CN109369620B - 吡啶类化合物及其制备方法与抗胃癌应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种对针对酶活性位点设计合成的RBP2酶活性抑制的吡啶类化合物WXSA‑051B，还提供了其制备方法，试验证明该化合物能使人胃癌细胞BGC‑823中H3K4me3蛋白水平明显升高，具有明显的抑制RBP2酶活性作用，能使人胃癌细胞BGC‑823迁移能力降低。本发明的化合物可作为胃癌抑制剂用于制备抗胃癌药物。化合物结构如下

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Description

吡啶类化合物及其制备方法与抗胃癌应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及吡啶类化合物WXSA-051B及其制备方法与抗胃癌应用。

背景技术

临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类药物大多数存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点。近年来，随着生命科学研究的飞速发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明，给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。因此以一些与肿瘤细胞修饰相关的关键酶/蛋白作为药物靶点，筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。表观遗传学在肿瘤进展中的作用逐渐被挖掘阐明，组蛋白修饰作为一种表观遗传学修饰，可调节染色质状态和基因表达，在癌症的发生发展中发挥作用。很多研究证实新型表观遗传学酶的抑制剂对相关疾病有治疗作用，因此，许多参与调节表观遗传学的酶便成为极具潜力的药物靶点。在组蛋白去乙酰化酶抑制剂获准用于癌症治疗之后，这种干扰表观遗传学修饰的药物研发更加需要进一步的证明研究。表观遗传学药物的底物结构和功能都需要被进一步研究，从而提高这类药物的特异性，减少不良反应的发生。总的来说，通过干预表观遗传学酶的活性来治疗癌症和神经精神疾病等很多难治性疾病都有很好的前景。

RBP2作为组蛋白去甲基化酶家族中的一员，可以特异性的使H3K4me3/2进行脱甲基化，并且很多研究已经证明RBP2参与许多癌症的发生发展，RBP2在肿瘤中的功能也越来越多的被发掘研究，同时RBP2对癌症的发生，恶行转化，代谢以及耐药都发挥作用，可以作为临床治疗靶点。RBP2可以促进CCND1以及 CCNE1的表达上调从而促进肺癌的发生；RBP2在非小细胞肺癌中可以通过AKT信号通路上调VEGF，从而促进血管的生成，使癌症发生发展。同时RBP2 在胃癌细胞中过表达,可以通过PI3K/AKT介导的SP1依赖性的被幽门螺旋杆菌的毒力因子Cag-A诱导，靶向CCND1促进幽门螺旋杆菌诱导的胃黏膜上皮细胞的恶性转化，同时可被TGF-β诱导，抑制E-cadherin的表达，促进胃癌的恶性进展；并可通过负调控细胞周期依赖性激酶的抑制剂来抑制肿瘤细胞衰老、促进细胞增殖。此外，RBP2表达涉及对肺和乳腺癌中靶向抗癌治疗的耐药性，以及对胶质母细胞瘤中DNA烷基化剂的抗性。最近的证据表明，KDM5脱甲基酶中主要是RBP2和KDM5B是许多细胞培养模型中致死药物暴露后耐药性亚细胞群体存活所必需的。

近几年已经有很多有关KDMs抑制剂合成研发的记录。由于JMJC KDMs的催化结构域的晶体结构显示漏斗形的活性位点，其含有带电的共底物2-OG的紧密的极性结合位点。催化铁和极性氨基酸，跨越酶家族保守，协调2-OG结合，使选择性KDMs抑制剂的设计复杂化。已经产生了这些酶的非选择性金属螯合抑制剂, 如2,2-二吡啶或羟基喹啉，其中一些缺乏明确的抑制机制。其他分子以2-OG竞争的方式抑制KDMs，例如N-草酰甘氨酸（NOG），2,4-吡啶二羧酸（2,4-PDA），缺乏选择性或者细胞通透性差，使使用这些化合物的生物学研究的解释复杂化。因此需要了解配体结合的结构基础，从而有助于开发选择性KDMs抑制剂。

药物活性先导化合物的发现是制备新药研发的源头，构建结构多样、高选择性的化合物对先导化合物的发现和优化具有重要的意义。已有文献调研发现，含有己胺甲酰基片段的杂环化合物可以通过与组蛋白去甲基化酶5（KDM5）家族成员的JMJC区结合从而抑制其酶活性的作用。因此根据此化合物的活性部位进行衍生物合成，我们设计合成了针对RBP2酶活性的化合物，并对其在胃癌中的抑制作用进行研究。

发明内容

为解决现有技术上的不足，本发明提供了吡啶类化合物WXSA-051B及其制备方法与抗胃癌应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种吡啶类化合物WXSA-051B，结构式如下：

