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CN109108275A - 氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒、其制备方法及应用 Download PDF

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CN109108275A CN201710482072.8A CN201710482072A CN109108275A CN 109108275 A CN109108275 A CN 109108275A CN 201710482072 A CN201710482072 A CN 201710482072A CN 109108275 A CN109108275 A CN 109108275A
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Abstract

本发明提供了一种氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒、其制备方法及应用。本发明制得的抗菌金纳米颗粒具有优异的抗菌性，可对抗多药耐药菌；生物相容性好，将对人体细胞毒性小。可用于临床伤口处理，手术防止器官粘连，美容，治疗烧伤、烫伤、褥疮感染等各种创伤感染，是一种极为优良的医用抗菌材料。

Description

氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素的广泛使用和滥用导致多数抗菌药物对细菌没有抑制作用，使细菌产生耐药性。随着细菌感染性疾病的爆发和对抗生素产生抗性的细菌的兴起，迫切需要发现新的抗菌素。近年来，由于纳米尺寸的纳米材料的高表面积与体积比和新的物理和化学性质，抗菌纳米材料已成为传统小分子的抗生素的有希望的替代者。多种纳米材料，如银，铜，壳聚糖，氧化铁，氧化锌，碲等纳米颗粒，和石墨烯具有抗菌活性。然而，由于高毒性，复杂的修饰或较差的选择性，它们中的大多数不是理想的纳米抗生素。已经报道过的用作抗菌材料金纳米颗粒比较容易通过硫醇，胺和膦的修饰。例如，万古霉素修饰的金纳米颗粒可以增强万古霉素的抗菌活性。一系列小分子修饰的金纳米颗粒可以对抗多药耐药细菌(MDR)细菌感染。使用的小分子，4,6-二氨基-2-嘧啶硫醇(DAPT)本身没有抗细菌活性。当我们用它来修饰金纳米颗粒时，这种纳米颗粒可以抵抗革兰氏阴性细菌，包括抗生素敏感型和MDR型。此外，在金纳米颗粒上修饰非抗菌药物和嘧啶硫醇或直接修饰N-杂环分子，实现广谱抗菌金纳米颗粒。其可以抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，包括超级细菌。革兰氏阳性病原菌是住院患者血液和其他感染的常见原因，严重威胁生命安全。例如，最近MDR金黄色葡萄球菌是医院获得性感染的主要细菌类型，并引起世界范围的大范围感染和出现较高发病率。广谱抗菌材料可导致肠道微生物群的严重损伤，出现菌群失调现象。这样的菌群失调可能使得未受破坏的菌群中的微生物竞争而使细菌过度生长。因此，迫切需要开发用于精确靶向和预防革兰氏阳性感染的替代性抗菌材料。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有抗菌效果的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒，及其的制备方法和应用。
在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“Tween 80”是指：聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯；
术语“GluN”是指：D-葡糖胺；
术语“GalN”是指：D-半乳糖胺；
术语“ManN”是指：D-甘露糖胺；
术语“MRSA”是指：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒，所述抗菌金纳米颗粒包括：
单组份或多组分氨基糖；和
金纳米颗粒；
其中，所述氨基糖优选选自以下一种或多种：D-葡糖胺，D-半乳糖胺，和D-甘露糖胺。
根据本发明第一方面的抗菌金纳米颗粒，其中，所述抗菌金纳米颗粒的平均粒径为1～50nm，优选为2～10nm。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的抗菌金纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将氨基糖溶于去离子水得到氨基糖溶液，向溶液中加入三乙胺和Tween 80混合均匀；
