还取决于它们刺激抗肿瘤免疫的能力(Bridle BW.et al.,(2010)Mol Ther184:4269-4275)。这种免疫介导的肿瘤控制似乎在OV疗法的整体效力中起关键作用。实际上，肿瘤特异性的适应性免疫细胞可以巡查组织并且破坏被该OV漏掉的肿瘤细胞。此外，它们的记忆性部分(memory compartment)可以预防肿瘤的复发。
已经开发了各种策略来改善OV-诱导的抗肿瘤免疫(Pol J.et al.,(2012)VirusAdaptation and Treatment 4:1-21)。某些团队已改造出表达免疫刺激细胞因子的基因工程OV。表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的单纯性疱疹病毒和牛痘病毒分别到达用于癌症治疗的III期和IIB期的临床评估，而表达IFN-β的VSV刚刚进入了I期临床评估。
另一种策略是溶瘤疫苗，其由表达来自OV的肿瘤抗原组成(Russell SJ.et al.,(2012)Nat Biotechnol 30:658-670)。已有文献证明VSV也可以用作癌症疫苗载体(BridleBW.et al.,(2010)Mol Ther 184:4269-4275)。当被应用在异源初免:加强免疫环境中以治疗小鼠黑色素瘤模型时，VSV-人多巴色素互变异构酶(hDCT)溶瘤疫苗不仅诱导对DCT增加的肿瘤特异性免疫，而且还伴随降低的抗病毒适应性免疫。结果是，治疗效果显著改善，中期存活率和长期存活率(WO 2010/105347)。尽管使用hDCT作为肿瘤相关抗原显示VSV是有效的，但是无法预期什么肿瘤相关抗原在异源初免:加强免疫环境中将是有效的。
在PCT申请号PCT/CA2014/050118中公开了三种特异性初免:加强免疫组合疗法。该组合疗法包括编码作为抗原的人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7融合蛋白、人前列腺六次跨膜上皮抗原(huSTEAP)蛋白或肿瘤睾丸抗原1的慢病毒；以及包括编码相同抗原的Maraba MG1病毒。PCT申请号PCT/CA2014/050118还公开了使用编码作为抗原的MAGEA3的腺病毒及编码相同抗原的Maraba MG1病毒的初免:加强免疫组合疗法。
发明概述
以下概述旨在向读者介绍本文所述的一种或多种发明但不是界定它们中的任一种。
本公开文本的目的是消除或减轻先前抗癌症疫苗的至少一个缺点。
本公开文本的作者发现了一种诱导哺乳动物中的免疫应答的初免:加强免疫组合疗法。
与上述PCT申请号PCT/CA2014/050118中公开的将慢病毒用作“初免”的初免:加强免疫组合疗法相反，根据本公开文本的初免:加强免疫组合疗法将表达抗原的重组腺病毒作为初免病毒。表达抗原的重组Maraba MG1病毒被用作加强免疫病毒。本公开文本的示例性的组合疗法使用HPV E6/E7或STEAP作为抗原。
本文所讨论的结果显示，重组腺病毒提供了至少一个相对于该‘118PCT申请的重组慢病毒的优点。这些结果是意想不到的并且是不可预期的，因为没有办法预期如果初免病毒被改变，疗效是否或如何受影响。人们不能预期哪一种初免病毒(如果有的话)在初免:加强免疫组合疗法中将对免疫应答提供有益效果。
在一方面，本文提供了用于诱导哺乳动物中的免疫应答的初免:加强免疫组合疗法。该组合疗法包括:腺病毒，其(a)表达抗原性蛋白并且(b)被配制以在该哺乳动物中对该蛋白产生免疫。该组合疗法还包括Maraba MG1病毒，其(a)表达抗原性蛋白并且(b)被配制以在该哺乳动物中诱导免疫应答。由该腺病毒和Maraba MG1病毒表达的该抗原性蛋白是基于相同的肿瘤相关抗原，但不需要在序列上相同。
在该组合疗法的某些例子中，该抗原性蛋白是人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白。在该组合疗法的其他例子中，该抗原性蛋白是huSTEAP蛋白。
在其他方面，本公开文本提供了该病毒组合的用途以及使用该病毒组合的方法。该用途和方法可涉及:治疗或预防HPV源性癌症(例如由HPV16或HPV18引起的癌症)；增加对E6和/或E7蛋白的免疫应答；或其组合。
当结合附图审阅以下具体实施方式的描述时，本公开文本的其他方面和特征对于本领域的技术人员将变得明显。
附图说明
现在将参照附图仅通过举例的方式，说明本公开文本的实施方式。
图1是示例性的HPV E6/E7融合蛋白的序列的图示，该融合蛋白可以由腺病毒和Maraba MG1病毒表达并且用于本公开文本的初免:加强免疫组合疗法。
图2是示出了示例性的HPV E6/E7融合与p53相互作用的图。
图3是示出了示例性的HPV E6/E7融合与pRb相互作用的图。
图4A-4D示出了根据分泌干扰素-γ(IFNγ)的CD8+T细胞的百分比测定的本公开文本的初免:加强免疫组合疗法和对照疗法的针对E6或E7表位的免疫应答的刺激。
图5A和5B示出了在本公开文本的初免:加强免疫疗法之后相对在仅初免之后生成的CD8+T细胞数和E7特异性CD8+T细胞总数。
图6示出了根据分泌干扰素-γ(IFNγ)的CD8+T细胞随时间的百分比测定的本公开文本的初免:加强免疫组合疗法和对照疗法的针对E7表位的免疫应答。
图7A-7D示出了根据血液循环池和脾脏池(splenic pool)中发现的双阳性(IFNγ和TNFα)或三阳性(IFNγ、TNFα和IL-2)CD8+T细胞测定的所生成的T细胞应答的质量。
图8A和8B示出了根据分泌干扰素-γ(IFNγ)的CD8+T细胞的百分比测定的本公开文本的示例性初免:加强免疫组合疗法之后荷瘤小鼠中的E6特异性T细胞和E7特异性T细胞的扩增(胞内染色法)。
图9示出了用本公开文本的初免:加强免疫组合疗法和对照治疗处理的小鼠的存活百分比vs.时间的图。
图10示出了用本公开文本的治愈性初免:加强免疫组合疗法处理的小鼠的存活百分比vs.时间的图，在治疗的不同时间点进行CD8+T细胞的耗竭。
图11A和11B示出了在使用本公开文本的示例性初免:加强免疫组合疗法的加强免疫之后的第62天和第117天时血液和脾脏中的E7特异性CD8+T细胞的持久性。
图12是用于实施例7中所讨论的试验的处理模式图。
图13示出了在用Ad-huSTEAP初免无肿瘤小鼠之后，对特异性肽抗原的离体(exvivo)肽再刺激的应答。
图14示出了用Ad-huSTEAP初免无肿瘤小鼠并且随后用MG1-huSTEAP加强免疫之后，对特异性肽抗原的离体肽再刺激的应答。
图15是用于实施例8中所讨论的测试的处理模式图。
图16示出了在用Ad-huSTEAP初免移植有TrampC2细胞的小鼠后，对特异性肽抗原的离体肽的再刺激的应答。
图17示出了在用Ad-huSTEAP初免移植有TrampC2细胞的小鼠并且随后用MG1-huSTEAP加强免疫之后，对特异性肽抗原的离体肽再刺激的应答。
图18是在三个小鼠组中TrampC2肿瘤体积增长的图示。
图19是在三个小鼠组中小鼠随时间的存活率图示。
发明详述
本公开文本提供了用于诱导哺乳动物中的免疫应答的初免:加强免疫组合疗法。当使用相同抗原以及不匹配的疫苗递送方法时，初免:加强免疫能以“异源”初免:加强免疫形式进行；或者，当使用匹配的疫苗递送方法时，能以“同源”初免:加强免疫形式进行。当使用载体疫苗平台时，异源初免:加强免疫方法是优选的，因为同源疫苗接种会导致在次级应答(secondary response)中加强对该载体和转基因的应答。相反，异源系统将次级应答(即，加强应答)集中在抗原上，因为针对第一载体和第二载体的应答是初级应答(primaryresponse)，因而微弱得多。
通常，本公开文本的初免:加强免疫组合疗法包括:(1)腺病毒，其能够表达抗原性蛋白并且被配制以在哺乳动物中产生对该蛋白的免疫；以及(2)Maraba MG1病毒，其能够表达抗原性蛋白并且被配制以在该哺乳动物中诱导免疫应答。
由腺病毒表达的抗原性蛋白和由Maraba MG1病毒表达的抗原性蛋白可以是相同的或不同的。如果不同，则该抗原性蛋白是足够相似的，以使得与不存在初免病毒时所诱导的免疫应答相比，对由Maraba MG1病毒表达的抗原性蛋白的免疫应答增加了。
在根据本公开文本的一些示例性的组合疗法中，该疗法可以例如通过激活抗肿瘤上的肿瘤相关抗原的抗体和/或淋巴细胞来激活患者的免疫系统以杀死肿瘤细胞，并且对正常组织的毒性降低。在特定的例子中，该疗法可以表现出溶瘤活性和加强适应性细胞免疫的能力。
在一方面，本公开文本的初免:加强免疫组合疗法包括:(1)腺病毒，其能够表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白作为抗原性蛋白并且被配制以在哺乳动物中产生对该蛋白的免疫；以及(2)Maraba MG1病毒，其能够表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白作为抗原性蛋白并且被配制以在哺乳动物中诱导免疫应答。由该腺病毒表达的抗原性蛋白和由该Maraba MG1病毒表达的抗原性蛋白可以是相同的或不同的。
在另一方面，本公开文本的初免:加强免疫组合疗法包括:(1)腺病毒，其能够表达人前列腺六次跨膜上皮抗原(huSTEAP)蛋白作为抗原性蛋白并且被配制以在哺乳动物中产生对该蛋白的免疫；以及(2)Maraba MG1病毒，其能够表达huSTEAP蛋白作为抗原性蛋白并且被配制以在哺乳动物中诱导免疫反应。由该腺病毒表达的抗原性蛋白和由该Maraba MG1表达的抗原性蛋白可以是相同的或不同的。
本文所公开的上下文中，术语“初免腺病毒”和“加强Maraba病毒”应当被理解为分别指能够表达抗原性蛋白的腺病毒和能够表达抗原性蛋白的MarabaMG1病毒。术语“Ad-E6E7”、“腺病毒E6E7”和“编码HPV E6/E7蛋白的腺病毒”全部应该被理解为指能够表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白作为抗原性蛋白的腺病毒；并且术语“MG1-E6E7”、“Maraba MG1E6E7”和“编码HPV E6/E7蛋白的Maraba MG1病毒”全部应当被理解为指能够表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白的Maraba MG1病毒。相似地，术语“Ad-huSTEAP”、“腺病毒huSTEAP”、“编码huSTEAP蛋白的腺病毒”和“初免腺病毒”全部应该被理解为指能够表达huSTEAP蛋白作为抗原性蛋白的腺病毒；并且术语“MG1-huSTEAP”、“Maraba MG1 huSTEAP”和“编码huSTEAP的Maraba MG1病毒”全部应该被理解为能够表达huSTEAP蛋白的Maraba MG1病毒。
人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白是可以用于本公开文本的疗法和方法的抗原性蛋白的一个例子。HPV E6/E7包括与HPV16和HPV18血清型的E6和E7转化蛋白对应的序列，生成了包括HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白结构域的融合蛋白。这四个蛋白结构域通过蛋白酶体可降解的接头连接，一旦融合蛋白在蛋白酶体中，就生成了单独的HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7。融合蛋白中的该蛋白酶体可降解的接头可以是相同的或不同的。术语“HPV E6/E7蛋白”、“HPV E6/E7融合蛋白”和“治疗性E6E7构建体”全部应当被理解为与“人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白”是同义的。
本公开文本的人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白的一个实例具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在SEQ ID NO:1中，该蛋白酶体可降解的接头具有序列GGGGGAAY(SEQ ID NO:2)。作为选择，可以使用其他蛋白酶体可降解的接头。
为了生成SEQ ID NO:1的HPV E6/E7融合蛋白，Maraba MG1病毒的基因组可包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列的反向互补RNA版本序列。在具体的实施例中，Maraba MG1病毒基因组可以包括SEQ ID NO:4的反向互补RNA版本序列。
为了生成SEQ ID NO:1的HPV E6/E7融合蛋白，腺病毒可包括包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的转基因。该转基因可以额外地包括在HPV E6E7编码区域之前的启动子，例如鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)IE启动子。该转基因可以额外地包括(优选地与该启动子组合)在HPV E6E7编码区域之后的编码SV40聚腺苷酸化信号序列的区域。
因为HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白在蛋白酶体中彼此分离(由于在融合蛋白中存在蛋白酶体可降解的接头)，所以在本公开文本的人乳头瘤病毒E6/E7的序列中，蛋白结构域以与它们在SEQ ID NO:1中不同的顺序被重新排列并且还提供HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18E7蛋白。
如果SEQ ID NO:1中的HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7结构域的序列分别对应于A、B、C、D，则在本公开文本的人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白的序列中，四个结构域以任何其他23种可能方式重新排列(例如ABDC、ACBD、ACDB、ADBC、ADCB、BACD、BACD、BADC、CABD、CADB、DACB、DCAB、DCBA等)。SEQ ID NO:5-8中示出了SEQ ID NO:1的这样的重新排列的四个具体实例，但应当理解的是本公开文本还预期了其他十九种排列，并且这样的排列的序列能够容易地从SEQ ID NO:1和5-8中所公开的蛋白结构域和接头中衍生出来。
尽管本公开文本的HPV E6/E7融合蛋白可以由HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白的野生型序列形成，但合乎需要的是，修饰野生型序列来防止锌指的形成。如果用腺病毒HPV E6/E7转导的细胞将经历与编码产生不能形成锌指的E6和E7蛋白的融合蛋白的E6E7转基因整合事件，则产生的蛋白将不能够干预p53或视网膜母细胞瘤的功能，从而降低了阻止新生(de novo)肿瘤形成的可能性。
在优选的实施例中，一种或多种野生型HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白的序列可以被修饰以消除一个或多个CXXC模体形成锌指的能力。一种或多种野生型HPV16 E7和HPV18 E7蛋白的序列可以被额外地或替代地修饰来消除LXCXE序列模体结合至视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白的能力。例如，通过删除CXXC模体中的一个或两个半胱氨酸，可以实现防止锌指的形成。例如，通过缺失LXCXE序列模体中的一个或多个氨基酸(例如缺失CXE氨基酸)，可以实现防止结合至Rb蛋白。在缺失氨基酸的替换方案中，将CXXC或LXCXE模体中的一个或多个氨基酸替换为其他氨基酸(例如丙氨酸)可以防止结合。优选地，全部四种蛋白序列都被修饰来防止分离的E6和E7蛋白形成锌指和/或结合至Rb蛋白。
在SEQ ID NO:9-12中示出了可以用于人乳头瘤病毒E6/E7的融合蛋白的HPV16E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18E7蛋白的序列。
·在SEQ ID NO:9和10中，每个Xaa独立地是:缺失、半胱氨酸或非半胱氨酸氨基酸。当该被识别的可变的Xaa的残基是半胱氨酸时，该序列分别对应于HPV16 E6和HPV18 E6的野生型序列。
·在SEQ ID NO:11中，在位置24处Xaa是缺失、半胱氨酸、或非半胱氨酸氨基酸；在位置25处Xaa是缺失、酪氨酸或非酪氨酸氨基酸；在位置26处Xaa是缺失、谷氨酸或非谷氨酸氨基酸；以及在位置91和94处Xaa独立地是:缺失、半胱氨酸或非半胱氨酸氨基酸。当在位置24-26处的Xaa是半胱氨酸-酪氨酸-谷氨酸并且在位置91和94处的Xaa是半胱氨酸时，SEQID NO:11的序列对应于HPV16E7的野生型序列。
·在SEQ ID NO:12中，在位置27处的Xaa是缺失、半胱氨酸或非半胱氨酸氨基酸；在位置28处的Xaa是缺失、组氨酸或非组氨酸氨基酸；在位置29处的Xaa是缺乏、谷氨酸、或非谷氨酸氨基酸；并且在位置98和101处的Xaa独立地是缺失、半胱氨酸、或非半胱氨酸氨基酸。当在位置27-29处的Xaa是半胱氨酸-组氨酸-谷氨酸并且在位置98和101处的Xaa是半胱氨酸时，SEQ ID NO:12的序列对应于HPV18 E7的野生型序列。
本公开文本的人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白可以被定义为包括以任何顺序排列的具有SEQ ID NO:9、10、11和12的序列的四个蛋白结构域的融合蛋白，其中蛋白结构域通过相同或不同的蛋白酶体可降解的接头连接。
优选地，在SEQ ID NO:9、10、11和12中每一个中，至少一个Xaa是缺失的。更优选地，足够多的Xaa是缺失的，以减少蛋白酶体中生成的分离蛋白中的锌指的形成。在一些优选的实施例中，SEQ ID NO:9和10的第一CXXC模体中的Xaa是缺失的。
蛋白酶体可降解的接头优选地是具有序列GGGGGAAY的氨基酸接头。
应当理解的是，当满足以下条件时，上述定义对应于SEQ ID NO:1:
·蛋白结构域的排列顺序为:SEQ ID NO:9然后SEQ ID NO:10然后SEQ ID NO:11然后SEQ ID NO:12；
·蛋白结构域通过具有序列GGGGGAAY的接头被连接在一起；
·在SEQ ID NO:9中位置70、73、110和113处的Xaa缺失；
·在SEQ ID NO:10中位置65、68、105和108处的Xaa缺失；
·在SEQ ID NO:11中位置24-26和91处的Xaa缺失；并且
·在SEQ ID NO:12中位置27-29和98处的Xaa缺失。
应当理解的是，上文讨论的关于HPV E6/E7融合蛋白的所有变量(例如，蛋白结构域的顺序、蛋白酶体可降解的接头的序列、蛋白酶体可降解的接头是否是相同还是不同、以及野生型序列是否被修饰来防止锌指的形成)可以单独地被使用或组合使用，以生成被认为是本公开文本的HPV E6/E7融合蛋白的蛋白序列。
可以用于本公开文本的疗法和方法的抗原性蛋白的另外的例子是前列腺六次跨膜上皮抗原(STEAP)蛋白。人STEAP(huSTEAP)在前列腺癌中过度表达并且在多种癌细胞系中上调，包括胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、急性淋巴细胞白血病和Ewing肉瘤(Hubert RS et al.,(1999)Proc Natl Acad Sci 96:14523-14528)。
STEAP基因编码具有两侧为亲水氨基-和羧基-末端结构域的六种潜在跨膜区域的蛋白。本公开文本的作者使用了huSTEAP蛋白作为在初免腺病毒和Maraba MG1病毒中的抗原性蛋白。在本公开文本中，作者测试了在人和小鼠中表达的密码子优化的序列，其产生了341种氨基酸蛋白(SEQ ID NO:13)。表达SEQ ID NO:13的蛋白的反义RNA病毒可以包括SEQID NO:14的多聚核苷酸的反向互补RNA版本序列。表达SEQ ID NO:13的蛋白的DNA病毒可以包括SEQ ID NO:14的序列。
Maraba MG1被改造以包含人前列腺六次跨膜上皮抗原的转基因，其被插入在Maraba病毒的MG1双重突变的G和L病毒基因之间(Brun J.et al.,(2010)Mol Ther 8:1440-1449)。该转基因序列被密码子优化，以适合在哺乳动物细胞中表达。所生成的含有huSTEAP蛋白的Maraba MG1被命名为“Maraba-MG1-huSTEAP”或“MG1-huSTEAP”。使用修饰的Maraba MG1骨架以便于克隆。将沉默突变引入Maraba MG1基因组骨架的L基因，以移除其中一个Mlul位点。在G和L之间的克隆区域用BsiWI位点替换第二Mlul位点。与在Brun等的文章中描述的系统相比，对Maraba MG1基因组骨架的这些修饰形成了更直接的克隆系统，因为它避免使用穿梭质粒pMRB-MG1/pNF。huSTEAP转基因序列在它的Mlul和BsiWI位点处(在G和L之间的克隆区域处)被连接到该修饰的Maraba MG1基因组骨架中。然后拯救Maraba-MG1–huSTEAP(如先前在Brun J.et al.,(2010)Mol Ther 18:1440-1449中所述)，空斑纯化一次，并进行opti-prep纯化。Maraba-MG1-huSTEAP的基因组序列是SEQ ID NO:15的反向互补RNA版本序列。
本公开文本的示例性初免病毒是具有E1/E3缺失并表达huSTEAP或鼠STEAP(muSTEAP)的5型腺病毒。使用Ad-huSTEAP在无肿瘤动物中的huSTEAP免疫成功地产生了抗-STEAP免疫应答。尽管该应答对该人肽(human peptide)具有更强的反应性，但有证据显示针对鼠STEAP蛋白中存在的表位的加强的免疫应答。用Ad:MG1-huSTEAP处理能够产生抗-STEAP免疫应答并且显著地损害肿瘤生长，导致显著改善的存活率。
