CN109280697A

CN109280697A - 利用孕妇血浆游离dna进行胎儿基因型鉴定的方法

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Publication number: CN109280697A
Application number: CN201710597335.XA
Authority: CN
Inventors: 姜正文; 刘超; 杨锋
Original assignee: Tian Hao Biomedical Technology (suzhou) Co Ltd
Current assignee: Tian Hao Biomedical Technology (suzhou) Co Ltd
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2019-01-29
Anticipated expiration: 2037-07-20
Also published as: CN109280697B

Abstract

本发明提供了利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法，具体地本发明的方法使用高精确性的二代测序平台，避免对目标区域富集、建库等繁琐操作，克服了现有基于直接测序的检测技术操作复杂、费用昂贵、准确性不高的缺陷，是一种简单快速、低成本、高精确性的血浆游离DNA胎儿基因型的检测技术，在无创产前诊断等领域将会有广泛的应用前景。

Description

利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法。

背景技术

随着对遗传病分子基础认识的不断深入，检测特异基因突变的技术能力不断提高，为发展以DNA检测为基础的无创产前诊断提供了理论和技术基础。1997年Lo等利用传统聚合酶链反应(PCR)首次发现在孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA，不久其他学者也证实了游离胎儿DNA的存在，并已显示出其潜在的临床应用价值。

胎儿游离DNA被认为是来源于胎盘滋养层细胞的破裂或是从自然凋亡的胎儿细胞中释放出来的。通过对妊娠期、产后妇女血浆中胎儿细胞内DNA和胎儿游离DNA的比较发现，59％孕妇在孕5-8周时血浆中即能检测到胎儿游离DNA，在孕7-16周时明显升高，并随孕周增加。这种胎儿游离DNA的存在为无创伤性产前诊断提供了一种新途径。

因此，胎儿DNA基因型检测的技术方法开始受到研究者的广泛关注。无创产前诊断的最大难点在于胎儿游离DNA仅占母血总DNA的10％左右。因此，从母亲DNA背景下准确的判断胎儿基因型比较困难。

为了有效地开展单基因遗传病的无创产前诊断，本领域迫切需要开发利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的新技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种基因型鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供针对多个待检测位点的多重PCR引物；

(2)提供待测DNA、参照DNA和任选地用于位点扩增效率校正的校正DNA；其中，所述待测DNA为孕妇血浆中提取的DNA；所述参照DNA为孕妇血液白细胞中提取的基因组DNA；所述校正DNA为一个或多个正常人的基因组DNA；

(3)使用步骤(1)提供的所述多重PCR引物，对相同质量的待测DNA样本和参照DNA样本分别进行多重PCR扩增；

(4)对步骤(3)获得扩增产物进行高通量平行(二代)测序；

(5)分析步骤(4)获得的测序数据，进行测序序列的基因位点归类，统计步骤(2)中所述每个样本中每个目标位点等位基因的测序深度；

在待测DNA样本，一个目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：N1，Allele2：N2；参照DNA样本中，对应的目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：M1，Allele2：M2；校正DNA样本中，目标位点基因型为杂合的两个等位基因测序深度的平均值或中位数分别为Allele1：Q1，Allele2：Q2；

(6)对参照DNA和待测DNA中等位基因的比例进行统计比较；

假设某基因位点母亲的基因型为杂合Aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为Aa；若胎儿与母亲有显著差异，且N1/N2>M1/M2则胎儿基因型为AA，反之为aa；

假设母亲基因型为纯合AA，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为AA；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa；

假设母亲基因型为纯合aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度与母亲无显著差异，则胎儿基因型为aa；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(7)，对每个不同目标位点重复步骤(6)进行独立计算和评判。

在另一优选例中，所述多重PCR引物中，每对引物5’端部分序列是与第二轮PCR扩增引物相一致的通用序列，3’端部分序列为与待检测位点所在区域特异性结合的序列。

在另一优选例中，所述多重PCR引物扩增的基因组区域大小为10-200bp。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述校正DNA为10个以上(更优选地，20个以上；最优选地，30个以上，如40个、50个、100个)正常人的基因组DNA。

