CN109134622A - 口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK‑21悬浮细胞培养的口蹄疫病毒液中多步连续集成纯化得到口蹄疫抗原，包括经离心澄清、超滤浓缩和/或深层过滤澄清后的离子交换层析等步骤。该多步连续集成纯化方法，使用深层过滤技术结合PEG沉淀法去除口蹄疫超滤浓缩液中的部分杂蛋白成分，再根据口蹄疫抗原表面所带电荷的差异性，应用离子交换层析和疏水层析进行多步层析纯化的工艺。本发明可用于高纯度口蹄疫抗原的制备，对超滤浓缩液的单次处理量可达900ml，纯度可达到90％，适用于要求纯度大于90％的口蹄疫抗原的大规模生产，并可根据生产规模进行扩缩，用于生产高纯度抗原的精制口蹄疫疫苗。

Description

口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法

技术领域

本发明属于生物医药领域中的疫苗制备，涉及一种悬浮培养的口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起的牛、猪和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫以口腔黏膜、舌面、唇、鼻镜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征，平均致死率仅为1％，但是被感染动物100％发病，且传播效力极高，使实际的畜产量锐减。口蹄疫一旦爆发将造成巨大的经济损失，因此世界各国对该病的研究极为重视。鉴于其危害之大，影响范围之广，口蹄疫被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病之首。

目前，用于预防口蹄疫的疫苗为灭活口蹄疫病毒疫苗。传统的口蹄疫疫苗的制备方法是用BHK21细胞进行活病毒悬浮培养，将病毒液进行离心或过滤，去除细胞碎片，对收获的口蹄疫病毒液进行灭活处理，将灭活后的口蹄疫病毒液直接用作口蹄疫疫苗。该方法生产的疫苗由于抗原纯度较低(纯度一般为12.5％)，杂质含量较高(主要是宿主细胞蛋白质及DNA)，存在较严重的副反应。随着公众对畜牧产品的安全性和品质的关注度日益提升，生产企业和用户对口蹄疫疫苗的安全性和有效性提出了更高的要求；与此同时，相关质检机构也提高了口蹄疫疫苗的质量标准。由于在口蹄疫病毒的纯化过程中，病毒的多聚亚基复杂结构极易被破坏，导致聚集或解聚，从而丧失抗原特性。因此，需要更精细的口蹄疫病毒抗原纯化工艺去除可能会导致副反应的宿主细胞蛋白质及DNA。

目前，用于口蹄疫病毒抗原纯化的常规技术包括PEG沉淀、超滤浓缩、深层过滤等，这些技术由于操作简便成本较低而广泛应用于口蹄疫疫苗的纯化，但以上方法对于宿主细胞蛋白及DNA的去除能力有限。还有在实验室规模应用凝胶过滤层析(如公开号为CN102988970A的专利申请中提到)纯化口蹄疫病毒的，能够有效提高抗原的纯度，但由于单次处理量仅为200μg/ml层析介质，处理量小，成本的限制与口蹄疫疫苗的市场需求规模之间的矛盾，使得该方法尚未应用到实际生产中。

发明内容

本发明旨在提供一种口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，以提高抗原纯度，保证疫苗安全，加大单次处理量以适应市场需求，该多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的口蹄疫病毒液中多步连续集成纯化得到口蹄疫抗原，包括经离心澄清、超滤浓缩和/或深层过滤澄清后的离子交换层析等步骤。

所述离子交换层析为阴离子交换层析，层析柱选用Diamond Q Mustang阴离子交换层析柱，紫外检测波长为280nm。

在离子交换层析后还有疏水层析步骤；优选的，所述疏水层析的层析柱选用Diamond Phenyl Mustang疏水层析柱，紫外检测波长为280nm。

所述离心澄清具体为：将口蹄疫病毒培养液在3000-8000rpm下离心15-30min，取上清即为澄清液。

所述超滤浓缩具体为：用切向流超滤浓缩对离心澄清获得的澄清液进行超滤浓缩得到浓缩液，浓缩倍数为10-60倍，截留分子量为300-500KDa。

所述深层过滤澄清采用深层过滤滤膜澄清或采用PEG沉淀澄清。

所述深层过滤澄清为深层过滤滤膜澄清，对超滤浓缩得到的浓缩液用深层滤芯以100-300L/h的恒定流速进行澄清过滤，膜堆进出口压差控制在0.5MPa以内，得到浓缩澄清液。