(2)向(1)所得溶液中加入HAuCl4溶液，冰水浴搅拌；
(3)剧烈搅拌下向(2)所得溶液中滴加NaBH4溶液，冰水浴低速搅拌；
(4)去离子水透析(3)所得溶液，过滤并灭菌，得到所述抗菌金纳米颗粒，并储存在4℃。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述氨基糖溶液的浓度为0.01～0.20mol/L，优选为0.05～0.10mol/L，最优选为0.07mol/L；所述三乙胺与氨基糖溶液的体积比为1:100～1:200，优选为1:100～1:150，最优选为1:120；所述Tween 80与所述氨基糖的摩尔比为1:1～1:10，优选为1:1～1:5，最优选为1:1～1:2.8。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(2)中，所述HAuCl4溶液的浓度为0.05～0.5mol/L，优选为0.05～0.2mol/L，最优选为0.1mol/L；所述搅拌时间为1～20分钟，优选为5～15分钟，最优选为10分钟。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(3)中，所述NaBH4溶液的浓度为0.01～0.20mol/L，优选为0.02～0.10mol/L，最优选为0.075mol/L；所述剧烈搅拌速度为1000～2000rpm，优选为1000～1500rpm，最优选为1200rpm；所述冰水浴搅拌时间为0.5～3小时，优选为0.5～2小时，最优选为1小时。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(4)中，所述透析截止值为10～20kDa MW，优选为10～15kDa MW，最优选为14kDa MW；所述透析时间为10～48小时，优选为20～30小时，最优选为24小时。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(4)中，所述灭菌方法为过滤灭菌；优选地，所述灭菌方法使用0.1-0.25μm最优选0.22μm的滤膜过滤灭菌。
本发明的第三方面提供了根据第一方面所述的抗菌金纳米颗粒或按照第二方面所述的方法制备的抗菌金纳米颗粒在制备用于治疗多药耐药菌的药物或产品中的应用。
优选地，所述多药耐药菌选自以下一种或多种：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，单核细胞增生李斯特菌，屎肠球菌和金黄色葡萄球菌。
本发明的第四方面提供了根据第一方面所述的抗菌金纳米颗粒或按照第二方面所述的方法制备的抗菌金纳米颗粒在制备用于治疗临床伤口处理、手术防止器官粘连、美容、治疗烧伤、烫伤和/或褥疮感染的药物或产品中的应用。
本发明的目的在于合成抗菌金纳米颗粒，可以选择性和有效地针对革兰氏阳性菌和MDR菌株，以避免对革兰氏阴性等益生菌的误杀。我们筛选的氨基糖有D-葡糖胺(D-glucosamine,GluN)，D-半乳糖胺(D-galactosamine,GalN)或D-甘露糖胺(D-mannosamine,ManN)作为修饰分子来研究合成抗菌金纳米颗粒，由于氨基糖是细菌肽聚糖层的主要组分。氨基糖修饰的AuNP可以通过肽聚糖层并干扰细胞壁的合成从而使细菌死亡。与革兰氏阳性细菌相比，革兰氏阴性细菌具有更复杂的细菌细胞壁结构。革兰氏阴性菌肽聚糖外富含高分子量脂质和多糖聚合物，形成围绕肽聚糖骨架的外膜层。基于上述原因，氨基糖修饰的金纳米颗粒不能有效抑制革兰氏阴性细菌的生长。
为达到目的，本发明采用以下技术方案：
根据本发明提供的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒，其中，所述含金纳米颗粒的平均粒径在50nm以下。更优选为2～10nm。
根据本发明提供的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒，其中，所述具有抗菌性能的含金纳米颗粒选自纳米金、由单组份或多组分氨基糖。
优选地，所述由单组份或多组分氨基糖修饰的纳米金为D-葡糖胺(D-glucosamine,GluN)，D-半乳糖胺(D-galactosamine,GalN)或D-甘露糖胺(D-mannosamine,ManN)作为单组份修饰的纳米金颗粒.