在另一优选例中，所述步骤(3)中分别进行两轮PCR扩增。

在另一优选例中，所述步骤(4)中，高通量平行测序(二代测序)时对第二轮PCR扩增产物进行高通量高深度双端测序。

在另一优选例中，所述步骤(4)中，高通量平行测序(二代测序)的测序读长≤250bp(优选地为50-250bp；更优选地为70-250bp；最优选地为100-250bp)，平均测序深度≥1000重(≥1000X；优选地≥1500X；更优选地≥2000X；最优选地≥5000X)。

在另一优选例中，所述步骤(4)中，针对多重PCR得到的扩增产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对其进行扩增；优选地，PCR引物包括一段数个至数十个碱基长度的标签序列，对来自不同样本的多重扩增产物可以用带不同标签序列的PCR引物进行扩增，从而使得来自不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去。

在另一优选例中，所述步骤(5)中，如果测序数据包括多个样本的数据，则步骤(5)中还包括对测序序列进行样本归类；

首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上，统计每个目标位点等位基因的测序深度；同一条PCR扩增产物首尾两端所产生的序列进行相互比对以降低测序错误率：若两条序列在目标位点处的碱基组成一致则计入统计，若不一致则丢弃。

在另一优选例中，所述步骤(6)中，统计比较方法包括步骤：

(a)计算胎儿DNA在游离DNA中的比例，针对参照DNA样本中母亲基因型为纯合的目标位点，使用公式min(N1,N2)/(N1+N2)*2*K；若N1<N2，则K＝Q2/Q1；若N2<N1，则K＝Q1/Q2；选取所有结果大于0.5％的数值并求得平均值或中位数，即为胎儿比例F；

(b)计算参照DNA中等位基因Allele2的比例Control％＝M2/(M1+M2)；计算待测DNA中等位基因Allele2的比例Plasma％＝N2/(N1+N2)；若Plasma％＝0或1，则胎儿基因型与母亲基因型相同且均为纯合；若Plasma％≠0且Control％＝0，则赋值min(M1,M2)＝n(优选地，n为远小于1000的正整数；如1-100之间的正整数；更优选地为1-10之间的正整数)并重新计算Control％；当Plasma％和Control％均不为0，但Plasma％小于Control％，则Control％＝M1/(M1+M2)，Plasma％＝N1/(N1+N2)；若Plasma％大于Control％，则进行c步计算；

(c)赋值q0＝Control％，当0.2≤q0≤0.8时，q1＝q0+(1-q0)*F；当q0<0.2时，q1＝F/2；当q0>0.8时，q1＝0.99999999；用q0和q1值进行如下计算：d＝(1-q1)/(1-q0)，g＝q1*(1-q0)/(q0*(1-q1))，Upper limit＝(ln(Z)/(N1+N2)-ln(d))/ln(g)，Lower limit＝(ln(1/Z)/(N1+N2)-ln(d))/ln(g)，Z为大于等于8的整数；

(d)比较Plasma％与Upper limit、Lower limit的值的大小关系，若Plasma％>Upper limit，则胎儿目标位点基因型与母亲有显著差异；若Plasma％<Lower limit，则胎儿目标位点基因型与母亲无显著差异；若Lower limit≤Plasma％≤Upper limit，则结果为无法判定。

在另一优选例中，所述步骤(6)中，统计比较方法包括步骤：

首先计算理论卡方P值，即假设在该目标位点胎儿基因型与母亲不同(母亲纯合、胎儿杂合或母亲杂合、胎儿纯合)，在当前的测序深度和胎儿比例下是否能够得到显著性结果；计算方法如下：

(b)计算血浆DNA的测序深度D＝M1+M2；

(c)对母亲纯合的位点，参照样本的两个等位基因理论测序深度分别为D，0；血浆样本对应的两个等位基因理论测序深度分别为D*(1-F/2)，D*F/2；

(d)对母亲杂合的位点，参照样本的两个等位基因理论测序深度分别为D/2，D/2；血浆样本对应的两个等位基因理论测序深度分别为D*(1+F)/2，D*(1-F)/2；

