CN109295250B

CN109295250B - 一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒和方法

Info

Publication number: CN109295250B
Application number: CN201811292655.5A
Authority: CN
Inventors: 黄盈; 曾莲; 李文静
Original assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109295250A

Abstract

本发明公开了一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒和方法，涉及转基因检测技术领域。该检测试剂盒包括下引物对中的一种或多种的组合：SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10、SEQ ID NO.11‑12、SEQ ID NO.13‑14、SEQ ID NO.15‑16和SEQ ID NO.17‑18；采用该试剂盒可以检测样品中的食源性植物过敏原成分，具有较高的特异性和灵敏度、检测结果准确可靠。

Description

一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及转基因检测技术领域，具体而言，涉及一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒和方法。

背景技术

食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属机体对外源物质产生的一种变态反应。食物过敏轻者可引起皮肤、胃肠道过敏症状，重者可致哮喘发作、过敏性休克，危及生命甚至死亡。据世界卫生组织的数据表明，目前全球有 22％-25％的人患有过敏性疾病，并以每10年23倍的速度增加，其中食物过敏占过敏性疾病的绝大部分，并逐渐成为全球关注的问题。美国每年有100-125例因食物过敏而致死的病例，英国近十年来过敏反应发病率成倍地增长，每年有高达 150万的人群出现食品过敏现象。近20年，食物过敏才被视为一种严重的公共卫生课题。由于食物过敏治疗尚无特效方法，严格避免含有过敏成分的食品是最有效的疗法。一些发达国家已对食品中过敏原问题进行立法管理。欧盟 (2003/89/EC指令)、美国(《食品过敏原标签及消费者保护法》，2004)、日本 (《食品卫生法》，2002)等发达国家先后出台了各种法规要求进出口的食品使用食品标签，以明确食品成分，这样可以有效地避免过敏原给患者带来的危害。我国也在《中华人民共和国食品安全法》和《预包装食品标签通则》中规定了食品中可能含有致敏物质时的推荐标示要求。食品安全性是食品质量中最关键的组成部分，而食物过敏已成为其中重要的食品安全问题。同时，由于发达国家已对进出口食品过敏原标识进行了严格要求，食物过敏原甚至成为进出口贸易的壁垒。因此，如何快速准确地检测出食物中的过敏原成为当前亟需解决的问题之一。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒，该检测试剂盒能够同时对常见的食源性植物过敏原成分例如花生、胡桃、开心果、芝麻、榛果、大豆、杏仁、腰果和胡萝卜等成分进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量、操作便捷等特点。

本发明的另一目的在于提供食源性植物过敏原成分的检测方法，该检测方法能够同时对常见的食源性植物过敏原成分例如花生、胡桃、开心果、芝麻、榛果、大豆、杏仁、腰果和胡萝卜等成分进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量等特点。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒，其包括核酸组合，所述核酸组合包括如下用于检测食源性植物过敏原成分的引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物的用于检测花生成分的第一引物对，

包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物的用于检测胡桃成分的第二引物对，

包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物的用于检测开心果成分的第三引物对，

包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物的用于检测芝麻成分的第四引物对，

包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的用于检测榛果成分的第五引物对，

包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物的用于大豆成分的第六引物对，

包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物的用于检测杏仁成分的第七引物对，

包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物的用于检测腰果成分的第八引物对，

包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物的用于检测胡萝卜成分的第九引物对。

本发明提供的检测试剂盒中的引物对通过合理的设计，可以使得上述的9 种引物对在同一PCR反应体系进行多重PCR，避免非特异性扩增，提高检测的灵敏度和特异性，能够同时对常见的食源性植物过敏原成分例如花生、胡桃、开心果、芝麻、榛果、大豆、杏仁、腰果和胡萝卜等成分实现检测。

例如使用上述试剂盒的检测方法可以是：以待测食物样品的总DNA为模板，以上述9对特异性引物组合进行PCR扩增，各对引物的目标序列分别为食源性植物过敏原成分特异性靶序列，同时以多重PCR扩增产物设计得到探针，将各探针固定在膜芯片上，最后将扩增产物与探针杂交后使用显色液显色，并通过肉眼或成像仪观察检测结果。如果样品中有相应的过敏原成分则扩增出的PCR产物与对应的探针杂交，并被显色观察，实现检出效果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括内参引物对，其包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物。

