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CN109069658B - 用于靶向her2肿瘤的具有改善的治疗指数的抗体-缀合物以及用于改善抗体-缀合物的治疗指数的方法 - Google Patents

用于靶向her2肿瘤的具有改善的治疗指数的抗体-缀合物以及用于改善抗体-缀合物的治疗指数的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于靶向HER2的新型和改善的抗体‑缀合物。发明人发现，当使用特定的缀合模式制备抗体‑缀合物时，它们表现出改善的治疗指数。缀合模式包括第一步骤(i)：在催化剂存在下使含有1‑4个核心N‑乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x‑P的化合物接触，以获得经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心‑GlcNAc部分；以及第二步骤(ii)：使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头‑缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体‑缀合物，其中接头L包括S‑Z3‑L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团。本发明还涉及用于改善抗体‑缀合物的治疗指数的用途以及用于靶向表达HER2的细胞的方法。

Description

用于靶向HER2肿瘤的具有改善的治疗指数的抗体-缀合物以 及用于改善抗体-缀合物的治疗指数的方法
发明的技术领域
本发明涉及生物缀合领域。更具体而言，本发明涉及制备生物缀合物的特定缀合模式，所述生物缀合物对生物缀合物的治疗指数具有有益作用，特别是在靶向表达HER2的肿瘤方面。
发明的背景技术
生物缀合是连接两个或更多个分子的方法，其中至少一个分子为生物分子。所述生物分子也可称为“目的生物分子”，其他分子也可称为“靶分子”或“目的分子”。通常目的生物分子(BOI)将由蛋白质(或肽)、聚糖、核酸(或寡核苷酸)、脂质、激素或天然药物(或其片段或组合)组成。其他目的分子(MOI)也可为生物分子，从而形成同源或异源二聚体(或更高级低聚体)，或其他分子可具有通过缀合方法而赋予至目的生物分子的特定特征。例如，通过使用用于检测和/或分离的化学探针的共价修饰来对蛋白质结构和功能进行调节已经发展为基于蛋白质组的研究和生物医药应用中的有力工具。对蛋白质的荧光标记或亲和标记是研究蛋白质在其原生境(habitat)中运输的关键。基于蛋白质-碳水化合物缀合物的疫苗在对抗HIV、癌症、疟疾和病原菌方面得以凸显，而固定于微阵列上的碳水化合物有助于阐明糖组。合成的DNA和RNA寡核苷酸(ON)需要引入用于诊断和治疗应用的适合的官能团，所述应用例如微阵列技术、反义和基因沉默疗法、纳米技术和多种材料科学应用。例如，连接穿透细胞的配体是处理在基于寡核苷酸的疗法(反义、siRNA)过程中所遇到的低ON内在化率的最常用的策略。类似地，基于寡核苷酸的微阵列的制备需要将ON选择性地固定在合适的固体表面(例如玻璃)上。
存在大量的适合于共价连接两个(或更多个)分子结构的化学反应的实例。然而，生物分子的标记使可应用的反应条件(溶剂、浓度、温度)受到高度限制，而所需要的化学选择性标记限制了反应性基团的选择。出于显而易见的原因，生物系统通常是在水性环境中反应状态(flourish)最佳，这意指用于生物缀合的试剂应当适用于在水性系统中的应用。一般而言，两种策略概念可在生物缀合技术领域中得到认可：(a)基于已存在于目的生物分子中的官能团的缀合，所述官能团例如硫醇、胺、醇或羟基苯酚单元；或(b)两阶段方法，其涉及在实际缀合过程之前，将一个(或多个)独特的反应性基团工程化地插入BOI中。
第一种方法通常涉及蛋白质中的反应性氨基酸侧链(例如半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸和酪氨酸)，或聚糖中的官能团(例如胺、醛)或核酸中的官能团(例如嘌呤或嘧啶官能团或醇)。如尤其是在G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,第3版.2013(以引用的方式纳入)中所总结的，近年来，大量的反应性官能团可用于化学选择性靶向这些官能团(例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺、活化酯、活化碳酸酯、磺酰卤、活化硫醇衍生物、烯烃、炔烃、丙二烯酰胺(allenamide)等)中的一种，其中每一种均要求其自身的特定的缀合条件(pH、浓度、化学剂量、光等)。最显著的是，半胱氨酸-马来酰亚胺缀合由于其高的反应速率和化学选择性而突显出来用于蛋白质缀合。然而，当无半胱氨酸可用于缀合时，如在许多蛋白质中，当然还在其他生物分子中，则通常需要其他方法，每种方法都具有其自身的缺点。