(e)对上述的两种情况分别进行卡方检验计算P值，若P≤0.001则该位点检测结果有效，否则为无法判定；卡方检验公式如下：

P＝CHIDIST(χ²,df)

(f)对所有有效结果，根据参照样本与血浆样本在目标位点的实际测序深度进行P值计算:

当P>0.01时，胎儿目标位点基因型与参照样本无显著差异

当0.001<P<0.01之间时，无法判定

当P≤0.001时，胎儿目标位点基因型与参照样本有显著差异。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的。

在另一优选例中，所述方法用于利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定。

本发明的第二方面，提供了一种利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的系统，所述系统包括多重PCR扩增单元、二代测序单元和数据处理单元，其特征在于，所述系统被设置为执行本发明第一方面所述的方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的检测原理。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法，该方法使用高精确性的二代测序平台，避免对目标区域富集、建库等繁琐操作，克服了现有基于直接测序的检测技术操作复杂、费用昂贵、准确性不高的缺陷，是一种简单快速、低成本、高精确性的血浆游离DNA胎儿基因型的检测技术，在无创产前诊断等领域将会有广泛的应用前景。

具体地，本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种利用孕妇血浆DNA进行胎儿基因型鉴定的无创检测技术，该技术通过多重PCR扩增以及高通量高深度测序，可对多个样本的多个待检测位点进行平行测序，以母亲血液细胞中的基因组DNA(不含胎儿游离DNA)作为参照，通过统计学方法如序概率比检验(SPRT)、卡方检验(Chi-squared test)进行等位基因比例的差异性分析，判断胎儿在待测位点的基因型与母亲基因型是否存在显著性差异，进而判断出胎儿在待检测位点的基因型。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

从母亲DNA背景下准确的判断胎儿基因型，将有助于开展单基因遗传病的无创产前诊断。主要的几种检测方法简述如下。

一、基于毛细电泳检测的测定方法

一种是基于Sanger测序的检测技术，该方法主要是获取妊娠母血后进行离心，对于获得的血浆进行游离DNA的分离和纯化，然后针对待检测位点设计引物扩增后进行直接测序，当检测的位点在母体中是纯合子时，可通过测序结果中是否存在有微量区别于母体的等位基因，判断胎儿和母亲基因型是否存在差异。另一种是基于荧光标记的特异性核苷酸终止延伸的方法，该方法主要是针对待检测位点设计扩增引物进行目的片段PCR扩增，再针对待检测位点设计特异性延伸引物，根据待检测位点序列特点，有选择性的利用荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)中的一种替换单脱氧核苷酸(dNTP)中对应的一种核苷酸，当胎儿游离DNA中存在与母体纯合子位点不同的基因型时，延伸不会在目标位点位置终止，而是会在目标位点下游数个碱基的位置终止，通过毛细管电泳检测出微量的信号。这些方法的缺陷在于仅适用于待检测位点在母体中为纯合子状态，而且毛细电泳检测背景较高时也会导致检测结果不准确，且仅适用与点突变检测。

二、基于连接标记、扩增的高通量测序技术的检测方法

2014年Lv.W等通过循环单分子扩增和重测序技术(cSMART)对四个具有Wilson疾病家族病史的家族进行研究。确定了每个家族的致病性ATP7B基因突变，并对先证者的患病原因进行了确认。通过模拟的血浆模型(模仿胎儿父亲、母亲或双亲等位基因突变的血浆模型)验证cSMART法之后，显示第二次妊娠取得了侵入性产前诊断和无创产前检测(NIPT)胎儿基因型一致的检测结果。该方法主要是通过对外周血中游离DNA片段进行标记、环化、扩增和高通量测序，并采用独特计数方式，能够准确、定量地分析外周血中游离DNA片段所携带的多种突变。虽然该方法敏感性和特异性较高，但其缺陷在于对DNA提取的质量要求较高，另外该方法依赖于复杂的文库构建流程，检测结果受到环化连接效率影响。

三、基于digital PCR的检测方法

20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析和定量。

2011年Nancy B.Y.Tsui等利用数字PCR开发出一个基于相对突变剂量(RMD)的方法，从12个血友病高危妊娠孕妇血浆样本中准确的检测出胎儿基因型。该方法需要使用数字PCR平台，增加了操作难度和检测成本。

