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CN109182382A - 用于抑制lgals12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用 - Google Patents

用于抑制lgals12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用 Download PDF

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CN109182382A
CN109182382A CN201811087229.8A CN201811087229A CN109182382A CN 109182382 A CN109182382 A CN 109182382A CN 201811087229 A CN201811087229 A CN 201811087229A CN 109182382 A CN109182382 A CN 109182382A
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CN
China
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lgals12
inhibiting
nucleic acid
substance
acid molecule
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CN201811087229.8A
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张瑾
毋文静
彭永佳
尹亚军
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Jiaxing University
Original Assignee
Jiaxing University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了用于抑制LGALS12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用。本发明要求保护用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用、在抑制前体脂肪细胞分化中的应用、在抑制前体脂肪细胞向脂肪细胞分化中的应用、在猪的育种中的应用。本发明的发明人发现降低LGALS12蛋白水平可以抑制脂肪细胞分化。本发明对于瘦肉型猪的育种具有重大价值。

Description

用于抑制LGALS12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的 应用
技术领域
本发明涉及用于抑制LGALS12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用。
背景技术
越来越多的研究结果表明脂肪组织不仅是被动的能量储存器官，而且是能够分泌多种激素类物质的内分泌器官。脂肪细胞分化及其调控失常与人类多种疾病如肥胖症、糖尿病、脂肪肝、高脂血症及乳腺癌等密切相关。对脂肪细胞分化机制及其调控的研究，不仅对于探讨上述疾病的致病过程具有重要理论意义，而且对于上述疾病的预防与治疗，特别是对于在细胞和分子水平上筛选针对上述疾病的药物，也具有实际意义。
此外，脂肪细胞的分化调控相关的研究对于农业动物育种，尤其是优质瘦肉型猪新品种的培育也具有重要意义。我国是世界上最大的生猪养殖国和猪肉消费国，猪肉产量已经超过5000万吨。但随着生活水平的提高，人们对优质瘦肉猪的需求越来越旺盛。所谓的优质瘦肉猪，一方面要求皮下脂肪沉积较少，而同时肌内脂肪含量较高。如果想实现这样的育种目标，必须解析脂肪细胞分化调控的相关机理和调控措施。
脂肪细胞的分化是一个复杂的过程，受到许多基因和多个信号通路调控。利用体外培养的细胞已经证明，脂肪细胞的形成可以分为两个阶段：间充质干细胞(Mesenchymalstem cell,MSC)可以分化为前体脂肪细胞(preadipocyte)；前体脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞(adipocyte)。脂肪组织中包含有大量的前体脂肪细胞，它们形态与成纤维细胞类似，Pref-1基因呈现高表达，并且具有一定的增殖能力。当给予一定的诱导条件，这些前体脂肪细胞能够启动分化进程，细胞形态由细长的成纤维样变成近圆形，胞内出现脂滴，前体脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，Pref-1基因呈现低表达，油红O染色呈红色。当机体营养过剩或者激素水平异常，就可能诱导机体的前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。对于人类而言，可能会引起肥胖和其它代谢类疾病；对于农业动物而言，会引起体脂积累增加，瘦肉率降低。因此，研究前体脂肪细胞向脂肪细胞分化的调控过程，是研究动物脂类代谢的关键步骤，具有理论和实践的双重意义。
发明内容
本发明的目的是提供用于抑制LGALS12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用。
本发明要求保护用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用。所述脂肪细胞为猪脂肪细胞。所述脂肪细胞为肌肉组织来源的脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的脂肪细胞。
本发明要求保护用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在抑制前体脂肪细胞分化中的应用。所述前体脂肪细胞为猪前体脂肪细胞。所述前体脂肪细胞为肌肉组织来源的前体脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的前体脂肪细胞。
本发明还保护用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在抑制前体脂肪细胞向脂肪细胞分化中的应用。所述前体脂肪细胞为猪前体脂肪细胞。所述前体脂肪细胞为肌肉组织来源的前体脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的前体脂肪细胞。
