CN109321615B - 一种高糖基转移活性解淀粉芽孢杆菌在非水相中生物合成红景天苷的应用 - Google Patents
一种高糖基转移活性解淀粉芽孢杆菌在非水相中生物合成红景天苷的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种高糖基转移活性解淀粉芽孢杆菌在非水相中生物合成红景天苷的应用，属于生物催化技术领域。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌FJ18，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2016272。本发明所提供的方法能以廉价的糖基供体在非水相中高效催化酪醇制备红景天苷，解决了红景天苷稀缺的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，涉及一种高糖基转移活性解淀粉芽孢杆菌FJ18在生物合成红景天苷中的应用。
背景技术
红景天苷是景天科植物红景天的主要有效成分，具有显著的抗氧化、抗炎、抗疲劳、抗衰老、抗辐射、免疫调节之功效。作为酚苷类天然产物的典型代表，目前红景天苷已广泛应用于药品、保健品、化妆品等工业生产中(巨修炼等.ZL 201510099303.8)。
传统的方法是采用植物提取法获取红景天苷，然而植物中此化合物的含量较低，通常仅为0.5％-0.8％，因此分离提取的成本较高。目前，随着红景天苷的工业应用越来越广泛，现有的植物分离提取手段已难以满足工业需求。而采用化学法进行红景天苷生物合成时，通常需要基团保护、脱保护等多步反应，并使用价格昂贵的金属催化剂，难于工业生产。
目前，生物转化方法已取得显著进展。已报道的生物转化技术包括采用糖基转移酶以及采用糖苷水解酶作为催化剂两种。采用糖苷水解酶进行转化时，通常需要底物酪醇的含量过量，且由于糖苷水解酶较强的水解活性，转化难于向合成方向进行，转化率通常低于40％(魏胜华等.化工进展,2018,37(2):694-700；张立伟等，ZL201610613563.7)。采用糖基转移酶为催化剂进行转化，已成为目前红景天苷合成的主要研究热点，利用糖苷转移酶较高的糖基转移效率，可将葡萄糖残基高效地转移到底物酪醇分子上，实现底物酪醇高效转化(通产高于90％)，符合酪醇分子转化的原子经济效益；然而单独采用糖基转移酶作为催化剂时，需添加尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)等昂贵的活性糖基供体，不利于反应成本控制，通过将糖基转移酶导入到大肠杆菌等底盘细胞中，构建基因工程菌株(含糖基活化系统)，可避免昂贵的糖基供体的使用(赵广荣等，ZL201610408741.2；何冰芳等，Scientificreports,2017,7(1):463；刘涛等，ZL201611200315.6)。目前，以糖基转移酶(或含糖基转移酶的基因工程菌株)为催化剂进行红景天苷合成的方法，已取得显著进展，具有理想的工业应用前景，然而糖基转移酶仍是红景天苷生物合成系统中的限速步骤，同时基因工程菌株大规模发酵时的稳定性(基因工程菌大规模发酵时容易丢失外源插入的质粒，从而丧失催化活力)，以及对底物分子的适应性及耐受性，仍是制约红景天苷生物合成的瓶颈。因此开发具有高效糖基转移活性，且对催化体系(含前体分子及溶剂等)具有较高耐受性的野生型菌株，有望创建高效合成红景天苷的策略，解决红景天苷稀缺的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌在非水相中制备红景天苷的方法，应用上述菌株的静息细胞作为催化剂在非水相中通过糖基化制备红景天苷，菌株发酵性能稳定、仅需采用廉价的糖基供体，且催化效率高。
为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：
一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称：解淀粉芽孢杆菌FJ18(Bacillusamyloliquefaciens FJ18)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2016年5月20日；保藏号为：CCTCC NO：M 2016272。该菌株在黄酮类化合物的催化上，显示了极强的糖基转移活性(ZL201610719089.6)。
本发明的另一技术方案是：一种解淀粉芽孢杆菌的用途，在生物合成红景天苷中的应用。
本发明的另一技术方案是：一种使用解淀粉芽孢杆菌生物合成红景天苷的方法，该方法以酪醇和廉价的葡萄糖基供体为原料，在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，酪醇上的醇羟基发生糖基化反应，形成红景天苷。
优选的，包括以下三个步骤：
步骤(1)：将所述的解淀粉芽孢杆菌FJ18，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；
步骤(2)：以酪醇和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；
步骤(3)：将步骤(1)的湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应。
优选的，步骤(2)中所述的磷酸缓冲溶液浓度为100～200mmol/L，pH为8.0。
优选的，步骤(2)中所述的原料溶液，其组分中，酪醇的浓度为0.01～10g/L，糖基供体的溶液浓度为5～50g/L，非水相溶剂体积百分比为5％～20％。
优选的，所述的非水相溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种。
优选的，所述的非水相溶剂为二甲基亚砜、乙醇或DMF。
优选的，所述的糖基供体选自麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、糊精中的任意一种。
优选的，所述的糖基供体为葡萄糖或蔗糖。
有益效果：
1.本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌FJ18，底物酪醇在非水相中(水有机溶剂体系)可以相对较高的浓度下与糖供体之间发生糖基化反应，提高反应的催化效率，解决红景天苷稀缺的问题；与化学法合成相比，本反应过程中立体选择性较高，产物中不产生红景天苷的手性对映体，因此分离成本较低，具备一定的工业化前景；
