CN109270180A - 土壤中抗生素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种土壤中抗生素的检测方法，该土壤中抗生素的检测方法包括以下步骤：向待测土样中加入提取液，进行超声提取，得到土样提取液；将土样提取液进行固液分离，收集上清液；取上清液进行固相萃取，保留目标物；将目标物进行氮吹定容，即得待测溶液；精密吸取待测溶液，采用液相色谱‑质谱对待测溶液进行测定。提供了一种快速准确的同步检测土壤中6类30种抗生素的分析检测方法，且该检测方法加标回收率高，线性好，灵敏度高。

Description

土壤中抗生素的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学检测技术领域，特别是涉及一种土壤中抗生素的检测方法。

背景技术

自20世纪50年代美国食品与药物管理局(FAD)首次批准抗生素用作饲料添加剂后，抗生素被全方位推广应用于畜牧生产。在巨大的经济利益驱动下，禽畜抗生素用量迅速增长，我国近年禽畜抗生素年平均消费已达6000t。抗生素滥用造成的不良影响及人类健康危害已越来越严重，并逐渐成为人们普遍关注的一个社会热点问题。研究发现，抗生素被动物摄取后并不能完全降解，约有60％～90％抗生素以母体的形式随粪、尿等排泄物排出体外，这些粪便作为有机肥施入农田，可对农田土壤、作物、水体等产生不利影响，并通过食物链对生态系统产生危害，影响植物、动物和微生物的正常生命活动，最终影响人类的健康。研究表明，土壤中抗生素残留量在μg/kg到g/kg之间。我国对养殖系统抗生素的残留研究已有相关报道，但关于畜禽粪肥田土壤中抗生素残留检测的报道不多，这在一定程度上限制了有关抗生素残留对生态系统及人类健康的影响研究。

目前分析方法中，土壤中抗生素的检测主要采用超声萃取、加速溶剂萃取等前处理方法和液相色谱-质谱联用仪分析检测方法。但土壤基质复杂，抗生素种类较多，处理效果并不理想。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速准确的同步分析土壤中多种抗生素的检测方法。

一种土壤中抗生素的检测方法，包括以下步骤：

(1)制备待测溶液

向待测土样中加入提取液，进行超声提取，得到土样提取液；

将所述土样提取液进行固液分离，收集上清液；

取所述上清液进行固相萃取，保留目标物；

将所述目标物进行氮吹定容，即得待测溶液；

(2)测定

精密吸取所述待测溶液，采用液相色谱-质谱对所述待测溶液进行测定；

所述液相色谱的条件为：流动相A为水、甲醇与甲酸的混合液，水与甲醇的体积比为98:2，甲酸占水与甲醇体积和的0.05％；流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，流速：0.2mL/min-0.3mL/min；柱温：35℃-45℃；进样量：4μL-6μL；

所述质谱的条件为：离子源：ESI源；电离模式：正离子模式；毛细管电压：2.8kv-3.2kv；离子源温度：140℃-160℃；锥孔反吹气流量：40L/Hr-60L/Hr；脱溶剂气温度：480℃-520℃；脱溶剂气流量：850L/Hr-950L/Hr；监测模式：MRM模式。

上述土壤中抗生素的检测方法，通过超声提取-离心分离-固相萃取-氮吹定容对待测土样进行提取、净化，制得待测溶液，之后通过液相色谱-质谱对待测溶液进行分析检测。提供了一种快速准确的同步检测土壤中6类30种抗生素的分析检测方法，30种抗生素在6min时间内能够达到很好的分离效果，峰形对称，基质干扰小，满足测试要求。并且通过回收率、线性、检出限和定量限对本检测方法进行了验证，该检测方法加标回收率高，加标回收率为55.8％-128％；在0.5μg/L-200μg/L的浓度范围内线性良好，线性相关系数R²>0.99；检出限低，检出限达到0.007ng/mL；定量限达到0.022ng/mL。

另外，该检测方法使用有机溶剂量少、仪器设备大众化、操作简单、同步检测，是一种高选择性、高灵敏性、重现性好的分析检测方法。

在其中一个实施例中，所述超声提取的时间为5min-15min；所述固液分离的时间为：5min-15min；所述固液分离的转速为3000r/min-5000r/min。