用于生物缀合的完善且广泛适用的解决方案涉及两阶段方法。尽管更加费力，但是与在天然官能团上的缀合相比，经工程化官能团的两阶段缀合通常产生更高的选择性(位点特异性)。此外，通过适当选择构建体可实现完全的稳定性，这可能是在天然官能团上的一阶段缀合的重要缺点，尤其是对于半胱氨酸-马来酰亚胺缀合而言。可添加到BOI上的官能团的典型实例包括(应变)炔烃、(应变)烯烃、降冰片烯、四嗪、叠氮化物、膦、氧化腈、硝酮、腈亚胺、重氮化合物、羰基化合物、(O-烷基)羟胺和肼，这可以通过化学或分子生物学方法实现。已知上述每个官能团都具有至少一个反应配偶体(partner)，在许多情况下涉及完全相互反应性。例如，环辛炔选择性地且专一性地与1,3-偶极子、应变烯烃与四嗪、以及膦与叠氮化物的反应，产生完全稳定的共价键。然而，上述的一些官能团具有高亲脂性的缺点，这可能会使缀合效率受损，尤其是在与亲脂性目的分子组合时(参见下文)。
就溶解性、稳定性和生物相容性而言，生物分子和其他目的分子之间的最终连接单元还应优先与水性环境完全相容。例如，高度亲脂性接头可能导致聚集(在缀合期间和/或缀合之后)，这可显著增加反应时间和/或降低缀合产率，尤其是在MOI也具有疏水性性质时。类似地，高度亲脂性接头-MOI组合可能导致与相同或其他生物分子的表面或特定疏水斑块(patch)的非特异性结合。如果所述接头对水解或其他水诱导的裂解反应敏感，则所述包含最初生物缀合物的组分通过扩散而分离。例如，当β-羟基羰基或γ-二羰基化合物可分别导致逆羟醛(retro-aldol)反应或逆迈克尔(retro-Michael)反应时，某些酯部分由于皂化而不适合。最终，所述接头对于生物缀合物中存在的官能团或在应用生物缀合物期间可能遇到的任何其他官能团应为惰性的，这就尤其排除了使用以例如酮或醛部分(可导致亚胺形成)、α,β-不饱和羰基化合物(Michael加成)、硫酯或其他活化酯(酰胺键形成)为特征的接头。
目前在生物分子缀合方法中，由乙二醇线性低聚体构成的化合物(所谓的PEG(聚乙二醇)接头)特别受欢迎。PEG接头是高度水溶性、无毒性、非抗原性的，并且导致可忽略的聚集或无聚集。为此，许多种类的线性、双官能的PEG接头可从不同来源市售得到，其可使用目的(生物)分子在任意一端进行选择性修饰。PEG接头为环氧乙烷的聚合过程的产物，因此通常以链长度的随机混合物而获得，其可被部分地分解为平均重量分布集中为约1、2、4kDa或更多(最高达60kDa)的PEG构建体。还已知具有最高达4kDa的分子量的均一、离散的PEG(dPEG)，其支化形式最高达15kDa。有趣的是，所述PEG单元自身赋予生物分子以特定的特征。具体地，蛋白质PEG化可导致在体内的停留时间延长、减少通过代谢酶的降解以及降低或消除蛋白质免疫原性。若干种PEG化蛋白已获FDA批准，目前在市场上销售。
由于其高的极性，PEG接头完全适用于小的和/或水溶性的部分在水性条件下的生物缀合。然而，在疏水的、非水溶性的目的分子的缀合的情况下，PEG单元的极性可能不足以抵消疏水性，从而导致反应速率显著降低、产率下降并且引起了聚集问题。在这种情况下，可能需要相对长的PEG接头和/或大量的有机共溶剂以溶解试剂。例如，在抗体-药物缀合物领域，将不同数量的有毒的有效载荷可控地连接至单克隆抗体是关键，其中有效载荷通常选自耳抑素(auristatin)E或F、美登木素生物碱(maytansinoid)、多卡米星(duocarmycin)，加利车霉素(calicheamicin)或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)，还有很多其他的正在进行中。除了耳抑素F以外，所有的有毒的有效载荷的非水溶性差，这就需要有机共溶剂来实现成功的缀合，例如25％二甲基乙酰胺(DMA)或50％丙二醇(PG)。在疏水性有效载荷的情况下，尽管使用了上述共溶剂，但是在缀合期间可能需要大的化学计量的试剂，同时由于聚集(在处理中或在产物分离之后)，效率和产率可能会显著降低，如例如Senter等在Nat.Biotechn.2014,24,1256-1263(以引用的方式纳入)中所记载的。使用长的PEG间隔基(12个单元或更多)可部分提高溶解性和/或缀合效率，但是已表明长的PEG间隔基可能导致更快速的体内清除，因此对ADC的药代动力学特性产生负面影响。
使用常规的接头(例如PEG)，有效缀合通常受到接头-缀合物在水性介质中相对低溶解度的阻碍，特别是在使用相对不溶于水或疏水性靶分子时。在寻求能够快速有效地缀合疏水部分的短的极性间隔基时，本发明人开发了磺酰胺接头，发现其改善了接头-缀合物的溶解度，这反过来显著提高了缀合的效率并减少了过程和产品聚合。这在专利申请PCT/NL2015/050697(WO 2016/053107)中公开，其全部内容并入本文中。