所述深层过滤澄清为PEG沉淀澄清，向超滤浓缩得到的浓缩液中加入终浓度为5-15％(优选6-12％)(W/V，g/100ml)的PEG，6000rpm/min离心30min，收集上清，即为浓缩澄清液。

所述离子交换层析具体为：用平衡液稀释深层过滤澄清得到的浓缩澄清液后上样，上样体积为4倍柱体积，上样流速90-120cm/h；再用平衡液对离子交换层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后用平衡液和洗脱液进行阶段洗脱，洗脱流速为90-120cm/h，收集280nm紫外检测到的第一个吸收峰，即为阴离子交换洗脱液；

所述平衡液优选0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH7.2-7.5，所述洗脱液优选含0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和1mol/L氯化钠(NaCl)溶液，pH 7.2-7.5。

所述疏水层析具体为：对疏水层析柱进行平衡，向离子交换层析得到的阴离子交换洗脱液中加入硫酸铵溶液进行稀释后上样，上样体积为4倍柱体积，上样流速为90-120cm/h；再对疏水层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后用平衡液和洗脱液进行洗脱，洗脱流速为90-120cm/h，收集紫外280nm检测到的第一个吸收峰，即为纯化后的口蹄疫抗原液；

所述平衡液优选含0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和1mol/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液，pH 7.2-7.5；洗脱液优选为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH 7.2-7.5。

本发明提供的口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，使用深层过滤法或PEG沉淀法去除口蹄疫超滤浓缩液中的部分杂蛋白成分，再根据口蹄疫抗原表面所带电荷的差异性，应用离子交换层析法(离子交换层析法根据口蹄疫抗原与宿主细胞蛋白表面所带电荷种类和数量差异实现分离)，以及利用口蹄疫抗原与杂蛋白表面疏水区域的差异性应用疏水层析法(疏水层析法依据口蹄疫抗原表面暴露的疏水区域与细胞蛋白表面疏水区域的不同实现分离纯化)进行多步层析纯化。本发明可用于高纯度口蹄疫抗原的制备，对超滤浓缩液的单次处理量可达900ml，纯度可达到90％，适用于要求纯度大于90％的口蹄疫抗原的大规模生产，并可根据生产规模进行扩缩，用于生产高纯度抗原的精制口蹄疫疫苗。

附图说明

图1为Diamond Q Mustang离子交换层析图(A型口蹄疫抗原)。

图2为Diamond phenyl Mustang疏水层析图(A型口蹄疫抗原)。

图3为纯化前、后口蹄疫抗原的SDS-PAGE电泳图谱(A型口蹄疫抗原)。

具体实施方式

为提高抗原纯度保证疫苗安全，加大单次处理量以适应市场需求，本发明根据口蹄疫抗原表面电荷特点结合口蹄疫抗原表面疏水区域的特点，提供了一种口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法。该方法使用深层过滤法或PEG沉淀法去除口蹄疫超滤浓缩液中的部分杂蛋白成分，再根据口蹄疫抗原表面和杂蛋白表面所带电荷与疏水区域的差异性，应用离子交换层析法(根据口蹄疫抗原与宿主细胞蛋白表面所带电荷种类和数量差异实现分离)和疏水层析法(依据口蹄疫抗原表面暴露的疏水区域与细胞蛋白表面疏水区域的不同实现分离纯化)进行多步层析纯化。

本发明口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法可以依次经离心澄清、超滤浓缩、深层过滤澄清、离子交换层析等步骤；也可以依次经离心澄清、深层过滤澄清、离子交换层析等步骤；也可以依次经离心澄清、超滤浓缩、离子交换层析等步骤；为了进一步提高抗原纯度，离子交换层析后还可以增加疏水层析步骤。

具体的，本发明提供的一种口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的口蹄疫病毒液中多步连续集成纯化得到口蹄疫抗原，包括以下步骤：