腺病毒、Maraba MG1病毒或两者都可以被配制成分离的病毒用于给药。该腺病毒可以配制在例如含10％甘油的10mM Tris-Cl，pH 8.0中。Maraba MG1病毒可以配制在例如10mM HEPES、0.15M NaCl和4％蔗糖中，pH约为7.5。
在本公开文本的初免:加强免疫组合疗法中，两种病毒可表达没有相同序列的抗原性蛋白，例如HPV E6/E7融合蛋白或huSTEAP蛋白。例如，腺病毒可表达具有以ABCD顺序排列的四个蛋白结构域的HPV E6/E7融合蛋白，而Maraba MG1病毒可表达具有以BADC顺序排列的四个蛋白结构域的HPV E6/E7融合蛋白。在另外的例子中，腺病毒能够表达HPV E6/E7融合蛋白，其中四个蛋白结构域通过蛋白酶体可降解的接头连接，该接头不同于连接由Maraba MG1病毒表达的融合蛋白的四个蛋白结构域的蛋白酶体可降解的接头。在另外例子中，腺病毒能够表达根据SEQ ID NO:13的huSTEAP蛋白；而Maraba MG1病毒能够表达作为SEQ ID NO:13的变体的huSTEAP蛋白，例如与SEQ ID NO:13 90％相同的蛋白。
术语“变体”应当被理解为指与参比蛋白的序列至少70％相同的蛋白。优选地，该变体将至少80％相同。更优选地，该变体将至少90％相同。甚至更优选地，该变体将至少95％相同。在具体序列(例如SEQ ID NO:1)的融合蛋白上下文中，该融合蛋白的变体将被理解为指其中每个该蛋白结构域与参比蛋白中它们的相应结构域的序列至少70％相同的蛋白。优选地，该变体将至少80％相同。更优选地，该变体将至少90％相同。甚至更优选地，该变体将至少95％相同。具有更高序列同一性的变体增加了表位以与参比蛋白相似的3-维方式呈现的可能性。相应地，在两种病毒不生成具有相同序列的蛋白的组合的另一种例子中，腺病毒能够表达SEQ ID NO:1的蛋白，而Maraba MG1病毒能够表达作为SEQ ID NO:1的变体的蛋白，例如下述融合蛋白，即其中四个蛋白结构域中的每一个与SEQ ID NO:1中它们相应的蛋白结构域的序列至少90％相同。
在本文中，应当理解的是，所有讨论的和提及的“由病毒表达的蛋白”，更准确地是指由被病毒感染的细胞表达的蛋白，因为病毒本身不具有表达蛋白的能力。相似地，所有讨论的和提及的“表达蛋白的病毒”或“能够表达蛋白的病毒”更准确地是指包括了对于由被感染该病毒的细胞表达该蛋白所必需的遗传信息(即“编码”该蛋白)的病毒。
在本文中，“初免:加强免疫组合疗法”应当被理解为是指本文所讨论的腺病毒和Maraba MG1病毒将作为初免:加强免疫治疗被施用的疗法。不需要将腺病毒和Maraba MG1病毒实体上一起提供或包装，因为将腺病毒将首先被施用，并且仅在免疫应答已经在哺乳动物中产生之后才施用Maraba MG1病毒。在一些例子中，以多个初免腺病毒包装以及单独的多个加强Maraba MG1病毒包装形式将该组合提供至医疗机构，例如医院或医生办公室。可以在不同时间提供该腺病毒包装和该Maraba MG1病毒包装。在其他例子中，以包括初免腺病毒和加强Maraba MG1病毒的包装的形式将该组合提供至医疗机构，例如医院或医生办公室。
初免:加强免疫组合疗法可以额外地包括免疫增强化合物(例如环磷酰胺(CPA))，其增强因施用第一病毒而在哺乳动物中产生的对肿瘤相关抗原性蛋白的初级免疫应答。环磷酰胺是化学治疗剂，其可以导致对该肿瘤相关抗原性蛋白的增强的免疫应答。在协同的鼠黑色素瘤模型中，在初免载体之前施用CPA显著地增加了存活率，而在加强免疫载体之前施用CPA则不会。
本公开文本公开的治疗方法将:(1)腺病毒疫苗和(2)作为溶瘤病毒疫苗的MarabaMG1病毒组合，两者都表达抗原性蛋白，例如人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白或huSTEAP。用本公开文本的溶瘤疫苗进行加强免疫可以在由腺病毒疫苗初免的动物中导致由溶瘤病毒所致的肿瘤消蚀以及肿瘤特异性CTL(细胞毒性T-淋巴细胞)数量的大量增加。反常的是，与无肿瘤的动物相比，该方法学实际上在荷瘤动物中生成了更大的抗肿瘤应答，因为与无肿瘤动物中的溶瘤病毒的复制及相关联的抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)数量相比，溶瘤病毒在荷瘤动物中的复制扩大了，导致抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)数量增加。
HPV基因的表达产物被加工成肽，其随后被表达在细胞表面上。这可以导致肿瘤细胞被特异性CTL裂解。对外源性抗原应答的T细胞包括细胞溶解T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。当CD8+细胞毒性或细胞溶解T细胞(CTL)被激活时，其溶解呈递由HLA I类分子呈递的适当抗原的细胞。CD4+T辅助性细胞是分泌细胞因子来刺激巨噬细胞和产生抗原的B细胞的T细胞，两者通过HLA II类分子在它们表面上呈递适当的抗原。
术语“哺乳动物”指人类及非人类哺乳动物。术语“癌症”在本文中包括表达作为抗原性蛋白的由初免和加强病毒编码的蛋白(例如E6和E7蛋白或huSTEAP蛋白)的任何癌症。这样的癌症的例子包括但不限于:例如宫颈癌、头颈癌和其他肛门与生殖器癌症的多发性上皮恶性肿瘤(multiple epithelial malignancy)，前列腺癌，胰腺癌，结肠癌，乳腺癌，睾丸癌，宫颈癌，膀胱癌，卵巢癌，急性淋巴细胞白血病和Ewing肉瘤。
腺病毒、Maraba MG1病毒、或两者都可以静脉内、肌肉内、腹膜内或鼻内方式独立地施用至哺乳动物。在施用病毒后，哺乳动物在免疫应答间隔期内(例如在约4天之内)产生免疫应答并且持续数月、数年，或者可能持续终生。
为了建立对于抗原性蛋白的免疫应答，可以使用成熟的技术来用腺病毒和MarabaMG1病毒进行疫苗接种。如本领域技术人员将理解的，产生免疫应答所需的病毒的量将随许多因素(包括例如将被处理的哺乳动物，例如物种、年龄、大小等)而变化。关于这点，例如，至少约107PFU的编码HPV E6/E7蛋白的腺病毒载体被肌内给药至小鼠足以产生免疫应答。相应的量将足以用于施用至人类以产生免疫应答。
一旦通过施用编码抗原性蛋白的腺病毒而在哺乳动物中产生了免疫应答，则在适合的免疫应答间隔之内以适合于溶瘤病毒疗法的量施用编码抗原性蛋白的Maraba MG1病毒。适合的免疫应答间隔可以是例如至少约24小时，优选地至少约2-4天或更长，例如至少约1周，或至少约2周。如本领域技术人员将理解的，适合于溶瘤病毒疗法的Maraba MG1病毒的量将随将被治疗的哺乳动物而变化。例如，经IV施用至小鼠的108PFU编码HPV E6/E7蛋白的Maraba MG1病毒对溶瘤疗法是足够的。相应的量将足以用于人类。
可以使用标准重组技术，将编码HPV E6/E7蛋白的转基因的反向互补序列掺入Maraba MG1病毒，制备编码HPV E6/E7蛋白的Maraba MG1病毒。例如，该转基因的反向互补序列可以被掺入Maraba MG1病毒的基因组中，或者可以将掺入了该转基因的质粒掺入该病毒中。编码该蛋白的转基因可以是密码子优化的转基因。
在实施例中示出了本公开文本的示例性初免:加强免疫组合疗法能够在小鼠中治愈大多数具有250mm3的平均体积的晚期且大体积皮下肿瘤。该示例性初免:加强免疫组合疗法能在小鼠中诱导肿瘤特异性CD8+T细胞应答，并具有在小鼠中产生超过五千万个E7特异性T细胞的潜能。不希望受理论束缚，本公开文本的作者认为，使用HPV E6/E7作为抗原性蛋白的本公开文本初免:加强免疫疗法可用于人类以治疗HPV阳性肿瘤。
虽然本文所用的TC1肿瘤模型显得不容易受直接溶瘤作用影响，但本公开文本的作者认为HPV阳性人类肿瘤将被MG1 Maraba选择性地感染并杀死。在不存在I型IFN的情况下，Maraba能够在体外裂解TC1细胞。然而，用IFNβ预处理TC1细胞可保护这些细胞免受病毒溶瘤作用。由I型IFN所产生的保护作用解释了为什么当用编码非特异性转基因的MG1Maraba处理荷TC1肿瘤的小鼠时缺乏效力。当整合到人类细胞的基因组中时，E6和E7都抑制对I型IFN16的细胞应答(如在高度恶性HPV肿瘤中的情况)。来自G-缺失VSV试验(下文讨论的试验，数据未示出)的数据在人上皮细胞系中重现了这种效应。通过确认E6和E7在TC1细胞系中的表达，对病毒溶瘤作用的易感性的缺乏可以通过E6和E7不能与小鼠组织中的I型IFN的级联相互作用来解释，因此这种效应对HPV对人类宿主有机体的适应性是特异性的。不希望受理论束缚，本公开文本的作者认为HPV阳性人类肿瘤的敏感性可进一步加强本公开文本的初免:加强免疫组合疗法的效力。
由于Maraba病毒是弹状病毒家族的一员，所以它不会造成插入突变风险，因为从未在病毒的生命周期中制造DNA，其完全发生在细胞核之外。腺病毒整合到宿主基因组中的频率很低。如果用Ad-E6E7转导的细胞经历与E6E7转基因的整合事件(该转基因编码任选地具有上文所讨论的防止锌指形成的突变的蛋白)，则所产生的蛋白质将不能干扰p53或视网膜母细胞瘤的功能，从而降低阻止新生肿瘤形成的可能性。
通过包括来自HPV 16和HPV 18的E6和E7的全长序列，具有HPV相关癌症的患者可能适合于用本公开文本的初免:加强免疫组合疗法来治疗。该组合疗法能够引起对多种潜在表位的应答。
基于疫苗的疗法在治疗感染性疾病中的效力被认为与保护性T细胞能够产生多种细胞因子的能力相关。本文示出了示例性初免:加强免疫组合疗法诱导多种不同的T细胞群体，这些T细胞群体通过它们的细胞因子产生模式来定义。在一些例子中，细胞因子阳性T细胞能够在E7肽的存在下脱粒。本公开文本说明了单独施用Ad-E6E7能够诱导多功能T细胞，但是当用MG1-E6E7加强免疫时增加了这些细胞的数量。本公开文本的初免:加强免疫疗法组合可用于产生多功能T细胞，这被认为对治疗性疫苗有益。
如本文讨论的实验所示，本公开文本的示例性初免:加强免疫组合疗法可以产生特异性抗肿瘤细胞毒性T细胞，并且耗尽这些CD8+T细胞导致疗效丧失。
不希望受理论束缚，本公开文本的作者认为能够生成相当大的特异性免疫应答的组合疗法可能在面对晚期疾病中会导致有利的临床结局。本公开文本的作者还认为这样的组合疗法可用于在缺乏这样的应答的患者中诱导特异性E6和/或E7应答，并且用这样的组合疗法进行治疗可改善患者的预后。在治愈了晚期TC1肿瘤的小鼠中，本文所测试的示例性组合疗法显示出反应性CD8+T细胞的显著且耐久的持久性，并且中枢记忆性T细胞随着时间变化相对扩增。中枢记忆性T细胞的缺乏被认为是治疗性癌症疫苗接种失败的一个潜在原因。本文所讨论的结果显示，本公开文本的示例性组合疗法能够在小鼠中治疗晚期HPV阳性肿瘤模型。
材料和方法
小鼠
六至八周龄雌性C57BL/6小鼠购自Charles River(Wilmington,MA)并饲养于无特异性病原体环境中。所有动物研究均获得麦克马斯特大学动物研究伦理委员会的批准，并遵守加拿大动物保护委员会的指导原则。
重组病毒
专门制造密码子优化的转基因，其编码突变的减毒E6E7和WT E6E7(GensScript,Piscataway,NJ)序列。Ad BHG和Ad E6E7是人类血清型5复制缺陷型(E1/E3缺失)腺病毒。AdBHG不含转基因，AdE6E7含有编码减毒的治疗性E6E7构建体的转基因。将GFP或E6E7转基因插入到Maraba病毒的减毒MG1株的G和L病毒基因之间，以分别产生MG1 GFP和MG1 E6E7。
细胞培养
表达来自HPV16的E6和E7的鼠TC1细胞生长于含有10％胎牛血清、10mmol/lHEPES、2mmol/l L-谷氨酰胺和400μg/ml G418(Gold Biotechnology,St Lois,MO)的RPMI中。Vero、L929和A549细胞均培养于含有8％胎牛血清和2mmol/l L-谷氨酰胺的αMEM中。SaOS2细胞培养于含有10％胎牛血清和2mmol/l L-谷氨酰胺的DMEM中。Panc02细胞培养于含有10％胎牛血清和2mmol/l L-谷氨酰胺的RPMI中。
体外的感染
在200μl培养基中以逐渐降低的感染复数(从10到0.001以及未感染的对照孔)感染含有汇合的TC1细胞(每孔约1.5x106个)的六孔板45分钟，在感染之后加入新鲜培养基并在感染后48小时，用甲醇固定细胞，并用0.1％结晶紫(Sigma-Aldridge St Lois，MO)在20％乙醇中染色用于活性测定。
干扰素β应答测试
在96孔板中将IFNβ响应性L929细胞和IFNβ抗性Panc02细胞系接种在TC1细胞旁边，并在达到汇合时用稀释系列的鼠IFNβ处理过夜。次日，用每孔5x105PFU的表达GFP的野生型VSV感染这些细胞。使用Typhoon Trio可变模式成像仪(GE Healthcare,Buckinghamshire,U.K)在感染后24小时检测荧光。
确定E6和E7对人上皮肿瘤细胞中先天性抗病毒应答的影响的G缺失VSV试验
将A549人肺腺癌细胞接种在96孔板中，并使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)，用目标质粒和编码VSV糖蛋白(PSG5-G)的质粒共转染。随后用表达GFP的G缺失VSV感染细胞并收获上清液。收集含有任何拯救病毒子代的上清液，并使用连续稀释液来感染96孔板中的汇合的Vero细胞，并对其进行荧光成像。如荧光检测所示，只有用PSG5-G成功地转染并且通过被转染的目的质粒抑制抗病毒状态的细胞能够产生病毒子代。
瞬时转染
将A549细胞铺板在6孔板中，当80％汇合时，使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)以2μg在pShuttle-CMV载体(Agilent，SantaClara，CA)中的来自HPV16和18的野生型E6E7、减毒E6E7转基因或GFP转染细胞。将SaOS2细胞用在pcDNA 3中的HA标记的视网膜母细胞瘤(来自Joe Mymryk的馈赠)、GFP和WT E6E7、减毒E6E7或空pShuttle-CMV之一共转染。在转染后24-48小时，在100μl补充有Complete Mini蛋白酶抑制剂片剂(Roche,Mannheim,Germany)的放射免疫沉淀试验缓冲液中裂解细胞。
免疫印迹和抗体
每个泳道将等量(20或30μg)蛋白质裂解物上样到聚丙烯酰胺凝胶上，并通过SDS-PAGE分离，转移到0.45μm硝酸纤维素膜上。用PBS中的5％脱脂牛奶或Odyssey封闭缓冲液(LI COR Biosciences,Lincoln,NE)在室温下封闭膜40分钟。用针对p53(克隆DO1,SantaCruz,Dallas,TX)、HA(克隆F7,Santa Cruz,Dallas,TX)、E7(克隆8E2,Abcam,Cambridge,UK)、β-肌动蛋白(克隆13E5,Cell Signalling,Danvers,MA)和GFP(克隆D5.1,CellSignaling,Danvers,MA)的抗体探测膜。然后用二级IRDye(LI COR Biosciences,Lincoln,NE)抗体探测膜。扫描膜并使用LI COR Odyssey系统(LI COR Biosciences,Lincoln,NE)定量荧光。
小鼠的疫苗接种
在气体全身麻醉下以2x108PFU的剂量在100μl的0.9％NaCl注射液(Hospira,LakeForest,IL)中施用腺病毒，该剂量分成两份，50μl注射到两个后肢的半膜肌中。对于TC1肿瘤的直接溶瘤作用，将Maraba MG1 GFP以200μl 0.9％NaCl中的5x108PFU的剂量静脉注射，给予3次剂量，每剂间隔48小时。当用作加强免疫时，在腺病毒疫苗接种之后9天，以200μl0.9％NaCl中的1x109PFU剂量以单次剂量形式施用Maraba MG1 GFP或E6E7。
肿瘤激发(Tumour challenge)
在气体全身麻醉下在小鼠皮下移植1x106TC1细胞。每2-3天测量肿瘤的最长轴(长度)和与此垂直的轴(宽度)，并使用下式计算肿瘤体积:
体积＝4/3π(0.5长度x0.5宽度2)
当在移植小鼠中平均肿瘤体积达到250mm3时，开始治疗荷瘤小鼠。当肿瘤生长至1500mm3体积或相对于肿瘤移植之前记录的体重小鼠损失其体重的20％时，小鼠达到终点。
肽
来自HPV血清型16的已知免疫显性肽由Biomer Technologies(San Francisco,CA)合成。所使用的H-2Kb结合E6肽的序列是EVYDFAFRDL(SEQ ID NO:16)，并且所使用的H-2Db结合E7肽的序列是RAHYNIVTF(SEQ ID NO:17)。
细胞内细胞因子染色及抗体
在腺病毒疫苗接种后8天和MarabaMG1处理后5天获得血液样本，在Maraba后5天也收获脾脏。将外周血单核细胞和脾细胞在完全RPMI(含有10％胎牛血清和2mmol/l L-谷氨酰胺)中与2μg/ml肽和抗CD107a(克隆1D4B,BD,Franklin Lakes,NJ)一起孵育。孵育在37℃，5％CO2培养箱中在95％湿度下进行总共5小时，在最后4小时添加1μg/ml布雷菲德菌素A(brefeldin A)(GolgiPlug,BD,Franklin Lakes,NJ)。然后将细胞与抗CD16/CD32(克隆2.4G2,小鼠BD Fc Block,BD,Franklin Lakes,NJ)一起孵育。用抗CD8a(克隆53-6.7,eBiosciences,Inc.,San Diego,CA)和CD4(克隆RM4-5,eBiosciences,Inc.,San Diego,CA)抗体进行T细胞表面染色。随后将细胞固定并透化(Cytofix/Cytoperm,BD,FranklinLakes,NJ)。然后使用抗IFNγ(克隆XMG1.2,BD,Franklin Lakes,NJ)、TNFα(克隆MP6-XT22,BD,Franklin Lakes,NJ)和IL-2(克隆JES6-5H4,BD,Franklin Lakes,NJ)抗体进行细胞内细胞因子染色。使用LSRFORTESSA细胞计数器(BD，Franklin Lakes，NJ)获取数据，并用FlowJo Mac软件(Treestar，Ashland，OR)分析。
T细胞计数
将已知量的荧光微球(bead)(123count eBeads,eBiosciences,Inc.,San Diego,CA)加入50μl已用抗CD8a(克隆53-6.7,eBiosciences,Inc.,San Diego,CA)和CD4(克隆RM4-5,eBiosciences,Inc.,San Diego,CA)抗体染色的全血中并固定和裂解(1步Fix/Lyse溶液,eBiosciences,Inc.,San Diego,CA)。在2次洗涤步骤之后，将细胞和微球重悬在FACS中，并计算绝对细胞数。为了计算脾脏细胞，将整个脾脏处理并重悬于完全RPMI中，然后如对外周血一样分析50μl重悬的脾脏细胞。通过将每只小鼠的体重(克)乘以70来计算以μl计的总血液体积，从而允许T细胞的总循环计数。
T细胞记忆表型和抗体
将PBMC和脾细胞与抗CD16/CD32(克隆2.4G2,小鼠BD Fc Block,BD,FranklinLakes,NJ)抗体一起孵育。然后用抗CD8a抗体(克隆53-6.7,eBiosciences,Inc.,SanDiego,CA)，抗CD4抗体(克隆RM4-5,eBiosciences,Inc.,San Diego,CA)，抗CD62L抗体(克隆MEL-14,BD,Franklin Lakes,NJ)、抗CD127抗体(克隆SB/199,BD,Franklin Lakes,NJ)和抗HPV H-2Db E7四聚体RAHYNIVTF抗体(Baylor College of Medicine,Houston,TX)染色细胞。
耗竭抗体
间隔48小时给予2次剂量的抗-CD8a(2.43克隆)或抗-CD4(GK1.5克隆)抗体来选择性地耗竭T细胞。在300μl 0.9％NaCl中用200μg抗体腹腔注射小鼠。从对CD8a和CD4染色的外周血样本中通过流式细胞术评估耗竭。
统计学分析
使用用于Mac的GraphPad Prism版本6(GraphPad Software,San Diego,CA)以图形方式显示和分析数据。将转染和免疫应答数据绘制成柱状图并显示平均值和标准误差。当比较两个组时使用非成对的T检验，并且使用ANOVA检验来比较两个以上的组。使用Kaplan-Meier曲线绘制存活率，并使用对时序检验比较中值存活率。统计学显著性定义为p≤0.05(*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001,****p≤0.0001)。
实施例
为清楚起见，在以下实施例中由病毒编码的HPV E6E7融合蛋白具有根据SEQ IDNO:1的序列。它可以被称为“减毒的治疗性E6E7构建体”。
实施例1:减毒的E6E7转基因在体外不降解p53或视网膜母细胞瘤
设计了本公开文本的HPV E6/E7融合蛋白的一个实例并将其克隆到腺病毒和Maraba MG1病毒中。示例性融合蛋白基于HPV的16和18血清型的E6和E7转化蛋白。在四个蛋白结构域中的每一个之间包括GGGGGAAY接头，以促进蛋白酶体降解并生成HPV16E6、HPV18E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白。在HPV16和HPV18E6结构域中，对四个CXXC模体中的两个进行缺失突变，该模体起到形成介导p53降解的锌指的作用。在突变的转基因的HPV16 E7和HPV18 E7结构域中，将一个缺失应用于其中一个羧基末端CXXC模体，并将多个缺失应用于负责HPV诱导的癌症中视网膜母细胞瘤功能障碍的LXCXE序列。示例性的突变转基因具有根据SEQ ID NO:1的序列，并在图1中示出，其中第一蛋白结构域和第二蛋白结构域分别对应于HPV16 E6和HPV18 E6，第三蛋白结构域和第四蛋白结构域分别对应于HPV16 E7和HPV18E7，而GGGGGAAY接头未突出显示。