接头是本领域已知的，并且公开于例如WO 2008/070291(以引用的方式纳入)中。WO 2008/070291公开了用于将靶向试剂偶联到锚定组分的接头。所述接头包含以聚乙二醇(PEG)为代表的亲水性区域和缺少手性中心的延伸部分，所述延伸部分与靶向试剂偶联。
WO 01/88535——以引用方式纳入——公开了一种用于生物缀合的表面的接头体系，尤其是具有新的亲水性间隔基基团的接头体系。用于接头体系中的亲水性原子或基团选自O、NH、C＝O(酮基)、O-C＝O(酯基)和CR3R4，其中R3和R4独立地选自H、OH、C1-C4烷氧基和C1-C4酰氧基。
WO 2014/100762——以引用方式纳入——记载了含有亲水性自我牺牲型接头的化合物，所述接头可在适当条件下裂解，并掺入亲水性基团以提供化合物的更好的溶解性。所述化合物包含药物部分、能够靶向所选的细胞群的靶向部分，以及包含酰基单元的接头、用于提供所述药物部分和靶向部分之间距离的任选的间隔单元、可在适当条件下裂解的肽接头、亲水性自我牺牲型接头、以及任选的第二自我牺牲型间隔基或环化自我牺牲型接头。亲水性自我牺牲型接头为例如苄氧基羰基。
发明内容
本发明涉及用于提高生物缀合物(即生物分子和靶分子的缀合物)的治疗指数的方法或用途。发明人出乎意料地发现经特定的缀合模式制备的生物缀合物与经不同的缀合模式获得的相同的生物缀合物(即相同的生物分子、相同的靶分子(例如活性物质)和相同的生物分子药物比率)相比，显示出更高的治疗指数。将生物分子与靶分子缀合的方式在接头本身和/或接头与生物分子的连接点处暴露。基于常识，不能设想到接头和/或连接点可能对生物缀合物(例如抗体-药物-缀合物)的治疗指数具有影响。在该领域内，接头在处理时被认为是惰性的，并且仅由于制备生物缀合物而存在。选择特定的缀合模式对治疗指数的影响是前所未有的，并且是生物缀合物(特别是抗体-药物-缀合物)领域的突破性发现。
本发明的生物缀合物与经不同的缀合模式获得的相同的生物缀合物(即相同的生物分子、相同的靶分子(例如活性物质)和相同的生物分子/靶分子比率)相比，一方面是更有效(治疗有效的)，和/或另一方面显示出更高的耐受性。随着治疗窗变宽，该发现对用本发明的生物缀合物治疗受试者具有重大影响。由于治疗窗的变宽，治疗剂量可降低，因此潜在的、不希望的副作用减少。
在一个实施方案中，本发明的缀合模式包括：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺取代基的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure BDA0001818785290000061
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团。
在一个实施方案中，本发明的缀合模式确保所述生物缀合物包含含有式(1)的基团的接头L或其盐：
Figure BDA0001818785290000062
发明人出乎意料地发现所制备的包含含有式(1)的基团的接头L或其盐的生物缀合物与包含不含现存的式(1)的基团的接头的相同的生物缀合物(即相同的生物分子、相同的靶分子(例如活性物质)和相同的生物分子药物比率)相比，显示出更高的治疗指数。
在式(1)的基团中，
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为另一个靶分子D，其中D任选地通过间隔基部分与N连接。
在本发明的上下文中，缀合模式用于通过接头L连接生物分子B和靶分子D。缀合指的是生物分子连接至靶分子的具体方式。本发明的生物缀合物由式(A)表示：
B–L–D
(A)
其中
-B为生物分子；
-L为连接B和D的接头；
-D为靶分子；以及
-每个“-”的存在独立地为键或间隔基部分。
对于其中缀合模式称为“磺酰胺键”的实施方案，优选以下实施方案：
1.提高生物缀合物的治疗指数的方法，其包括通过使靶分子(D)上的反应性基团Q1与生物分子(B)上的官能团F1反应，使得L包含式(1)的基团或其盐，来制备式(A)的生物缀合物的步骤：
B–L–D
(A)，
其中：
-B为生物分子；
-L为连接B和D的接头；
-D为靶分子；以及
-每个“-”的存在独立地为键或间隔基部分；
Figure BDA0001818785290000071
其中：
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S或NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为另一个靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
2.根据实施方案1的方法，还包括将所述生物缀合物给予有需要的受试者的步骤。
