CN109342633A

CN109342633A - 尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法

Info

Publication number: CN109342633A
Application number: CN201811420940.0A
Authority: CN
Inventors: 乔荷; 刘晓东; 李珏; 孟祥娟; 牛东升; 丁晓文
Original assignee: Beijing Chemical Occupational Disease Prevention Hospital
Current assignee: Beijing Chemical Occupational Disease Prevention Hospital
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN109342633B

Abstract

本发明公开了一种尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法，包括如下步骤：(1)将尿液与第一溶剂混合，然后离心，得到上清液；将上清液与第二溶剂混合，得到第一样品液，采用液相色谱串联质谱检测第一样品液中的第一代谢物；第一代谢物包括苯巯基尿酸S‑PMA、8‑羟基‑2‑脱氧鸟苷8‑OHdG、2‑甲基马尿酸2‑MHA、3‑甲基马尿酸3‑MHA和4‑甲基马尿酸4‑MHA；(2)将部分第一样品液与第三溶剂混合，得到第二样品液，采用液相色谱串联质谱检测第二样品液中的第二代谢物；第二代谢物包括马尿酸HA。本发明的方法可以联合检测六种以上代谢物。

Description

尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法

技术领域

本发明涉及一种尿液中代谢物的检测方法，尤其是一种尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法。

背景技术

生物监测是指对人体生物材料(血液、尿液等)中的化学物质及其代谢物含量或由它们产生的生物效应水平进行监测，可以反映机体不同途径及来源的化学物质的总接触量。因此，生物监测可以提供机体实际接触水平，因而比环境监测更具有优势。

苯系化合物是工业上应用十分广泛的化学品，可用做化学原料、溶剂、稀释剂、燃料等。苯系化合物也是一类常见的环境污染物。在苯系化合物中，苯、甲苯和二甲苯最为常见。苯具有血液毒性和致癌性；甲苯和二甲苯的毒性虽然比苯小，但长期接触对皮肤、内分泌、神经系统等也会产生有害影响。因此，对苯、甲苯及二甲苯的暴露水平进行生物监测在职业防护中是非常必要的。然而，目前针对苯系化合物代谢物的联合检测方法的报道则比较少。

CN106680394A公开了一种液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的试剂盒，所述14种环境荷尔蒙分别为：邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A、三氯沙。CN106680393A公开了一种液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，采用高效液相色谱串联质谱法定量检测尿液样品中14种环境荷尔蒙，先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子-子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为X轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为Y轴，建立校正曲线，计算上述14种环境荷尔蒙的含量。CN103837624A公开了一种尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法，将样品经稀释后直接引入液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪进行测定，可快速、准确检测出尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量水平。CN102788852A公开了一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯的检测，该方法采用浓HCl水解尿液，并通过PAH分子印迹柱对样品进行纯化处理，进液相色谱-串联质谱联用仪分析。上述方法采用液相色谱串联质谱检测一些芳香族化合物及其代谢物，但均不是苯、甲苯和二甲苯的代谢物。

CN103175921A公开了一种液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢物的方法，配制系列浓度的混合标样工作液，进行仪器分析，根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系制成标准曲线；取待测尿样，加入含四种特征代谢物同位素内标物混合工作标准品溶液；用固相萃取小柱吸附目标化合物，然后进行仪器分析；得到四种特征代谢物的响应值；根据已知的系数f，求出尿样中四种特征代谢物的浓度。所述的仪器分析是采用超高压液相色谱串联质谱法，色谱柱采用粒径＜2μm的反相C18色谱柱。上述方法采用固相萃取法分离代谢物，由于受萃取条件的限制，仅能针对有限的四种代谢物进行检测，因而无法全面检测苯系化合物的代谢物。

近年来，很多企业使用苯系化合物的混合物，现场往往存在多种苯系化合物。因此，仍然需要开发新的检测方法，以全面检测苯系化合物的代谢物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法，其可以联合检测苯、甲苯和二甲苯的六个以上生物标志物。本发明进一步的目的在于提供一种检测方法，其可以减少基质的干扰，检测准确度较高。