在其中一个实施例中，所述超声提取的时间为10min；所述固液分离的时间为10min；所述固液分离的转速为4000r/min。

在其中一个实施例中，对所述待测土壤样品进行所述超声提取与所述固液分离的操作重复两次。

在其中一个实施例中，所述固相萃取的操作采用串联柱对所述目标物进行富集。

在其中一个实施例中，所述串联柱为LC-SAX与HLB，规格为500mg/6mL。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的程序为：0-0.25min，流动相B体积比保持10％±5％不变；0.25min-3.5min，流动相B体积比由10％±5％增至50％±5％；3.5min-4min，流动相B体积比由50％±5％增至95％±5％；4.0min-5.0min，流动相B体积比保持95％±5％不变；5.0min-5.1min，流动相B体积比由95％±5％减至10％±5％；5.1min-6.0min，流动相B体积比保持10％±5％不变。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的程序为：0-0.25min，流动相B体积比保持10％不变；0.25min-3.5min，流动相B体积比由10％增至50％；3.5min-4min，流动相B体积比由50％增至95％；4.0min-5.0min，流动相B体积比保持95％不变；5.0min-5.1min，流动相B体积比由95％减至10％；5.1min-6.0min，流动相B体积比保持10％不变。

在其中一个实施例中，所述提取液为磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合液，所述磷酸盐缓冲溶液与所述乙腈的体积比为1:1。

在其中一个实施例中，所述液相色谱的条件为：流动相A为水、甲醇与甲酸的混合液，水与甲醇的体积比为98:2，甲酸占水与甲醇体积和的0.05％；流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；

所述质谱的条件为：离子源：ESI源；电离模式：正离子模式；毛细管电压：3.0kv；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流量：50L/Hr；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：900L/Hr；监测模式：MRM模式。

附图说明

图1为本发明30种抗生素的选择反应监测色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

1、实验部分

1.1制备待测溶液

称取100g预冷冻土样，用锡箔纸包裹放在冷冻干燥机中冷冻干燥，冷冻干燥后的土样研磨过100目孔径筛。

称取5g过筛后的土样于离心管中，加入10mL提取液(磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为1:1)，之后放在涡旋仪上涡旋振荡2min，超声仪上提取10min，得到土样提取液。接着将土样提取液以4000r/min的速度进行离心分离10min，收集上清液于500mL烧杯中，再按照上述方法重复提取2次，合并上清液并加超纯水稀释至300mL。

将上述稀释的上清液通过串联柱进行富集。串联柱预先用10mL甲醇、10mL超纯水(去离子水)依次进行活化。过柱时，流速控制在3mL/min-5mL/min，样品富集完毕后，用10mL甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为2:8)淋洗串联柱，去掉LC-SAX小柱，HLB小柱真空干燥5min。

将上述得到的HLB固相萃取柱用10mL甲醇对目标物进行洗脱，12mL试管收集的洗脱液固定在氮吹仪中水浴45℃下氮吹至近干，然后用甲醇定容至1mL，过0.22μm有机相滤膜后，收集在2mL棕色色谱瓶中，准备上机检测。

1.2检测方法

1.2.1仪器设备

超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，生产厂家为美国Waters公司；涡旋仪，型号为M37610-33CN，生产厂家为上海安普实验科技股份有限公司；超声提取仪，型号为KQ-500DE，生产厂家为昆山市超声仪器有限公司；离心机，型号为TGL-20bR，生产厂家为上海安亭科学仪器厂；LC-SAX和HLB串联柱，规格为500mg/6mL，生产厂家为美国Waters公司；氮吹仪，型号为EFAA-DC12，生产厂家为上海安普实验科技股份有限公司。

1.2.2实验材料

甲醇(UPLC级试剂)，乙腈(UPLC级试剂)，磷酸盐缓冲溶液，乙腈，0.22μm有机相滤膜，红霉素、罗红霉素、林可霉素、阿奇霉素、泰乐霉素、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、乙酰磺胺、磺胺二甲基嘧啶、甲氧苄啶、磺胺喹噁啉、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氟罗沙星、双氟沙星、盐酸强力霉素、四环素、氧四环素、氯四环素、醋磺胺甲噁唑、咪康唑、酮康唑、氟康唑、磺胺噻唑和甲砜霉素的标准品。

1.2.3标准溶液的配制

分别精确称取30种抗生素的标准物质各10mg，用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，摇匀，得到质量浓度为100mg/L的储备液，并置于-20℃冰箱内避光保存。之后通过梯度稀释法，逐级稀释成浓度为0.5mg/L、1mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准工作溶液。

1.2.4液相色谱-质谱检测器条件选择

1.2.4.1液相方法的建立

高效液相色谱的参数：流动相A为水、甲醇与甲酸的混合液，水与甲醇的体积比为98:2，甲酸占水与甲醇体积和的0.05％；流动相B为乙腈；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相梯度如表1所示。