3.根据实施方案2的方法，其中所述受试者为癌症患者。
4.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物分子为抗体以及所述生物缀合物为抗体-药物-缀合物。
5.根据前述实施方案中任一项的方法，其中靶分子D为活性物质，优选细胞毒素。
6.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物缀合物具有式B–Z3–L–D，其中Z3通过反应性基团Q1与官能团F1的反应获得。
7.根据实施方案6的方法，其中Z3通过使具有式Q1–L–D的接头-缀合物与具有式B–F1的生物分子反应来获得，其中L包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000081
其中B、D、a和R1如实施方案1中所定义。
8.根据实施方案7的方法，其中所述接头-缀合物为式(4a)或(4b)或其盐：
Figure BDA0001818785290000082
Figure BDA0001818785290000091
其中：
-a独立地为0或1；
-b独立地为0或1；
-c为0或1；
-d为0或1；
-e为0或1；
-f为1至150范围内的整数；
-g为0或1；
-i为0或1；
-D为靶分子；
-Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
-Sp1为间隔基部分；
-Sp2为间隔基部分；
-Sp3为间隔基部分；
-Sp4为间隔基部分；
-Z1为连接基团，其将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接；
-Z2为连接基团，其将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接；
以及
-R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基；或R1为D、-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]或-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]，其中D为靶分子以及Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、D、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
9.根据实施方案8的方法，其中Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
10.根据实施方案8或9的方法，其中Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR2-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NR2、-NR2C(O)-、-NR2C(O)O-、-NR2C(O)NR2-、-SC(O)-、-SC(O)O-、-SC(O)NR2-、-S(O)、-S(O)2-、-OS(O)2-、-OS(O)2O-、-OS(O)2NR2-、-OS(O)-、-OS(O)O-、-OS(O)NR2-、-ONR2C(O)-、-ONR2C(O)O-、-ONR2C(O)NR2-、-NR2OC(O)-、-NR2OC(O)O-、-NR2OC(O)NR2-、-ONR2C(S)-、-ONR2C(S)O-、-ONR2C(S)NR2-、-NR2OC(S)-、-NR2OC(S)O-、-NR2OC(S)NR2-、-OC(S)-、-OC(S)O-、-OC(S)NR2-、-NR2C(S)-、-NR2C(S)O-、-NR2C(S)NR2-、-SS(O)2-、-SS(O)2O-、-SS(O)2NR2-、-NR2OS(O)-、-NR2OS(O)O-、-NR2OS(O)NR2-、-NR2OS(O)2-、-NR2OS(O)2O-、-NR2OS(O)2NR2-、-ONR2S(O)-、-ONR2S(O)O-、-ONR2S(O)NR2-、-ONR2S(O)2O-、-ONR2S(O)2NR2-、-ONR2S(O)2-、-OP(O)(R2)2-、-SP(O)(R2)2-、-NR2P(O)(R2)2-及其两个或更多个的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
11.根据实施方案8-10中任一项的方法，其中Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S或NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C24烷基，并且其中Q1为式(9a)、(9q)、(9n)、(9o)或(9p)、(9t)或(9zh)：