本发明提供一种尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法，包括如下步骤：

(1)将尿液与第一溶剂混合，然后离心，得到上清液；将上清液与第二溶剂混合，得到第一样品液，采用液相色谱串联质谱检测第一样品液中的第一代谢物；其中，第一溶剂选自甲醇和乙腈中的一种或两种，第二溶剂选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种或多种；第一代谢物包括苯巯基尿酸S-PMA、8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG、2-甲基马尿酸2-MHA、3-甲基马尿酸3-MHA和4-甲基马尿酸4-MHA；

(2)将部分第一样品液与第三溶剂混合，得到第二样品液，采用液相色谱串联质谱检测第二样品液中的第二代谢物；其中，第三溶剂选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种和多种；第二代谢物包括马尿酸HA。

根据本发明的检测方法，优选地，第一代谢物还包括反,反式-粘糠酸t,t-MA。

根据本发明的检测方法，优选地，第一代谢物还包括邻甲基苯酚。

根据本发明的检测方法，优选地，所述尿液与第一溶剂的体积比为1:1～20；所述上清液与第二溶剂的体积比为1:0.5～20；所述部分第一样品液与第三溶剂的体积比为1:20～500。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，第一溶剂为甲醇，第二溶剂为超纯水；步骤(2)中，第三溶剂为超纯水与甲醇的混合物。

根据本发明的检测方法，优选地，在超纯水与甲醇的混合物中，甲醇的体积百分数为10～25vol％。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)和(2)的液相色谱串联质谱的条件如下：

液相色谱条件：液相色谱柱为反相色谱柱，所述反相色谱柱的填料的粒径小于等于5.0μm，柱长为30～150mm；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为体积百分数为0.005～0.2vol％的甲酸或乙酸的水溶液；流动相B为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的甲醇溶液，或者为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的乙腈溶液；流动相的流速为0.1～0.5mL/min；柱温为30～60℃；洗脱方式为梯度洗脱；进样量为1～10μL。

质谱条件：采用电喷雾电离源ESI，其中，8-羟基-2-脱氧鸟苷采用正离子模式ESI⁺，除了8-羟基-2-脱氧鸟苷之外的其他代谢物采用负离子模式ESI^﹣；采用正负离子模式分段采集；采用多反应监测模式MRM进行监测；毛细管电压为0.5～5kV；离子源温度为120～180℃。

根据本发明的检测方法，优选地，梯度洗脱如下：0～1min，流动相A保持85vol％不变；1～10min，流动相A从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相A从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相A从25vol％升至85vol％。

根据本发明的检测方法，优选地，在质谱条件中，碰撞能为5～25eV，锥孔电压为1～50V，定量离子对如下所示：

化合物	母离子(m/z)	子离子(m/z)
			8-OHdG	284	168
HA	178	134
			2-MHA	192	91
3-MHA	192	91
			4-MHA	192	91
S-PMA	238	109

根据本发明的检测方法，优选地，采用外标法进行定量，以标准品浓度为X轴，以定量离子响应峰面积为Y轴，建立标准曲线；将步骤(1)和(2)的液相色谱串联质谱得到的响应峰面积通过标准曲线进行定量，得出测量浓度；将所述测量浓度经过换算，得到第一代谢物和第二代谢物在尿液中的浓度c；换算公式如下：

c＝c₀×n

式中，c₀为测量浓度；n为稀释倍数。

本发明采用甲醇或乙腈将尿液中的蛋白沉淀，然后经过合适的溶剂稀释后直接进样。与传统的液液萃取和固相萃取相比，采用本发明的方法可以联合检测苯、甲苯和二甲苯的六个以上生物标志物，因而更加全面地监测苯系化合物的暴露水平。本发明针对不同的代谢物，采用不同的稀释倍数，从而有效减少基质干扰，提高测量准确度。