2.本反应中有机溶剂的添加一方面能提高底物的溶解度，增加底物与催化剂(FJ18菌)的接触效率；一方面有机溶剂的添加，还能促使反应向合成方向进行，提高反应效率；同时，在工业生产过程中，有机溶剂的添加还能阻止杂菌的干扰，降低染菌效率，而不对耐有机溶剂的FJ18菌株产生影响。
3.相比于已报道的糖苷酶生物转化制备红景天苷法，本反应过程无须酪醇过量，酪醇基本能实现90％以上高效转化，更符合原子经济效益；且与普通的糖基转移酶制备红景天苷法相比，本反应中无须添加昂贵的人工活性糖基供体(如UDPG)，因此成本更低。
4.采用基因工程菌株进行工业放大生产时，通常会面临放大效应，即基因工程菌放大生产时容易因丢失质粒而失去原有的催化功能；而本发明所采用的菌株为从自然界筛选获得的野生型菌株，遗传性状稳定。通过该菌株在非水相中制备红景天苷的方法，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图l是红景天苷的1H NMR谱图。
图2是红景天苷的13C NMR谱图。
图3是红景天苷的HMBC谱图。
本发明中所采用的解淀粉芽孢杆菌FJ18已经于2016年5月20日提交中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，位于中国武汉大学)进行保藏，保藏号为CCTCC NO：M2016272。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
红景天苷高效合成菌株的筛选
从本实验室自主开发的具有糖基转移活性的菌库中进行复筛(该菌库中含有拟香味菌XT02,解淀粉芽孢杆菌FJ18等上百株具有糖基转移活性的菌株)，获取能在非水相中高效转化酪醇生成红景天苷的菌种。
LB平板培养基：酵母膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉20g/L。
筛选培养基组成为：酪醇1g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L,NaCl 10.0g/L,葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,DMSO 10％(v/v),初始pH 7.0。
将菌库中冻存的具有糖基转移活性的菌株在LB平板培养基中进行复苏，于30℃下培养24h后接种到筛选培养基中(50mL培养液/250mL三角瓶)，于30℃，200rpm培养24h，分别取0,12,24h的样品进行HPLC检测。反应后，以红景天苷为对照品，经HPLC检测，获得3株具有酪醇转化能力的菌株。其中解淀粉芽孢杆菌转化酪醇制备红景天苷的活力最高，优化后该菌株对底物的转化能力能达到95％以上。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵及静息细胞的制备
将解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵接种到种子培养基中：酵母膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH 7.0，于30℃，200rpm培养12小时。扩大培养基、发酵培养基(采用自主开发的利于糖基转移酶酶活的培养基)，其组分和含量均为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L.KH2PO4 1.0g/L，CaCl2 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。以NaOH调节pH至7.5。种子液按0.5％(v/v)接种到扩大培养基、发酵培养基，于30℃，200rpm培养12小时。10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得解淀粉芽孢杆菌FJ18的静息细胞。
实施例3
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、酪醇、葡萄糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，酪醇10g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，葡萄糖浓度为50g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养24h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得酪醇转化率高于96.5％。
产物用大孔树脂进行分离，取适量树脂，用乙醇浸泡24h后，除去树脂碎片和杂物。湿法装柱
用1L乙醇冲洗，再用蒸馏水洗至无醇味；接行酸碱处理，即先后用体积分数5％的HCl溶液与质量分数2％的NaOH溶液分别以2BV/h流速通过树脂柱，并静止置2～4h后，用蒸馏水洗至pH值中性。为避免DMSO溶解转化产物降低上样吸附率，所以转化液用5倍体积的去离子水(pH4.0，冰醋酸调节)稀释至DMSO<2％后加样。加样量20mg/g湿树脂，加样流速20mL/min。用10倍柱床体积的去离子水(pH4.0，冰醋酸调节)淋洗过量未反应的糖基供体(葡萄糖)，直到洗脱液用浓硫酸检测不出糖为止，流速20mL/min。选用甲醇加去离子水作流动相进行洗脱，调整甲醇和去离子水的体积比，在洗脱流速20mL/min时，确定洗脱液中甲醇比例。浓缩干燥：经HPLC检测，合并洗脱液，用旋转蒸发仪对其减压真空浓缩，加热温度40℃。最后将固体置于真空干燥箱中，40℃干燥6h。
解淀粉芽孢杆菌FJ18非水相中制备红景天苷的反应化学式见下式：
经核磁共振质谱分析鉴定从NMR图谱上看，获得的结构与预期产物的结构一致。以上结果证实该反应中生成了葡萄糖基化的酪醇，即红景天苷。红景天苷的核磁共振波谱数据为：
1H-NMR(MeOH-d6,400MHz)δ：7.04(2H,d,J＝8.5Hz,3and 5-H),6.66(2H,d,J＝8.5Hz,2and 6-H),4.16(1H,d,J＝7.8Hz,1'-H),3.84-3.89(1H,m,8-HA),3.64-3.66(1H,m,6'-HA),3.54-3.57(1H,m,8-HB),3.41-3.44(1H,m,6'-HB),2.97-3.13(3H,m,3'and 4'and5'-H),2.94-2.97(1H,m,2'-H),2.71-2.75(2H,m,7-HA and 7-HB)。
13C NMR(MeOH-d6,400MHz)δ：156.2(C-1),130.3(C-3),130.3(C-5),129.1(C-4),115.6(C-2),115.6(C-6),103.4(C-1'),77.4(C-5'),77.3(C-3'),74.0(C-2'),70.6(C-4'),70.5(C-8),61.6(C-6'),35.4(C-7)。