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本发明还提供了吡啶类化合物WXSA-051B的制备方法，

WXSA-051B的制备方法步骤包括：

步骤（i），以4-甲酯基-2-吡啶甲胺盐酸盐、3-溴丙炔、碳酸钾为起始原料，通过一步亲核取代反应得到关键中间体2；

步骤（ii），在DMSO与水的混合溶液中，3-溴-正己基-N-甲基丙酰胺先与叠氮化钠先发生一步亲核取代，再与中间体2进行Click环合反应得到目标化合物WXSA-051B；

合成路线如下：

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合成需要试剂及合成条件如下:

步骤（i），3-溴丙炔，乙腈，碳酸钾，20-30 ℃；

步骤（ii），3-溴-正己基-N-甲基丙酰胺，叠氮化钠，碘化亚铜，抗坏血酸钠，(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺，二甲亚砜，水，N₂，65-75 ℃。

具体制备步骤如下：

（1）取25mL圆底烧瓶，称取4-甲酯基-2-吡啶甲胺盐酸盐4.9 mmol和碳酸钾7.2mmol于10 mL的乙腈中，室温搅拌15分钟后将3-溴丙炔2.5 mmol的乙腈溶液用恒压滴液漏斗逐滴滴加入，继续室温搅拌过夜。反应完毕后减压蒸干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗后，无水硫酸钠干燥；浓缩上样，快速制备色谱硅胶柱分离得到中间体2。

（2）取25mL圆底烧瓶，称取3-溴-正己基-N-甲基丙酰胺1.07 mmol与叠氮化钠1.27mmol于6mLDMSO与H₂O的混合溶液（DMSO：H₂O = 5:1）中，室温搅拌；再依次加入2 -（（丙-2-炔-1-基氨基）甲基）异烟酸甲酯0.98 mmol、碘化亚铜0.19 mmol、抗坏血酸钠0.39 mmol及(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺0.10 mmol，再加入6mLDMSO与H₂O的混合溶液（DMSO：H₂O = 5:1），N₂置换，65-75 °C搅拌回流反应6h。反应完毕后减压蒸干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗后，无水硫酸钠干燥；浓缩上样，快速制备色谱硅胶柱分离得到化合物WXSA-051B。

本发明所述的室温为20-25 ℃。

本发明还对提供的化合物在抗胃癌发生过程中的功能进行了研究。

本发明公开了RBP2酶抑制剂小分子化合物在抗胃癌发生过程中的功能验证结果。通过实验证明本发明的RBP2酶抑制剂小分子化合物有良好的抑制RBP2组蛋白去甲基化酶活性，同时对人胃癌细胞BGC-832具有显著的抑制细胞迁移的能力。

如图1所示，检测化合物对RBP2酶作用底物H3K4me3的作用。化合物WXSA-051B用DMSO配制成母液，终浓度200mM，使用时用不完全培养基稀释使用，DMSO终浓度不超过0.1%。取BGC-823细胞铺板六孔板进行实验。设立空白组，对照组以及加药组，六孔板中细胞长达90%时进行处理。分别空白组（补加同体积培基），对照组（加DMSO），处理组（加化合物），孵育48h后消化收细胞，用EpiQuik Total Histone Extraction Kit（OP-0006-100）进行组蛋白提取，之后用Pierce^® BCA Protein Assay Kit进行浓度测定，跑western blot进行蛋白定量比较。结果显示化合物能使人胃癌细胞BGC-823中H3K4me3蛋白水平明显升高，具有明显的抑制RBP2酶活性作用。

如图2所示，检测化合物对胃癌细胞迁移能力影响。化合物WXSA-051B样品用DMSO配制成母液，终浓度200mM，使用时用不完全培养基稀释使用，DMSO终浓度不超过0. 1%。取人胃癌细胞BGC-823比例达90%以上的细胞进行实验。细胞消化、用1640重悬计数、取浓度为5×10⁵的细胞悬液（体积应小于150μL），24孔板中每孔加入600 μL 20%FBS+80%1640，放置小室，小室每孔加入5×10⁵ 细胞，同时补齐体积为150μL；24孔板置于37℃，5% CO₂培养箱中培养48小时，之后用PBS清洗小室内外膜三次，用棉签擦去小室内膜细胞，甲醇1mL于24孔板中固定小室细胞30min，晾干，24孔板加结晶紫1mL，染色30min。镜下观察并拍照。结果显示化合物能使人胃癌细胞BGC-823迁移能力降低。