附图说明

图1为实施例2的多反应监测(MRM)图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明的尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法仅仅是为了评估苯系化合物的接触者或未接触者的苯系化合物代谢物状况，因而不涉及疾病的诊断和治疗。此外，上述代谢物状况与某种疾病并没有直接或间接的关系，因而不能用于诊断疾病。

苯巯基尿酸(S-PMA)、反,反式-粘糠酸(t,t-MA)、8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)是研究较多的苯接触的生物标志物，能够较好地反映出苯的内暴露水平。马尿酸(HA)和邻甲基苯酚(o-cresol)是甲苯接触的生物标志物，能够较好地反映出甲苯的内暴露水平。2-甲基马尿酸(2-MHA)，3-甲基马尿酸(3-MHA)和4-甲基马尿酸(4-MHA)是二甲苯(包含邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯三种异构体)的主要代谢物，可以作为二甲苯接触的生物标志物。

本发明的尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法包括如下步骤：(1)第一代谢物检测步骤；(2)第二代谢物检测步骤。下面进行详细描述。

在步骤(1)中，将尿液与第一溶剂混合，然后离心，得到上清液；将上清液与第二溶剂混合，得到第一样品液，采用液相色谱串联质谱检测第一样品液中的第一代谢物。

将尿液与第一溶剂混合之后，可以将尿液中的蛋白沉淀，从而减少对检测数据的干扰。通过离心分离将蛋白除去。离心的转速可选择8000rpm以上。第一溶剂选自甲醇和乙腈中的一种或两种，优选为甲醇或乙腈，更优选为甲醇。

在本发明中，所述尿液与第一溶剂的体积比可以为1:1～20；优选为1:1～10，更优选为1:2～5。尿液与第一溶剂的合适的比例可以将蛋白充分沉淀，从而改善检测准确性，并且可以节约有机溶剂用量。根据本发明的一个实施方式，所述尿液与甲醇的体积比可以为1:1～20；优选为1:1～10，更优选为1:2～5。

离心后得到的上清液与第二溶剂混合，得到第一样品液。这样可以将尿液样品稀释，减少尿液基质的干扰。第二溶剂选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种或多种；优选为超纯水或甲醇，更优选为超纯水。本发明发现，超纯水更加有利于提高检测结果的准确性。超纯水在本领域具有通常的含义，且可以容易地获得，这里不再赘述。

在本发明中，上清液与第二溶剂的体积比可以为1:0.5～20；优选为1:0.6～10，更优选为1:1～5。合适的稀释比例可以减少基质干扰，改善检测准确性。根据本发明的一个实施方式，上清液与超纯水的体积比为1:0.5～20；优选为1:0.6～10，更优选为1:1～5。

采用液相色谱串联质谱检测第一样品液中的第一代谢物。第一代谢物包括苯巯基尿酸S-PMA、8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG、2-甲基马尿酸2-MHA、3-甲基马尿酸3-MHA和4-甲基马尿酸4-MHA。本发明的方法可以同时检测五个以上的苯系化合物代谢物。优选地，第一代谢物还可以包括反,反式-粘糠酸t,t-MA。更优选地，第一代谢物还可以包括邻甲基苯酚。在某些实施方案中，检测的第一代谢物仅由苯巯基尿酸S-PMA、8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG、2-甲基马尿酸2-MHA、3-甲基马尿酸3-MHA和4-甲基马尿酸4-MHA组成。在另一些实施方案中，检测的第一代谢物仅由苯巯基尿酸S-PMA、反,反式-粘糠酸t,t-MA、8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG、2-甲基马尿酸2-MHA、3-甲基马尿酸3-MHA和4-甲基马尿酸4-MHA组成。

将部分第一样品液与第三溶剂混合，得到第二样品液。第三溶剂可以选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种和多种；优选为超纯水-甲醇的混合物。在超纯水-甲醇的混合物中，甲醇的体积百分数为10～25vol％，优选为15～20vol％。