本发明还保护用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在猪的育种中的应用；所述育种目标为获得瘦肉型猪。
本发明还保护用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质的应用，为降低脂肪细胞中脂滴的含量和/或甘油三酯的含量。所述脂肪细胞为猪脂肪细胞。所述脂肪细胞为肌肉组织来源的脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的脂肪细胞。
本发明还保护用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：
(a)抑制脂肪细胞分化；
(b)抑制前体脂肪细胞分化；
(c)抑制前体脂肪细胞向脂肪细胞分化；
(d)猪的育种；所述育种目标为获得瘦肉型猪；
(e)降低脂肪细胞中脂滴的含量和/或甘油三酯的含量。
所述脂肪细胞为猪脂肪细胞。所述脂肪细胞为肌肉组织来源的脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的脂肪细胞。
所述前体脂肪细胞为猪前体脂肪细胞。所述前体脂肪细胞为肌肉组织来源的前体脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的前体脂肪细胞。
以上任一所述LGALS12蛋白为半乳糖凝集素12。
以上任一所述LGALS12蛋白如序列表的序列1所示。
以上任一所述LGALS12基因为编码LGALS12蛋白的基因。
以上任一所述LGALS12基因为编码区如序列表的序列2所示的基因。
以上任一所述用于抑制LGALS12基因表达的物质为LGALS12-siRNA2、LGALS12-siRNA1或LGALS12-siRNA3。
本发明还保护LGALS12-siRNA2、LGALS12-siRNA1或LGALS12-siRNA3。
LGALS12-siRNA1为由单链核酸分子1-1和单链核酸分子1-2组成的具有粘末端的双链核酸分子。LGALS12-siRNA2为由单链核酸分子2-1和单链核酸分子2-2组成的具有粘末端的双链核酸分子。LGALS12-siRNA3为由单链核酸分子3-1和单链核酸分子3-2组成的具有粘末端的双链核酸分子。
单链核酸分子1-1如序列表的序列5所示。单链核酸分子1-2如序列表的序列6所示。单链核酸分子2-1如序列表的序列3所示。单链核酸分子2-2如序列表的序列4所示。单链核酸分子3-1如序列表的序列7所示。单链核酸分子3-2如序列表的序列8所示。
本发明还保护序列表的序列1所示的蛋白质。
本发明还保护序列表的序列1所示的蛋白质的编码基因。所述编码基因的编码区具体如序列表的序列2所示。
本发明还保护序列表的序列1所示的蛋白质在促进脂肪细胞分化中的应用。所述脂肪细胞为猪脂肪细胞。所述脂肪细胞为肌肉组织来源的脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的脂肪细胞。
以上任一所述猪具体可为外三元猪。
为了研究半乳糖凝集素12在猪前体脂肪细胞分化过程中的作用，本发明的发明人设计并制备了针对LGALS12基因的siRNA，将siRNA感染猪的肌肉组织来源的前体脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的前体脂肪细胞，检测细胞分化情况，检测成脂标志基因表达情况以及ERK1/2蛋白水平。结果表明，LGALS12-siRNA显著降低了LGALS12基因的表达，LGALS12基因表达降低后，细胞的脂质积累被抑制，成脂关键基因表达水平降低，脂解基因表达水平升高，PKA和Erk1/2的磷酸化水平增加。LGALS12蛋白可能通过抑制PKA-ERK1/2的磷酸化促进脂肪细胞分化，而LGALS12-siRNA对于LGALS12蛋白具有抑制作用，从而可以抑制脂肪细胞分化。
本发明对于瘦肉型猪的育种具有重大价值。
附图说明
图1为诱导成脂分化前和诱导成脂分化后标志基因的表达情况。
图2为诱导成脂分化前和诱导成脂分化后在倒置生物显微镜下观察的照片。
图3为siRNA对LGALS12基因的抑制效果。
图4为分光光度计检测OD值的结果。
图5为细胞中的甘油三酯含量。
图6为相关基因表达情况。
图7为Western blot检测HSL蛋白、FAS蛋白的水平。
图8为干扰LGALS12后促进Erk1/2的磷酸化的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置3-5个重复处理，并设置三次重复试验，试验数据以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，采用SPSS16.0软件进行数据分析，用Student t检验进行显著性检验。实施例中，基因相对表达水平采用2-△△Ct法计算，以β-actin作为内参基因。
本发明的发明人从外三元猪中获得了序列表的序列1所示的LGALS12蛋白。LGALS12蛋白的全称为半乳糖凝集素12。外三元猪中，LGALS12基因的编码框如序列表的序列2所示。
实施例1、LGALS12-siRNA的设计
LGALS12-siRNA1为由单链核酸分子1-1和单链核酸分子1-2组成的具有粘末端的双链核酸分子；
单链核酸分子1-1(序列表的序列5)：5'-GCCAGAUAUUGCCAUCCAUTT-3'；
单链核酸分子1-2(序列表的序列6)：5'-AUGGAUGGCAAUAUCUGGCTT-3'。
LGALS12-siRNA2为由单链核酸分子2-1和单链核酸分子2-2组成的具有粘末端的双链核酸分子；
单链核酸分子2-1(序列表的序列3)：5'-GCGUGAAUGGACUCCACUUTT-3'；
单链核酸分子2-2(序列表的序列4)：5'-AAGUGGAGUCCAUUCACGCTT-3'。
LGALS12-siRNA3为由单链核酸分子3-1和单链核酸分子3-2组成的具有粘末端的双链核酸分子；
单链核酸分子3-1(序列表的序列7)：5'-GGCUGAAGUUGGCACUCAATT-3'；
单链核酸分子3-2(序列表的序列8)：5'-UUGAGUGCCAACUUCAGCCTT-3'。
Scramble-siRNA由单链核酸分子4-1和单链核酸分子4-2组成的具有粘末端的双链核酸分子；
单链核酸分子4-1：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；