1)用连续流离心机对口蹄疫病毒培养液进行离心澄清得到澄清液，离心转速为3000-8000rpm，时间为15-30min；

2)使用切向流超滤浓缩对步骤1)获得的澄清液进行超滤浓缩得到浓缩液，浓缩倍数为10-60倍，截留分子量为300-500KDa；

3)用深层过滤法(滤膜孔径为0.15-0.65μm)或PEG(分子量为2000-20000)沉淀法对口蹄疫抗原超滤浓缩液进行澄清过滤，膜堆进出口压差控制在0.5MPa以内，得到浓缩澄清液；PEG沉淀法具体为：向步骤2)得到的浓缩液中加入终浓度为5-15％(优选6-12％)(W/V，g/100ml)的PEG，6000rpm/min离心30min，收集上清，即得到浓缩澄清液；

4)用阴离子交换层析柱对步骤3)得到的浓缩澄清液进行纯化，具体为：

①层析柱及层析仪的准备

Diamond Q Mustang阴离子交换层析柱，购自博格隆生物技术有限公司，柱高20厘米；层析仪为GE公司的蛋白层析系统(AKTA pilot)，紫外检测波长为280nm。

②离子交换层析

平衡液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH 7.2-7.5，洗脱液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)+1mol/L氯化钠(NaCl)溶液，pH 7.2-7.5；先用平衡液稀释步骤3)所得浓缩澄清液，使其趋近平衡液的pH值和电导值后上样，上样体积为4倍柱体积，上样流速90-120cm/h。

上样结束后，继续使用平衡液对层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后，开始洗脱；用70％平衡液+30％洗脱液进行阶段洗脱，洗脱流速为90-120cm/h；280nm紫外检测到的第一个吸收峰为口蹄疫抗原吸收峰，第二个为杂质吸收峰，收集第一个吸收峰的洗脱样品。

5)用疏水层析柱对步骤4)得到的洗脱样品(即阴离子交换洗脱液)进行纯化，得到纯化的口蹄疫抗原，具体为：

平衡液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)+1mol/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液，pH 7.2-7.5；洗脱液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH7.2-7.5。用80％平衡液+20％洗脱液对层析柱及系统进行平衡。

加入硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液稀释调整步骤4)所得阴离子交换洗脱液，使其趋近平衡液的pH值和电导值后上样。上样体积为4倍柱体积，上样流速90-120cm/h。

上样结束后，用80％平衡液+20％洗脱液对层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后，开始洗脱。用40％平衡液+60％洗脱液进行洗脱，洗脱流速为90-120cm/h。紫外280nm检测到的第一个吸收峰为口蹄疫抗原吸收峰，第二个为杂质吸收峰，收集第一个吸收峰的洗脱样品，即为纯化后口蹄疫抗原液。该口蹄疫抗原液后续可经稀释、与油相混合乳化等工序制成口蹄疫疫苗。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1、A型口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化

本实施例A型口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的A型口蹄疫病毒培养液中多步连续集成纯化A型口蹄疫抗原。BHK-21悬浮细胞培养的A型口蹄疫病毒液为灭活口蹄疫抗原。该纯化方法包括以下步骤：

1)离心澄清

用连续流离心机(型号CSC-6-06-476，购自德国GEA)对A型口蹄疫病毒培养液进行离心澄清，转速为8000rpm，时间为15min；弃去细胞碎片等沉淀，收集上清液即澄清液备用。

2)超滤浓缩

先使用0.5M NaOH溶液对中空纤维超滤柱(规格为UFP-300-E-75)进行清洗并浸泡30min；再使用经过滤除菌的PBS液对中空纤维柱进行清洗，直至pH小于7.5；

调节泵速，控制TMP(跨膜压力)不高于1.0bar，对步骤1)得到的澄清液进行超滤浓缩得到浓缩液，浓缩倍数为50倍，截留分子量为300KDa。

3)深层过滤澄清

用30sp深层滤芯以100L/h的恒定流速对步骤2)获得的浓缩液进行澄清过滤，膜堆进出口压差控制在0.5MPa以内，得到浓缩澄清液，放4℃冰箱备用。

4)离子交换层析

用Diamond Q Mustang阴离子交换层析柱对步骤3)获得的浓缩澄清液进行纯化，具体过程如下：

①层析柱及层析仪的准备

Diamond Q Mustang阴离子交换层析柱，购自博格隆生物技术有限公司，柱高20厘米；层析仪为GE公司的蛋白层析系统(AKTA pilot)，紫外检测波长为280nm。

