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CN109265563A - 一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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CN109265563A CN201811125546.4A CN201811125546A CN109265563A CN 109265563 A CN109265563 A CN 109265563A CN 201811125546 A CN201811125546 A CN 201811125546A CN 109265563 A CN109265563 A CN 109265563A
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Abstract

本发明涉及一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用，所述人源嵌合抗原受体包含人源的抗CD30的单链抗体、胞外铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述人源的抗CD30的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸。通过将本发明中装载嵌合抗原受体的慢病毒载体转导T细胞可得到CAR‑T细胞，从而获得能够高效并且特异性地杀伤CD30阳性的肿瘤细胞，从而为治疗CD30表面抗原阳性的恶性肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤等，提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。

Description

一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，更特别地，涉及一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体，包括其编码序列及应用。
背景技术
CD30是肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptorsuperfamily，TNFRSF)成员之一，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，高表达于霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)和间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphomas，ALCL)，低表达于非病理状态下活化的T细胞、B细胞表面，而正常细胞不表达。早期研究表明，CD30参与细胞活化和分化，NF-κB等信号的传导及T细胞免疫激活等。目前研究证实CD30与细胞的增值和死亡密切相关，其胞内部分可以与TNFR相关因子(TNFR associated factor)家族多个成员相互作用，既能通过JNK和p38途径介导T细胞的凋亡，又能通过NF-κB途径介导细胞的活化。CD30激活后很快被胞外蛋白酶降解，形成可溶性的sCD30。正常情况下，人体血清中的sCD30含量很低，但在病理状态下，sCD30含量明显升高，可作为疾病诊断的指标。sCD30在血清中的含量可作为HL和ALCL患者的肿瘤检测标志物。
对于难治性和复发性HL和ALCL的治疗始终是个难题，但是近来靶向治疗的出现为这些患者带来了新的希望。近20多年来单克隆抗体已在肿瘤治疗领域得到广泛应用，自从第一代抗CD30单克隆抗体SGN-30、MDX-060第二代抗CD30单克隆抗体MDX-1403、XmAb第三代抗CD30单克隆抗体SGN-35出现以来，在霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤治疗方面有重大突破，改变了传统的治疗方法，增加了CD30阳性患者的生存期，但是临床上依然存在诸多问题，如FDA批准的SGN-35仅用于自身干细胞移植失败或两次既往化疗失败不能接受移植的HL患者以及一次既往化疗失败的ALCL患者，而肿瘤患者早期需先接受化疗，会产生耐药性和毒副作用。随着基因工程技术的发展，CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy)治疗方案的不断进步，针对CD30靶点以及对CD30肿瘤发生发展机制的研究，将大大改变CD30阳性肿瘤的治病现状，为更多患者带来曙光。
CAR全称是ChimericAntigen Receptor，即嵌合抗原受体。完整的CAR结构包括：抗原结合区(scFv，单链抗体，识别肿瘤相关抗原的抗体片段)；跨膜连接区；胞内信号区(T细胞活化基序，CD3胞内信号域ITAM)。[Eleanor J.Cheadle，et al.CAR T cells:drivingthe road from the laboratory to the clinic.Immunological Reviews2014.Vol.257:91–106]。靶向CD30的CAR-T细胞治疗通过分离患者自身的T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程以特异性靶向CD30，从而识别和清除CD30阳性的恶性肿瘤细胞。CD30为靶点的CART疗法效果显著、研究广泛，已成为多数临床研究机构开展基因修饰T细胞治疗研究的模式疗法。然而，靶向CD30的嵌合抗原受体大多采用鼠源的scFv，其存在免疫原性，机体会产生人抗鼠抗体，影响CAR-T细胞在体内的长期存活，容易造成复发。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种人源的靶向CD30的嵌合抗原受体，所述人源嵌合抗原受体包含人源的抗CD30的单链抗体、胞外铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述人源的抗CD30的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述胞外铰链区来自CD8的铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述跨膜结构域来自CD28TM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
优选地，所述细胞内信号结构域由CD28ICD、4-1BB和CD3zeta组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明还提供了一种编码上述嵌合抗原受体的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
通过将本发明的嵌合抗原受体表达于T细胞中可使得到的CAR-T细胞能够高效并且特异性杀伤CD30阳性的恶性肿瘤细胞，从而为治疗一些表达CD30表面抗原的恶性肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤等，提供高效并且副作用和不良反应少的方法。
附图说明
图1为本发明实施例中编码hCD30嵌合抗原受体的结构示意图；
图2为本发明实施例中hCD30慢病毒表达载体BRD-PTK-hCD30的质粒图谱示意图；
图3为本发明实施例中PTK-hCD30CAR-T细胞的转导效率检测结果；
图4为本发明实施例中PTK-hCD30CAR-T细胞及T细胞对阳性靶细胞L428的体外杀伤效率；
图5为本发明实施例中PTK-hCD30CAR-T细胞及T细胞对阴性靶细胞Raji的体外杀伤效率；
图6为本发明实施例中流式细胞术检测L428-luc-GFP构建结果；
图7为本发明实施例中根据荧光强度检测CAR-T细胞对肿瘤细胞体内的杀伤效果评估。
具体实施方式
以下结合实例和说明书附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.人源的靶向CD30的嵌合抗原受体表达质粒的构建