单链核酸分子4-2：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
实施例2、LGALS12-siRNA抑制脂肪细胞分化
一、猪前体脂肪细胞的制备
洗涤液(pH7.2-7.4)：NaCl 2g、KCl 0.05g、Na2HPO4·12H2O 0.725g、KH2PO4 0.05g，定容至250mL，高压灭菌后加入青霉素和链霉素，使青霉素浓度为100IU/mL、链霉素浓度为100μg/mL，4℃备用。
消化液：0.1g I型胶原酶(Gibco)、2g牛血清白蛋白，溶解于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，10mL/支进行分装，-20℃保存备用。
无菌状态下采集1-3日龄外三元猪仔猪的背最长肌，用洗涤液洗涤，然后剪成约1mm3的组织块；取组织块，浸没于消化液中，37℃振荡消化90-120min，然后用200目钢筛过滤并收集滤液；取滤液，常温、1500rpm离心10min，收集细胞沉淀，用DMEM完全培养基重悬，得到细胞悬液；将细胞悬液接种于35mm培养皿中(接种密度为：5×104个细胞/cm2)，加入适量的DMEM完全培养基，置37℃、5％CO2培养箱培养1h；采用差速贴壁法，收集贴壁的细胞，即为肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞。
无菌状态下采集1-3日龄外三元猪仔猪的皮下脂肪组织，用洗涤液洗涤，然后剪成约1mm3的组织块；取组织块，浸没于消化液中，37℃振荡消化45-60min，然后用200目钢筛过滤并收集滤液；取滤液，常温、1500rpm离心10min，收集细胞沉淀，即为皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。
将肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞和皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞进行形态观察。
肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞和皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞分别进行诱导成脂分化(方法同步骤三的6)，检测诱导成脂分化前和诱导成脂分化后标志基因(pref-1基因)的表达情况。结果见图1，IM对应肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，SC对应皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。
肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞和皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞分别进行诱导成脂分化(方法同步骤三的6)，然后用10％甲醛固定30min，然后用PBS缓冲液充分洗涤细胞，然后用60％油红O工作液染色30min，然后用PBS缓冲液充分洗涤细胞，在倒置荧光生物显微镜下观察的照片见图2。图2中,A对应肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，B对应皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。
二、siRNA感染猪前体脂肪细胞后对LGALS12基因表达的影响
供试siRNA为：LGALS12-siRNA1、LGALS12-siRNA2、LGALS12-siRNA3或Scramble-siRNA。
供试细胞为：步骤一制备的肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。
1、取0.6nmol供试siRNA，加入Opti-MEM培养基至体积为1.5ml，充分混匀，孵育5min。
2、取30μl脂质体2000，加入Opti-MEM培养基至体积为1.5ml，充分混匀，孵育5min。
3、将步骤1得到的溶液和步骤2得到的溶液混合，震荡混匀，孵育20min，得到混合液。
4、将供试细胞接种至装有DMEM完全培养基的6孔细胞培养板(约3×105个细胞/孔)，培养至细胞密度约80％-90％(转染前2-4h更换新鲜的DMEM完全培养基)。
5、转染：将步骤3得到的混合液滴加到完成步骤4的细胞培养板中(500μl/孔)，培养72小时。
6、完成步骤5后，进行诱导成脂分化(方法同步骤三的6)，然后收集细胞，提取RNA，反转录得到cDNA。
7、以步骤6得到的cDNA为模板，以β-actin基因为内参基因，采用real-time PCR检测LGALS12基因的相对表达水平。
用于检测LGALS12基因的引物：CCCGACGGCTGTCACCAAGA；CAACCCTCGCTTCCATACCA。
用于检测β-actin基因的引物：CGTGAAAAGATGACCCAGATCA；CACAGCCTGGATGGCTACGT。
反应体系(25μl)：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)12.5μl，上游引物(10μmol/L)1μl，下游引物(10μmol/L)1μl，cDNA模板2μl，ddH2O 8.5μl。
反应程序：95℃预变性30s、95℃变性5s、60℃退火30s，共45个循环。
结果见图3。图3中，A为肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，B为皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。LGALS12-siRNA1、LGALS12-siRNA2和LGALS12-siRNA3均能有效沉默LGALS12基因，抑制细胞中LGALS12基因的表达。对于肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞来说，LGALS12-siRNA2的效果最好。对于皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞来说，三种LGALS12-siRNA效果无显著差异。
三、沉默LGALS12基因对猪前体脂肪细胞分化的影响