本发明发现，对于不同的代谢物，最好采用不同的稀释倍数，这样可以有效改善检测结果的准确性并能够更好地维护仪器。部分第一样品液与第三溶剂的体积比可以为1:20～500，优选为1:40～200，更优选为1:45～150。合适的稀释比例可以改善检测准确性。根据本发明的一个实施方式，部分第一样品液与超纯水-甲醇的混合物的体积比可以为1:20～500，优选为1:40～200，更优选为1:45～150。

采用液相色谱串联质谱检测第二样品液中的第二代谢物。第二代谢物包括马尿酸HA，优选地，检测的第二代谢物仅为马尿酸HA。

根据本发明的一个实施方式，尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法包括如下步骤：

(1)将尿液与甲醇按照体积比为1:1～20混合，然后离心，得到上清液；将上清液与超纯水按照体积比为1:0.5～20混合，得到第一样品液，采用液相色谱串联质谱检测第一样品液中的第一代谢物；第一代谢物由苯巯基尿酸S-PMA、8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG、2-甲基马尿酸2-MHA、3-甲基马尿酸3-MHA和4-甲基马尿酸4-MHA组成；

(2)将部分第一样品液与超纯水-甲醇的混合物按照体积比为1:20～500混合，得到第二样品液，采用液相色谱串联质谱检测第二样品液中的第二代谢物；第二代谢物为马尿酸HA。超纯水-甲醇的混合物中的甲醇的体积百分数为10～25vol％。

本发明的步骤(1)和(2)的液相色谱串联质谱可以采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱；例如，超高效液相色谱(Acquity UPLC I-Class，美国Waters公司)-三重四极杆质谱(Xevo TQ-XS，美国Waters公司)。本发明的步骤(1)和(2)的液相色谱串联质谱的条件可以相同，也可以略有不同，下面进行详细描述。

首先介绍液相色谱条件。液相色谱柱为反相色谱柱，所述反相色谱柱的填料的粒径小于等于5.0μm，柱长为30～150mm；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为体积百分数为0.005～0.2vol％的甲酸或乙酸的水溶液；流动相B为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的甲醇溶液，或者为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的乙腈溶液；流动相的流速为0.1～0.5mL/min；柱温为30～60℃；洗脱方式为梯度洗脱；进样量为1～10μL。

在本发明中，液相色谱柱为反相色谱柱，色谱柱的实例包括但不限于HSS T3型色谱柱、BEH C18型色谱柱。反相色谱柱的填料的粒径小于等于5.0μm，优选为小于等于2.0μm。柱长为30～150mm，例如100mm。

液相色谱条件的流动相包括流动相A和流动相B。流动相A为甲酸水溶液或乙酸水溶液；优选为体积百分数为0.005～0.2vol％的甲酸的水溶液或体积百分数为0.005～0.2vol％的乙酸的水溶液；优选为体积百分数为0.01～0.1vol％的甲酸的水溶液或体积百分数为0.01～0.1vol％的乙酸的水溶液。根据本发明的一个实施方式，流动相A为体积百分数为0.01～0.05vol％的甲酸的水溶液或体积百分数为0.01～0.05vol％的乙酸的水溶液；更优选为流动相A为体积百分数为0.01～0.05vol％的甲酸的水溶液。

流动相B为甲醇、乙腈、甲酸的甲醇溶液、乙酸的甲醇溶液、甲酸的乙腈溶液或乙酸的乙腈溶液；优选地，流动相B为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.2vol％的乙酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.2vol％的甲酸的乙腈溶液或体积百分数为0～0.2vol％的乙酸的乙腈溶液；更优选地，流动相B为体积百分数为0～0.1vol％的甲酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.1vol％的乙酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.1vol％的甲酸的乙腈溶液或体积百分数为0～0.1vol％的乙酸的乙腈溶液。根据本发明的一个实施方式，流动相B为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸的甲醇溶液或体积百分数为0～0.2vol％的乙酸的甲醇溶液；优选为体积百分数为0～0.1vol％的甲酸的甲醇溶液或体积百分数为0～0.1vol％的乙酸的甲醇溶液；更优选为甲醇。