通过人工合成SEQ ID NO:7所示的长度为1614bp的DNA片段(hCD30CAR的核酸序列)，其中，第1-69位的核苷酸编码SP(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，第70-798位的核苷酸编码人源靶向CD30的SCFV(其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)，第799-945位的核苷酸编码CD8铰链区(其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，第946-1026位的核苷酸编码CD28TM(其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)，第1027-1149位的核苷酸编码CD28ICD，第1150-1215位的核苷酸编码4-1BB，第1216-1614位的核苷酸编码CD3zeta，具体结构示意图见图1所示。其中，hCD30CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，后面三个区域构成胞内信号区(其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)。
将上述DNA片段插入慢病毒表达载体BRD-PTK的EF1alpha启动子下游，得到人源的靶向CD30的嵌合抗原受体表达质粒BRD-PTK-hCD30，质粒图谱见图2所示。
2.人源的靶向CD30的嵌合抗原受体表达质粒转染T细胞
1)慢病毒的包装制备
在多层细胞培养瓶(Hyperflask)(Corning)接入130.0-140.0×106数目的293T细胞(Takara)，共560mL DMEM完全培养基(50mL胎牛血清、5mL Antibiotic-Antimycotic 100×)，在37℃含5％CO2培养箱中培养24小时。将混有320μg质粒(质量比为PTK-hCD30:pMDLg:pRSV:pMD2.G＝12:10:5:6)的DMEM完全培养基加入含960μg PEI的管中，漩涡震荡，充分混匀，此混合液体积为35mL，室温平衡10min。将上述35mLPEI与质粒的混合液与525mLDMEM完全培养基混匀，换入上述多层细胞培养瓶中。将多层细胞培养瓶置于37℃含5％(v/v)CO2培养箱培养3天后，收集细胞培养上清液。
上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，4℃于30000g离心2.5h。去除上清，加入1mLT细胞培养基(OpTmizerTMCTSTMT-CellExpansion Basal Medium，Gibco，A3021201；OpTmizerTMCTS T-Cell ExpansionSupplement，Gibco，A3021601)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业)重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，标记为Lenti3-hCD30慢病毒并置于-80℃保存备用。
慢病毒活性滴度检测：
原理：Goat anti-Human IgGAntibody，FITC conjugate上标记有荧光素，而Goatanti-Human IgGAntibody能与CAR中单链抗体特异性结合，通过流式细胞仪检测到的荧光信号，间接反应了CAR在293T细胞中的表达情况。
方法：在6孔板中接入5.0×105个/孔的293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设置1个阴性对照。置于37℃含5％(v/v)CO2培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞，送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞的比例，并换算得到Lenti3-hCD30慢病毒浓缩液的活性滴度。检测分析结果见表1所示，所得到的病毒活性滴度很高，达到1.5E+09。
表1 Lenti3-hCD30慢病毒的活性滴度检测分析结果
样品 病毒添加量(μL) 转染效率 活性滴度
CK - 0.31％ /
Lenti3-hCD30-0.1 0.1 30.3％ 1.5E+09
2)T细胞的制备
取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(Mediatech)分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用T细胞完全培养液(OpTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion BasalMedium，Gibco，A3021201；OpTmizerTMCTS T-Cell Expansion Supplement，Gibco，A3021601)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业)中培养T细胞，同时按25μL/106个细胞加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco，11132D)，得到T细胞。
3)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
24小时后，按MOI为2加入PTK-hCD30CAR慢病毒进行转导，混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加T细胞完全培养基，调整细胞密度至1.0×106/mL进行培养。
慢病毒转导24小时后将细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0×106/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0×106/mL。
PTK-hCD30CAR-T细胞的转导效率检测
取1.0×106个转导后T细胞，与Goat anti-Human IgG Antibody，FITC conjugate室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR-T细胞在总细胞中的比率。检测结果如图3和表2所示。说明成功制备了PTK-hCD30CAR-T细胞。
表2 PTK-hCD30CAR-T细胞的转导效率检测结果
转导类型 转导效率
PTK-hCD30CAR-T 37.4％
3.PTK-hCD30CAR-T细胞的对CD30阳性的恶性细胞的特异性杀伤活性
采用钙黄绿素检测法对PTK-hCD30CAR-T细胞进行体外杀瘤功能检测。
取适量L428细胞作为靶细胞，在1×106/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温下，洗两遍后将细胞重悬至1.5×105/mL。按不同效靶比加入PTK-hCD30CAR-T细胞，200g离心30秒，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。
杀瘤实验数据：对慢病毒转导的T细胞在应用前需进行其对肿瘤细胞系杀伤等功能性检测，使用钙黄绿素检测法。结果参见图4和图5及表3和表4。结果显示，PTK-hCD30CAR-T细胞对高表达CD30的肿瘤细胞具有特异杀伤活性。
表3 PTK-hCD30CAR-T细胞及T细胞对阳性靶细胞L428的体外杀伤效率
表4 PTK-hCD30CAR-T细胞及T细胞对阴性靶细胞Raji的体外杀伤效率
4.L-428-luc-GFP稳转细胞系的构建
为了检测L428细胞在动物体内的增殖情况，本实施例选择Luc-Puro-GFP三标慢病毒(汉恒生物，ZH-LP01)转导L428细胞，构建L428-luc-GFP细胞，为后续PTK-hCD30CAR-T细胞药效实验做准备。转染成功后使用嘌呤霉素(puromycin，Gibco，A1113803)筛选高纯度的L428-luc-GFP稳定细胞系。具体试验步骤如下：
1)转染，用不含血清的1640基础培养基(Gibco，C11875500BT)重悬2*106细胞，加入polybrene(汉恒生物，HB-PB-05)和Luc-puro-GFP三标慢病毒37℃培养箱孵育。