本发明提供的一种利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法，使用高精确性的二代测序平台，避免对目标区域富集、建库等繁琐操作。二代平台主要是指illumina的Miseq平台，一次测序反应可以产生两千五百万个300bp读长的双端序列(15Gb的数据)。采用的原理是基于illumina边合成边测序(SBS)的高通量平行测序技术，通过桥式PCR扩增和4种含有末端阻断基团的不同荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)进行模板互补链合成，通过读取荧光信号获得被测DNA序列。

本发明提供了一种对孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定检测技术，其技术方案如下：

(1)针对多个待检测位点，设计对应的多重PCR引物，每对引物5’端部分序列是与第二轮PCR扩增引物相一致的通用序列，3’端部分为与待检测位点所在区域特异性结合的序列。被扩增的基因组区域大小为10-200bp；

(2)从要检测的孕妇血浆中提取DNA(以下简称待测DNA)；从孕妇血液白细胞中提取基因组DNA(以下简称参照DNA)；选取30个以上正常人的基因组DNA(以下简称校正DNA)，用于位点扩增效率的校正，对同一位点只需进行一次校正；

(3)使用(1)所述多重PCR引物，对相同质量的待测DNA样本和参照DNA样本分别进行多重PCR扩增；

(4)上述多重PCR得到的扩增产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对其进行扩增，通常情况下，PCR引物还有一段数个至数十个碱基长度的标签序列，来自不同样本的多重扩增产物可以用带不同标签序列的PCR引物进行扩增，使得来自不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去；

(5)对第二轮PCR扩增产物进行高通量高深度双端测序，测序读长不超过250bp，平均测序深度大于1000重(>1000X)；

(6)对测序数据进行分析，实现测序序列的样本归类，基因位点归类：首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上，统计每个目标位点等位基因的测序深度。同一条PCR扩增产物首尾两端所产生的序列进行相互比对以降低测序错误率：若两条序列在目标位点处的碱基组成一致则计入统计，若不一致则丢弃；

(7)在待测DNA样本，一个目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：N1，Allele2：N2，参照DNA样本中，对应的目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：M1，Allele2：M2；校正DNA样本中，目标位点基因型为杂合的两个等位基因测序深度的平均值或中位数分别为Allele1：Q1，Allele2：Q2：

1.使用序概率比检验(SPRT)对参照DNA和目标DNA中等位基因的比例进行统计学比较，方法如下：

a.计算胎儿DNA在游离DNA中的比例，针对参照DNA样本中母亲基因型为纯合的目标位点，使用公式min(N1,N2)/(N1+N2)*2*K。若N1<N2，则K＝Q2/Q1；若N2<N1，则K＝Q1/Q2。选取所有结果大于0.5％的数值并求得平均值或中位数，即为胎儿比例F；

b.计算参照DNA中等位基因Allele2的比例Control％＝M2/(M1+M2)；计算待测DNA中等位基因Allele2的比例Plasma％＝N2/(N1+N2)。若Plasma％＝0或1，则胎儿基因型与母亲基因型相同且均为纯合；若Plasma％≠0且Control％＝0，则赋值min(M1,M2)＝1并重新计算Control％。当Plasma％和Control％均不为0，但Plasma％小于Control％，则Control％＝M1/(M1+M2)，Plasma％＝N1/(N1+N2)；若Plasma％大于Control％，则进行c步计算；

c.赋值q0＝Control％，当0.2≤q0≤0.8时，q1＝q0+(1-q0)*F；当q0<0.2时，q1＝F/2；当q0>0.8时，q1＝0.99999999。用q0和q1值进行如下计算：d＝(1-q1)/(1-q0)，g＝q1*(1-q0)/(q0*(1-q1))，Upper limit＝(ln(Z)/(N1+N2)-ln(d))/ln(g)，Lower limit＝(ln(1/Z)/(N1+N2)-ln(d))/ln(g)，Z为大于等于8的整数。

d.比较Plasma％与Upper limit、Lower limit的值的大小关系，若Plasma％>Upper limit，则胎儿目标位点基因型与母亲有显著差异；若Plasma％<Lower limit，则胎儿目标位点基因型与母亲无显著差异；若Lower limit≤Plasma％≤Upper limit，则结果为无法判定。