供试细胞为：步骤一制备的肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞或皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。
1、取0.6nmol供试siRNA(LGALS12-siRNA2或Scramble-siRNA)，加入Opti-MEM培养基至体积为1.5ml，充分混匀，孵育5min。
2、取30μl脂质体2000，加入Opti-MEM培养基至体积为1.5ml，充分混匀，孵育5min。
3、将步骤1得到的溶液和步骤2得到的溶液混合，震荡混匀，孵育20min，得到混合液。
4、将供试细胞接种至装有DMEM完全培养基的6孔细胞培养板(约106个细胞/孔)，培养至细胞密度约80％-90％(转染前2-4h更换新鲜的DMEM完全培养基)。
5、转染：将步骤3得到的混合液滴加到完成步骤4的细胞培养板中(500μl/孔)，培养72小时。
6、完成步骤5后，收集细胞，诱导成脂分化。
诱导成脂分化的具体步骤：在含0.5mM IBMX、1μM DEX和5μg/ml insulin的DMEM完全培养基中培养2天，然后转移至含5μg/ml insulin的DMEM完全培养基培养8天，然后弃除培养基并用PBS缓冲液充分洗涤细胞。
7、完成步骤6后，用10％甲醛固定30min，然后用PBS缓冲液充分洗涤细胞，然后用60％油红O工作液染色30min，然后用PBS缓冲液充分洗涤细胞，在每孔加入1ml异丙醇，充分震荡1分钟，采用分光光度计检测OD值(510nm)。结果见图4。图4中，A为肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，B为皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。
8、完成步骤6后，收集细胞，利用甘油三酯试剂盒(南京建成)检测细胞中的甘油三酯含量，结果以单位细胞总蛋白(g)中甘油三酯的含量表示(mmol)。结果见图5。图5中，A为肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，B为皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。
结果表明，LGALS12-siRNA2能够抑制前体脂肪细胞进行诱导成脂分化后细胞中脂滴的积累(**P<0.01)和胞内甘油三酯含量(**P<0.01)，显著降低前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化程度。
四、相关基因表达情况
成脂标志蛋白包括：过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomeproliferator-activated receptorγ,PPARγ)、脂肪酸结合蛋白2(Adipocyte protein2,ap2)和脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase，FAS)。脂解蛋白包括：激素敏感脂肪酶(Hormone sensitive lipase，HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceridelipase,ATGL)、脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)。
完成步骤三的6后，利用TRIZOL收集细胞，提取RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以β-actin基因为内参基因，采用real-time PCR检测PPARγ基因、aP2基因、FAS基因、HSL基因、ATGL基因、LPL基因的相对表达水平。
检测PPARγ基因的引物：AGGACTACCAAAGTGCCATCAAA；GAGGCTTTATCCCCACAGACAC。
检测aP2基因的引物：GAGCACCATAACCTTAGATGGA；AAATTCTGGTAGCCGTGACA。
检测FAS基因的引物：AGCCTAACTCCTCGCTGCAAT；TCCTTGGAACCGTCTGTGTTC。
检测HSL基因的引物：CACTGACTGCTGACCCCAAG；TCCTCACTGTCCTGTCCTTCAC。
检测ATGL基因的引物：CGTGAAAAGATGACCCAGATCA；CACAGCCTGGATGGCTACGT。
检测LPL基因的引物：GGAGAGAGGAAGGGAAAACAGAG；AGACCGACCAATAAACTGCAAAG。
检测β-actin基因的引物：CGTGAAAAGATGACCCAGATCA；CACAGCCTGGATGGCTACGT。
反应体系(25μl)：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)12.5μl，上游引物(10μmol/L)1μl，下游引物(10μmol/L)1μl，cDNA模板2μl，ddH2O 8.5μl。
反应程序：95℃预变性30s、95℃变性5s、60℃退火30s，共45个循环。
结果所见图6。图6中，IM对应肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，SC对应皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。LGALS12-siRNA2明显降低了PPARγ基因、aP2基因和FAS基因的表达水平，并且显著上调了HSL基因的表达水平。对于皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞来说，LGALS12-siRNA2明显显著增加ATGL基因的表达水平。
完成步骤三的6后，收集细胞，提取总蛋白，通过Western blot检测HSL蛋白、FAS蛋白的水平(通过灰度进行定量)。结果见图7。图7中，IM对应肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，SC对应皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。LGALS12-siRNA2明显下调了FAS蛋白的水平，并且显著上调了HSL蛋白的水平。
五、干扰LGALS12后促进Erk1/2的磷酸化