本发明的化合物结构新颖，可作为抗癌特别是抗胃癌的先导化合物，可以应用于制备抗癌药物。

本发明提供的化合物，可以制作成一种抗癌特别是抗胃癌药物组合物，包括本发明的RBP2酶抑制剂小分子化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种对针对酶活性位点设计合成的RBP2酶活性抑制的小分子化合物，试验证明能使人胃癌细胞BGC-823中H3K4me3蛋白水平明显升高，具有明显的抑制RBP2酶活性作用，能使人胃癌细胞BGC-823迁移能力降低。本发明的RBP2酶抑制剂小分子化合物可作为胃癌抑制剂用于制备抗胃癌药物。

附图说明

图1是目标化合物对RBP2酶作用底物H3K4me3的作用图。

图2是目标化合物在胃癌细胞中对迁移能力作用图。

具体实施方式

通过下述实例有助于理解本发明，但是不能理解为限制本发明的内容。

实施例1 WXSA-051B的制备

一、中间体2的制备

取25mL圆底烧瓶，称取4-甲酯基-2-吡啶甲胺盐酸盐（1 g, 4.9 mmol）和碳酸钾（1g, 7.2 mmol）于10 mL的乙腈中，室温搅拌15分钟；然后将溶有3-溴丙炔（0.29 g, 2.5mmol）的25mL乙腈溶液用恒压滴液漏斗逐滴滴加入前述混合物中，继续室温搅拌过夜（TLC检测反应有新点生成）。反应完毕后减压蒸干溶剂，向其中加入50mL水，每次加乙酸乙酯35mL萃取三次，合并有机相并将之用饱和食盐水洗，再以无水硫酸钠干燥，过滤后减压旋蒸拌样，湿法装柱，以乙酸乙酯：石油醚：三乙胺=25：74：1至乙酸乙酯：石油醚：三乙胺=49：50：1梯度洗脱得中间体2。黄色固体，收率21%。

二、WXSA-051B的制备

称取3-溴-正己基-N-甲基丙酰胺（291 mg, 1.07 mmol）与叠氮化钠（83 mg, 1.27mmol）溶于6mL（DMSO：H₂O = 5:1）中室温搅拌6h；到时后在氮气保护下依次加入2 -（（丙-2-炔-1-基氨基）甲基）异烟酸甲酯（200 mg, 0.98 mmol）、碘化亚铜（37 mg, 0.19 mmol）、抗坏血酸钠（78 mg, 0.39 mmol）及(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺（14 mg, 0.10mmol），并再加入6mL（DMSO：H₂O = 5:1）后升温至70°C搅拌回流反应6h（TLC检测较为完全）。反应完毕后向其中加入30mL水，每次加乙酸乙酯25mL萃取三次，合并有机相并将之用饱和食盐水洗，再以无水硫酸钠干燥，过滤后减压旋蒸拌样，湿法装柱，以乙酸乙酯：石油醚：三乙胺=66：33：1至二氯甲烷：甲醇：三乙胺=90：1：1梯度洗脱得目标化合物WXSA-051B。黄色固体，收率12%。

WXSA-051B的波谱数据：¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.71 (d, J = 5.0 Hz,1H), 7.94 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 3.9Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.81 (s, 2H), 3.35 (s,3H), 3.31 – 3.25 (m, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.84 (s, 1H), 1.54 (d, J = 29.5 Hz,1H), 1.47 – 1.42 (m, 1H), 1.29 (d, J = 12.7 Hz, 3H), 1.24 (s, 3H), 0.86 (dd,J = 13.2, 6.6 Hz, 3H). MS: m/z 417.51. [M + 1]⁺. C₂₁H₃₂N₆O₃ (416.53).

实施例2 检测化合物在胃癌细胞中对RBP2酶作用底物影响（Western blot）

实验目的：

检测化合物对RBP2酶作用底物H3K4me3的作用

实验材料：

RPMI 1640培养基购自Gibco公司；

胎牛血清购自Gibco 公司；

DMSO购自Sigma公司；

EpiQuik Total Histone Extraction Kit（OP-0006-100）购自Epigentek集团公司；

Pierce^® BCA Protein Assay Kit购自Thermo fisher scientific公司

实验仪器：

HF safe 生物安全柜，

MCO-15AC二氧化碳培养箱，日本三洋SANYO，

聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳槽，中国北京市六一仪器厂

受试药物：

化合物WXSA-051B，用DMSO配制成母液，终浓度200mM，使用时用不完全培养基稀释使用，DMSO终浓度不超过0.1%。

细胞株：

人胃癌细胞BGC-823，为本实验室之前购买使用并冻存，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中；