2.使用卡方检验对参照DNA和目标DNA中等位基因的比例进行统计学比较，方法如下：

首先计算理论卡方P值，即假设在该目标位点胎儿基因型与母亲不同(母亲纯合、胎儿杂合或母亲杂合、胎儿纯合)，在当前的测序深度和胎儿比例下是否能够得到显著性结果。计算方法如下：

b.计算血浆DNA的测序深度D＝M1+M2；

c.对母亲纯合的位点，参照样本的两个等位基因理论测序深度分别为D，0；血浆样本对应的两个等位基因理论测序深度分别为D*(1-F/2)，D*F/2。

d.对母亲杂合的位点，参照样本的两个等位基因理论测序深度分别为D/2，D/2；血浆样本对应的两个等位基因理论测序深度分别为D*(1+F)/2，D*(1-F)/2。

e.对上述的两种情况分别进行卡方检验计算P值，若P≤0.001则该位点检测结果有效，否则为无法判定。卡方检验公式如下：

P＝CHIDIST(χ²,df)

f.对所有有效结果，根据参照样本与血浆样本在目标位点的实际测序深度进行P值计算:

当P>0.01时，胎儿目标位点基因型与参照样本无显著差异

当0.001<P<0.01之间时，无法判定

当P≤0.001时，胎儿目标位点基因型与参照样本有显著差异

(8)假设某基因位点母亲的基因型为杂合Aa，待检样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿与母亲无显著差异，则胎儿基因型即为Aa；若胎儿与母亲有显著差异，且N1/N2>M1/M2则胎儿基因型为AA，反之为aa；假设母亲基因型为纯合AA，若胎儿与母亲无显著差异，则胎儿基因型为AA；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa；假设母亲基因型为纯合aa，若胎儿与母亲无显著差异，则胎儿基因型为aa；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa。

(9)对每个不同目标位点重复以上步骤进行独立计算和评判。

本技术发明使用了高精确性的二代测序平台，却避免了对目标区域富集、建库等繁琐操作，克服了现有基于直接测序的检测技术操作复杂、费用昂贵、准确性不高的缺陷，是一种简单快速、低成本、高精确性的血浆游离DNA胎儿基因型的检测技术，在无创产前诊断等领域将会有广泛的应用前景。

本发明的主要优点在于：

1、快速检测：在选取特定的目标位点并设计对应的多重PCR引物后，只要将待测DNA与参照DNA分别进行两轮PCR扩增，然后进行高通量测序；

2、多个位点同时检测：由于采用了多重PCR体系，一个反应可以同时扩增20个以上的目标位点，这就使得检测通量大大提高。

3、应用灵活：针对任意需要检测的目标位点能够快速建立检测体系。

4、成本控制：针对选取特定的目标位点进行高通量测序，与全基因组和全外显子测序相比，能大大降低检测成本，更加经济有效。

5、高精确性：采用高深度测序，并且利用双端测序序列进行相互比对以降低测序错误率。对母体血浆DNA中胎儿基因型的检测极为准确，在无创产前诊断领域的应用具有极大潜力。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

配置模拟孕妇血浆游离DNA样本对本发明所述的技术进行胎儿基因型检测验证。

选取29个高频SNP位点，使用多重PCR进行扩增，扩增产物经过第二轮PCR在两端添加适合高通量测序的接头序列。SNP位点及多重PCR引物序列信息如表1。实验中使用的正向和逆向引物分别在5’端加上了与第二轮PCR引物特异性结合的通用序列。正向引物5’端的通用序列为：CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.1)；逆向引物5’端的通用序列为：TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.2)。