用含有E6E7转基因的野生型序列、突变的E6E7转基因或无关的对照质粒(GFP)的表达载体，转染含有野生型p53的A549细胞，随后通过免疫印迹定量p53的水平。用野生型转基因序列发现到了p53的降解。然而，相对于对照(GFP)质粒，该活性被上文讨论的引入至治疗性转基因的突变所抑制。与p53水平相关的实验的免疫印迹数据总结于图2中，其显示野生型E6E7转基因的表达导致p53降解，而突变体E6E7使p53蛋白水平未受损。
在一组平行实验中，无视网膜母细胞瘤细胞系SaOS2与编码HA标记的视网膜母细胞瘤(pRb)的表达质粒连同GFP编码质粒以及编码以下三种表达载体中的一个共转染:WTE6E7转基因、突变的治疗性转基因或对照质粒。在转染之后，使用免疫印迹定量HA标记的视网膜母细胞瘤的水平。观察到在WT E6E7转染的细胞裂解物中的显著下降，而对照质粒和突变E6E7的表达对稳态pRb水平没有影响。图3中为免疫印迹数据的标准化图示。
总之，在野生型序列中特定氨基酸的缺失分别阻止E6和E7蛋白的转化活性，该转化活性与它们与p53和视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白的相互作用有关，降低了在体内使用时的疫苗载体的致癌潜力。
实施例2:表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白的腺病毒初免载体和Maraba MG1疫苗载体的构建和免疫测试:
在本公开文本的示例性方法中，测试了溶瘤疫苗接种策略。该示例性方法使用编码治疗性E6E7(Ad-E6E7)转基因的腺病毒初免，然后使用编码相同转基因的MG1 Maraba病毒加强免疫(MG1-E6E7)。将病毒施用至小鼠，并使用细胞内细胞因子染色(ICS)定量免疫应答。为了比较，还分析了假初免组(Ad-BHG)和假加强组(MG1-GFP)。
如上文在材料和方法部分所述，Ad-BHG和Ad-E6E7是人血清型5重复缺陷型(E1/E3缺失)腺病毒。Ad BHG不含转基因，Ad-E6E7含有编码减毒的治疗性E6E7构建体的转基因。将GFP或E6E7转基因插入Maraba病毒的减毒MG1株的G和L病毒基因之间，以分别产生MG1-GFP和MG1-E6E7。
用已知的E6(EVYDFAFRDL)和E7(RAHYNIVTF)C57BL/6CD8+表位再刺激外周血单核细胞。Ad-E6E7初免之后的血液样品显示，由CD8+T细胞产生干扰素-γ(IFNγ)可知，产生了抗E6和E7表位的特异性应答。大约1％的CD8+T细胞在用E6表位刺激时分泌IFNγ，并且大约10％的CD8+T细胞在用E7表位刺激时分泌IFNγ。在假初免之后没有观察到任何应答。在假初免后施用MG1 E6E7之后，观察到微弱的应答(对于E6和E7肽，平均频率分别为0.042％和0.21％的CD8+T细胞产生IFNγ)。然而，在Ad-E6E7初免后施用MG1 E6E7的小鼠显示出IFN+T细胞频率的显著增加。同样，E7表位似乎是主要的，用该肽再刺激之后平均频率为68.87％的CD8+T细胞产生IFNγ。这些数据被总结在图4A-4D中。
为了比较单独使用AdE6E7生成的免疫应答与Ad-E6E7初免:MG1-E6E7加强免疫相比的真实量级，在加强免疫时间后处死一小部分小鼠，在用E7肽再刺激后，再次进行ICS，并且使用专门设计用来通过流式细胞术计算细胞数的荧光微球磁珠来定量外周血和脾的CD8+T细胞的数量。
与单独的AdE6E7相比，Ad-E6E7初免:MG1-E6E7加强免疫诱导了总的CD8+T细胞群体和E7特异性CD8+T细胞群体的明显且高度显著的扩增(如图5所示)。Ad-E6E7初免:MG1-E6E7加强免疫生成了6.5x 107个总CD8+T细胞数。当将E7特异性CD8+T细胞的脾脏池和E7特异性CD8+T细胞的循环池组合时，在Ad-E6E7初免:MG1-E6E7加强免疫之后产生了4.1x 107的平均绝对计数(n＝10，范围＝2.4-5.1x 107)。使用示例性HPV E6E7融合蛋白作为肿瘤抗原的组合初免:加强免疫疗法，能够产生抗E6和E7表位的特异性CD8+T细胞应答，并且伴随效应细胞的大量扩增。
还测量了示例性初免:加强免疫组合疗法的应答动力学。CD8+T细胞在峰值时应答超过所有外周CD8+T细胞的50％。在稍后的时间点，如E7中抗单个已知C57/B6表位所测量的，大于20％的外周CD8+T细胞对该转基因应答。该数据在图6中示出。
对比实施例3:表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白的慢病毒初免载体和溶瘤疫苗载体的构建和免疫测试:
表达HPV E6/E7的慢病毒作为对比初免病毒进行测试。
HPV转基因是HPV血清型16全长野生型E6(gi/4927720/gb/AAD33252.1/AF125673_1 E6人乳头瘤病毒16型)和E7(gi/4927721/gb/AAD33253.1/AF125673_2 E7)序列以及HPV血清型18全长野生型E6(gi/137758/sp/P06463.1/VE6_HPV18 RecName:Full＝蛋白质E6)和E7(gi/137792/sp/P06788.2/VE7_HPV18)RecName:Full＝蛋白质E7)序列的融合，其在所有4个核苷酸序列中具有缺失，以去除对Rb或p53结合所需的锌指(去除蛋白质的致癌潜力)。
所产生的融合蛋白具有柔性甘氨酸接头和AAY序列(其用作蛋白酶体切割位点，以确保每种抗原被蛋白水解地降解为用于抗原呈递通常所生成的肽)。该密码子优化的融合核苷酸序列产生527个氨基酸的HPV16/18 E6/E7融合蛋白(SEQ ID NO:1)。
使用pDY.EG.WS慢病毒载体制备表达人乳头瘤病毒E6/E7融合转基因的慢病毒。使用含有EcoRI限制性位点(正向引物ACTGGAATTCATGCATCAGAAGCGAACTGC，SEQ ID NO:18)和BamHI限制性位点(反向引物ACTGGGATCCTCACTGCTGGGAGGCACAC，SEQ ID NO:19)的引物PCR扩增修饰的HPV转基因。琼脂糖凝胶纯化HPV转基因的PCR产物。pDY.EG.WS慢病毒载体在EcoRI和BamHI位点被切割以除去eGFP，琼脂糖凝胶纯化，并使用CIAP(Invitrogen货号18009-019)进行去磷酸化。然后将切割的载体进行额外的琼脂糖凝胶纯化。然后使用T4DNA连接酶(Invitrogen)将该HPV转基因PCR产物连接到该EcoRI/BamHI切割的载体中。使用感受态细胞使连接反应进行转化，来自阳性菌落的质粒DNA进行mini-prep扩增。表达该修饰的HPV转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体进行maxi-prep扩增。在用6.4μg以下三种质粒中的每一种转染之后，在293T细胞上拯救表达人乳头瘤病毒E6/E7融合转基因的慢病毒，三种质粒为:表达该修饰的HPV转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体、包装质粒pCMV-8.84和包膜质粒pMD2G。合并病毒上清液，并通过0.45μM过滤器过滤，并在16℃、以50,000x g离心120分钟。将表达人乳头瘤病毒E6/E7融合转基因的慢病毒重悬浮于PBS中，并储存在-80℃。
将MarabaMG1设计成含有被插入在Maraba病毒的MG1双重突变体的G和L病毒基因之间的乳头瘤病毒E6/E7融合转基因(Brun J.et al.,(2010)Mol Ther 18:1440-1449)。对转基因序列(SEQ ID NO:2)进行密码子优化用于哺乳动物细胞中的表达。生成的含有HPVE6/E7的Maraba MG1通常称为“Maraba-MG1-HPV E6/E7”。使用修饰的Maraba MG1骨架来促进克隆。将沉默突变引入Maraba MG1基因组骨架的L基因以去除其中一个Mlul位点。第二个MluI位点在G和L之间的克隆区域被BsiWI位点取代。对Maraba MG1基因组骨架的这些修饰形成了比Brun等人的文章中描述的克隆系统更直接的克隆系统，因为它避免使用了穿梭质粒pMRB-MG1/pNF。HPV E6/E7融合转基因序列在其MluI位点和BsiWI位点(在G和L之间的克隆区域)连接到该修饰的Maraba MG1基因组骨架中。然后拯救Maraba-MG1-HPV E6/E7(如先前在Brun et al.,(2010)Mol Ther 18:1440-1449中所述)，噬斑纯化一次，并使其进行opti-prep纯化。在该实施例中所使用的Maraba-MG1-HPV E6/E7的基因组序列是SEQ IDNO:4的反向互补RNA版本序列。
通常，在第0天通过施用初免载体(慢病毒-HPV E6/E7+poly I:C作为佐剂)并在第14天通过施用1e9 PFU的加强载体(Maraba-MG1-HPV E6/E7)来免疫接种动物。用编码GFP(替代HPV E6/E7转基因作为对照非免疫原性转基因插件)的病毒载体对对照动物进行初免:加强免疫。在第14天进行初免应答的分析，在第19天进行加强应答的分析。每种慢病毒-HPVE6/E7制剂是通过将250ug poly I:C作为佐剂添加到初免病毒中而制备的，然后每份病毒分开用在5只动物之间。用异氟烷麻醉小鼠，并将30uL慢病毒-HPV E6/E7/poly I:C注射到每个后足垫中。剩余的病毒在左腹股沟淋巴结附近皮下注射。在初免后第14天，收集血液并通过流式细胞术分析。然后通过静脉内给药方式用11x109PFU MG1-HPV E6/E7加强免疫小鼠。加强免疫后第5天，抽取血液并通过流式细胞术评估免疫应答。
免疫分析如下进行:使用肝素化毛细管通过眼眶后出血收集血液，并将血液收集到肝素中。然后使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，并分析生成的PBMC对肿瘤抗原的免疫应答。PBMC在不存在肽的情况下孵育或用2ug/mL肽(RAHYNIVTF)刺激，持续总共5小时，并在刺激后1小时加入golgi plug。刺激后，使PBMC进行CD4、CD8和IFNγ染色，并在FACSCanto和FlowJo上分析。通过流式细胞术在IFN-γ的细胞内细胞因子染色(ICS)之后检测应答的T细胞。来自未刺激的PBMC的值被当作背景，并从自刺激的PBMC中获得的值中减去。数据代表平均值+/-SEM。在表2中，证明了HPV E6/E7肽能够刺激CD8细胞中的IFN-γ的产生，表明免疫应答的存在。
表2.对对比组合疗法(慢病毒HPV-E6E7作为初免)的免疫应答
实施例4溶瘤疫苗接种产生了多功能T细胞
为了进一步评估所生成的T细胞应答的质量，在用Ad-E6E7初免:MG1-E6E7加强免疫接种的小鼠用E7肽再刺激之后的血液和脾组织上进行多功能T细胞分析。只接受AdE6E7的一组小鼠用于比较。
单独使用AdE6E7的疫苗接种或其后使用MG1-E6E7的疫苗接种能够生成在循环池和脾池中出现的双阳性(IFNγ和TNFα)和三阳性(IFNγ、TNFα和IL-2)CD8+T细胞。这些数据示于图7A-7D。
如图7A-7D中的数据所示，当计数循环的和脾的双阳性CD8+T和三阳性CD8+T细胞时，接受Ad-E6E7初免:MG1-E6E7加强免疫方案的小鼠在两个位置都具有显著更多的两种细胞群体。在多功能分析中还包括脱粒标记物CD107a(LAMP1)，并且事实上所有产生任何对E7肽响应的细胞因子的细胞对该标记物都是阳性的。用AdE6E7的疫苗接种生成了能够分泌对E7肽响应的多种效应细胞因子的CD8+T细胞，虽然数量少，但当这些小鼠接受MG1 E6E7加强免疫时，观察到这些群体的急剧的和显著的扩增。
实施例5.溶瘤E6E7疫苗接种以CD8+依赖方式治愈了携带HPV阳性癌的晚期模型小鼠
获得了作为HPV诱导的癌症的鼠模型的C57BL/6细胞系TC1，并通过RT-PCR证实E6和E7抗原的表达。在皮下移植之后，当它们的肿瘤达到晚期体积(250mm3)时，小鼠接受Ad-E6E7初免。荷瘤动物中的细胞内染色揭示了抗E6和E7肽的特异性CD8+T细胞应答。此外，相对于所有其他组，在用MG1-E6E7加强免疫后记录到E7特异性T细胞的显著扩增。这些数据在图8A和8B中示出。
接受相同治疗疗法和对照疗法的无肿瘤小鼠展现出相似的结果(数据未显示)。
在未治疗的动物中未发现自发免疫。当达到终点体积(1500mm3)时或它们由于恶病质损失了20％的体重时，处死小鼠。
所有未治疗的小鼠死于肿瘤进展，而用假Ad-BHG初免:MG1-E6E7加强免疫或Ad-E6-E7初免:假MG1-GFP加强免疫的治疗延迟肿瘤进展但很少治愈。然而，用Ad-E6E7初免随后MG1-E6E7加强免疫治疗携带晚期TC1肿瘤的小鼠时，导致75％的小鼠(n＝12)的持久治愈。存活百分比与时间的关系在图9中示出。
在用治愈方案治疗的小鼠中，在加强免疫前两天并且随后在加强免疫后四十天进行CD8+T细胞耗尽(“CD8”)导致肿瘤控制的丧失，当CD8+细胞仅在稍后时间点被耗尽时(“CD8晚期”)或当CD4+细胞在加强免疫前两天被耗尽时(“CD4”)没有观察到这种效应。对照包括未用初免:加强免疫组合疗法治疗的小鼠，以及用示例性初免:加强免疫组合疗法治疗但在治疗方案期间没有让CD8或CD4细胞耗尽的小鼠。存活百分比与时间的关系在图10中示出。如上文方法部分所述，使用抗-CD8a(2.43克隆)或抗-CD4(GK1.5克隆)抗体实现CD8+T细胞的耗尽。
使用Ad-E6E7作为初免和MG1-E6E7作为加强免疫的示例性初免:加强免疫组合疗法能够在具有晚期可测量疾病的HPV鼠模型中产生抗E6和E7抗原的特异性免疫，导致呈CD8+依赖性方式的持久治愈。
实施例6.治愈的小鼠具有持久的抗原特异性免疫，其记忆性CD8+T细胞占优势
对来自实施例5从晚期TC1肿瘤中治愈的小部分小鼠进行了进一步的免疫分析以评估CD8+T细胞记忆表型。用E7特异性四聚体(H-2D(b)上的RAHYNIVTF)标记来自治愈的小鼠的循环T细胞和脾T细胞，在MG1-E6E7加强免疫后62天和117天对CD62L和CD127进行染色。
免疫分析显示，在血液和脾脏中的长期时间点，E7特异性CD8+T细胞显著地持续存在。大多数特异性细胞具有效应细胞记忆表型，其在血液和脾脏之间的分布如图11A和11B所示。
中枢记忆性T细胞的相对比例随着加强免疫和分析之间的时间间隔而增加(与加强后62天血液中5.1％和脾脏中9.4％相比，加强后117天血液中11.8％和脾脏中18.8％)。数据如表5所示。
表5.加强后62天和117天的记忆表型
溶瘤E6E7疫苗接种在从晚期TC1肿瘤治愈的小鼠中产生持久的CD8+免疫记忆。
实施例7.在无肿瘤小鼠中诱导特异性免疫应答的评估
对雌性C57Bl/6小鼠施用Ad-huSTEAP，总剂量为2e8PFU i.m.(向每支腿中i.m.给予50uL的1e8PFU)。根据图12中所示的治疗模式，以1e9PFU的剂量i.v.施用MG1-huSTEAP。
第13天(加强免疫前)和第19天(峰值加强)进行免疫分析。通过离体肽再刺激在PBMC上完成免疫分析，并对一组细胞因子进行染色以评估STEAP特异性CD8T细胞的数量。表1中列出的所有肽单独地用于确定T细胞应答哪些肽，以及它们是否是人类转基因特异性的或是否能够与小鼠序列交叉反应。
肽 序列 人类/小鼠的肽 再刺激的浓度
186-193 RSYRYKLL(SEQ ID NO:20) 完全保守 5ug/mL
hu327-335 VTKINKTEI(SEQ ID NO:21) 人类 5ug/mL
mu327-335 VSKINRTEM(SEQ ID NO:22) 小鼠 5ug/mL
5-13 KDITNQEEL(SEQ ID NO:23) 完全保守 5ug/mL
表1
Ad-huSTEAP免疫接种能够引发免疫应答。在hu327-335肽再刺激中观察到最大应答。在mu327再刺激以及保守的186-193和5-13再刺激中也存在免疫应答。这些数据在图13中示出。在MG1-huSTEAP之后，除了保守的5-13肽之外，所有肽都观察到加强的免疫应答。与初免免疫分析一样，hu327-335再刺激导致最大的抗STEAP应答。这些数据在图14中示出。
实施例8.在TrampC2前列腺癌模型中的免疫诱导和免疫效力
雄性C57Bl/6小鼠在左侧腹部s.q.移植2.5e6 TrampC2细胞，并且肿瘤被允许生长33天。将小鼠分配到表2中所示的三组中的一组。由于在该实验中使用了雄性小鼠，因此小鼠不能在笼间交换。为了获得最佳肿瘤体积起始点(平均值和方差)，将两个笼子组合成一组以获得所需的平均肿瘤体积。
表2
以2e8 PFU的总剂量i.m.施用Ad-huSTEAP(向每只后腿i.m.给予50μL的1e8PFU)。以1e9的剂量i.v.施用MG1-huSTEAP。治疗方案如图15中所示。
在第8天(初免分析)和第14天(峰值加强)进行免疫分析。通过离体肽再刺激在PBMC上完成免疫分析，并对一组细胞因子进行染色以评估STEAP特异性CD8T细胞的数量。使用一组小鼠特异性肽(186-193、mu327-335、5-13，参见表1)实施PBMC的再刺激。
记录所有小鼠的存活率。当肿瘤体积达到1500mm3时，则认为小鼠处于终点。为了计算肿瘤体积，使用了以下公式:体积＝(4/3)*3.14159*(L/2)*((W/2)2)。
与无肿瘤的研究结果相比，Ad-huSTEAP产生的平均免疫应答减少(0.15％vs5％)。然而，MG1-huSTEAP给药之后，约15％的平均加强应答更接近于无肿瘤实验中观察到的水平(约17％)。这些数据分别在图16和17中示出。
如图18所示，在Ad-huSTEAP给药后的三天内，Ad-huSTEAP使TrampC2肿瘤生长减弱。当肿瘤开始缓慢生长出时，在MG1-huSTEAP之后肿瘤控制仍持续了另外10天。然而，MG1-GFP对肿瘤生长仅具有非常有限的影响，肿瘤生长出现2-3天的小平台期，之后该肿瘤恢复到对照大小，并且在整个剩余的实验中与对照动物相似。用Ad-BHG/MG1-GFP治疗对存活率没有影响。然而，如图19中所示，用Ad:MG1-huSTEAP治疗导致显著的存活率优势。
在前面的描述中，为了解释的目的，阐明了许多细节从而提供对示例的全面理解。上述的例子仅是示例性的。本领域技术人员可以在不脱离且仅由所附权利要求限定的范围内对特定例子进行改变、修改和变形。
附录A–蛋白和核苷酸序列
HPV E6/E7融合蛋白的蛋白序列(SEQ ID NO:1):
注意:以粗体/斜体(即DK、IN、HK和LR)识别的二氨基酸对应于CXXC模体野生型序列中的XX氨基酸，其中半胱氨酸已被缺失；用下划线识别的二氨基酸对应于LXCXE模体野生型序列中的LX氨基酸，其中CXE氨基酸已被缺失。
HPV E6/E7融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO:3):
ATGCATCAGAAGCGAACTGCTATGTTTCAGGACCCTCAGGAGCGGCCACGCAAACTGCCTCAGCTGTGCACCGAACTGCAGACAACTATCCACGACATCATTCTGGAATGCGTGTACTGTAAGCAGCAGCTGCTGAGGAGAGAGGTCTATGACTTCGCTTTTCGCGATCTGTGCATCGTGTACCGAGACGGAAACCCATATGCAGTCGATAAGCTGAAGTTCTACAGCAAGATCTCCGAATACAGGCATTACTGTTACAGCGTGTACGGGACCACACTGGAGCAGCAGTATAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGAATTAATCAGAAGCCCCTGTGCCCTGAGGAAAAACAGAGGCACCTGGATAAGAAACAGAGATTTCATAACATCCGAGGACGATGGACCGGGCGGTGCATGTCCTGCTGTAGAAGCTCCCGGACTCGACGAGAGACCCAGCTGGGCGGAGGAGGAGGAGCAGCTTACATGGCACGATTCGAGGACCCTACCCGAAGGCCATATAAGCTGCCCGACCTGTGCACAGAACTGAATACTTCTCTGCAGGACATCGAGATTACATGCGTGTACTGTAAAACCGTCCTGGAGCTGACAGAAGTGTTCGAGTTTGCTTTCAAGGACCTGTTTGTGGTCTACCGGGATTCAATCCCTCACGCAGCCCATAAAATCGACTTCTACAGCAGGATCAGGGAACTGCGCCACTACTCCGACAGCGTGTACGGGGATACACTGGAGAAGCTGACAAACACTGGCCTGTACAATCTGCTGATCCGACTGCGACAGAAGCCACTGAACCCAGCCGAAAAACTGAGACACCTGAACGAGAAGAGACGGTTTCACAATATTGCAGGCCATTATAGGGGACAGTGCCATAGTTGCTGTAATCGAGCCAGGCAGGAAAGACTGCAGCGCCGAAGGGAGACTCAAGTCGGCGGAGGAGGAGGAGCTGCATACATGCACGGCGACACCCCCACACTGCATGAATATATGCTGGATCTGCAGCCTGAGACTACCGACCTGTACCAGCTGAACGATTCTAGTGAGGAAGAGGACGAAATCGACGGACCAGCAGGACAGGCAGAGCCTGACCGGGCCCACTATAATATTGTGACATTCTGCTGTAAGTGCGATTCTACTCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGTACTCATGTCGACATCCGCACCCTGGAGGATCTGCTGATGGGGACTCTGGGCATCGTCCCAATTTGTAGCCAGAAACCAGGCGGCGGCGGCGGAGCAGCTTACATGCACGGACCCAAGGCTACCCTGCAGGACATCGTGCTGCATCTGGAACCTCAGAATGAGATTCCAGTCGACCTGCTGCAGCTGAGTGATTCAGAAGAGGAAAACGACGAGATCGACGGCGTGAATCACCAGCATCTGCCTGCTAGACGGGCAGAGCCACAGCGACACACAATGCTGTGCATGTGCTGTAAGTGTGAAGCCAGGATCAAGCTGGTGGTCGAGTCAAGCGCCGACGATCTGCGCGCCTTCCAGCAGCTGTTCCTGAATACTCTGTCATTTGTCCCTTGGTGTGCCTCCCAGCAGTGA