流动相的流速为0.1～0.5mL/min；优选为0.2～0.4mL/min。柱温为30～60℃；例如为30～50℃。进样量为1～10μL，优选为3～6μL。洗脱方式为梯度洗脱。优选地，洗脱程序如下：0～1min，流动相A保持85vol％不变；1～10min，流动相A从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相A从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相A从25vol％升至85vol％。

然后介绍质谱条件。采用电喷雾电离源ESI，其中，8-羟基-2-脱氧鸟苷采用正离子模式ESI⁺，除了8-羟基-2-脱氧鸟苷之外的其他代谢物采用负离子模式ESI^﹣；采用正负离子模式分段采集；采用多反应监测模式MRM进行监测；毛细管电压为0.5～5kV；离子源温度为120～180℃。

本发明采用正负离子模式分段采集，可以一次检测多个代谢物，包括但不限于苯巯基尿酸S-PMA、反,反式-粘糠酸t,t-MA、8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG、马尿酸HA、邻甲基苯酚o-cresol、2-甲基马尿酸2-MHA、3-甲基马尿酸3-MHA和4-甲基马尿酸4-MHA。用多反应监测模式MRM进行监测可以进一步提高检测灵敏度和准确性。毛细管电压为0.5～5kV；优选为0.5～3.5kV。根据本发明的一个实施方式，毛细管电压：3.1kV(ESI⁺)，1.0kV(ESI^﹣)。离子源温度为120～180℃，例如为150℃。

在质谱条件中，碰撞能为5～25eV，优选为10～20eV。锥孔电压为1～50V，优选为3～30V。在被测化合物不出峰期间，可切换质谱的在线切换阀至废液，以降低样品对质谱的污染。

在质谱条件中，定量离子对如下所示：

化合物	母离子(m/z)	子离子(m/z)
			8-OHdG	284	168；89
t,t-MA	141	53；45
			HA	178	134；77
o-cresol	107	92；76
			2-MHA	192	91；149
3-MHA	192	91；149
			4-MHA	192	91；149
S-PMA	238	109；192

优选地，定量离子对如下所示：

化合物	母离子(m/z)	子离子(m/z)
			8-OHdG	284	168
t,t-MA	141	53
			HA	178	134
o-cresol	107	92
			2-MHA	192	91
3-MHA	192	91
			4-MHA	192	91
S-PMA	238	109

根据本发明的一个实施方式，定量离子对如下所示：

本发明采用外标法进行定量。以标准品浓度为X轴，以定量离子响应峰面积为Y轴，建立标准曲线。选取S-PMA、t,t-MA、8-OHdG、HA、o-cresol、2-MHA、3-MHA及4-MHA中的六个以上配制单一标准品储备溶液及混合标准应用液，并继而配制不同浓度的标准系列溶液。配制储备溶液、应用液及标准系列溶液所使用的溶剂选自超纯水、甲醇、乙腈中的一种或多种。所述标准系列溶液的个数为4～10个，优选5～8个。代谢物的标准溶液的最低浓度点分别为代谢物各自的定量限，为信噪比(S/N)≥10对应的浓度。代谢物的标准溶液的最高浓度点为：

S-PMA/8-OHdG：0.4～4ng/mL；

t,t-MA/o-cresol：20～200ng/mL；

HA/2-MHA/3-MHA/4-MHA：200～2000ng/mL。

将步骤(1)和(2)的液相色谱串联质谱得到的响应峰面积通过标准曲线进行定量，得出测量浓度。将所述测量浓度经过换算，得到第一代谢物和第二代谢物在尿液中的浓度c。

c＝c₀×n

式中，c₀为测量浓度；n为稀释倍数。

下面介绍以下实施例的仪器与试剂：

超高效液相色谱(Acquity UPLC I-Class，美国Waters公司)，三重四极杆质谱(Xevo TQ-XS，美国Waters公司)；甲醇及甲酸为LC-MS级；S-PMA、8-OHdG、t,t-MA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的标准品纯度均大于96％。