表1目标SNP位点及多重PCR引物序列

一、原始样本

本实施例所用到的样本有以下2种：

1.母亲基因组DNA样本；

2.子代基因组DNA样本；

二、样本配置与检测方法

将母亲与子代基因组DNA样本用超声波(Covaris)随机片段化，打碎的DNA分子经2100-生物分析仪检测表明片段化效率无明显差异。使用Qubit荧光光度计对两组片段化后的DNA进行精确定量，配置模拟孕妇血浆游离DNA的待测样本，使得子代DNA比例为8％，实验中DNA模板量为5ng。参照样本为片段化的母亲基因组DNA样本，待测样本与参照样本均标化至浓度5ng/μL待用。

使用第一轮多重PCR引物对29个目标SNP位点进行同时扩增。

多重PCR体系(20μL)配置：

PCR反应条件设置如下：98℃30s；6个循环扩增(98℃10s，63℃-1℃每循环30s和72℃30s)；12个循环扩增(98℃10s，65℃30s和72℃30s)，在72℃延伸5min，4℃保存；

PCR扩增产物使用Beckman AMPure XP beads进行纯化：

1)按体积比1:1.2(DNA:磁珠)混合，吸打混匀，静置5min；

2)将样本放置在磁力架上，待磁珠被完全吸附，吸去上清；

3)将样本持续放置在磁力架上，加入200μL 80％EtOH，静置30s后吸去上清；

4)重复步骤3一次；

5)将上清去除，静置5-10min晾干，加入21μL H₂O吸打混匀，使磁珠重悬；

6)将样本放置在磁力架上，待磁珠被完全吸附，移出20μL上清至新的EP管中,避免吸到磁珠。

纯化后的DNA作为第二轮PCR扩增的模板，用于在第一轮PCR扩增产物的5’和3’端加上适用于高通量测序反应的接头序列。

第二轮PCR使用的正向引物序列为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.61)

逆向引物序列为：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO.62)

第二轮PCR体系(20μL)配置：

PCR反应条件设置如下：98℃30s；10个循环扩增(98℃10s，60℃30s和72℃30s)，在72℃延伸5min，4℃保存；

1)扩增产物使用Beckman AMPure XP beads进行纯化：

2)按体积比1:1.2(DNA:磁珠)混合，吸打混匀，静置5min；

3)将样本放置在磁力架上，待磁珠被完全吸附，吸去上清；

4)将样本持续放置在磁力架上，加入200μL 80％EtOH，静置30s后吸去上清；

5)重复步骤3一次；

6)将上清去除，静置5-10min晾干，加入22μL H₂O吸打混匀，使磁珠重悬；

将样本放置在磁力架上，待磁珠被完全吸附，移出20μL上清至新的EP管中,避免吸到磁珠。

纯化产物使用Qubit荧光光度计按照标准操作流程对文库DNA进行精确定量后进行illumina高通量高深度测序，按照NextSeq Benchtop Sequencer标准操作流程进行双向测序，两端各产生150bp序列。

三、实验结果

1、对参照样本和待测样本的测序深度分析得到的统计结果如表2所示。

表2测序深度统计结果

2、胎儿基因型判别方法

在待测DNA样本，一个目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：N1，Allele2：N2，参照样本中，对应的待检测位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：M1，Allele2：M2；该实施例以序概率比检验(SPRT)为例，对等位基因的比例进行统计学比较，方法如下：

1)计算胎儿DNA在游离DNA中的比例，使用公式min(N1,N2)/(N1+N2)x2，对每个目标位点进行计算，选取结果在2％-30％之间的数值并求得平均值或中位数，即为胎儿DNA比例F；在本实施例中根据此方法计算得到胎儿比例为8.7％，与实际配置的比例8.0％接近。

2)计算参照DNA中等位基因a的比例Control％＝M2/(M1+M2)；计算待测DNA中等位基因a的比例Plasma％＝N2/(N1+N2)。若Plasma％＝0或1，则胎儿基因型与母亲基因型相同且均为纯合；若Plasma％≠0且Control％＝0，则赋值min(M1,M2)＝1并重新计算Control％。当Plasma％和Control％均不为0，但Plasma％小于Control％，则Control％＝M1/(M1+M2)，Plasma％＝N1/(N1+N2)；若Plasma％大于Control％，则进行下步计算；