本发明还提供了上述的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒或采用上述制备方法制备的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒用于临床伤口处理、手术时防止器官粘连、美容或治疗烧伤、烫伤、褥疮感染的药物或产品中的应用。
本发明的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒可以具有但不限于以下有益效果：
1、本发明制得的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒具有优异的抗菌性，可对抗多药耐药菌，甚至是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
2、本发明制得的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒生物相容性好，将对人体细胞毒性小。可用于临床伤口处理，手术防止器官粘连，美容，治疗烧伤、烫伤、褥疮感染等各种创伤感染，是一种极为优良的医用抗菌材料。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了三种纳米颗粒的TEM图、所用小分子结构及纳米颗粒大小。
图2示出了纳米颗粒对细菌细胞壁的破坏性的研究图(PI染色)。
图3示出了纳米颗粒对细菌细胞壁的破坏性的研究图(SEM和TEM图)。
图4示出了细胞活性随Au_GluN纳米颗粒的浓度变化图。
图5示出了Au_GluN纳米颗粒应用于MRSA动物伤口感染模型。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：试剂：
氯化金(III)水合物(HAuCl4.3H2O)购自中国金科化工有限公司；
D-葡糖胺(GluN)，D-半乳糖胺(GalN)，D-甘露糖胺(ManN)和硼氢化钠(NaBH4)购自Aladdin Industrial Corporation(中国)；
去离子水(18.2M.Ωcm)，Milli-Q净化系统提供；
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,ATCC 12228)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,ATCC 66633)，单核细胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes,ATCC 19115)，屎肠球菌(Enterococcus faecium ATCC 51559)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,ATCC 6538P)的标准菌株来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所)；
临床分离物，MDR表皮葡萄球菌和MDR金黄色葡萄球菌来自北京各医院；
碘化丙啶购自Invitrogen；
苯唑西林、生理盐水购自北京百灵威科技公司；
银纳米颗粒购自张家港耐尔纳米科技有限公司；
Eagle's培养基，购自Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM；
过滤器，购自Millipore；
三乙胺、Tween 80购自北京百灵威科技公司；
苏木精、伊红，磷酸盐缓冲盐水购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
细胞计数试剂(CCK-8)购自日本同仁化学；
人脐静脉内皮细胞购自中国科学院细胞库；
Wistar雌性大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
仪器：
Zeta电位仪，购自Malvern Instruments，型号Zetasizer Nano ZS；
扫描电子显微镜(SEM)，购自日本日立公司、型号Hitachi S4800；
单光子激光共聚焦成像系统，购自卡尔蔡司公司、型号LSM 710；
透射电子显微镜(TEM)，购自美国FEI公司、型号Tecnai G2 20 ST；
多功能酶标仪，购自瑞士TECAN集团公司、型号Tecan infinite M200。
实施例1
本实施例用于说明D-葡糖胺(GluN)修饰的抗菌金纳米颗粒Au_GluN的合成。
将D-葡糖胺(GluN)(9mg，0.042mmol)溶于6mL去离子水，加入50μL三乙胺和20mgTween 80混合均匀，然后加入HAuCl4溶液(41mg，0.1mmol，溶于1mL去离子水中),在冰水浴中搅拌约10分钟，在剧烈搅拌下(1200rpm)滴加新制NaBH4溶液(6mg，0.15mmol，溶解于2mL去离子水中，现配现用，防止被氧化)。溶液立即变成棕色。随后降低搅拌速度并在冰水浴中继续搅拌1小时。之后用去离子水透析(14kDa MW截止值，Millipore)溶液24小时，过滤并通过0.22μm过滤器(Millipore)灭菌，并储存在4℃。纳米颗粒大小如图1所示。