该内参引物对可检测植物的叶绿体tRNA-Leu(trnL)基因，该内参引物对包括SEQID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.21-29所示的探针中的一种或多种。

各探针对应的扩增产物分别如下：

SEQ ID NO.21为花生探针，可与第一引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.22为胡桃探针，可与第二引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.23为开心果探针，可与第三引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.24为芝麻探针，可与第四引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.25为榛果探针，可与第五引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.26为大豆探针，可与第六引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.27为杏仁探针，可与第七引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.28为腰果探针，可与第八引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.29为胡萝卜探针，可与第九引物对的PCR产物杂交。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述膜芯片上还固定内参探针(trnL 探针)，其碱基序列如SEQ ID NO.30所示。该内参探针可与内参引物对的PCR 产物杂交结合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述膜芯片上还固定有如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

所述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.31所示；

所述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.32所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.33所示。

阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针结合，而不与阴性探针结合。因此，在膜芯片上的阳性探针位置有斑点而阴性探针位置没有斑点说明杂交结果可靠，检测结果更可信。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

存在于上游引物的5’端或下游引物的5’端的标记物可以使得扩增产物带有相应的标记物，当PCR产物与探针结合后，通过该标记物扩增产物易于与带有对应标记物的催化酶相结合，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应探针位置是否有相应的扩增产物，进而可判断样本中的食源性植物过敏原成分类别。

当引物的5’端的标记物为生物素时，则可采用由碱性磷酸酶标记的催化酶(Streptavidin，SA)来进行显色反应。生物素与链霉亲和素具有极高的亲和力，反应呈高度专一性。每个链霉亲和素分子具有4个生物素分子结合位点，因此，链霉亲和素可同时以多价形式结合生物素。生物素标记的引物与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素联合使用，将检测信号级联放大，最后通过显色反应或化学发光可检测。

相应的，当引物的5’端的标记物为异硫氰酸荧光素时，则可采用由异硫氰酸荧光素抗体标记的催化酶来进行显色反应。当引物的5’端的标记物为地高辛，则可采用由地高辛抗体标记的催化酶来进行显色反应。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该检测试剂盒还包括PCR反应组分和配液；

其中，PCR反应组分包括UNG酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR 缓冲液中的至少一种。

使用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)移除DNA中的尿嘧啶，在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNG酶敏感，所以可以在PCR前对新配制的反应体系用UNG酶处理，一定程度上杜绝气溶胶污染。dNTPs作为PCR反应的原料，应用于以原DNA 为模板合成新的DNA序列；通过TaqDNA聚合酶的作用，DNA链更容易打开，使反应更容易进行；Mg²⁺作为TaqDNA聚合酶的活化剂，可以激活TaqDNA聚合酶的功能；PCR反应缓冲液，使反应在一个稳定的环境中反应，避免影响 TaqDNA聚合酶的活性，进而影响反应的进行。PCR反应缓冲液使得反应顺利的进行。

另外，配液包括去活化液、去活化清洗液、杂交液、杂交清洗液、催化酶液、酶标液、酶标清洗液1、酶标清洗液2、显色液和显色清洗液。

其中，去活化液包括100mmol/L的NaOH，去活化清洗液包括2×SSPE 和0.1％SDS；杂交液包括2×SSPE和0.1％SDS；杂交清洗液包括2×SSPE和 0.5％SDS；酶标液包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标清洗液1包括2×SSPE和 0.5％SDS；酶标清洗液2包括1M Tris-HCl,pH9.5，5M NaCl，1M MgCl₂。

催化酶液为含有碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶，其用链霉亲和素、异硫氰酸荧光素抗体或地高辛抗体标记。在使用时，将催化酶液以合适比例加入到酶标液混合。

SSPE(Saline sodium phosphate EDTA，SSPE)缓冲液是一种常见的核酸杂交缓冲液；SSPE缓冲液包括NaCl、NaH₂PO₄·H₂O(或NaH₂PO₄·2H₂O)和 EDTA-Na₂。