完成步骤三的6后，收集细胞，提取总蛋白，通过Western blot检测检测PKA-Erk1/2信号通路关键蛋白的水平。结果见图8。图8中，IM对应肌肉组织来源的猪前体脂肪细胞，SC对应皮下脂肪组织来源的猪前体脂肪细胞。LGALS12-siRNA2明显促进了PKA和Erk1/2的磷酸化，即LGALS12蛋白可能通过PKA-Erk1/2信号通路促进猪前体脂肪细胞分化。
SEQUENCE LISTING
<110> 嘉兴学院
<120> 用于抑制LGALS12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用
<130> GNCYX181618
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 314
<212> PRT
<213> Sus scrofa domesticus
<400> 1
Met Ser Pro Gly Glu Lys Leu Asp Pro Leu Pro Asp Thr Phe Ile Leu
1 5 10 15
Gln Pro Pro Val Phe His Pro Val Val Pro Tyr Val Thr Thr Ile Phe
20 25 30
Gly Gly Leu Arg Ala Gly Lys Met Val Gln Leu Gln Gly Val Val Pro
35 40 45
Leu Asp Ala Arg Arg Phe Gln Val Asp Phe Gln Cys Gly Cys Ser Leu
50 55 60
His Pro Arg Pro Asp Ile Ala Ile His Phe Asn Pro Arg Phe His Thr
65 70 75 80
Thr Lys Pro His Val Ile Cys Asn Thr Leu Gln Gly Gly His Trp Gln
85 90 95
Ala Glu Ala Arg Trp Pro His Leu Ala Leu Gln Arg Gly Ala Ser Phe
100 105 110
Leu Ile Leu Phe Leu Phe Gly Asn Glu Glu Met Lys Val Ser Val Asn
115 120 125
Gly Leu His Phe Leu His Tyr Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Ser Arg Val
130 135 140
Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Asp Ile Leu Val Thr Ala Val Gly Phe
145 150 155 160
Leu Asn Ile Asn Pro Phe Val Glu Gly Gly Ser Glu Tyr Pro Val Gly
165 170 175
His Pro Phe Leu Leu Gln Ser Pro Arg Leu Glu Val Pro Cys Ser Arg
180 185 190
Ala Leu Pro Arg Gly Leu Trp Pro Gly Gln Val Ile Ile Val Arg Gly
195 200 205
Leu Val Leu Pro Glu Pro Lys Asp Phe Thr Leu Arg Leu Arg Asp Glu
210 215 220
Ala Ala His Val Pro Val Thr Leu Arg Ala Ser Phe Ala Asp Arg Thr
225 230 235 240
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275 280 285
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<212> DNA
<213> Sus scrofa domesticus
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atgtcacctg gagagaaact ggacccgctt cctgacacct tcatcctgca gccgccagtc 60
ttccacccgg tggttcctta tgtcacgacg atttttggtg gcctgcgagc aggcaagatg 120
gtccagctcc agggagtggt ccctctagat gcgcgcaggt tccaggtgga cttccagtgc 180
ggctgcagcc tacatccccg gccagatatt gccatccatt tcaaccctcg cttccatacc 240
accaagcccc acgtcatctg caacaccctt cagggtgggc actggcaagc cgaggcccgg 300
tggccccacc tggccctgca gagaggagcc agcttcctca tcctctttct ctttggaaat 360
gaggagatga aggtgagcgt gaatggactc cactttctcc actaccgcta ccggctcccg 420
ctgtcccgtg tagacaccct gggcatatac ggtgacatct tggtgacagc cgtcgggttt 480
ctgaacatca acccgtttgt ggagggcggt agcgagtatc cagttggaca ccctttcctg 540
ctgcagagcc ccaggctgga ggtgccctgt tcgcgtgccc ttccccgggg tctctggccc 600
ggacaggtca tcatagtgcg gggactggtc ttgccagagc cgaaggattt cacgctccgt 660
ctgcgggacg aggccgccca cgttcctgtg acgctcaggg catccttcgc agaccgaact 720
ctagcctggg tctcgcgctg gggcgggaag aagctgatcc cggccccctt cctcttctac 780
ccccagcgat tcttcgaggt gctgctcctg tgccaggagg gagggctgaa gttggcactc 840
aacgggcaag gcctgggggc caccagcctg ggcccacagg ccctggagcg gctacgagag 900
ctgcacatca gtggcagcat ccagctctac tgtgtccact actga 945