实施例2
本实施例用于说明D-半乳糖胺(GalN)修饰的抗菌金纳米颗粒Au_GalN的合成。
将D-半乳糖胺(GalN)(9mg，0.042mmol)溶于6mL去离子水，加入50μL三乙胺和20mgTween 80混合均匀，然后加入HAuCl4溶液(41mg，0.1mmol，溶于1mL去离子水中),在冰水浴中搅拌约10分钟，在剧烈搅拌下(1200rpm)滴加新制NaBH4溶液(6mg，0.15mmol，溶解于2mL去离子水中，现配现用，防止被氧化)。溶液立即变成棕色。随后降低搅拌速度并在冰水浴中继续搅拌1小时。之后用去离子水透析(14kDa MW截止值，Millipore)溶液24小时，过滤并通过0.22μm过滤器(Millipore)灭菌，并储存在4℃。纳米颗粒大小如图1所示。
实施例3
本实施例用于说明D-甘露糖胺(ManN)修饰的抗菌金纳米颗粒Au_ManN的合成。
将D-甘露糖胺(ManN)(9mg，0.042mmol)溶于6mL去离子水，加入50μL三乙胺和20mgTween 80混合均匀，然后加入HAuCl4溶液(41mg，0.1mmol，溶于1mL去离子水中),在冰水浴中搅拌约10分钟，在剧烈搅拌下(1200rpm)滴加新制NaBH4溶液(6mg，0.15mmol，溶解于2mL去离子水中，现配现用，防止被氧化)。溶液立即变成棕色。随后降低搅拌速度并在冰水浴中继续搅拌1小时。之后用去离子水透析(14kDa MW截止值，Millipore)溶液24小时，过滤并通过0.22μm过滤器(Millipore)灭菌，并储存在4℃。纳米颗粒大小如图1所示。
试验例1
本实施例用于说明氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒对细菌的抑制作用。
我们使用微量肉汤稀释法来测定氨基糖修饰的金纳米颗粒的抗菌活性，得出最低抑菌浓度(MIC)。使用一次性康宁96孔板(Costar 3599)进行此测定。首先将其进行分组，每组第一个孔为最高浓度药物组，体积为200μL。其余各孔分别加入100μL培养基，随后将第一孔液体取出100μL加入第二孔中混匀，药物浓度为第一个孔的一半。后面各孔以类似方法依次进行倍比稀释，直到倒数第二组，混匀后，直接取出100μL弃去。最后一个孔为阴性对照组，药物浓度为0μg/mL。将细菌培养至对数期，用培养基调节菌浓度到1×105CFU/mL，每孔加入10μL上述菌液，随后将孔板置于37℃的恒温培养箱中培养24h。每个浓度均设三个平行。观察每个孔的浑浊度，溶液透明、不浑浊的孔所对应的最低药物浓度为最小抑菌浓度。实验结果如表1所示。
表1氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒对细菌的抑制作用
试验例2
本实施例用于说明本发明提供的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒的抗菌机理。
在本实验中，我们选择金黄色葡萄球菌作为待测菌来观察。将1.0×108CFU mL-1的金黄色葡萄球菌与不同浓度的Au_GluN纳米颗粒在37℃的摇床上孵育4小时，然后8000rpm离心5分钟去掉上清液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.01M，pH＝7.4)洗涤三次。再用PBS重新分散细菌。利用这些分散细菌悬浮液作为荧光测定，SEM和TEM样品。室温避光环境下，用碘化丙啶(PI)PBS溶液(4μM)对细菌悬浮液进行染色30分钟。之后，用PBS溶液洗涤两次，并将10μL的细菌样品滴在超薄的载玻片上，再盖上盖玻片，用树脂封片。用没有用Au_GluN纳米颗粒处理的金黄色葡萄球菌作为对照。在共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)下观察并记录荧光，如图2和图3所示，经过Au_GluN孵育以后，细菌的细胞壁通透性增强，细胞壁被破坏。
试验例3
本试验例用于说明本发明提供的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒的细胞毒性实验。
为了研究Au_GluN纳米颗粒的细胞毒性，人脐静脉内皮细胞(human umbilicalveinendothelial cells,HUVECs)在含有10％胎牛血清，1％谷氨酰胺和1％青霉素和链霉素的Dulbecco's改良的Eagle's培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)中培养。HUVECs在96孔培养板上生长过夜(大约10,000个细胞/孔)。在96孔板中加入不同浓度的氨基糖修饰的金纳米颗粒与细胞共孵育。孵育24小时后，用培养基洗涤细胞，向细胞中加入100μL含有10μL细胞计数试剂(CCK-8)的培养基，并在37℃下染色2小时。孵育2小时后，采用多功能酶标仪记录450nm处的细胞的光密度。如图4所示，可以看出纳米金的细胞毒性不大。
试验例4