配制1L的SSPE缓冲液的方法如下：用800mL蒸馏水溶解17.53g的NaCl， 27.6g的NaH₂PO₄·H₂O(或31.2g的NaH₂PO₄·2H₂O)和7.4g的EDTA-Na₂，再用10M的NaOH大约6mL调节pH值至7.4，然后定容至1L，过滤后高压蒸汽灭菌。

通过使用上述的各种配液，清除杂质，排除干扰，使结果更准确、清晰可靠。

显色液含有被催化酶催化反应进而显色的底物。

当催化酶是碱性磷酸酶时，显色液为碱性磷酸酶的化学显色底物 NBT/BCIP，含0.15mg/mL BCIP，0.30mg/mL NBT，100mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，pH 9.5)；显色清洗液为双蒸水。

需要说明的是，在其他的一些实施例方案中，碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶代替。

当催化酶为辣根过氧化物酶时，显色液含有的底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS (2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑 -6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任一种。TMB、 ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应，使得检测结果可视化。

或者用，葡萄糖氧化酶代替碱性磷酸酶，底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢，后者可通过辣根过氧化物酶 -TMB显色系统进行检测。

总之，该检测试剂盒能够同时对常见的食源性植物过敏原成分例如花生、胡桃、开心果、芝麻、榛果、大豆、杏仁、腰果和胡萝卜等进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量、操作便捷等特点。

另一方面，本发明提供了一种食源性植物过敏原成分的检测方法，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有内参引物对和如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物的用于检测胡萝卜成分的第九引物对；

每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比大于1。

非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比为1.2-1.7。

优选的，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比为1.5。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR反应体系还含有内参引物对，该内参引物对包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物。内参引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物，其标记物的类型和其他检测引物的类型相同。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR反应体系还含有用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.33所示。阳性寡核苷酸单链DNA分子的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物，其标记物的类型和其他检测引物的类型相同。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述PCR扩增反应之后，所述方法还包括：杂交步骤；

所述杂交步骤包括：将由所述PCR扩增反应得到的PCR反应产物与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.21-29所示的探针中的一种或多种。

将探针负载于膜芯片上，探针与PCR产物杂交，然后通过探针和引物上标记的标记物显色；通过显色反应，可以直接肉眼判定实验结果；方法简单易行。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述膜芯片选自硝酸纤维素膜、尼龙膜和具有三维孔径结构的薄膜中的任意一种。

选用硝酸纤维素膜、尼龙膜或具有三维孔径结构的薄膜中的一种作为支持膜，方便将探针负载于膜上制备膜芯片；如具有三维孔径结构的薄膜可以方便的将探针分子吸附固定在薄膜上，便于后续的反应的进行。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，膜芯片上固定有碱基序列如SEQ IDNO.30所示的内参探针。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，膜芯片上固定有碱基序列如SEQ IDNO.31所示的阳性对照探针和碱基序列如SEQ ID NO.32所示的阴性对照探针。

总之，该检测方法能够同时对常见的食源性植物过敏原成分例如花生、胡桃、开心果、芝麻、榛果、大豆、杏仁、腰果和胡萝卜等成分进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量、结果易于观察等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的各探针固定在膜芯片上的位置示意图。

图2为本发明实施例3中的检测结果。

图3为本发明实施例4中的检测结果。

图4为本发明实施例5中的检测结果。

图5为本发明实施例6中的检测结果。

图6为本发明实施例7中的检测结果。

图7为本发明实施例8中的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的食源性植物过敏原成分的检测试剂盒包括核酸组合和膜芯片，其中，核酸组合包括10种引物对和阳性寡核苷酸单链DNA，各引物对如下：