表1.流动相梯度

1.2.4.2质谱方法的建立

质谱的参数：离子源：ESI源；电离模式：正离子模式；毛细管电压：3.0kv；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流量：50L/Hr；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：900L/Hr；监测模式：MRM模式。

1.3检测结果

1.3.1 30种抗生素的质谱参数(如图1及表2所示)

表2 30种抗生素的质谱参数

在上述优化的液相色谱-质谱分析条件下，30种抗生素在6min时间内能够达到很好的分离效果，峰形对称，基质干扰小，满足测试要求。

1.3.2 30种抗生素的质量控制参数

表3 30种抗生素的质量控制参数

从表3中30种抗生素的标准工作曲线可以看出，在该方法条件下，30种抗生素在0.5μg/L-200μg/L的浓度范围内线性良好，各抗生素的线性相关系数均达到0.99，满足测试要求。

1.3.2.1回收率实验

取2个待测溶液，分别加入浓度为10ng/g和100ng/g的抗生素的标准溶液，进行加标回收率实验。如表3所示，30种抗生素的加标回收率在55.8％-128％之间，准确度高，满足微量物质的测试要求。

1.3.2.2检出限确定

在该方法条件下，对不同浓度的标准溶液进行分析，以3倍信噪比(S/N)确定方法检出限。如表3所示，30种抗生素的检出限检出限(LOD)最低达到0.007ng/mL，能够满足30种抗生素的测试要求。

1.3.2.2定量限确定

在该方法条件下，对不同浓度的标准溶液进行分析，以10倍信噪比(S/N)确定方法定量限。如表3所示，30种抗生素的定量限(LOQ)最低达到0.022ng/mL，能够满足30种抗生素的测试要求。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备待测溶液

向待测土样中加入提取液，进行超声提取，得到土样提取液；

将所述土样提取液进行固液分离，收集上清液；

取所述上清液进行固相萃取，保留目标物；

将所述目标物进行氮吹定容，即得待测溶液；

(2)测定

精密吸取所述待测溶液，采用液相色谱-质谱对所述待测溶液进行测定；

所述液相色谱的条件为：流动相A为水、甲醇与甲酸的混合液，水与甲醇的体积比为98:2，甲酸占水与甲醇体积和的0.05％；流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，流速：0.2mL/min-0.3mL/min；柱温：35℃-45℃；进样量：4μL-6μL；

所述质谱的条件为：离子源：ESI源；电离模式：正离子模式；毛细管电压：2.8kv-3.2kv；离子源温度：140℃-160℃；锥孔反吹气流量：40L/Hr-60L/Hr；脱溶剂气温度：480℃-520℃；脱溶剂气流量：850L/Hr-950L/Hr；监测模式：MRM模式。

2.根据权利要求1所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述超声提取的时间为5min-15min；所述固液分离的时间为：5min-15min；所述固液分离的转速为3000r/min-5000r/min。

3.根据权利要求1所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述超声提取的时间为10min；所述固液分离的时间为10min；所述固液分离的转速为4000r/min。

4.根据权利要求1所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，对所述待测土壤样品进行所述超声提取与所述固液分离的操作重复两次。

5.根据权利要求1所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述固相萃取的操作采用串联柱对所述目标物进行富集。

6.根据权利要求5所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述串联柱为LC-SAX与HLB，规格为500mg/6mL。

7.根据权利要求1所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0-0.25min，流动相B体积比保持10％±5％不变；0.25min-3.5min，流动相B体积比由10％±5％增至50％±5％；3.5min-4min，流动相B体积比由50％±5％增至95％±5％；4.0min-5.0min，流动相B体积比保持95％±5％不变；5.0min-5.1min，流动相B体积比由95％±5％减至10％±5％；5.1min-6.0min，流动相B体积比保持10％±5％不变。

8.根据权利要求7所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0-0.25min，流动相B体积比保持10％不变；0.25min-3.5min，流动相B体积比由10％增至50％；3.5min-4min，流动相B体积比由50％增至95％；4.0min-5.0min，流动相B体积比保持95％不变；5.0min-5.1min，流动相B体积比由95％减至10％；5.1min-6.0min，流动相B体积比保持10％不变。

9.根据权利要求1所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述提取液为磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合液，所述磷酸盐缓冲溶液与所述乙腈的体积比为1:1。

10.根据权利要求1所述的土壤中抗生素的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的条件为：流动相A为水、甲醇与甲酸的混合液，水与甲醇的体积比为98:2，甲酸占水与甲醇体积和的0.05％；流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；

所述质谱的条件为：离子源：ESI源；电离模式：正离子模式；毛细管电压：3.0kv；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流量：50L/Hr；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：900L/Hr；监测模式：MRM模式。