编码HPV-E6E7融合蛋白的示例性Maraba MG1 DNA序列(SEQ ID NO:4)
示例性HPV E6/E7融合蛋白的蛋白序列(SEQ ID NO:5):
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKP*
示例性HPV E6/E7融合蛋白的蛋白序列(SEQ ID NO:6):
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKP*
示例性HPV E6/E7融合蛋白的蛋白序列(SEQ ID NO:7):
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKPGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
示例性HPV E6/E7融合蛋白的蛋白序列(SEQ ID NO:8):
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKPGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV*
HPV16 E6(SEQ ID NO:9):
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILEXaaVYXaaKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVXaaDKXaaLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRXaaINXaaQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRXaaMSXaaCRSSRTRRETQL
注意:当所有的Xaa都是半胱氨酸时，该序列是野生型序列。
HPV18 E6(SEQ ID NO:10):
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITXaaVYXaaKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAXaaHKXaaIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRXaaLRXaaQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQXaaHSXaaCNRARQERLQRRRETQV
注意:当所有的Xaa都是半胱氨酸时，该序列是野生型序列。
HPV16 E7(SEQ ID NO:11):
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYXaaXaaXaaQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVXaaPIXaaSQKP
注意:野生型序列具有XaaXaaXaa＝CYE
注意:野生型序列在位置91和94处具有半胱氨酸
HPV18 E7(SEQ ID NO:12):
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLXaaXaaXaaQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVXaaPWXaaASQQ
注意:野生型序列具有XaaXaaXaa＝CHE
注意:野生型序列在位置98和101处具有半胱氨酸
示例性huSTEAP的蛋白序列(SEQ ID NO:13)
MESRKDITNQEELWKMKPRRNLEEDDYLHKDTGETSMLKRPVLLHLHQTAHADEFDCPSELQHTQELFPQWHLPIKIAAIIASLTFLYTLLREVIHPLATSHQQYFYKIPILVINKVLPMVSITLLALVYLPGVIAAIVQLHNGTKYKKFPHWLDKWMLTRKQFGLLSFFFAVLHAIYSLSYPMRRSYRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDVWRMEIYVSLGIVGLAILALLAVTSIPSVSDSLTWREFHYIQSKLGIVSLLLGTIHALIFAWNKWIDIKQFVWYTPPTFMIAVFLPIVVLIFKSILFLPCLRKKILKIRHGWEDVTKINKTEICSQLKL
hu-STEAP蛋白的DNA序列(SEQ ID NO:14):
编码huSTEAP蛋白的示例性Maraba MG1 DNA序列(SEQ ID NO:15)
序列表
<110> 布莱恩·利克蒂
<120> 组合初免:加强免疫疗法
<130> PAT 103704W-90
<150> US 62,333,685
<151> 2016-05-09
<150> US 62/402,670
<151> 2016-09-30
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒 (HPV) E6/E7融合蛋白
<400> 1
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Asp Lys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu
65 70 75 80
Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln
85 90 95
Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Ile Asn Gln Lys Pro
100 105 110
Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe
115 120 125
His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg
130 135 140
Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu
165 170 175
Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile
180 185 190
Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu
195 200 205
Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His
210 215 220
Ala Ala His Lys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His
225 230 235 240
Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr
245 250 255
Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Leu Arg Gln Lys Pro Leu Asn Pro
260 265 270
Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile
275 280 285
Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg
290 295 300
Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ala Ala Tyr Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met
325 330 335
Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gln Leu Asn Asp Ser
340 345 350
Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser
370 375 380
Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
385 390 395 400
Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Pro Ile Cys Ser Gln
405 410 415
Lys Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Met His Gly Pro Lys Ala
420 425 430
Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro
435 440 445
Val Asp Leu Leu Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile
450 455 460
Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln
465 470 475 480
Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Lys
485 490 495
Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu
500 505 510
Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln
515 520 525
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Tyr
1 5
<210> 3
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV E6/E7融合蛋白的DNA序列
<400> 3
atgcatcaga agcgaactgc tatgtttcag gaccctcagg agcggccacg caaactgcct 60
cagctgtgca ccgaactgca gacaactatc cacgacatca ttctggaatg cgtgtactgt 120
aagcagcagc tgctgaggag agaggtctat gacttcgctt ttcgcgatct gtgcatcgtg 180
taccgagacg gaaacccata tgcagtcgat aagctgaagt tctacagcaa gatctccgaa 240
tacaggcatt actgttacag cgtgtacggg accacactgg agcagcagta taacaagccc 300
ctgtgcgacc tgctgatcag aattaatcag aagcccctgt gccctgagga aaaacagagg 360
cacctggata agaaacagag atttcataac atccgaggac gatggaccgg gcggtgcatg 420
tcctgctgta gaagctcccg gactcgacga gagacccagc tgggcggagg aggaggagca 480
gcttacatgg cacgattcga ggaccctacc cgaaggccat ataagctgcc cgacctgtgc 540
acagaactga atacttctct gcaggacatc gagattacat gcgtgtactg taaaaccgtc 600
ctggagctga cagaagtgtt cgagtttgct ttcaaggacc tgtttgtggt ctaccgggat 660
tcaatccctc acgcagccca taaaatcgac ttctacagca ggatcaggga actgcgccac 720
tactccgaca gcgtgtacgg ggatacactg gagaagctga caaacactgg cctgtacaat 780
ctgctgatcc gactgcgaca gaagccactg aacccagccg aaaaactgag acacctgaac 840
gagaagagac ggtttcacaa tattgcaggc cattataggg gacagtgcca tagttgctgt 900
aatcgagcca ggcaggaaag actgcagcgc cgaagggaga ctcaagtcgg cggaggagga 960
ggagctgcat acatgcacgg cgacaccccc acactgcatg aatatatgct ggatctgcag 1020
cctgagacta ccgacctgta ccagctgaac gattctagtg aggaagagga cgaaatcgac 1080
ggaccagcag gacaggcaga gcctgaccgg gcccactata atattgtgac attctgctgt 1140
aagtgcgatt ctactctgcg gctgtgcgtg cagagtactc atgtcgacat ccgcaccctg 1200
gaggatctgc tgatggggac tctgggcatc gtcccaattt gtagccagaa accaggcggc 1260
ggcggcggag cagcttacat gcacggaccc aaggctaccc tgcaggacat cgtgctgcat 1320
ctggaacctc agaatgagat tccagtcgac ctgctgcagc tgagtgattc agaagaggaa 1380
aacgacgaga tcgacggcgt gaatcaccag catctgcctg ctagacgggc agagccacag 1440
cgacacacaa tgctgtgcat gtgctgtaag tgtgaagcca ggatcaagct ggtggtcgag 1500
tcaagcgccg acgatctgcg cgccttccag cagctgttcc tgaatactct gtcatttgtc 1560
ccttggtgtg cctcccagca gtga 1584
<210> 4
<211> 12754
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 额外地编码HPV-E6E7 融合蛋白的Maraba MG1 DNA序列
<400> 4
acgaagacaa acaaaccatt gatagaatta agaggctcat gaaaatcctt aacagcgttc 60
aaaatgtctg ttacagtcaa gagagtcatt gatgattcac tcatcacccc caaattgcct 120
gcgaatgagg accctgtgga gtaccctgct gattatttca aaaagtcccg tgatattccg 180
gtgtacataa acacgaccaa aagtttgtct gatttgcggg gctatgttta tcaaggccta 240
aagtcaggca acatctctat aattcatgtc aacagttatc tgtatgcagc attaaaagag 300
atcagaggaa aattggacag agattggatc acctttggta tccaaatcgg aaaaacagga 360
gatagcgtgg ggatattcga tttactgacc ctaaaacctc tagatggtgt tttaccagat 420
ggggtgtctg atgctactcg aactagctca gacgatgcat ggcttccact gtatctattg 480
gggttataca gagttggtcg aacacagatg ccagaataca ggaagaagct gatggatggt 540
ctgattaatc aatgtaagat gatcaatgag cagtttgaac cactgttgcc agaaggaaga 600
gatgtctttg atgtctgggg aaatgacagc aattacacaa agattgtggc cgctgtagat 660
atgttcttcc atatgttcaa aaagcatgag aaggcctctt tcaggtatgg cacaatagtg 720
tcaagattta aggattgtgc agcattggct acatttggtc atctgtgtaa gatcactggt 780
atgtccactg aagatgtgac aacttggatt ctaaacaggg aggtggctga tgagatggtt 840
caaatgatgt acccaggaca ggagatagat aaggctgatt cttacatgcc ttatctaatc 900
gacttaggtc tgtcctcaaa atctccatat tcatcagtta aaaatccagc tttccatttt 960
tggggtcaat tgaccgcatt gttactgaga tcaaccagag ccagaaatgc acgtcagccg 1020
gatgacatcg agtatacatc cctgaccact gctgggctgt tgtatgcata tgccgttggt 1080
tcgtctgcag acctggctca acaattctac gttggggaca acaagtatgt gccagaaact 1140
ggagatggag gattaaccac caatgcaccg ccacaagggc gagatgtggt cgagtggctt 1200
agttggtttg aagatcaaaa cagaaaacct accccagaca tgctcatgta tgctaagaga 1260
gctgtcagtg ctttacaagg attgagggag aagacgattg gcaagtacgc caagtcagag 1320
tttgacaaat gacaactcac tcaccatatg tattactacc tttgcttcat atgaaaaaaa 1380
ctaacagcga tcatggatca gctatcaaag gtcaaggaat tccttaagac ttacgcgcag 1440
ttggatcaag cagtacaaga gatggatgac attgagtctc agagagagga aaagactaat 1500
tttgatttgt ttcaggaaga aggattggag attaaggaga agccttccta ttatcgggca 1560
gatgaagaag agattgattc agatgaagac agcgtggatg atgcacaaga cttagggata 1620
cgtacatcaa caagtcccat cgaggggtat gtggatgagg agcaggatga ttatgaggat 1680
gaggaagtga acgtggtgtt tacatcggac tggaaacagc ctgagctgga atccgacggg 1740
gatgggaaaa ctctccgatt gacgatacca gatggattga ctggggagca gaagtcgcaa 1800
tggcttgcca cgattaaggc agttgttcag agtgctaaat attggaacat ctcagaatgt 1860
tcatttgaga gttatgagca aggggttttg attagagaga gacaaatgac tcctgatgtc 1920
tacaaagtca ctcctgtttt aaatgctcca ccggttcaaa tgacagctaa tcaagatgtt 1980
tggtctctca gcagcactcc atttacattt ttgcccaaga aacaaggtgt gactccattg 2040
accatgtcct tagaagaact cttcaacacc cgaggtgaat tcatatctct gggaggaaac 2100
gggaaaatga gtcaccggga ggccatcatt ctagggttga gacacaagaa gctctataat 2160