实施例1

样品处理：

将300μL尿液置于离心管中，加入900μL甲醇，旋涡振荡均匀，以15000rpm的转速离心15min，得到上清液。将500μL上清液置于新的离心管中，并加入2mL超纯水，涡旋振荡均匀，得到第一样品液。将1mL第一样品液置于2mL进样瓶，进样以分析S-PMA、8-OHdG、2-MHA、3-MHA及4-MHA的含量。

将20μL第一样品液和1980μL的15vol％甲醇的水溶液均置于新的离心管中，涡旋振荡均匀，得到第二样品液。将1mL第二样品液置于2mL进样瓶，进样以分析HA的含量。

标准溶液配制：

以15vol％甲醇的水溶液为溶剂，配制不同浓度的混合标准溶液。8-OHdG的浓度范围：0.002～2ng/mL；S-PMA的浓度范围：0.001～2ng/mL；HA的浓度范围：0.5～1000ng/mL；2-MHA、3-MHA及4-MHA的浓度范围：0.05～1000ng/mL。

液相色谱条件：

色谱柱为HSS T3型色谱柱，填料的粒径为1.8μm，柱长为100mm。流动相：流动相A为体积百分数为0.04vol％的甲酸水溶液；流动相B为甲醇。流动相的流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：4μL。梯度洗脱：0～1min，流动相A保持85vol％不变；1～10min，流动相A从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相A从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相A从25vol％升至85vol％。

质谱条件：

8-OHdG采用正离子模式ESI⁺，S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA采用负离子模式ESI^﹣；采用正负离子模式分段采集；毛细管电压：3.1kV(ESI⁺)，1.0kV(ESI^﹣)；多反应监测模式(MRM)；离子源温度：150℃。定量离子对、碰撞能及锥孔电压的选择如下表所示：

表1

化合物	母离子(m/z)	子离子(m/z)	碰撞能(eV)	锥孔电压(V)
					8-OHdG	284	168	14	28
S-PMA	238	109	10	14
					HA	178	134	16	4
2-MHA	192	91	16	26
					3-MHA	192	91	16	26
4-MHA	192	91	16	26

方法学验证：

采用外标法进行定量，建立标准曲线，所得标准曲线的r²均在0.995以上。

信噪比(S/N)≥10对应的浓度确定为定量限，8-OHdG、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的定量限分别为2、1、500、50、50和50pg/mL。

采用基质加标方式考察方法的准确度和精密度。分别配制低、中、高三个浓度水平的加标尿液，每组处理6份样品，测定回收率及批内精密度：8-OHdG、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的回收率在98～110％范围内；批内精密度在2.0～4.0％范围内。各个浓度基质加标样品分6次分别处理，测定批间精密度：8-OHdG、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的批间精密度在0.6～9.5％范围内。

样品测试：

采集某制鞋厂员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：8-OHdG、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的含量分别为0.825～12.651ng/mL、0.024～0.186ng/mL(6例未检出)、8.619～811.166μg/mL、12.952～5154.764ng/mL、18.650～10428.540ng/mL和11.077～4707.659ng/mL。

采集某物业公司员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：8-OHdG、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的含量分别为0.943～10.433ng/mL、0.020～0.034ng/mL(14例未检出)、6.118～452.130μg/mL、5.760～40.313ng/mL、11.286～135.178ng/mL和6.270～67.055ng/mL。

实施例2

样品处理：

将300μL尿液置于离心管中，加入900μL甲醇，旋涡振荡均匀，以15000rpm的转速离心15min，得到上清液。将500μL上清液置于新的离心管中，并加入2mL超纯水，涡旋振荡均匀，得到第一样品液。将1mL第一样品液置于2mL进样瓶，进样以分析S-PMA、t,t-MA、8-OHdG、2-MHA、3-MHA及4-MHA的含量。