本试验例用于说明本发明提供的氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒动物模型。
为了测试氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒的临床效果，我们研究了其对MRSA背部伤口感染的大鼠模型的治愈能力。我们在Wistar雌性大鼠的背侧准备了直径为2.0cm的三个圆形全厚度伤口。接着用MRSA感染每只大鼠以建立细菌伤口感染模型。然后应用氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒处理伤口。商用抗生素苯唑西林、生理盐水、商用银纳米颗粒(AgNPs)作为对照。
为了直观地研究伤口愈合效果，我们拍摄了感染的全层伤口的照片，并对手术后第7天的伤口组织用苏木精和伊红(H&E)染色，进行伤口愈合的组织学分析。如图5所示，我们发现氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒(Au_GluN)处理的伤口面积较小，愈合程度最大。组织切片中也可以看出Au_GluN纳米颗粒处理的伤口的没有出现如对照组那样的炎症反应。说明氨基糖修饰的金纳米颗粒具有治疗MRSA感染的临床伤口的潜力。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (11)

1.一种氨基糖修饰的抗菌金纳米颗粒，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒包括：
单组份或多组分氨基糖；和
金纳米颗粒；
其中，所述氨基糖优选选自以下一种或多种：D-葡糖胺，D-半乳糖胺，和D-甘露糖胺。
2.根据权利要求1所述的抗菌金纳米颗粒，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒的平均粒径为1～50nm，优选为2～10nm。
3.根据权利要求1或2所述的抗菌金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将氨基糖溶于去离子水得到氨基糖溶液，向溶液中加入三乙胺和Tween 80混合均匀；
(2)向(1)所得溶液中加入HAuCl4溶液，冰水浴搅拌；
(3)剧烈搅拌下向(2)所得溶液中滴加NaBH4溶液，冰水浴低速搅拌；
(4)去离子水透析(3)所得溶液，过滤并灭菌，得到所述抗菌金纳米颗粒，并储存在4℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述氨基糖溶液的浓度为0.01～0.20mol/L，优选为0.05～0.10mol/L，最优选为0.07mol/L；所述三乙胺与氨基糖溶液的体积比为1:100～1:200，优选为1:100～1:150，最优选为1:120；所述Tween 80与所述氨基糖的摩尔比为1:1～1:10，优选为1:1～1:5，最优选为1:1～1:2.8。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述HAuCl4溶液的浓度为0.05～0.5mol/L，优选为0.05～0.2mol/L，最优选为0.1mol/L；所述搅拌时间为1～20分钟，优选为5～15分钟，最优选为10分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述NaBH4溶液的浓度为0.01～0.20mol/L，优选为0.02～0.10mol/L，最优选为0.075mol/L；所述剧烈搅拌速度为1000～2000rpm，优选为1000～1500rpm，最优选为1200rpm；所述冰水浴搅拌时间为0.5～3小时，优选为0.5～2小时，最优选为1小时。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述透析截止值为10～20kDa MW，优选为10～15kDa MW，最优选为14kDaMW；所述透析时间为10～48小时，优选为20～30小时，最优选为24小时。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述灭菌方法为过滤灭菌；优选地，所述灭菌方法使用0.1-0.25μm最优选0.22μm的滤膜过滤灭菌。
9.根据权利要求1或2所述的抗菌金纳米颗粒或根据权利要求3至8中任一项所述的方法制备的抗菌金纳米颗粒在制备用于治疗多药耐药菌的药物或产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述多药耐药菌选自以下一种或多种：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，单核细胞增生李斯特菌，屎肠球菌和金黄色葡萄球菌。
11.根据权利要求1或2所述的抗菌金纳米颗粒或根据权利要求3至8中任一项所述的方法制备的抗菌金纳米颗粒在制备用于治疗临床伤口处理、手术防止器官粘连、美容、治疗烧伤、烫伤和/或褥疮感染的药物或产品中的应用。
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