caagccagac taaagtataa cttagcttga atatgaaaaa aactaacaga tatcaaaaga 2220
tatctctaac tcagtccatt gtgttcagtt caatcatgag ctctctcaag aaaattttgg 2280
gtattaaagg gaaagggaag aaatctaaga aattaggtat ggctccccca ccctatgaag 2340
aagagactcc aatggaatat tctccaagtg caccttatga taagtcattg tttggagtcg 2400
aagatatgga tttccatgat caacgtcaac tccgatatga gaaatttcac ttctcattga 2460
agatgactgt gagatcaaac aaaccatttc gaaattatga tgacgttgca gcagcggtgt 2520
ccaattggga tcatatgtac atcggcatgg caggaaaacg tcctttttat aagatattag 2580
cattcatggg ttctactcta ttgaaggcta caccagccgt ctgggctgac caaggacagc 2640
cagaatatca tgctcactgt gagggacgag cttacttgcc gcatcggtta gggccgaccc 2700
ctccgatgtt gaatgtccct gaacattttc gccgtccatt taacatcgga ttattcagag 2760
ggacaatcga cataaccctg gtacttttcg atgatgaatc tgtagattct gccccggtca 2820
tatgggatca ttttaatgca tccagattga gcagcttcag agaaaaggct ttgttgtttg 2880
gtttgattct agaaaagaaa gccactggga attgggtatt ggactctatt agtcatttca 2940
agtaattatc acaagtgttg aggtgatggg cagactatga aaaaaactaa cagggttcaa 3000
acactcttga tcgaggtacc cagttatatt tgttacaaca atgttgagac tttttctctt 3060
ttgtttcttg gccttaggag cccactccaa atttactata gtattccctc atcatcaaaa 3120
agggaattgg aagaatgtgc cttccacata tcattattgc ccttctagtt ctgaccagaa 3180
ttggcataat gatttgactg gagttagtct tcatgtgaaa attcccaaaa gtcacaaagc 3240
tatacaagca gatggctgga tgtgccacgc tgctaaatgg gtgactactt gtgacttcag 3300
atggtacgga cccaaataca tcacgcattc catacactct atgtcaccca ccctagaaca 3360
gtgcaagacc agtattgagc agacaaagca aggagtttgg attaatccag gctttccccc 3420
tcaaagctgc ggatatgcta cagtgacgga tgcagaggtg gttgttgtac aagcaacacc 3480
tcatcatgtg ttggttgatg agtacacagg agaatggatt gactcacaat tggtgggggg 3540
caaatgttcc aaggaggttt gtcaaacggt tcacaactcg accgtgtggc atgctgatta 3600
caagattaca gggctgtgcg agtcaaatct ggcatcagtg gatatcacct tcttctctga 3660
ggatggtcaa aagacgtctt tgggaaaacc gaacactgga ttcaggagta atcactttgc 3720
ttacgaaagt ggagagaagg catgccgtat gcagtactgc acacgatggg gaatccgact 3780
accttctgga gtatggtttg aattagtgga caaagatctc ttccaggcgg caaaattgcc 3840
tgaatgtcct agaggatcca gtatctcagc tccttctcag acttctgtgg atgttagttt 3900
gatacaagac gtagagagga tcttagatta ctctctatgc caggagacgt ggagtaagat 3960
acgagccaag cttcctgtat ctccagtaga tctgagttat ctcgccccaa aaaatccagg 4020
gagcggaccg gccttcacta tcattaatgg cactttgaaa tatttcgaaa caagatacat 4080
cagagttgac ataagtaatc ccatcatccc tcacatggtg ggaacaatga gtggaaccac 4140
gactgagcgt gaattgtgga atgattggta tccatatgaa gacgtagaga ttggtccaaa 4200
tggggtgttg aaaactccca ctggtttcaa gtttccgctg tacatgattg ggcacggaat 4260
gttggattcc gatctccaca aatcctccca ggctcaagtc ttcgaacatc cacacgcaaa 4320
ggacgctgca tcacagcttc ctgatgatga gactttattt tttggtgaca caggactatc 4380
aaaaaaccca gtagagttag tagaaggctg gttcagtagc tggaagagca cattggcatc 4440
gttctttctg attataggct tgggggttgc attaatcttc atcattcgaa ttattgttgc 4500
gattcgctat aaatacaagg ggaggaagac ccaaaaaatt tacaatgatg tcgagatgag 4560
tcgattggga aataaataac agatgacgca tgagggtcag atcagattta cagcgtaagt 4620
gtgatattta ggattataaa ggttccttaa ttttaatttg ttacgcgttg tatgaaaaaa 4680
actcatcaac agccatcatg catcagaagc gaactgctat gtttcaggac cctcaggagc 4740
ggccacgcaa actgcctcag ctgtgcaccg aactgcagac aactatccac gacatcattc 4800
tggaatgcgt gtactgtaag cagcagctgc tgaggagaga ggtctatgac ttcgcttttc 4860
gcgatctgtg catcgtgtac cgagacggaa acccatatgc agtcgataag ctgaagttct 4920
acagcaagat ctccgaatac aggcattact gttacagcgt gtacgggacc acactggagc 4980
agcagtataa caagcccctg tgcgacctgc tgatcagaat taatcagaag cccctgtgcc 5040
ctgaggaaaa acagaggcac ctggataaga aacagagatt tcataacatc cgaggacgat 5100
ggaccgggcg gtgcatgtcc tgctgtagaa gctcccggac tcgacgagag acccagctgg 5160
gcggaggagg aggagcagct tacatggcac gattcgagga ccctacccga aggccatata 5220
agctgcccga cctgtgcaca gaactgaata cttctctgca ggacatcgag attacatgcg 5280
tgtactgtaa aaccgtcctg gagctgacag aagtgttcga gtttgctttc aaggacctgt 5340
ttgtggtcta ccgggattca atccctcacg cagcccataa aatcgacttc tacagcagga 5400
tcagggaact gcgccactac tccgacagcg tgtacgggga tacactggag aagctgacaa 5460
acactggcct gtacaatctg ctgatccgac tgcgacagaa gccactgaac ccagccgaaa 5520
aactgagaca cctgaacgag aagagacggt ttcacaatat tgcaggccat tataggggac 5580
agtgccatag ttgctgtaat cgagccaggc aggaaagact gcagcgccga agggagactc 5640
aagtcggcgg aggaggagga gctgcataca tgcacggcga cacccccaca ctgcatgaat 5700
atatgctgga tctgcagcct gagactaccg acctgtacca gctgaacgat tctagtgagg 5760
aagaggacga aatcgacgga ccagcaggac aggcagagcc tgaccgggcc cactataata 5820
ttgtgacatt ctgctgtaag tgcgattcta ctctgcggct gtgcgtgcag agtactcatg 5880
tcgacatccg caccctggag gatctgctga tggggactct gggcatcgtc ccaatttgta 5940
gccagaaacc aggcggcggc ggcggagcag cttacatgca cggacccaag gctaccctgc 6000
aggacatcgt gctgcatctg gaacctcaga atgagattcc agtcgacctg ctgcagctga 6060
gtgattcaga agaggaaaac gacgagatcg acggcgtgaa tcaccagcat ctgcctgcta 6120
gacgggcaga gccacagcga cacacaatgc tgtgcatgtg ctgtaagtgt gaagccagga 6180
tcaagctggt ggtcgagtca agcgccgacg atctgcgcgc cttccagcag ctgttcctga 6240
atactctgtc atttgtccct tggtgtgcct cccagcagtg acgtacgtgt atgaaaaaaa 6300
ctcatcaaca gccatcatgg atgttaacga ttttgagttg catgaggact ttgcattgtc 6360
tgaagatgac tttgtcactt cagaatttct caatccggaa gaccaaatga catacctgaa 6420
tcatgccgat tataatttga attctccctt aatcagcgat gatattgatt tcctgatcaa 6480
gaaatataat catgagcaaa ttccgaaaat gtgggatgtc aagaattggg agggagtgtt 6540
agagatgttg acagcctgtc aagccagtcc aattttatct agcactatgc ataagtgggt 6600
gggaaagtgg ctcatgtctg atgatcatga cgcaagccaa ggcttcagtt ttcttcatga 6660
agtggacaaa gaagctgatc tgacgtttga ggtggtggag acattcatta gaggatgggg 6720
aggtcgagaa ttgcagtaca agaggaaaga cacatttccg gactccttta gagttgcagc 6780
ctcattgtgt caaaaattcc ttgatttgca caaactcact ctgataatga attcagtctc 6840
tgaagtcgaa cttaccaacc tagcaaagaa ttttaaagga aaaaacagga aagcaaaaag 6900
cggaaatctg ataaccagat tgagggttcc cagtttaggt cctgcttttg tgactcaggg 6960
atgggtgtac atgaagaagt tggaaatgat tatggatcgg aattttttgt tgatgttgaa 7020
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aaagatgatg aatctggcac gtaaatatcg tcctctcatc cctacatttc ctcattttga 7260
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tgagtatttg attaagacgc actttgtccc gatgtttaaa gggttgacca tggcggatga 8040
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tgagagaact catgaatttt ttgagaagag tctgatatat tacaatggac gaccagatct 8280
gatgcgggtt cgaggaaatt ctctagtcaa cgcctcatct ttaaatgtct gctgggaggg 8340
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cattcagaga gaagcaaaaa taaggaacac cgccgtgaaa gtgctagctc aaggtgacaa 8460
tcaggtgata tgtactcagt ataaaacgaa gaaatcccgg aatgatattg agcttaaggc 8520
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cgagaaactg ggtcttttga ttaatgatga tgagacaatg caatctgctg attacctcaa 8640
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tcgagtgacc tgtgtgacaa atgatcagat tccaacgtgt gcgaacatta tgagctctgt 8760
gtcaactaat gcattaactg tagcccattt tgccgagaat ccagtcaatg ccatcattca 8820
gtataactac tttggaacat ttgcaaggct actgctgatg atgcatgacc ccgctctgag 8880
gatctctctg tatgaagtcc aatcaaaaat tccaggactt cacagtttga catttaaata 8940
ttctatgttg tatctggatc cttcgatagg aggagtctcc ggaatgtcac tctcgagatt 9000
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<210> 5
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HPV E6/E7融合蛋白
<400> 5
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Asp Lys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu
65 70 75 80
Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln
85 90 95
Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Ile Asn Gln Lys Pro
100 105 110
Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe
115 120 125
His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg
130 135 140
Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu
165 170 175
Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile
180 185 190
Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu
195 200 205
Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His
210 215 220
Ala Ala His Lys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His
225 230 235 240
Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr
245 250 255
Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Leu Arg Gln Lys Pro Leu Asn Pro
260 265 270
Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile
275 280 285
Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Ala Ala Tyr Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val
325 330 335
Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Gln Leu
340 345 350
Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln
355 360 365
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370 375 380
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Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala
465 470 475 480
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg
485 490 495
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Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
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<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HPV E6/E7融合蛋白
<400> 6
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys
20 25 30
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35 40 45
Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg
195 200 205
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Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Asp Lys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
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Gly Ala Ala Tyr Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val
325 330 335
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340 345 350
Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln
355 360 365