②离子交换层析

平衡液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH 7.2-7.5，洗脱液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)+1mol/L氯化钠(NaCl)溶液，pH 7.2-7.5；用平衡液稀释步骤3)所得浓缩澄清液，使其趋近平衡液的pH值和电导值后上样，上样体积为4倍柱体积，上样流速120cm/h。

上样结束后，继续使用平衡液对层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后，开始洗脱；用70％平衡液+30％洗脱液进行阶段洗脱，洗脱流速为120cm/h；离子交换层析图如图1所示，其中280nm紫外检测到的第一个吸收峰为口蹄疫抗原吸收峰，第二个为杂质吸收峰，收集第一个吸收峰的洗脱样品，备用。

5)疏水层析

用Diamond Phenyl Mustang疏水层析柱对步骤4)离子交换层析获得的口蹄疫抗原洗脱样品进行纯化，具体方法如下：

平衡液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)+1mol/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液，pH 7.2-7.5；洗脱液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH7.2-7.5。用80％平衡液+20％洗脱液对层析柱及系统进行平衡。

加入硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液稀释调整步骤4)所得口蹄疫抗原洗脱样品，使其趋近平衡液的pH值和电导值后上样。上样体积为4倍柱体积，上样流速120cm/h。

上样结束后，用80％平衡液+20％洗脱液对层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后，开始洗脱。用40％平衡液+60％洗脱液进行洗脱，洗脱流速为120cm/h。DiamondPhenyl Mustang疏水层析图如图2所示，其中紫外280nm检测到的第一个吸收峰为口蹄疫抗原吸收峰，第二个为杂质吸收峰，收集第一个吸收峰的洗脱样品，即为纯化后口蹄疫抗原液。

分别对步骤4)收集到的洗脱样品和步骤5)收集到的洗脱样品使用蔗糖密度梯度离心法和ELISA方法平行测定A型口蹄疫抗原146S含量，并计算回收率，结果分别见表1和表2，SDS-PAGE电泳图谱如图3所示。

表1 A型口蹄疫抗原经离子交换层析后样品146S含量及抗原回收率检测结果

从表1可以看出通过控制离子交换层析洗脱条件，可大幅提高抗原纯度(从5.23μg/mL提高到15.20μg/mL)，且抗原回收率达到85.87％；收集第一个吸收峰之后的洗脱液检测发现，其中的抗原纯度仅为3％，说明通过离子交换层析，目标组分和杂质组分实现了有效的分离，且回收率高，损失小。

表2 A型口蹄疫抗原经疏水层析后样品146S含量及抗原回收率检测结果

从表2可以看出通过控制疏水层析洗脱条件，可进一步大幅提高抗原纯度(从15.20μg/mL到31.10μg/mL)，且抗原回收率达到98.45％；收集第一个吸收峰之后的洗脱液检测发现，其中的抗原纯度仅为2％，说明疏水层析可以实现目标组分和杂质组分的有效分离。

如图3显示层析纯化前后病毒结构蛋白，纯化后可见口蹄疫抗原结构蛋白(框线内)，表明经过层析纯化实现了对杂质的有效去除。

实施例2、O型口蹄疫抗原的多步连续集成纯化

本实施例O型口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒培养液中多步连续集成纯化O型口蹄疫抗原。

BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒液为灭活口蹄疫抗原。

该纯化方法包括以下步骤：

1)离心澄清

用连续流离心机(型号CSC-6-06-476，购自德国GEA)对O型口蹄疫病毒培养液进行离心澄清，转速为8000rpm，时间为30min；弃去细胞碎片等沉淀，收集上清液即澄清液备用。

2)超滤浓缩

先使用0.5M NaOH溶液对超滤浓缩中空纤维柱(规格为UFP-300-E-75)进行清洗并浸泡30min；再使用经过滤除菌的PBS液对中空纤维柱进行清洗，直至pH小于7.5；