用于检测花生成分的第一引物对，其可扩增花生Arah3基因：

其包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；

用于检测胡桃成分的第二引物对，其可扩增胡桃Jug r2基因：

其包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；

用于检测开心果成分的第三引物对，其可扩增开心果18S rRNA与5.8S rRNA基因间区序列：

其包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；

用于检测芝麻成分的第四引物对，其扩增芝麻2S albumin mRNA基因序列：

其包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；

用于检测榛果成分的第五引物对，其扩增榛果oleosin基因：

其包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；

用于检测大豆成分的第六引物对，扩增大豆Lectin基因：

其包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；

用于检测杏仁成分的第七引物对，扩增杏仁Pru dul基因：

其包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；

用于检测腰果成分的第八引物对，扩增腰果ana o 3基因：

其包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；

用于检测胡萝卜成分的第九引物对，扩增胡萝卜afp基因；

其包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物。

另外，针对植物叶绿体trnL基因的内参引物对包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物。

阳性寡核苷酸单链DNA的碱基序列如SEQ ID NO.33所示。

每个引物对中的下游引物的5’端以及阳性寡核苷酸单链DNA的5’端带有生物素标记。

需要说明的是，在其他的实施例中，核酸组合可以包括第一至第九引物对中的一种或两种或三种或四种或五种或六种或七种或八种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

膜芯片上固定有探针，探针包括12种，各探针的碱基序列(5’-3’)如下：

上述12种探针按图1所示的位置顺序地分别固定在支持膜上的相应位置。在其他的实施例中，探针的固定顺序可与本实施例有所不同。

其中，上述膜芯片制作方法可参考如下方法：

用打印机在膜上打印出表格后把尼龙膜浸泡于50mL含有0.5％-5％(体积：体积)戊二醛的PBS溶液中，摇床缓慢摆动孵育2小时；随后在PBS中洗膜4 次，一次50mL，每次5分钟；最后将膜放在空气中干燥并密封保存。

同时用0.5M NaHCO₃，pH8.4调整探针(其5’端用氨基修饰)浓度至10μ M，将阳性对照探针和阴性对照探针分别稀释到5μM；并将各检测探针、阳性对照探针和阴性对照探针依次点样在尼龙膜上。点好探针的膜芯片放入烘箱中， 80℃烘烤2小时备用。

膜芯片的探针位置模式图如图1所示，PC表示阳性对照(Positive Control)； NC表示阴性对照(Negative Control)。

需要说明的是，在其他的实施例中，膜芯片上固定的探针可以是上述12种的一种或多种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

实施例2

采用实施例1的检出试剂盒检测食源性植物过敏原成分的方法，具体如下：

2.1提取待测样本的基因组DNA，并用微量核酸测定仪测定样本核酸浓度，得到待测样本的DNA模板。

2.2多重PCR体系和条件

PCR扩增的反应体系：10×PCR Buffer(含Mg²⁺，含UNG酶):5μL；

dNTP(2.5mM each)：5μL；

带生物素标记的下游引物(20μM)：1.5μL；上游引物(20μM)：1μL；(说明： 13种引物对(实施例1提供的)都加入，每个引物对的下游引物1.5μL，上游引物1μL；

待测样本的DNA模板：100ng；

阳性寡核苷酸DNA((20μM)):0.01μL；

加ddH₂O至总体积50μL。

对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由预变性、多重PCR循环组成，条件分别为：

UNG酶消化反应：温度37℃，时间5分钟

多重PCR：

预变性：温度95℃，时间3分钟；PCR循环：35个循环组成：变性：温度 95℃，时间15秒；退火：温度55℃，时间30秒；延伸：温度72℃，时间15 秒；最后延伸：温度72℃，时间3分钟；保存：温度4℃。

2.3膜芯片杂交：

反应结束后，将PCR产物95℃热变性5分钟，冰浴5min以上。取冷却后的PCR产物20μL加入杂交液中，进行膜芯片斑点杂交检测，依次自动完成去活化、去活化清洗、杂交、杂交清洗、酶标、酶标清洗、显色、显色清洗等步骤，进行膜芯片杂交检测。杂交过程如下：

(1)将固定有探针的膜芯片(实施例1提供的膜芯片)放入杂交盒中，芯片标签正面朝上，加入去活化液(100mmol/L NaOH)1mL，37℃孵育8min；

(2)加入去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)1mL，60℃孵育5min；

(3)吸除去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)，加入杂交体系液(将PCR 后产物变性后加入杂交液(2×SSPE，0.1％SDS)中混合)1mL，45℃水平摇床 90rpm孵育45min；