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Tyr Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu
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<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HPV E6/E7融合蛋白
<400> 7
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
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Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Gln Leu Ser Asp Ser Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HPV E6/E7融合蛋白
<400> 8
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<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工HPV16 E6蛋白序列. 当所有Xaa为半胱氨酸时，该序列相当于野生型HPV16E6蛋白序列。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(110)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (113)..(113)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (143)..(143)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (146)..(146)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (146)..(146)
<223> 存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400> 9
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Xaa Val Tyr Xaa Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Xaa Asp Lys Xaa Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Xaa Ile Asn
100 105 110
Xaa Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Xaa Met
130 135 140
Ser Xaa Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 10
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工HPV18 E6蛋白序列。当所有Xaa是半胱氨酸时，该序列相当于野生型HPV18E6蛋白序列。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (68)..(68)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(105)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (108)..(108)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (138)..(138)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (141)..(141)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400> 10
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Xaa
20 25 30
Val Tyr Xaa Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala
35 40 45
Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala
50 55 60
Xaa His Lys Xaa Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr
85 90 95
Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Xaa Leu Arg Xaa Gln Lys Pro Leu
100 105 110
Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His
115 120 125
Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Xaa His Ser Xaa Cys Asn Arg
130 135 140
Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
145 150 155
<210> 11
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工HPV16 E7蛋白序列。当XaaXaaXaa是CYE且在位置91和94处的Xaa是半胱氨酸时，序列相当于野生型HPV16 E7蛋白序列。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(26)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(94)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400> 11
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Xaa Xaa Xaa Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Xaa Pro Ile Xaa Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 12
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工HPV18 E7蛋白序列。 当XaaXaaXaa是CYE且在位置98和101处的Xaa是半胱氨酸时，序列相当于野生型HPV18 E7蛋白序列。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(29)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (98)..(98)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可以存在或不存在，如果存在Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400> 12
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
1 5 10 15
Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Xaa Xaa Xaa Gln Leu Ser
20 25 30
Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
35 40 45
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
50 55 60
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Lys Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
65 70 75 80
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Val Xaa Pro Trp Xaa Ala Ser Gln Gln
100 105
<210> 13
<211> 341
<212> PRT
<213> 智人种
<400> 13
Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met
1 5 10 15
Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln
35 40 45
Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr
50 55 60
Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile
65 70 75 80
Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His
85 90 95
Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu
100 105 110
Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu
115 120 125
Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly
130 135 140
Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr
145 150 155 160
Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala
165 170 175
Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu
180 185 190
Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp
195 200 205
Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile
210 215 220
Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser
225 230 235 240
Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys
245 250 255
Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe
260 265 270
Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro
275 280 285
Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe
290 295 300
Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile
305 310 315 320
Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys
325 330 335
Ser Gln Leu Lys Leu
340
<210> 14
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huSTEAP蛋白的密码子优化的DNA序列
<400> 14
atggaatcac ggaaggacat cactaatcag gaggaactgt ggaaaatgaa gccaagaagg 60
aatctggaag aggacgacta tctgcacaag gacaccggcg aaacaagtat gctgaaacga 120
ccagtgctgc tgcacctgca tcagactgct cacgcagacg agtttgattg cccctctgaa 180
ctgcagcaca cccaggagct gttcccacag tggcatctgc ccatcaagat tgccgctatc 240
attgcttcac tgacatttct gtacactctg ctgagagaag tgatccaccc cctggccacc 300
agccatcagc agtacttcta taagatccct atcctggtca tcaacaaggt cctgccaatg 360
gtgagcatca cactgctggc cctggtctac ctgcctggag tgatcgcagc cattgtccag 420
ctgcacaatg ggacaaagta taagaaattt ccacattggc tggataagtg gatgctgact 480
aggaaacagt tcggactgct gtccttcttt ttcgccgtgc tgcacgctat ctacagcctg 540
tcctatccca tgaggaggag ctaccggtat aagctgctga actgggctta ccagcaggtg 600
cagcagaaca aggaggacgc atggattgaa catgacgtgt ggcgcatgga aatctacgtg 660
agcctgggca ttgtcggact ggccatcctg gctctgctgg cagtgaccag tatcccttct 720
gtcagtgact cactgacatg gagagagttt cactacattc agagcaagct ggggatcgtg 780
tccctgctgc tgggcaccat ccatgcactg atttttgcct ggaacaagtg gatcgatatc 840
aagcagttcg tgtggtatac tccccctacc tttatgattg ccgtcttcct gcccatcgtg 900
gtcctgatct tcaagtccat cctgttcctg ccttgtctgc ggaagaaaat cctgaaaatt 960
cggcacggat gggaggatgt caccaaaatc aataagactg aaatctgtag ccagctgaag 1020
ctttaa 1026
<210> 15
<211> 12196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码huSTEAP蛋白的Maraba MG1病毒的DNA序列
<400> 15
acgaagacaa acaaaccatt gatagaatta agaggctcat gaaaatcctt aacagcgttc 60
aaaatgtctg ttacagtcaa gagagtcatt gatgattcac tcatcacccc caaattgcct 120
gcgaatgagg accctgtgga gtaccctgct gattatttca aaaagtcccg tgatattccg 180
gtgtacataa acacgaccaa aagtttgtct gatttgcggg gctatgttta tcaaggccta 240
aagtcaggca acatctctat aattcatgtc aacagttatc tgtatgcagc attaaaagag 300
atcagaggaa aattggacag agattggatc acctttggta tccaaatcgg aaaaacagga 360
gatagcgtgg ggatattcga tttactgacc ctaaaacctc tagatggtgt tttaccagat 420
ggggtgtctg atgctactcg aactagctca gacgatgcat ggcttccact gtatctattg 480
gggttataca gagttggtcg aacacagatg ccagaataca ggaagaagct gatggatggt 540
ctgattaatc aatgtaagat gatcaatgag cagtttgaac cactgttgcc agaaggaaga 600
gatgtctttg atgtctgggg aaatgacagc aattacacaa agattgtggc cgctgtagat 660
atgttcttcc atatgttcaa aaagcatgag aaggcctctt tcaggtatgg cacaatagtg 720
tcaagattta aggattgtgc agcattggct acatttggtc atctgtgtaa gatcactggt 780
atgtccactg aagatgtgac aacttggatt ctaaacaggg aggtggctga tgagatggtt 840
caaatgatgt acccaggaca ggagatagat aaggctgatt cttacatgcc ttatctaatc 900
gacttaggtc tgtcctcaaa atctccatat tcatcagtta aaaatccagc tttccatttt 960
tggggtcaat tgaccgcatt gttactgaga tcaaccagag ccagaaatgc acgtcagccg 1020
gatgacatcg agtatacatc cctgaccact gctgggctgt tgtatgcata tgccgttggt 1080
tcgtctgcag acctggctca acaattctac gttggggaca acaagtatgt gccagaaact 1140
ggagatggag gattaaccac caatgcaccg ccacaagggc gagatgtggt cgagtggctt 1200
agttggtttg aagatcaaaa cagaaaacct accccagaca tgctcatgta tgctaagaga 1260
gctgtcagtg ctttacaagg attgagggag aagacgattg gcaagtacgc caagtcagag 1320
tttgacaaat gacaactcac tcaccatatg tattactacc tttgcttcat atgaaaaaaa 1380
ctaacagcga tcatggatca gctatcaaag gtcaaggaat tccttaagac ttacgcgcag 1440
ttggatcaag cagtacaaga gatggatgac attgagtctc agagagagga aaagactaat 1500
tttgatttgt ttcaggaaga aggattggag attaaggaga agccttccta ttatcgggca 1560
gatgaagaag agattgattc agatgaagac agcgtggatg atgcacaaga cttagggata 1620
cgtacatcaa caagtcccat cgaggggtat gtggatgagg agcaggatga ttatgaggat 1680
gaggaagtga acgtggtgtt tacatcggac tggaaacagc ctgagctgga atccgacggg 1740
gatgggaaaa ctctccgatt gacgatacca gatggattga ctggggagca gaagtcgcaa 1800
tggcttgcca cgattaaggc agttgttcag agtgctaaat attggaacat ctcagaatgt 1860
tcatttgaga gttatgagca aggggttttg attagagaga gacaaatgac tcctgatgtc 1920
tacaaagtca ctcctgtttt aaatgctcca ccggttcaaa tgacagctaa tcaagatgtt 1980
tggtctctca gcagcactcc atttacattt ttgcccaaga aacaaggtgt gactccattg 2040
accatgtcct tagaagaact cttcaacacc cgaggtgaat tcatatctct gggaggaaac 2100
gggaaaatga gtcaccggga ggccatcatt ctagggttga gacacaagaa gctctataat 2160
caagccagac taaagtataa cttagcttga atatgaaaaa aactaacaga tatcaaaaga 2220
tatctctaac tcagtccatt gtgttcagtt caatcatgag ctctctcaag aaaattttgg 2280
gtattaaagg gaaagggaag aaatctaaga aattaggtat ggctccccca ccctatgaag 2340
aagagactcc aatggaatat tctccaagtg caccttatga taagtcattg tttggagtcg 2400