2)孵育4h、24h、48h补液，倒置显微镜下观察转导的L428状态，荧光显微镜观察转导48h后GFP表达情况。
3)筛选，孵育72h后，离心转导后L428细胞用含2.5μg/ml puromycin的1640完全培养液培养细胞，取相同数量的未转导的L428细胞，用同样含2.5μg/ml puromycin的1640完全培养基重悬细胞沉淀，作为对照；
(a)L428control组，2.5μg/ml puromycin的1640完全培养基培养2*106L428细胞；
(b)L428-luc-GFP组，2.5μg/ml puromycin的1640完全培养基培养2*106L428-luc-GFP细胞。
4)使用2.5μg/ml puromycin的1640完全培养基培养6天，期间定期换液，于第6天使用流式细胞术检测筛选情况。
流式细胞术结果显示，L428control组细胞在加入2.5μg/ml puromycin后，细胞大量死亡，于第6天时对照组细胞全部死亡。L428-luc-GFP组筛选6天后，流式细胞术检测，GFP阳性细胞占95.1％(见图6)，至此，已成功构建出L428-luc-GFP组稳定细胞系，为后续PTK-hCD30CAR-T细胞药效实验做准备。
5.PTK-hCD30CAR-T细胞在小鼠荷瘤模型中的抗肿瘤效应
为了检测PTK-hCD30CAR-T细胞在体内的抗肿瘤效应，本实施例选择免疫缺陷B-NSG小鼠(百奥赛图江苏基因生物有限公司)与L428-luc-GFP细胞用于建立肿瘤模型，建模成功后分组并分别尾静脉注射PTK-hCD30CAR-T细胞和普通T细胞，使用IVIS Spectrum小动物活体成像系统(Xenogen，Hopkinton，USA)，分别于不同的时间进行活体成像，分析成像试验结果。具体试验步骤如下：
1)建模，给6～8周龄的B-NSG小鼠尾静脉注射(i.v.)1.5×106个L428-luc-GFP细胞/只。
2)7天后动物成像，分别以100～150mg/kg的剂量腹腔注射D-luciferin(Molecular Imaging Products，Bend，USA)、50～75mg/kg的剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠注射液麻醉小鼠，等10～15分钟后使用IVIS小动物活体成像系统(Xenogen，Hopkinton，USA)收集光信号。
3)建模成功后，当天进行分组，分别尾静脉注射PTK-hCD30CAR-T细胞和普通T细胞，分组如下：
(a)PTK-hCD30CAR-T细胞注射组，尾静脉注射PTK-hCD30CAR-T细胞1×107个/只；
(b)普通T细胞注射组，尾静脉注射普通T细胞1×107个/只。
4)静脉注射T细胞后的第7、10、14、18天后分别进行荷瘤小鼠活体成像，分析活体成像试验结果，参见图7，其中CD30：PTK-hCD30CAR–T细胞注射组；NT：普通T细胞注射组。荷瘤小鼠的活体成像结果显示，普通T细胞注射组小鼠的肿瘤逐渐增大直至小鼠死亡；而与普通T细胞注射组相比，PTK-hCD30CAR-T细胞注射组荷瘤小鼠体内的肿瘤逐渐消失。这表明普通T细胞对在荷瘤小鼠体内肿瘤细胞无抗肿瘤效应，而PTK-hCD30CAR-T细胞在荷瘤小鼠体内具有很好的抗肿瘤效果，为临床用药提供理论依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉波睿达生物科技有限公司
<120> 一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用
<130> WH1809083-1
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 1
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Phe Glu Trp Met Gly Trp Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ala
65 70 75 80
Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Ile Leu Ser Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Arg Leu Thr Ser Asp
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Lys Thr Thr Gln Thr Thr Trp
115 120 125
Gly Phe Pro Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160
Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
165 170 175
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Tyr Gln Trp Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Lys
195 200 205
Ala Ser His Leu Tyr Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp
225 230 235 240
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Pro Ala Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val
305 310 315 320
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
325 330 335
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
340 345 350
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
355 360 365
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys
370 375 380
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
385 390 395 400
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
405 410 415
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
420 425 430
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
435 440 445
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
450 455 460
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
465 470 475 480
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
485 490 495
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
500 505 510
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
515 520 525
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 2
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Met Ala
20
<210> 3