(4)吸除杂交体系液，加入预热好的杂交清洗液(2×SSPE，0.5％SDS)1 mL，52℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(5)吸除杂交清洗液，加入预热好的酶标液(链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(1mg/mL)，按1:2000的比例加入到999.5μL的酶标液(2×SSPE，0.5％SDS) 中)，42℃水平摇床90rpm，震荡孵育30min；

(6)吸除酶标液，加入预热好的酶标清洗液1(2×SSPE，0.5％SDS)1mL， 42℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(7)吸除酶标清洗液1，加入预热好的酶标清洗液2(含：0.3mol/L NaCl， 20mmol/LNaH₂PO₄，20mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.4)1mL，37℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(8)吸除酶标清洗液2，加入显色液(含BCIP/NBT的混合物，即5-溴-4- 氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰)1mL，室温静置显色15min。

(9)吸除显色液，加入去离子水1mL室温洗涤2次，待膜芯片干燥后进行结果判读。具体杂交流程如表1。

表1自动杂交仪测定过程

程序	试剂	温度(℃)	时间(min)
				去活化	去活化液	37	8
去活化清洗	去活化清洗液	60	5
				杂交	杂交液	45	45
杂交清洗	杂交清洗液	52	5
				杂交清洗	杂交清洗液	52	5
酶标	酶标液	42	30
				酶标清洗1	酶标清洗液1	42	5
酶标清洗1	酶标清洗液1	42	5
				酶标清洗2	酶标清洗液2	37	5
酶标清洗2	酶标清洗液2	37	5
				显色	显色液	37	15
显色清洗	去离子水	37	5
				显色清洗	去离子水	37	5

其中：去活化液包括100mmol/L的NaOH，去活化清洗液包括2×SSPE 和0.1％SDS；杂交液包括2×SSPE和0.1％SDS；杂交清洗液包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标液包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标清洗液1包括2×SSPE和 0.5％SDS；酶标清洗液2包括1M Tris-HCl,pH9.5，5M NaCl，1M MgCl₂。

配制1L的SSPE缓冲液的方法如下：用800mL蒸馏水溶解17.53g的NaCl， 27.6g的NaH₂PO₄·H₂O和7.4g的EDTA-Na₂，再用10M的NaOH大约6mL调节 pH值至7.4，然后定容至1L，过滤后高压蒸汽灭菌。

显色液为碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP，含0.15mg/mL BCIP，0.30 mg/mLNBT，100mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl2，pH 9.5)；显色清洗液为双蒸水。

(10)结果分析：

在实际的样本检测过程中，应当设置空白对照、阴性对照、阳性对照，提高检测结果的准确性。

a)空白对照：使用水作为空白对照样本作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，其余靶点不显色；

b)阴性对照：使用阴性对照样本(除花生，胡桃，开心果，芝麻，榛果，大豆，杏仁，腰果，胡萝卜以外的植物DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色；

c)阳性对照：使用阳性对照样本(含花生，胡桃，开心果，芝麻，榛果，大豆，杏仁，腰果，胡萝卜中的一种食源性植物过敏原成分的或多种食源性植物过敏原成分的混合的DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色，相应靶点显色(例如是阳性对照样本含花生，则在膜芯片花生靶点区域有显色)；

同时满足以上三个条件的为有效实验，则可根据显色结果判断待测样本是否为常见的食源性植物过敏原成分(花生，胡桃，开心果，芝麻，榛果，大豆，杏仁，腰果，胡萝卜中，或其混合)。

需要说明的是：可通过肉眼判读结果，也可采用扫描仪判读结果，以减少人为主观判读带来的误差。扫描仪判读软件根据大量数据统计各靶点信号值，设定各靶标阈值，若信号值大于阈值判定为阳性，小于阈值判定为阴性。

实施例3

取市场购买的花生，胡桃，开心果，芝麻，榛果，大豆，杏仁，腰果和胡萝卜种子或块茎DNA为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图2所示，从图2结果可以看出，每种食源性植物过敏原成分均被检测出，各样本相互之间无交叉反应，说明实施例1的试剂盒具有较好的特异性。