Figure BDA0001818785290000111
其中
-U为O或NR9，并且R9为氢、直链或支链的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基。
-R10为(硫)酯基；以及
-R18选自任选取代的C1-C12烷基和C4-C12(杂)芳基。
12.根据前述实施方案中任一项的方法，其中反应性基团Q1与官能团F1之间的反应为选自以下的缀合反应：来自可表示为(10a)或(10b)的连接部分Z3的硫醇-烯烃缀合；来自可表示为(10c)的连接部分Z3的氨基-(活化的)羧酸缀合；来自可表示为(10d)的连接部分Z3的酮-肼基缀合，其中Y＝NH；来自可表示为(10d)的连接部分Z3的酮-氧基氨基缀合，其中Y＝O；来自可表示为(10e)或(10g)的连接部分Z3的炔烃-叠氮化物缀合以及来自可表示为(10h)的连接部分Z3的烯烃-1,2,4,5-四嗪缀合或炔烃-1,2,4,5-四嗪缀合，其中N2消除；其中部分(10a)、(10b)、(10c)、(10d)、(10e)、(10g)和(10h)表示为：
Figure BDA0001818785290000121
其中Z选自氢、甲基和吡啶基。
13.根据前述实施方案中任一项的方法，其中a＝0。
14.生物缀合物，其用于治疗有需要的受试者，其中所述生物缀合物表示为式(A)：
B–L–D
(A)，
其中：
-B为生物分子；
-L为连接B和D的接头；
-D为靶分子；以及
-每个“-”的存在独立地为键或间隔基部分；
其中L包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000122
其中：
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为另一个靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
15.根据实施方案14用于所述用途的生物缀合物，其用于治疗癌症。
因此，在第一方面，本发明涉及用于提高生物缀合物的治疗指数的方法或用途，其中本发明的缀合模式包含在所述生物缀合物中或用于制备所述生物缀合物。在一个实施方案中，缀合模式包括如本文中所定义的步骤(i)和(ii)。在一个替代的实施方案中，缀合模式包括制备式(A)的生物缀合物的步骤，使得如上所定义的接头L包含在生物缀合物中。在一个实施方案中，本发明的方法或用途还包括将生物缀合物给予有需要的受试者。根据第一方面的本发明还可以表述为如上所定义的缀合模式在生物缀合物中用于提高生物缀合物的治疗指数的用途，或者表述为如上所定义的接头L在生物缀合物中用于提高生物缀合物的治疗指数的用途。
在另一方面，本发明涉及对有需要的受试者的治疗，包括给予本发明的生物缀合物。通常，以治疗有效剂量给予生物缀合物。鉴于增加的治疗功效，如在用常规生物缀合物的治疗中和/或在更低剂量下，给药可以不那么频繁。或者，考虑到增加的耐受性，如在用常规生物缀合物的治疗中和/或在更高剂量下，给药可以更频繁。给药可以是以单剂量或可以例如每月1-4次，优选每月1-2次，更优选每3或4周一次，最优选每4周一次。如本领域技术人员所理解的，本发明的生物缀合物的剂量可取决于许多因素，并且技术人员可通过常规实验确定最佳剂量。生物缀合物通常以0.01-50mg/kg受试者体重的剂量给药，更精确地0.03-25mg/kg或最精确地0.05-10mg/kg，或者0.1-25mg/kg或0.5-10mg/kg。
在一个实施方案中，本发明的生物缀合物的给药是以低于不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的TD50的剂量，优选剂量为至多99-90％，更优选至多89-60％，甚至更优选59-30％，最优选至多29-10％的不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的TD50。或者，本发明的生物缀合物的给药是以高于不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的TD50的剂量，优选剂量为至多10-29％，更优选至多30-59％，甚至更优选60-89％，最优选至多90-99％的不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的TD50。