调节泵速，控制TMP(跨膜压力)不高于1.0bar，对步骤1)得到的澄清液进行超滤浓缩得到浓缩液，浓缩倍数为50倍，截留分子量为300KDa。

3)PEG澄清

向步骤2)获得的浓缩液中加入终浓度为5％(W/V，g/ml)的PEG 6000，6000rpm/min离心30min进行澄清，收集上清，即为浓缩澄清液，放4℃冰箱备用。

4)离子交换层析

用Capto Q(GE healthcare)阴离子交换层析柱对步骤3)获得的浓缩澄清液进行纯化，具体过程如下：

①层析柱及层析仪的准备

Capto Q阴离子交换层析柱，购自美国通用公司，柱高20厘米；层析仪为GE公司的蛋白层析系统(AKTA pilot)，紫外检测波长为280nm。

②离子交换层析

平衡液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH 7.2-7.5，洗脱液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)+1mol/L氯化钠(NaCl)溶液，pH 7.2-7.5；用平衡液稀释步骤3)所得浓缩澄清液，使其趋近平衡液的pH值和电导值后上样，上样体积为4倍柱体积，上样流速120cm/h。

上样结束后，继续使用平衡液对层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后，开始洗脱；用70％平衡液+30％洗脱液进行阶段洗脱，洗脱流速为120cm/h；280nm紫外检测到的第一个吸收峰为口蹄疫抗原吸收峰，第二个为杂质吸收峰，收集第一个吸收峰的洗脱样品，备用。

5)疏水层析

用Phenyl Sepharaose HP疏水层析柱对步骤4)离子交换层析获取的口蹄疫抗原洗脱样品进行纯化，具体方法如下：

平衡液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)+1mol/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液，pH 7.2-7.5；洗脱液为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH7.2-7.5。用80％平衡液+20％洗脱液对层析柱及系统进行平衡。

加入硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液稀释调整步骤4)所得口蹄疫抗原洗脱样品，使其趋近平衡液的pH值和电导值后上样。上样体积为4倍柱体积，上样流速120cm/h。

上样结束后，用80％平衡液+20％洗脱液对层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后，开始洗脱。用40％平衡液+60％洗脱液进行洗脱，洗脱流速为120cm/h。紫外280nm检测到的第一个吸收峰为口蹄疫抗原吸收峰，第二个为杂质吸收峰，收集第一个吸收峰的洗脱样品，即为纯化后口蹄疫抗原液。

分别对步骤4)收集到的洗脱样品和步骤5)收集到的洗脱样品使用蔗糖密度梯度离心法测定O型口蹄疫抗原146S含量，并计算回收率，结果分别见表3和表4。

表3 O型口蹄疫抗原经离子交换层析后样品146S含量及抗原回收率检测结果

从表3可以看出通过控制离子交换层析洗脱条件，可大幅提高抗原纯度(从6.47μg/mL提高到14.00μg/mL)，且抗原回收率达到80.30％；收集第一个吸收峰之后的洗脱液检测发现，其中的抗原纯度仅为2％，说明通过离子交换层析，目标组分和杂质组分实现了有效的分离。

表4 O型口蹄疫抗原经疏水层析后样品146S含量及抗原回收率检测结果

从表4可以看出通过有效控制疏水层析洗脱条件，可进一步大幅提高抗原纯度(从14.00μg/mL到24.65μg/mL)，且抗原回收率达到95.30％；收集第一个吸收峰之后的洗脱液检测发现，其中的抗原纯度仅为0.12％，说明疏水层析可以实现目标组分和杂质组分的有效分离。

比较例1

本比较例为O型口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒培养液中多步连续集成纯化O型口蹄疫抗原。

BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒液为灭活口蹄疫抗原。

该纯化方法包括以下步骤：

1)离心澄清

同实施例2。

2)超滤浓缩

同实施例2。

3)PEG澄清

无。

4)离子交换层析

无。

5)疏水层析

无。

分别对步骤2)得到的浓缩液使用蔗糖密度梯度离心法测定O型口蹄疫抗原146S含量，并计算回收率。处理体积：100ml，回收率：90％，纯度1％。

比较例2

本比较例为O型口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒培养液中多步连续集成纯化O型口蹄疫抗原。

BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒液为灭活口蹄疫抗原。

该纯化方法包括以下步骤：

1)离心澄清

无。

2)超滤浓缩

无。

3)PEG澄清

无。

4)离子交换层析

同实施例2。

5)疏水层析

无。

分别对离子交换层析得到的洗脱液使用蔗糖密度梯度离心法测定O型口蹄疫抗原146S含量，并计算回收率。处理体积：200ml，回收率：85％，纯度10％。

比较例3

本比较例为O型口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒培养液中多步连续集成纯化O型口蹄疫抗原。

BHK-21悬浮细胞培养的O型口蹄疫病毒液为灭活口蹄疫抗原。

该纯化方法包括以下步骤：

1)离心澄清

无。

2)超滤浓缩

无。

3)PEG澄清

无。

4)离子交换层析

无。

5)疏水层析

同实施例2。

分别对疏水层析得到的洗脱液使用蔗糖密度梯度离心法测定O型口蹄疫抗原146S含量，并计算回收率。处理体积：200ml，回收率：90％，纯度20％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种口蹄疫抗原的多步连续集成纯化方法，是从BHK-21悬浮细胞培养的口蹄疫病毒液中多步连续集成纯化得到口蹄疫抗原，其特征在于，包括经离心澄清、超滤浓缩和/或深层过滤澄清后的离子交换层析等步骤。

2.根据权利要求1所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析为阴离子交换层析，层析柱选用Diamond Q Mustang阴离子交换层析柱，紫外检测波长为280nm。

3.根据权利要求1或2所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，在离子交换层析后还有疏水层析步骤；优选的，所述疏水层析的层析柱选用Diamond Phenyl Mustang疏水层析柱，紫外检测波长为280nm。

4.根据权利要求1-3任一所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述离心澄清具体为：将口蹄疫病毒培养液在3000-8000rpm下离心15-30min，取上清即为澄清液。

5.根据权利要求1-4任一所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述超滤浓缩具体为：用切向流超滤浓缩对离心澄清获得的澄清液进行超滤浓缩得到浓缩液，浓缩倍数为10-60倍，截留分子量为300-500KDa。

6.根据权利要求1-5任一所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述深层过滤澄清采用深层过滤滤膜澄清或采用PEG沉淀澄清。

7.根据权利要求1-6任一所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述深层过滤澄清为深层过滤滤膜澄清，对超滤浓缩得到的浓缩液用深层滤芯以100-300L/h的恒定流速进行澄清过滤，膜堆进出口压差控制在0.5MPa以内，得到浓缩澄清液。

8.根据权利要求1-7任一所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述深层过滤澄清为PEG沉淀澄清，向超滤浓缩得到的浓缩液中加入终浓度为5-15％(优选6-12％)(W/V，g/100ml)的PEG，6000rpm/min离心30min，收集上清，即为浓缩澄清液。

9.根据权利要求2-8任一所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析具体为：用平衡液稀释深层过滤澄清得到的浓缩澄清液后上样，上样体积为4倍柱体积，上样流速90-120cm/h；再用平衡液对离子交换层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后用平衡液和洗脱液进行阶段洗脱，洗脱流速为90-120cm/h，收集280nm紫外检测到的第一个吸收峰，即为阴离子交换洗脱液；

所述平衡液优选0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH7.2-7.5，所述洗脱液优选含0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和1mol/L氯化钠(NaCl)溶液，pH 7.2-7.5。

10.根据权利要求3-9任一所述多步连续集成纯化方法，其特征在于，所述疏水层析具体为：对疏水层析柱进行平衡，向离子交换层析得到的阴离子交换洗脱液中加入硫酸铵溶液进行稀释后上样，上样体积为4倍柱体积，上样流速为90-120cm/h；再对疏水层析柱进行清洗，直至紫外吸收信号下降至平稳后用平衡液和洗脱液进行洗脱，洗脱流速为90-120cm/h，收集紫外280nm检测到的第一个吸收峰，即为纯化后的口蹄疫抗原液；

所述平衡液优选含0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和1mol/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)溶液，pH 7.2-7.5；洗脱液优选为0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液，pH 7.2-7.5。