标准溶液配制：

以15vol％甲醇的水溶液为溶剂，配制不同浓度的混合标准溶液。8-OHdG的浓度范围：0.002～2ng/mL；S-PMA的浓度范围：0.001～2ng/mL；t,t-MA的浓度范围：0.04～100ng/mL；HA的浓度范围：0.5～1000ng/mL；2-MHA、3-MHA及4-MHA的浓度范围：0.05～1000ng/mL。

液相色谱条件：

质谱条件：

8-OHdG采用正离子模式ESI⁺，S-PMA、t,t-MA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA采用负离子模式ESI^﹣；采用正负离子模式分段采集；毛细管电压：3.1kV(ESI⁺)，1.0kV(ESI^﹣)；多反应监测模式(MRM)；离子源温度：150℃。定量离子对、碰撞能及锥孔电压的选择如下表所示：

表2

方法学验证：

信噪比(S/N)≥10对应的浓度确定为定量限，8-OHdG、t,t-MA、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的定量限分别为2、40、1、500、50、50和50pg/mL。

图1为实施例2的多反应监测(MRM)图。采用基质加标方式考察方法的准确度和精密度。分别配制低、中、高三个浓度水平的加标尿液，每组处理6份样品，测定回收率及批内精密度：8-OHdG、t,t-MA、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的回收率在86～110％范围内；批内精密度在2.0～4.5％范围内。各个浓度基质加标样品分6次分别处理，测定批间精密度：8-OHdG、t,t-MA、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的批间精密度在0.6～9.5％范围内。

样品测试：

采集某制鞋厂员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：8-OHdG、t,t-MA、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的含量分别为0.825～12.651ng/mL、6.708～131.461ng/mL、0.024～0.186ng/mL(6例未检出)、8.619～811.166μg/mL、12.952～5154.764ng/mL、18.650～10428.540ng/mL和11.077～4707.659ng/mL。

采集某物业公司员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：8-OHdG、t,t-MA、S-PMA、HA、2-MHA、3-MHA及4-MHA的含量分别为0.943～10.433ng/mL、4.173～48.504ng/mL、0.020～0.034ng/mL(14例未检出)、6.118～452.130μg/mL、5.760～40.313ng/mL、11.286～135.178ng/mL和6.270～67.055ng/mL。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims

1.一种尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，第一代谢物还包括反,反式-粘糠酸t,t-MA。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，第一代谢物还包括邻甲基苯酚。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述尿液与第一溶剂的体积比为1:1～20；所述上清液与第二溶剂的体积比为1:0.5～20；所述部分第一样品液与第三溶剂的体积比为1:20～500。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，第一溶剂为甲醇，第二溶剂为超纯水；步骤(2)中，第三溶剂为超纯水与甲醇的混合物。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在超纯水与甲醇的混合物中，甲醇的体积百分数为10～25vol％。

7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)和(2)的液相色谱串联质谱的条件如下：

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，梯度洗脱如下：0～1min，流动相A保持85vol％不变；1～10min，流动相A从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相A从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相A从25vol％升至85vol％。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，在质谱条件中，碰撞能为5～25eV，锥孔电压为1～50V，定量离子对如下所示：

化合物母离子(m/z) 子离子(m/z) 8-OHdG 284 168 HA 178 134 2-MHA 192 91 3-MHA 192 91 4-MHA 192 91 S-PMA 238 109

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，采用外标法进行定量，以标准品浓度为X轴，以定量离子响应峰面积为Y轴，建立标准曲线；将步骤(1)和(2)的液相色谱串联质谱得到的响应峰面积通过标准曲线进行定量，得出测量浓度；将所述测量浓度经过换算，得到第一代谢物和第二代谢物在尿液中的浓度c；换算公式如下：

c＝c₀×n

式中，c₀为测量浓度；n为稀释倍数。