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Ile Leu Ser Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Lys Thr Thr Gln Thr Thr Trp Gly Phe Pro Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Gly Val Tyr Gln Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser His Leu Tyr Asn Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg
<210> 4
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 4
Ala Asp Pro Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
1 5 10 15
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
20 25 30
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
35 40 45
Asp
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 5
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 6
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 6
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
35 40 45
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
50 55 60
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
85 90 95
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
100 105 110
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
115 120 125
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
130 135 140
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
145 150 155 160
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
165 170 175
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
180 185 190
Pro Pro Arg
195
<210> 7
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 7
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60
agaatggccc aggtacagct gcagcagtca ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg 120
gtgaaggtct cctgcaagac ttctggatac accttcaccg gctactatat gcactgggtg 180
cggcaggccc ctggacaagg gtttgagtgg atgggatgga tcgaccctaa cagtggtgcc 240
acaacctatg cacagaaatt tcagggcagg ctcatcctga gccgggacac gtccatcaac 300
acagcctaca tggaactgag gaggctgaca tctgatgaca cggctgtata ttactgtgca 360
aaaaagacaa ctcagactac gtgggggttt cctttttggg gccaagggac cacggtcacc 420
gtctcgagtg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcggacatc 480
gtgatgaccc agtctccttc caccctgtct gcgtctgtcg gagacagagt caccatcact 540
tgccgggcca gtcagggtgt ctatcagtgg ttggcctggt atcagcagaa gccagggaaa 600
gcccctaacc tcctgatcta taaggcgtct catttataca atggggtccc atcaagattc 660
agtggcagtg gctccgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctgca gcctgatgat 720
tttgcgactt attactgcca acagcttaat agttacccgc tcactttcgg cggagggacc 780
aaggtggaaa tcaaacgtgc ggatcccgcc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg 960
gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1020
tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 1080
cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1140
tatcgctcca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1200
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1260
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1320
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1380
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1440
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1500
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1560
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1614

Claims (5)

1.一种人源的靶向CD30表面抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，所述人源嵌合抗原受体包含人源的抗CD30的单链抗体、胞外铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述人源的抗CD30的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外铰链区来自CD8的铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域来自CD28TM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求1或2或3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞内信号结构域由CD28ICD、4-1BB和CD3zeta组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.一种编码权利要1-3中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
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