实施例4

按照天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(货号： DP305)的说明提取等量的花生、胡桃、开心果、芝麻、榛果、大豆、杏仁、腰果和胡萝卜混合样品的基因组DNA，以此为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图3所示，从图3结果可以看出，该样品为植物，并且含有植物过敏原花生、胡桃、开心果、芝麻、榛果、大豆、杏仁、腰果和胡萝卜成分。说明实施例1的试剂盒具有较好的特异性和灵敏度，可以将混合样品中的每种成分都检测出。

实施例5

按照天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(货号： DP305)的说明提取不含食源性植物过敏原成分的样本猪基因组DNA，以此为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图4所示，从图4结果可以看出，该样本中不含植物成分。

实施例6

按照天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(货号： DP305)的说明提取饼干样品基因组DNA。以此为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图5所示，从图5结果可以看出，该样品含植物成分，具体为植物过敏原花生、胡桃、开心果、榛果、大豆成分。

实施例7

按照天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(货号： DP305)的说明提取燕麦基因组DNA。以此为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图6所示，从图结果可以看出，该样品含植物成分，但不含本芯片所列植物过敏原成分，与预期结果相符。

实施例8

按照天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(货号： DP305)的说明提取开心果基因组DNA。使用微量核酸测定仪测定浓度后将核酸梯度稀释至浓度为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，0.1ng/μL，并以此为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图7所示。从图结果可以看出，该试剂盒检测开心果核酸时，最低在0.1ng/μL时可以检测到，即该试剂盒检测开心果核酸的绝对灵敏度可达0.1ng/μL。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川华汉三创生物科技有限公司

<120> 一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒和方法

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcgtccctag ccctctggta aa 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tattcagtcc cgttctcgtc 20

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<213> 人工序列

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cgctattgtg acctcctcgg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtgaagttga aggaagcgg 19

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<212> DNA

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gtttcttcca ctgcctcttc ta 22

<210> 14

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cagccttaac atcctcttcc tt 22

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<212> DNA

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cctcctatct gccttcgc 18

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tgggagacct accatacc 18

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<212> DNA

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cctgagaagt caagcctaat 20

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ggggatagag ggacttgaac 20

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<212> DNA

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<400> 22

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ctccacccgt gcttcgtcgg gtgtcggt 28

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgacctaca ccaccactgt gacca 25

<210> 25

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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taacgcctcc atttaccgag ccattgt 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctccccaatc ttttcggaaa aatcccaga 29

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<212> DNA

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aagtgrkaac ttycaaattc agagaaaccc yggaat 36

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<212> DNA

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gcatccagat cagaagcaat aatgagcagt gcgagaagaa cgagtgtcca aagtaccag 59

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<212> DNA

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ggttccttga gaaatgtttt acgggattac ttccatgttt gttggatgat cctattttc 59

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ctggtacttt ggacactcgt tcttctcgca ctgctcatta ttgcttctga tctggatgc 59

Claims

1.一种食源性植物过敏原成分的检测试剂盒，其特征在于，其包括核酸组合，所述核酸组合如下：

所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.21-29所示的探针。

2.根据权利要求1所述的食源性植物过敏原成分的检测试剂盒，其特征在于，所述膜芯片上还固定有如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

所述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.31所示；

所述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.32所示。

3.根据权利要求2所述的食源性植物过敏原成分的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO.33所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的食源性植物过敏原成分的检测试剂盒，其特征在于，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

5.一种食源性植物过敏原成分的检测方法，其特征在于，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对组合：

每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物;

在所述PCR扩增反应之后，所述方法还包括：杂交步骤；

其中，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.21-29所示的探针。

6.根据权利要求5所述的食源性植物过敏原成分的检测方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比大于1。

7.根据权利要求6所述的食源性植物过敏原成分的检测方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比为1.2-1.7。

8.根据权利要求5所述的食源性植物过敏原成分的检测方法，其特征在于，所述膜芯片选自硝酸纤维素膜、尼龙膜和具有三维孔径结构的薄膜中的任意一种。