aagatatgga tttccatgat caacgtcaac tccgatatga gaaatttcac ttctcattga 2460
agatgactgt gagatcaaac aaaccatttc gaaattatga tgacgttgca gcagcggtgt 2520
ccaattggga tcatatgtac atcggcatgg caggaaaacg tcctttttat aagatattag 2580
cattcatggg ttctactcta ttgaaggcta caccagccgt ctgggctgac caaggacagc 2640
cagaatatca tgctcactgt gagggacgag cttacttgcc gcatcggtta gggccgaccc 2700
ctccgatgtt gaatgtccct gaacattttc gccgtccatt taacatcgga ttattcagag 2760
ggacaatcga cataaccctg gtacttttcg atgatgaatc tgtagattct gccccggtca 2820
tatgggatca ttttaatgca tccagattga gcagcttcag agaaaaggct ttgttgtttg 2880
gtttgattct agaaaagaaa gccactggga attgggtatt ggactctatt agtcatttca 2940
agtaattatc acaagtgttg aggtgatggg cagactatga aaaaaactaa cagggttcaa 3000
acactcttga tcgaggtacc cagttatatt tgttacaaca atgttgagac tttttctctt 3060
ttgtttcttg gccttaggag cccactccaa atttactata gtattccctc atcatcaaaa 3120
agggaattgg aagaatgtgc cttccacata tcattattgc ccttctagtt ctgaccagaa 3180
ttggcataat gatttgactg gagttagtct tcatgtgaaa attcccaaaa gtcacaaagc 3240
tatacaagca gatggctgga tgtgccacgc tgctaaatgg gtgactactt gtgacttcag 3300
atggtacgga cccaaataca tcacgcattc catacactct atgtcaccca ccctagaaca 3360
gtgcaagacc agtattgagc agacaaagca aggagtttgg attaatccag gctttccccc 3420
tcaaagctgc ggatatgcta cagtgacgga tgcagaggtg gttgttgtac aagcaacacc 3480
tcatcatgtg ttggttgatg agtacacagg agaatggatt gactcacaat tggtgggggg 3540
caaatgttcc aaggaggttt gtcaaacggt tcacaactcg accgtgtggc atgctgatta 3600
caagattaca gggctgtgcg agtcaaatct ggcatcagtg gatatcacct tcttctctga 3660
ggatggtcaa aagacgtctt tgggaaaacc gaacactgga ttcaggagta atcactttgc 3720
ttacgaaagt ggagagaagg catgccgtat gcagtactgc acacgatggg gaatccgact 3780
accttctgga gtatggtttg aattagtgga caaagatctc ttccaggcgg caaaattgcc 3840
tgaatgtcct agaggatcca gtatctcagc tccttctcag acttctgtgg atgttagttt 3900
gatacaagac gtagagagga tcttagatta ctctctatgc caggagacgt ggagtaagat 3960
acgagccaag cttcctgtat ctccagtaga tctgagttat ctcgccccaa aaaatccagg 4020
gagcggaccg gccttcacta tcattaatgg cactttgaaa tatttcgaaa caagatacat 4080
cagagttgac ataagtaatc ccatcatccc tcacatggtg ggaacaatga gtggaaccac 4140
gactgagcgt gaattgtgga atgattggta tccatatgaa gacgtagaga ttggtccaaa 4200
tggggtgttg aaaactccca ctggtttcaa gtttccgctg tacatgattg ggcacggaat 4260
gttggattcc gatctccaca aatcctccca ggctcaagtc ttcgaacatc cacacgcaaa 4320
ggacgctgca tcacagcttc ctgatgatga gactttattt tttggtgaca caggactatc 4380
aaaaaaccca gtagagttag tagaaggctg gttcagtagc tggaagagca cattggcatc 4440
gttctttctg attataggct tgggggttgc attaatcttc atcattcgaa ttattgttgc 4500
gattcgctat aaatacaagg ggaggaagac ccaaaaaatt tacaatgatg tcgagatgag 4560
tcgattggga aataaataac agatgacgca tgagggtcag atcagattta cagcgtaagt 4620
gtgatattta ggattataaa ggttccttaa ttttaatttg ttacgcgttg tatgaaaaaa 4680
actcatcaac agccatcatg gaatcacgga aggacatcac taatcaggag gaactgtgga 4740
aaatgaagcc aagaaggaat ctggaagagg acgactatct gcacaaggac accggcgaaa 4800
caagtatgct gaaacgacca gtgctgctgc acctgcatca gactgctcac gcagacgagt 4860
ttgattgccc ctctgaactg cagcacaccc aggagctgtt cccacagtgg catctgccca 4920
tcaagattgc cgctatcatt gcttcactga catttctgta cactctgctg agagaagtga 4980
tccaccccct ggccaccagc catcagcagt acttctataa gatccctatc ctggtcatca 5040
acaaggtcct gccaatggtg agcatcacac tgctggccct ggtctacctg cctggagtga 5100
tcgcagccat tgtccagctg cacaatggga caaagtataa gaaatttcca cattggctgg 5160
ataagtggat gctgactagg aaacagttcg gactgctgtc cttctttttc gccgtgctgc 5220
acgctatcta cagcctgtcc tatcccatga ggaggagcta ccggtataag ctgctgaact 5280
gggcttacca gcaggtgcag cagaacaagg aggacgcatg gattgaacat gacgtgtggc 5340
gcatggaaat ctacgtgagc ctgggcattg tcggactggc catcctggct ctgctggcag 5400
tgaccagtat cccttctgtc agtgactcac tgacatggag agagtttcac tacattcaga 5460
gcaagctggg gatcgtgtcc ctgctgctgg gcaccatcca tgcactgatt tttgcctgga 5520
acaagtggat cgatatcaag cagttcgtgt ggtatactcc ccctaccttt atgattgccg 5580
tcttcctgcc catcgtggtc ctgatcttca agtccatcct gttcctgcct tgtctgcgga 5640
agaaaatcct gaaaattcgg cacggatggg aggatgtcac caaaatcaat aagactgaaa 5700
tctgtagcca gctgaagctt taacgtacgt gtatgaaaaa aactcatcaa cagccatcat 5760
ggatgttaac gattttgagt tgcatgagga ctttgcattg tctgaagatg actttgtcac 5820
ttcagaattt ctcaatccgg aagaccaaat gacatacctg aatcatgccg attataattt 5880
gaattctccc ttaatcagcg atgatattga tttcctgatc aagaaatata atcatgagca 5940
aattccgaaa atgtgggatg tcaagaattg ggagggagtg ttagagatgt tgacagcctg 6000
tcaagccagt ccaattttat ctagcactat gcataagtgg gtgggaaagt ggctcatgtc 6060
tgatgatcat gacgcaagcc aaggcttcag ttttcttcat gaagtggaca aagaagctga 6120
tctgacgttt gaggtggtgg agacattcat tagaggatgg ggaggtcgag aattgcagta 6180
caagaggaaa gacacatttc cggactcctt tagagttgca gcctcattgt gtcaaaaatt 6240
ccttgatttg cacaaactca ctctgataat gaattcagtc tctgaagtcg aacttaccaa 6300
cctagcaaag aattttaaag gaaaaaacag gaaagcaaaa agcggaaatc tgataaccag 6360
attgagggtt cccagtttag gtcctgcttt tgtgactcag ggatgggtgt acatgaagaa 6420
gttggaaatg attatggatc ggaatttttt gttgatgttg aaagacgtta tcatcgggag 6480
gatgcagacg atcctgtcca tgatctcaag agatgataat ctcttctccg agtctgatat 6540
ctttactgta ttaaagatat accggatagg ggataagata ttagaaaggc aagggacaaa 6600
gggttacgac ttgatcaaaa tgattgagcc tatttgtaac ttaaagatga tgaatctggc 6660
acgtaaatat cgtcctctca tccctacatt tcctcatttt gaaaaacata ttgctgactc 6720
tgttaaggaa ggatcgaaaa tagacaaagg gattgagttt atatatgatc acattatgtc 6780
aatccctggt gtggacttga ccttagttat ttacggatca tttcggcact ggggtcatcc 6840
ttttatcaac tactatgagg gcttagagaa gctacacaag caggttacaa tgcccaagac 6900
tattgacaga gaatatgcag aatgtcttgc tagtgatctg gcaagaatcg ttcttcagca 6960
acaattcaat gaacataaga aatggtttgt tgatgtagat aaagtcccac aatcccatcc 7020
tttcaaaagc catatgaaag agaatacttg gcctactgca gcccaagttc aggattacgg 7080
cgatcgctgg catcagctcc cactcatcaa atgcttcgaa atcccagatt tgttagatcc 7140
atcgatcatc tactcagaca aaagtcattc catgaaccgg tctgaagtac tacgacatgt 7200
aagacttaca cctcatgtgc ccattccaag caggaaagta ttgcagacaa tgttggagac 7260
taaggcaaca gactggaaag agtttttaaa gaaaattgac gaagaggggt tagaggatga 7320
tgatcttgtc ataggactca aagggaaaga gagagaatta aaaattgcgg gaagattctt 7380
ttctttgatg tcctggaagc tcagagagta ttttgtcatc actgagtatt tgattaagac 7440
gcactttgtc ccgatgttta aagggttgac catggcggat gacttgacag cggtgataaa 7500
gaagatgatg gacacatctt caggacaagg cttagataat tatgaatcca tttgtatagc 7560
caaccatatt gactatgaga agtggaacaa tcatcaaaga aaagagtcga acgggcccgt 7620
gttcaaggtg atgggtcaat tcttgggata tccacgtctg attgagagaa ctcatgaatt 7680
ttttgagaag agtctgatat attacaatgg acgaccagat ctgatgcggg ttcgaggaaa 7740
ttctctagtc aacgcctcat ctttaaatgt ctgctgggag ggtcaagctg ggggattaga 7800
aggactgcga cagaagggat ggagtattct aaatttgctt gtcattcaga gagaagcaaa 7860
aataaggaac accgccgtga aagtgctagc tcaaggtgac aatcaggtga tatgtactca 7920
gtataaaacg aagaaatccc ggaatgatat tgagcttaag gcagctctaa cacagatggt 7980
atctaataat gagatgatta tgtctgcgat taaatcaggc accgagaaac tgggtctttt 8040
gattaatgat gatgagacaa tgcaatctgc tgattacctc aattacggga aggttcccat 8100
tttcagagga gtaatcagag gccttgagac aaaaagatgg tctcgagtga cctgtgtgac 8160
aaatgatcag attccaacgt gtgcgaacat tatgagctct gtgtcaacta atgcattaac 8220
tgtagcccat tttgccgaga atccagtcaa tgccatcatt cagtataact actttggaac 8280
atttgcaagg ctactgctga tgatgcatga ccccgctctg aggatctctc tgtatgaagt 8340
ccaatcaaaa attccaggac ttcacagttt gacatttaaa tattctatgt tgtatctgga 8400
tccttcgata ggaggagtct ccggaatgtc actctcgaga ttcctcataa gatcatttcc 8460
agatccagtg acagaaagtt tggcgttctg gaaatttatc cactctcatg caagaagcga 8520
ttcattaaag gagatatgtg cagtttttgg aaatcctgaa attgcaagat ttcggctaac 8580
tcatgtcgat aaattggtgg aagacccaac ctcattgaac atagctatgg gaatgagtcc 8640
tgctaatcta ttaaagacag aggtaaaaaa atgtctactg gaatcaaggc agagcatcaa 8700
gaaccagatt gtaagagatg ctactattta cctacaccat gaggaagaca aacttcgtag 8760
tttcttatgg tccataacac cactgttccc tcggttcttg agtgaattca aatctgggac 8820
attcatcgga gtagcagatg gcctgatcag cttatttcag aactctagga ctattcgaaa 8880
ttcttttaaa aagcgttatc acagggaact tgatgattta ataatcaaga gcgaagtttc 8940
ctcacttatg catttgggta agctacattt gaggcgaggc tcagttcgta tgtggacttg 9000
ctcttctact caggctgatc ttctccgatt ccggtcatgg ggaagatctg ttataggaac 9060
cacagtccct catcccttag agatgttagg acaacatttt aaaaaggaga ctccttgcag 9120
tgcttgcaac atatccggat tagactatgt atctgtccac tgtccgaatg ggattcatga 9180
cgtttttgaa tcacgtggtc cactccctgc atatttgggt tctaaaacat ccgaatcaac 9240
ttcgatcttg cagccgtggg agagagagag taaagtaccg ttgattaagc gtgccacaag 9300
gcttcgtgat gcaatttcat ggtttgtgtc tcccgactct aacttggcct caactatcct 9360
taagaacata aatgcattaa caggagaaga atggtcaaag aagcagcatg gatttaaaag 9420
gacgggatcg gcgttacaca ggttctccac atccaggatg agtcatggtg gttttgcttc 9480
tcagagtacg gctgccttga ctagattgat ggcaactact gacactatga gagatctggg 9540
agaacagaac tatgatttcc tgtttcaggc gacattattg tatgctcaaa taaccacaac 9600
tgtagtcagg aatggatcat ttcatagctg cacggaccat taccatataa cctgcaaatc 9660
ttgtctgagg gccattgatg agattacctt ggattcagcg atggaatata gccctccaga 9720
tgtatcatca gttttacaat cttggaggaa tggagaaggc tcttggggac atgaagtgaa 9780
acaaatatac ccagttgaag gtgactggag gggactatct cctgttgaac aatcttatca 9840
agtcggacgc tgtatcgggt ttctgttcgg tgatctggcg tatagaaaat catcccatgc 9900
agatgatagc tccatgtttc cgttatctat acaaaacaaa gtcagaggaa gaggcttttt 9960
aaaagggctt atggatgggt taatgagagc cagttgttgc caggtgatcc atcgtcgaag 10020
cttagcccat ctgaagagac cggctaatgc agtctatgga gggctgattt atttgataga 10080
caaattgagt gcatctgccc cttttctttc actgacgaga catggacctt taagggaaga 10140
attagaaact gttccacata agataccgac ttcttatcct acgagcaacc gagatatggg 10200
ggtgatagtt cgtaattatt ttaaatatca gtgcagactg gtagaaaaag gtcggtacaa 10260
gacacattat cctcaattgt ggcttttctc agatgtgctg tccattgatt tcttaggacc 10320
cctgtctata tcttcaactc tattgggtat tctgtataaa cagacgttat cttctcgaga 10380