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gcgugaaugg acuccacuut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aaguggaguc cauucacgct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gccagauauu gccauccaut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
auggauggca auaucuggct t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
ggcugaaguu ggcacucaat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
uugagugcca acuucagcct t 21

Claims (10)

1.用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用。
2.用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在抑制前体脂肪细胞分化中的应用。
3.用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在抑制前体脂肪细胞向脂肪细胞分化中的应用。
4.用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在猪的育种中的应用；所述育种目标为获得瘦肉型猪。
5.用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质的应用，为降低脂肪细胞中脂滴的含量和/或甘油三酯的含量。
6.用于抑制LGALS12基因表达的物质或用于抑制LGALS12蛋白活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：
(a)抑制脂肪细胞分化；
(b)抑制前体脂肪细胞分化；
(c)抑制前体脂肪细胞向脂肪细胞分化；
(d)猪的育种；所述育种目标为获得瘦肉型猪；
(e)降低脂肪细胞中脂滴的含量和/或甘油三酯的含量。
7.LGALS12-siRNA2、LGALS12-siRNA1或LGALS12-siRNA3；
LGALS12-siRNA1为由单链核酸分子1-1和单链核酸分子1-2组成的具有粘末端的双链核酸分子；LGALS12-siRNA2为由单链核酸分子2-1和单链核酸分子2-2组成的具有粘末端的双链核酸分子；LGALS12-siRNA3为由单链核酸分子3-1和单链核酸分子3-2组成的具有粘末端的双链核酸分子；
单链核酸分子1-1如序列表的序列5所示。单链核酸分子1-2如序列表的序列6所示。单链核酸分子2-1如序列表的序列3所示。单链核酸分子2-2如序列表的序列4所示。单链核酸分子3-1如序列表的序列7所示。单链核酸分子3-2如序列表的序列8所示。
8.序列表的序列1所示的蛋白质。
9.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
10.序列表的序列1所示的蛋白质在促进脂肪细胞分化中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041052A (zh) * 2019-12-30 2020-04-21 嘉兴学院 mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用
CN112210529A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 青岛嘉智生物技术有限公司 一种抑制猪前体脂肪细胞分化的提取物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103103213A (zh) * 2013-01-29 2013-05-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法
CN104704122A (zh) * 2012-04-20 2015-06-10 艾珀特玛治疗公司 产热的miRNA调节剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104704122A (zh) * 2012-04-20 2015-06-10 艾珀特玛治疗公司 产热的miRNA调节剂
CN103103213A (zh) * 2013-01-29 2013-05-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WENJING WU等: "Knockdown of LGALS12 inhibits porcine adipocyte adipogenesis via PKA–Erk1/2 signaling pathway", 《ACTA BIOCHIM BIOPHYS SIN》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041052A (zh) * 2019-12-30 2020-04-21 嘉兴学院 mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用
CN111041052B (zh) * 2019-12-30 2021-05-28 嘉兴学院 mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用
CN112210529A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 青岛嘉智生物技术有限公司 一种抑制猪前体脂肪细胞分化的提取物
CN112210529B (zh) * 2020-10-15 2022-06-07 青岛嘉智生物技术有限公司 一种抑制猪前体脂肪细胞分化的提取物
CN114934089A (zh) * 2020-10-15 2022-08-23 青岛嘉智生物技术有限公司 一种用于瘦肉猪育种的生物制剂
CN114934089B (zh) * 2020-10-15 2023-08-01 青岛嘉智生物技术有限公司 一种用于瘦肉猪育种的生物制剂

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