实施例4
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、酪醇、葡萄糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为15％(v/v)，酪醇5g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，葡萄糖浓度为25g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养24h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得酪醇转化率为98.5％。
产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例3；产物检测方法同实施例3。
实施例5
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、酪醇、葡萄糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为5％(v/v)，酪醇0.1g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为100mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，葡萄糖浓度为5g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养36h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得酪醇转化率为99.2％。产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例3；产物检测方法同实施例3。
实施例6
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以乙醇、酪醇、葡萄糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂乙醇的比例为15％(v/v)，酪醇1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，葡萄糖浓度为30g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养48h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得酪醇转化率为95.8％。产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例3；产物检测方法同实施例3。
实施例7
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以DMF、酪醇、葡萄糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂DMF的比例为15％(v/v)，酪醇1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，葡萄糖浓度为30g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养48h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得酪醇转化率为95.3％。产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例3；产物检测方法同实施例3。
Claims (5)
1.一种解淀粉芽孢杆菌在非水相中制备红景天苷的方法，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌FJ18，保藏名称：解淀粉芽孢杆菌FJ18（Bacillus amyloliquefaciens FJ18），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2016年5月20日；保藏号为：CCTCC NO：M 2016272，在非水相中制备红景天苷中；该方法以酪醇和糖基供体葡萄糖为原料，在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，酪醇的醇羟基发生糖基化反应，形成红景天苷；
包括以下三个步骤：
步骤（1）：将所述的解淀粉芽孢杆菌 FJ18，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；
步骤（2）：以酪醇和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；
步骤（3）：将步骤（1）的湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤（2）的溶液中进行催化反应。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在非水相中制备红景天苷的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的磷酸缓冲溶液浓度为100 ~ 150 mmol/L，pH为8.0。
3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在非水相中制备红景天苷的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的原料溶液，其组分中，酪醇的浓度为0.01～10 g/L，糖基供体的溶液浓度为5 ~ 50 g/L，非水相溶剂体积百分比为5%～20%。
4.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在非水相中制备红景天苷的方法，其特征在于：所述的非水相溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌在非水相中制备红景天苷的方法，其特征在于：所述的非水相溶剂为二甲基亚砜、乙醇或二甲基甲酰胺。
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