在一个实施方案中，本发明的生物缀合物的给药是以低于不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的ED50的剂量，优选剂量为至多99-90％，更优选至多89-60％，甚至更优选59-30％，最优选至多29-10％的不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的ED50。或者，本发明的生物缀合物的给药是以高于不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的TD50的剂量，优选剂量为至多高出不包含本发明的缀合模式的相同生物缀合物的TD50的1.1-1.49倍，更优选至多高1.5-1.99倍，甚至更优选高2至4.99倍，最优选至多高5-10倍。
生物缀合物的制备通常包括使具有式Q1-L-D(其中L和D如上所定义，Q1是能够与官能团F1反应的反应性基团)的接头-缀合物与具有式B-F1(其中B如上所定义，F1是能与Q1反应的官能团)的生物分子反应的步骤。在此，Q1和F1反应形成连接基团Z3，其位于式(A)的生物缀合物中B和L之间的间隔基部分中。
附图说明
图1描述了生物分子缀合的一般概念：将包含一个或多个官能团F1的目的生物分子(BOI)与(过量的)经特定的接头共价连接至反应性基团Q1的靶分子D(也称为目的分子或MOI)温育。在生物缀合过程中，发生F1和Q1之间的化学反应，由此形成了包含在BOI和MOI之间的共价连接的生物缀合物。所述BOI可例如为肽/蛋白质、聚糖或核酸。
图2示出了半乳糖胺的UDP糖的衍生物的几种结构，其可以是例如在2位上用3-巯基丙酰基(11a)、叠氮基乙酰基(11b)或叠氮基二氟乙酰基(11c)修饰的，或在N-乙酰半乳糖胺的6位用叠氮基叠氮基乙酰基(11d)修饰的。
图3示意性地示出了在半乳糖基转移酶突变体或GalNAc-转移酶的作用下，如何可将UDP-糖11a-d中的任一个连接至包含GlcNAc部分12的糖蛋白(例如，单克隆抗体，其中聚糖被内切核苷酸剪接)上，由此在GalNAc衍生物和GlcNAc之间产生β-糖苷1-4键(分别为化合物13a-d)。
图4示出了经修饰的抗体13a-d如何可通过与马来酰亚胺的亲核加成(对于3-巯基丙酰基-半乳糖胺修饰的13a，生成硫醚缀合物14，或对于与工程化的半胱氨酸残基缀合，生成硫醚缀合物17)或通过使用环辛炔试剂的张力促进的环加成(对于13b、13c或13d，分别生成三唑15a、15b或16)来进行生物缀合过程。
图5示出了生物分子中天然存在的或通过工程化引入的一组代表性官能团(F1)，其在与反应性基团Q1反应后产生连接基团Z3。也可将官能团F1人工引入(工程化)到生物分子中的任何所选择的位置上。
图6示出了本发明的优选生物缀合物。制备缀合物81-85，并在实施例中研究其治疗指数。缀合物81-85与作为抗体的曲妥珠单抗(trastuzumab)缀合。
图7A-E示出了实施例34的关于对照抗体-缀合物Kadcyla(图7A)和本发明的抗体-缀合物84(图7B)、81(图7C)、82(图7D)、83(图7E)的耐受性研究的结果。示出了基于治疗开始(第1天)100％的体重变化百分比(ΔBW)随时间的变化。C＝载体处理。
图8A示出了实施例33的关于对照抗体-缀合物Kadcyla(K)和本发明的抗体-缀合物81-84的效力研究的结果。类似的结果示于图8B中，其中呈现了本发明的抗体-缀合物85和对照抗体-缀合物Kadcyla(K)的效力，在图8C中，其中呈现了本发明的抗体-缀合物95-98的效力。效力表示为肿瘤体积随时间的变化，其中更高的效力导致肿瘤体积的更大的减少或更小的增加。C＝载体处理。图8D示出了对应于实施例33d的关于对照抗体-缀合物Kadcyla(K)和本发明的抗体-缀合物84的功效研究的结果。
发明详述
在本发明的上下文中，缀合反应一方面涉及含有官能团F1的生物分子(BOI)，另一方面涉及含有反应性基团Q1的靶分子(MOI)，或如本文所定义的“接头-缀合物”，其中Q1与F1反应形成连接基团，该连接基团将BOI和MOI连接在生物缀合物中。本文中，反应性基团Q1通过接头连接至MOI，所述接头包含式(1)的磺酰胺部分。
Figure BDA0001818785290000161
反应性基团Q1可以连接至式(1)部分的任一末端，在这种情况下，MOI连接至式(1)部分的对侧末端。在一个实施方案中，反应性基团Q1通过羰基末端与式(1)的部分连接，MOI通过式(1)的部分的磺酰胺末端连接。在一个实施方案中，反应性基团Q1通过磺酰胺末端与式(1)的部分连接，MOI通过式(1)的部分的羰基末端连接。
定义
本说明书和权利要求书中所用的动词“包含”及其动词的变化形式以其非限制性含义使用，意指包括该词之后的项，但并不排除未特别提及的项。
此外，除非上下文明确要求有且只有一个元素，否则用不定冠词“一”或“一个(种)”提及元素时不排除存在多于一个所述元素的可能性。因此，所述不定冠词“一”或“一个(种)”通常意指“至少一个(种)”。