3)赋值q0＝Control％，当0.2≤q0≤0.8时，q1＝q0+(1-q0)*F；当q0<0.2时，q1＝F/2；当q0>0.8时，q1＝0.99999999。用q0和q1值进行如下计算：d＝(1-q1)/(1-q0)，g＝q1*(1-q0)/(q0*(1-q1))，Upper limit＝(ln(1000)/(N1+N2)-ln(d))/ln(g)，Lower limit＝(ln(0.001)/(N1+N2)-ln(d))/ln(g)。

比较Plasma％与Upper limit和Lower limit的大小关系:

若Plasma％<Lower limit，则胎儿基因型与母亲基因型相同；

若Lower limit≤Plasma％≤Upper limit，则结果为无法判定。

若Plasma％>Upper limit，则胎儿基因型与母亲基因型有显著差异；

假设某基因位点母亲的基因型为杂合Aa，待检样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿与母亲无显著差异，则胎儿基因型即为Aa；若胎儿与母亲有显著差异，且N1/N2>M1/M2则胎儿基因型为AA，反之为aa；

假设母亲基因型为纯合AA，若胎儿与母亲无显著差异，则胎儿基因型为AA；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa；

假设母亲基因型为纯合aa，若胎儿与母亲无显著差异，则胎儿基因型为aa；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa。实验中检测出的胎儿基因型与真实基因型之间的比对见表3。

下面以rs10636856位点为例(测序深度统计结果见表2)，说明统计比较的过程，母亲在此位点基因型为-/-。

该样本为人工配置样本，子代DNA比例(胎儿比例)为8％，以下采用序概率比检测(SPRT)方法说明数据统计步骤：

参照DNA中等位基因Allele2的比例Control％＝0/(5429+0)＝0，待测DNA中Allele2的比例Plasma％＝0/(6346+0)＝0。因为Plasma％＝0，所以胎儿基因型与母亲基因型相同且均为纯合，故胎儿在该位点基因型为-/-。

下面以rs5774423位点为例(测序深度统计结果见表2)，说明统计比较的过程，母亲在此位点基因型为TACT/TACT。

参照DNA中等位基因Allele2的比例Control％＝0/(38844.45+0)＝0，待测DNA中Allele2的比例Plasma％＝2032/(46901+2032)＝0.0415。Plasma％≠0且Control％＝0，赋值min(M1,M2)＝1,重新计算Control％＝1/(38844.45+1)＝2.57e-5。计算Upper limit＝0.005963769，Lower limit＝0.005926008。将Plasma％与Upper和Lower limit进行比较，发现Plasma％>Upper limit，所以胎儿基因型与母亲有显著差异，且因为N1/N2<M1/M2，故胎儿在该位点基因型为TACT/-。

表3模拟孕妇血浆游离DNA样本中胎儿基因型判断结果一致性比较

四、结论

在29个目标SNP位点的检测中，有27个位点胎儿基因型与实际基因型完全吻合，两个位点为无法判定。因此，本发明对胎儿基因型的判定非常准确。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 天昊生物医药科技（苏州）有限公司

<120> 利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法

<130> P2017-1100

<160> 62

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 1

cctacacgac gctcttccga tct 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 2

tcagacgtgt gctcttccga tct 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 3

tgactgagct gccccttagg t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 4

tcaagggatg tgctgtgagc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 5

cctctttggc caccagctc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 6

agactgggct gcctgtcctt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 7

tttgaagaca gcccctggaa 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 8

tgcatgaaac caatcaagga ga 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 9

ccaacacccc atcacagga 19

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 10

tcaaaggcat ttttgctagg ttg 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 11

gcagccaggg tggtttaaga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 12

cagggtcgcc aatgagaaac 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 13

gagccatatc ctcgacttgt gg 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 14

cggggacacc aaaaaccata 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 15

gggactcgga tgatgatcta atg 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 16

tcacatgacc atgggagttt ct 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 17

gagtgtggaa ggggcttcag 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 18

cgcagatgtg agctttgact g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 19

gactagccgg acagcaccaa 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 20

tgagtctcct tgaggggcag t 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 21

gcatacaagg agaagcaaga gga 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 22