实验方案：

Western blotting检测H3K4me3变化

取BGC-823细胞铺板六孔板进行实验。设立空白组，对照组以及加药组，六孔板中细胞长达90%时进行处理。分别空白组（补加同体积培基），对照组（加DMSO），处理组（加化合物），孵育48h后消化收细胞，用EpiQuik Total Histone Extraction Kit（OP-0006-100）进行组蛋白提取，之后用Pierce^® BCA Protein Assay Kit进行浓度测定，跑western blot进行蛋白定量比较。

剂量设置：

剂量组：100μM；

实验结果：

实验结果如图1所示，化合物能使人胃癌细胞BGC-823中H3K4me3蛋白水平明显升高，具有明显的抑制RBP2酶活性作用。

实施例3 检测化合物在胃癌细胞中对迁移能力作用（Transwell）

实验目的：

检测化合物对胃癌细胞迁移能力影响

实验材料：

RPMI 1640培养基购自Gibco公司；

胎牛血清购自Gibco 公司；

DMSO购自Sigma公司；

Corning Transwell 3542小室购自北京索莱宝科技有限公司

实验仪器：

HF safe 生物安全柜，

MCO-15AC二氧化碳培养箱，日本三洋SANYO，

Olympus CKX53 生物显微镜，上海普赫光电科技有限公司，

受试药物：

化合物WXSA-051B，样品用DMSO配制成母液，终浓度200mM，使用时用不完全培养基稀释使用，DMSO终浓度不超过0.1%。

细胞株：

人胃癌细胞BGC-823，为本实验室之前购买使用并冻存，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中；

实验方案：

Transwell法检测细胞迁移能力

取活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞消化、用1640重悬计数、取浓度为5×10⁵的细胞悬液（体积应小于150μL），24孔板中每孔加入600 μL 20%FBS+80%1640，放置小室，小室每孔加入5×10⁵ 细胞，同时补齐体积为150μL；24孔板置于37℃，5% CO₂培养箱中培养48小时，之后用PBS清洗小室内外膜三次，用棉签擦去小室内膜细胞，甲醇1mL于24孔板中固定小室细胞30min，晾干，24孔板加结晶紫1mL，染色30min。镜下观察并拍照。

剂量设置：

剂量组：100μM；

实验结果：

实验结果见图2，化合物WXSA-051B能使人胃癌细胞BGC-823迁移能力降低。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种吡啶类化合物，命名为WXSA-051B，具有如下所示的结构：

2.如权利要求1所述的吡啶类化合物WXSA-051B的制备方法，步骤如下：

步骤(i)，以4-甲酯基-2-吡啶甲胺盐酸盐、3-溴丙炔、碳酸钾为起始原料，通过一步亲核取代反应得到中间体2；

步骤(ii)，在DMSO与水的混合溶液中，3-溴-正己基-N-甲基丙酰胺先与叠氮化钠先发生一步亲核取代，再与中间体2进行Click环合反应得到目标化合物WXSA-051B；

合成路线如下：

合成需要试剂及合成条件如下:

步骤(i)，3-溴丙炔，乙腈，碳酸钾，20-30℃；

步骤(ii)，3-溴-正己基-N-甲基丙酰胺，叠氮化钠，碘化亚铜，抗坏血酸钠，(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺，二甲亚砜，水，N₂，65-75℃。

3.如权利要求2所述的吡啶类化合物WXSA-051B的制备方法，步骤如下：

(1)取25mL圆底烧瓶，称取4-甲酯基-2-吡啶甲胺盐酸盐4.9mmol和碳酸钾7.2mmol于10mL的乙腈中，室温搅拌15分钟后将3-溴丙炔2.5mmol的乙腈溶液用恒压滴液漏斗逐滴滴加入，继续室温搅拌过夜， 反应完毕后减压蒸干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗后三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离得到中间体2；

(2)取25mL圆底烧瓶，称取3-溴-正己基-N-甲基丙酰胺1.07mmol与叠氮化钠1.27mmol于6mLDMSO与H₂O的混合溶液中，DMSO与H₂O的比例是5:1，室温搅拌；再依次加入2-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)异烟酸甲酯0.98mmol、碘化亚铜0.19mmol、抗坏血酸钠0.39mmol及(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺0.10mmol，再加入6mLDMSO与H₂O的混合溶液，DMSO与H₂O的比例是5:1，N₂置换，65-75℃搅拌回流反应6h， 反应完毕后减压蒸干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗后三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离得到化合物WXSA-051B。

4.如权利要求1所述的化合物在制备抗胃癌药物中的应用。

5.一种抗癌药物组合物，包含权利要求1所述化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

6.一种抗胃癌药物组合物，包含权利要求1所述化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

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