本说明书和权利要求书中公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括所有的非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体，以及对映异构体的任意混合物、外消旋体或其他形式。当一种化合物的结构被描述为具体的对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构体形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构体形式。当化合物的结构被描述为具体的互变异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的互变异构体。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以外型(exo)和内型(endo)非对映异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的外型和单独的内型非对映异构体，及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的内型或外型非对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的内型或外型非对映异构体。
此外，本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以顺式(cis)和反式(trans)异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的顺式异构体和单独的反式异构体，及其混合物。例如，当化合物的结构被描述为顺式异构体时，应理解，相应的反式异构体或顺式和反式异构体的混合物未被排除在本申请的发明之外。当化合物的结构被描述为具体的顺式或反式异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的顺式或反式异构体。
未取代的烷基具有通式CnH2n+1并且可以是直链或支链的。任选地，所述烷基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
环烷基为环状烷基。未取代的环烷基包含至少3个碳原子，并且具有通式CnH2n-1。任选地，所述环烷基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
烯基包含一个或多个碳-碳双键，并且可以是直链或支链的。未取代的包含一个C-C双键的烯基具有通式CnH2n-1。未取代的包含两个C-C双键的烯基具有通式CnH2n-3。烯基可包含末端C-C双键和/或内部C-C双键。末端烯基为其中C-C双键定位于碳链的末端位置的烯基。烯基还可包含两个或更多个C-C双键。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、叔丁烯基、1,3-丁二烯基、1,3-戊二烯基等。除非另有说明，烯基可任选地被一个或多个独立地选择的如下所定义的取代基取代。除非另有说明，烯基可任选地被选自O、N和S中的一个或多个杂原子间隔。
炔基包含一个或多个碳-碳三键，并且可以是直链或支链的。未取代的包含一个C-C三键的炔基具有通式CnH2n-3。炔基可包含末端C-C三键和/或内部C-C三键。末端炔基为其中C-C三键位于碳链的末端位置的炔基。炔基还可包含两个或更多个C-C三键。除非另有说明，炔基可任选地被一个或多个独立地选择的如下所定义的取代基取代。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、异丙炔基、叔丁炔基等。除非另有说明，炔基可任选地被选自O、N和S中的一个或多个杂原子间隔。
芳基包含6至12个碳原子，并且可包括单环或双环结构。任选地，所述芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。芳基的实例为苯基和萘基。
芳基烷基和烷基芳基包含至少7个碳原子，并且可包括单环和双环结构。任选地，所述芳基烷基和烷基芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。芳基烷基为例如苄基。烷基芳基为例如4-叔丁基苯基。
杂芳基包含至少两个碳原子(即至少C2)以及一个或多个杂原子N、O、P或S。杂芳基可具有单环或双环结构。任选地，所述杂芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。合适的杂芳基的实例包括吡啶基、喹啉基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、吡咯基、呋喃基、三唑基、苯并呋喃基、吲哚基、嘌呤基、苯并噁唑基、噻吩基、磷杂环戊二烯基(phospholyl)和噁唑基。