gacatgccca agccaggata 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 23

ggcttctgac ggtctcaatg 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 24

cggattccag tgcatcattt c 21

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 25

tcaaggagct cacaactgag tg 22

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 26

ttattccacc aaccttcagt cac 23

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 27

aaatgcaatt ttgatgtctt gttcat 26

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 28

ggcttcatcg agtatgtcat tgc 23

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 29

cacactgaaa tcctttacac agttgtc 27

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 30

aagagaaggc tacccccatg at 22

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 31

ggaagagaac cctgggcttg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 32

cagccgcaaa gagagcctaa 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 33

cagcacagaa tccagcaggt 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 34

ggtagagcag gcatttccac a 21

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 35

tgaaggttga ggtcctagat gagaa 25

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 36

agtccctctg gaaggcacat 20

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 37

cggccagttc tcagggaag 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 38

aggatgaagc gttgctgctc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 39

cacccggaaa tggtctcact 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 40

ttgatgtgag gagccacagg 20

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 41

cacagagtcc ttactgagac catca 25

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 42

tttttcacct ttggggtcca 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 43

gctctggatt catcctcagc aa 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 44

ggatgccagg gtcatttcaa 20

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 45

cacagtgact aagctcagca agga 24

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 46

tcaacaaaat catcatcttc cccta 25

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 47

gctgagacac agcagcacac a 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 48

tggagtttgc agtggggttt 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 49

caggtaccag tgcccagcag 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 50

aggaggactg gccacactca 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 51

aggtggaagc ggtcctgaac 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 52

tctgccactc cagcactctg 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 53

ccgcttgggc ttgctactta 20

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 54

cacagtaaca tcttgctgaa gtgtcc 26

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 55

gaaggcaccc agactcgaag 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 56

tacagggcct gatggaggaa 20

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 57

tcttgcagtg gacaacagat ga 22

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 58

cccctttgac tggccatttg 20

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 59

ccatattcca aacaccatgc aa 22

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 60

tcacacattc caacaaggga agt 23

<210> 61

<211> 62

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 61

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat 60

ct 62

<210> 62

<211> 58

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 62

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58

Claims

1.一种基因型鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提供针对多个待检测位点的多重PCR引物；

(4)对步骤(3)获得扩增产物进行高通量平行测序；

(6)对参照DNA和待测DNA中等位基因的比例进行统计比较；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多重PCR引物中，每对引物5’端部分序列是与第二轮PCR扩增引物相一致的通用序列，3’端部分序列为与待检测位点所在区域特异性结合的序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多重PCR引物扩增的基因组区域大小为10-200bp。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，高通量平行测序时对第二轮PCR扩增产物进行高通量高深度双端测序。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，高通量平行测序的测序读长≤250bp(优选地为50-250bp；更优选地为70-250bp；最优选地为100-250bp)，平均测序深度≥1000重(≥1000X；优选地≥1500X；更优选地≥2000X；最优选地≥5000X)。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，针对多重PCR得到的扩增产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对其进行扩增；优选地，PCR引物包括一段数个至数十个碱基长度的标签序列，对来自不同样本的多重扩增产物可以用带不同标签序列的PCR引物进行扩增，从而使得来自不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，如果测序数据包括多个样本的数据，则步骤(5)中还包括对测序序列进行样本归类；

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，统计比较方法包括步骤：

(d)比较Plasma％与Upper limit、Lower limit的值的大小关系，若Plasma％>Upperlimit，则胎儿目标位点基因型与母亲有显著差异；若Plasma％<Lower limit，则胎儿目标位点基因型与母亲无显著差异；若Lower limit≤Plasma％≤Upper limit，则结果为无法判定。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，统计比较方法包括步骤：

(b)计算血浆DNA的测序深度D＝M1+M2；

P＝CHIDIST(X²,df)

当P>0.01时，胎儿目标位点基因型与参照样本无显著差异

当0.001<P<0.01之间时，无法判定

当P≤0.001时，胎儿目标位点基因型与参照样本有显著差异。

10.一种利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的系统，所述系统包括多重PCR扩增单元、二代测序单元和数据处理单元，其特征在于，所述系统被设置为执行权利要求1所述的方法。