caaaaatgag ttgagagaac tcgctaactt gtcttcattg ttgagatcag gagaaggatg 10440
ggaagatatc catgtcaaat tcttctctaa ggacacttta ctctgccctg aagagatccg 10500
acatgcgtgc aaatttggga ttgctaagga atccgctgtt ttaagctatt atcctccttg 10560
gtctcaagag tcttatggag gcatcacctc gatccccgta tatttttcga ccaggaagta 10620
tcccaaaatt ttagatgtcc ctcctcgggt tcaaaaccca ttggtctcgg gtctacgatt 10680
ggggcaactc cctactggag cacattataa gattaggagc attgtaaaga acaagaacct 10740
tcgttataga gatttcctta gttgtgggga tggatctggg gggatgaccg cggcactatt 10800
gagagaaaac agacaaagta ggggaatctt caacagcctg ttagagttag ccggatctct 10860
tatgagagga gcatctccag agcctccaag tgcactggag acgctcgggc aagaacgatc 10920
taggtgtgtg aatggaagca catgttggga gtactcatct gacctaagcc aaaaagagac 10980
atgggattac ttcttaagat tgaagagagg cctgggtttg accgtggact taatcaccat 11040
ggacatggag gtcagagacc ctaatacaag tttgatgata gaaaagaacc tcaaagttta 11100
tctgcatcag atattagaac caactggtgt cttaatatat aaaacatacg ggacccatat 11160
tgcgacacaa acagataata tcctgacgat aatcggtcct ttctttgaga cggttgacct 11220
agtccagtcc gaatacagca gctcacaaac gtccgaggtc tattttgtag gacgaggctt 11280
gcgctctcat gttgacgaac cctgggtgga ctggccatcc ttaatggaca attggagatc 11340
catttatgct tttcatgatc ctactacaga atttatcaga gcaaaaaaag tctgtgaaat 11400
tgacagtctt ataggcattc cggctcaatt cattccagac ccatttgtaa atctcgagac 11460
catgctacag atagttggtg ttccaacagg agtttcgcat gccgcagctc tattatcatc 11520
acaatatcca aatcaattgg tcacaacgtc aatattttat atgacactcg tgtcttatta 11580
taatgtaaac catattcgaa gaagccccaa gcctttctct cctccgtctg atggagtctc 11640
acagaacatt ggttcagcca tagtcggact aagtttttgg gtgagtttga tggagaatga 11700
tctcggatta tacaaacagg ctctaggtgc aataaagacg tcattcccta ttagatggtc 11760
ctctgtccag accaaggatg ggtttacaca agaatggaga actaaaggaa acggaattcc 11820
taaagattgt cgtctctcag actctttggc tcagatagga aactggatca gagcgatgga 11880
attggttagg aacaaaacga ggcaatcagg attttctgaa accctatttg atcaattctg 11940
cggacttgca gaccatcacc tcaaatggcg gaagttggga aacagaacag gaattattga 12000
ttggctaaat aatagaattt catccattga caaatccatc ttggtgacca aaagtgatct 12060
gcatgacgag aactcatgga gggagtgaag atgtattctt ccacctctca ttgggtgata 12120
cccatatatg aaaaaaacta taagtacttt aaactctctt tgttttttaa tgtatatctg 12180
gttttgttgt ttccgt 12196
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 H-2Kb结合E6肽
<400> 16
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 H-2Db结合E7肽
<400> 17
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 18
actggaattc atgcatcaga agcgaactgc 30
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 19
actgggatcc tcactgctgg gaggcacac 29
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Val Ser Lys Ile Asn Arg Thr Glu Met
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu
1 5

Claims (55)

1.一种用于在哺乳动物中诱导免疫应答的组合初免:加强免疫疗法，其中所述组合包含:
腺病毒，其能够表达抗原性蛋白，并且其被配制以在所述哺乳动物中产生对所述蛋白的免疫性；以及
Maraba MG1病毒，其能够表达抗原性蛋白，并且其被配制以在所述哺乳动物中诱导所述免疫应答；
其中能够由所述腺病毒表达的抗原性蛋白和能够由Maraba MG1病毒表达的抗原蛋白均基于相同的肿瘤相关抗原。
2.根据权利要求1所述的组合疗法，其中由所述腺病毒表达的抗原性蛋白是人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白，并且由所述Maraba MG1病毒表达的抗原性蛋白是人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的组合疗法，其中由所述腺病毒编码的所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白具有包括HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白结构域的氨基酸序列，其中这些蛋白结构域由蛋白酶体可降解的接头连接。
4.根据权利要求3所述的组合疗法，其中由所述腺病毒编码的蛋白的蛋白结构域的顺序为:HPV16 E6，然后HPV18 E6，然后HPV16 E7，然后HPV18 E7。
5.根据权利要求3所述的组合疗法，其中由所述腺病毒编码的蛋白的蛋白结构域的顺序不同于:HPV16 E6，然后HPV18 E6，然后HPV16 E7，然后HPV18 E7。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的组合疗法，其中由所述Maraba MG1病毒编码的所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白具有包括HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白结构域的氨基酸序列，其中这些蛋白结构域由蛋白酶体可降解的接头连接。
7.根据权利要求6所述的组合疗法，其中由所述Maraba MG1病毒编码的蛋白的蛋白结构域的顺序为:HPV16 E6，然后HPV18 E6，然后HPV16 E7，然后HPV18 E7。
8.根据权利要求6所述的组合疗法，其中由Maraba MG1病毒编码的蛋白的蛋白结构域的顺序不同于:HPV16 E6，然后HPV18 E6，然后HPV16 E7，然后HPV18 E7。
9.根据权利要求3-8中任一项的所述的组合疗法，其中，在由所述腺病毒、所述MarabaMG1病毒或两者编码的HPV E6/E7融合蛋白中:
所述HPV16 E6蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:9的序列或其变体；
所述HPV18 E6蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:10的序列或其变体；
所述HPV16 E7蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:11的序列或其变体；以及
所述HPV18 E7蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:12的序列或其变体。
10.根据权利要求9所述的组合疗法，其中:在SEQ ID NO:9中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个Xaa独立地是:不存在的或非半胱氨酸氨基酸。
11.根据权利要求9或10所述的组合疗法，其中:
在SEQ ID NO:10中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个Xaa独立地是:不存在的或非半胱氨酸氨基酸。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的组合疗法，其中:
在SEQ ID NO:11的位置91和94处的Xaa中的至少一个是不存在的或非半胱氨酸氨基酸；
并且满足以下条件中的至少一个:
在SEQ ID NO:11的位置24处的Xaa是不存在的或非半胱氨酸氨基酸；
在SEQ ID NO:11的位置25处的Xaa是不存在的或非酪氨酸氨基酸；和
在SEQ ID NO:11的位置26处的Xaa是不存在的或非谷氨酸氨基酸。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的组合疗法，其中:
在SEQ ID NO:12的位置98和101处的Xaa中的至少一个不存在的或非半胱氨酸氨基酸；并且满足以下条件中的至少一个:
在SEQ ID NO:12的位置27处的Xaa是不存在的或非半胱氨酸氨基酸；
在SEQ ID NO:12的位置28处的Xaa是不存在的或非组氨酸氨基酸；和
在SEQ ID NO:12的位置29处的Xaa是不存在的或非谷氨酸氨基酸。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的组合疗法，其中在SEQ ID NO:9和10中每一个的五个、六个、七个或八个Xaa是不存在的。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的组合疗法，其中:
在SEQ ID NO:11的位置91和94处的Xaa中至少一个是不存在的；并且
在SEQ ID NO:11的位置24-26处的Xaa是不存在的。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的组合疗法，其中:
在SEQ ID NO:12的位置98和101处的Xaa中的至少一个是不存在的；并且
在SEQ ID NO:12的位置27-29处的Xaa是不存在的。
17.根据权利要求3-16中任一项所述的组合疗法，其中所述蛋白酶体可降解的接头是具有序列GGGGGAAY的氨基酸接头。
18.根据权利要求2所述的组合疗法，其中由所述腺病毒编码的所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其变体。
19.根据权利要求2或18所述的组合疗法，其中由所述Maraba MG1病毒编码的所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其变体。
20.根据权利要求2-19中任一项所述的组合疗法，其中由所述腺病毒编码的所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白和由所述Maraba MG1病毒编码的所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白具有相同的氨基酸序列。
21.根据权利要求2所述的组合疗法，其中所述腺病毒包含根据SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
22.根据权利要求2或21所述的组合疗法，其中所述Maraba MG1包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的反向互补RNA版本序列。
23.根据权利要求22所述的组合疗法，其中所述Maraba MG1病毒基因组包含SEQ IDNO:4的核苷酸序列的反向互补RNA版本序列。
24.根据权利要求1所述的组合疗法，其中由所述腺病毒表达的抗原性蛋白是人前列腺六次跨膜上皮抗原(hu-STEAP)蛋白，并且由所述Maraba MG1病毒表达的抗原性蛋白是hu-
STEAP蛋白。
25.根据权利要求24所述的组合疗法，其中由所述腺病毒表达的hu-STEAP蛋白具有与SEQ ID NO:13至少70％、至少80％、至少90％或至少95％相同的序列。
26.根据权利要求25所述的组合疗法，其中由所述腺病毒表达的hu-STEAP蛋白具有与SEQ ID NO:13相同的序列。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的组合疗法，其中由所述Maraba MG1病毒表达的hu-STEAP蛋白具有与SEQ ID NO:13至少70％、至少80％、至少90％或至少95％相同的序列。
28.根据权利要求27所述的组合疗法，其中由所述Maraba MG1病毒表达的hu-STEAP蛋白具有与SEQ ID NO:13相同的序列。
29.根据权利要求24所述的组合疗法，其中所述腺病毒包含根据SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
30.根据权利要求24所述的组合疗法，其中所述Maraba MG1包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列的反向互补RNA版本序列。
31.根据权利要求24所述的组合疗法，其中所述Maraba MG1的病毒基因组包含SEQ IDNO:15的核苷酸序列的反向互补RNA版本序列。
32.一种腺病毒，其能够表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白作为抗原性蛋白，并且其被配制以在哺乳动物中产生对所述蛋白的免疫性。
33.根据权利要求32所述的腺病毒，其中所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白具有包括成任何顺序的HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白结构域的氨基酸序列，并且其中所述蛋白结构域由蛋白酶体可降解的接头连接。
34.根据权利要求32或33所述的腺病毒，其中:
所述HPV16 E6蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:9的序列或其变体；
所述HPV18 E6蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:10的序列或其变体；
所述HPV16 E7蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:11的序列或其变体；以及
所述HPV18 E7蛋白结构域具有根据SEQ ID NO:12的序列或其变体。
35.根据权利要求34所述的腺病毒，其中:
SEQ ID NO:9中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个Xaa独立地是:不存在的或非半胱氨酸氨基酸。
36.根据权利要求34或35所述的腺病毒，其中:
SEQ ID NO:10中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个Xaa独立地是:不存在的或非半胱氨酸氨基酸。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的腺病毒，其中:
在SEQ ID NO:11的位置91和94处的Xaa中的至少一个是不存在的或非半胱
氨酸氨基酸；并且满足以下条件中的至少一个:
在SEQ ID NO:11的位置24处的Xaa是不存在的或者非半胱氨酸氨基酸；
在SEQ ID NO:11的位置25处的Xaa是不存在的或者非酪氨酸氨基酸；和
在SEQ ID NO:11的位置26处的Xaa是不存在的或非谷氨酸氨基酸。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的腺病毒，其中:
在SEQ ID NO:12的位置98和101处的Xaa中的至少一个是不存在的或非半胱氨酸氨基酸；并且满足以下条件中的至少一个:
在SEQ ID NO:12的位置27处的Xaa是不存在的或者是非半胱氨酸氨基酸；
在SEQ ID NO:12的位置28处的Xaa是不存在的或者是非组氨酸氨基酸；和
在SEQ ID NO:12的位置29处的Xaa是不存在的或非谷氨酸氨基酸。
39.根据权利要求32所述的腺病毒，其中所述人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白具有根据SEQ ID NO:1的序列。
40.根据权利要求32所述的腺病毒，其中所述腺病毒包含根据SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
41.一种腺病毒，其能够表达hu-STEAP蛋白作为抗原性蛋白，并且其被配制以在哺乳动物中产生对所述蛋白的免疫性。
42.根据权利要求41所述的腺病毒，其中所述hu-STEAP蛋白具有与SEQ ID NO:13至少70％、至少80％、至少90％或至少95％相同的序列。
43.根据权利要求42所述的腺病毒，其中所述hu-STEAP蛋白具有与SEQ ID NO:13相同的序列。
44.一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包含:
将根据权利要求1-31中任一项所述的组合初免:加强免疫疗法施用至所述哺乳动物；
其中，在施用腺病毒之后至少约24小时施用Maraba MG1病毒。
45.根据权利要求44所述的方法，其中在施用所述腺病毒之后2-4天施用所述MarabaMG1病毒。
46.根据权利要求44所述的方法，其中在施用所述腺病毒之后约1周施用所述MarabaMG1病毒。
47.根据权利要求44所述的方法，其中在施用所述腺病毒之后2周施用所述Maraba MG1病毒。
48.根据权利要求44所述的方法，其中在施用所述腺病毒之后超过2周施用所述MarabaMG1病毒。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有HPV源性癌，所述初免:加强免疫疗法是根据权利要求2-23中任一项所述，并且诱导免疫应答导致所述癌的大小的减少。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述HPV源性癌症是由HPV16或HPV18引起的癌症。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述由HPV16或HPV18引起的癌症是多发性上皮恶性肿瘤。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述多发性上皮恶性肿瘤是宫颈癌、头颈癌或生殖器癌。
53.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、急性淋巴细胞白血病或Ewing肉瘤；所述组合初免:加强免疫疗法是根据权利要求24-31中任一项所述；并且诱导免疫应答导致癌的大小的减小。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物患有前列腺癌。
55.一种Maraba MG1病毒，其被配制以在哺乳动物中诱导免疫应答，所述病毒编码人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白作为抗原性蛋白，
其中所述融合蛋白具有包括HPV16 E6、HPV18 E6、HPV16 E7和HPV18 E7蛋白结构域的氨基酸序列，
其中所述蛋白结构域由蛋白酶体可降解的接头连接；以及
其中所述融合蛋白不具有根据SEQ ID NO:1的序列。
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