杂芳基烷基和烷基杂芳基包含至少3个碳原子(即至少C3)，并且可包括单环和双环结构。任选地，所述杂芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。
在芳基表示为(杂)芳基的情况下，该表示法意指包括芳基和杂芳基。类似地，烷基(杂)芳基意指包括烷基芳基和烷基杂芳基，(杂)芳基烷基意指包括芳基烷基和杂芳基烷基。因此，C2–C24(杂)芳基应理解为包括C2–C24杂芳基和C6–C24芳基。类似地，C3–C24烷基(杂)芳基意指包括C7–C24烷基芳基和C3–C24烷基杂芳基，C3–C24(杂)芳基烷基意指包括C7–C24芳基烷基和C3–C24杂芳基烷基。
环炔基为环状炔基。未取代的包含一个三键的环炔基具有通式CnH2n-5。任选地，环炔基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。环炔基的实例包括环辛炔基。
杂环炔基为被选自氧、氮和硫的杂原子间隔的环炔基。任选地，杂环炔基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。杂环炔基的实例为氮杂环辛炔基。
(杂)芳基包含芳基和杂芳基。烷基(杂)芳基包含烷基芳基和烷基杂芳基。(杂)芳基烷基包含芳基烷基和杂芳基烷基。(杂)炔基包含炔基和杂炔基。(杂)环炔基包含环炔基和杂环炔基。
(杂)环炔烃化合物在本文被定义为包含(杂)环炔基的化合物。
本说明书和权利要求书中所公开的几种化合物可被描述为稠合的(杂)环炔烃化合物，即其中第二环结构被稠合(即被增环)至所述(杂)环炔基的(杂)环炔烃化合物。例如在稠合的(杂)环辛炔化合物中，可将环烷基(例如环丙基)或芳烃(例如苯)增环至(杂)环辛炔基上。稠合的(杂)环辛炔化合物中的(杂)环辛炔基的三键可位于三个可能的位置——即所述环辛炔部分的第2、3或4位(依据“IUPAC有机化学命名法”，A31.2条进行编号)——中的任一个。本说明书和权利要求书中对于任何稠合的(杂)环辛炔化合物的描述意指包括所述环辛炔部分的所有三个单独的位置异构体。
除非另有说明，烷基、环烷基、烯基、炔基、(杂)芳基、(杂)芳基烷基、烷基(杂)芳基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、(杂)亚芳基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、(杂)芳基亚烯基、(杂)芳基亚炔基、烯基、烷氧基、烯氧基、(杂)芳氧基、炔氧基和环烷氧基可被一个或多个独立地选自如下的取代基取代：C1–C12烷基、C2–C12烯基、C2–C12炔基、C3–C12环烷基、C5–C12环烯基、C8–C12环炔基、C1–C12烷氧基、C2–C12烯氧基、C2–C12炔氧基、C3–C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代和甲硅烷基，其中所述甲硅烷基可表示为式(R20)3Si-，其中R20独立地选自C1–C12烷基、C2–C12烯基、C2–C12炔基、C3–C12环烷基、C1–C12烷氧基、C2–C12烯氧基、C2–C12炔氧基和C3–C12环烷氧基，其中所烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被选自O、N和S中的一个或多个杂原子间隔。
本文使用的一般性术语“糖”指单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。本文使用的术语“糖衍生物”指单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcNH2)、半乳糖胺(GalNH2)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、也称为N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)的唾液酸(Sia)、以及N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡糖醛酸(GlcA)和艾杜糖醛酸(IdoA)。糖衍生物的实例还包括本文中表示为S(F1)x的化合物，其中S是糖或糖衍生物，并且其中S包含x个官能团F1。
核心N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)或核心N-乙酰葡糖胺部分在本文中定义为通过C1与抗体键合的GlcNAc，优选通过N-糖苷键与抗体的天冬酰胺氨基酸侧链中的酰胺氮原子键合的GlcNAc。核心-GlcNAc取代基可以存在于抗体的天然糖基化位点上，但也可以将其引入在抗体的不同位点上。本文中，核心-N-乙酰基葡糖胺取代基是单糖取代基，或者如果所述核心-GlcNAc取代基是岩藻糖基化的，则它是二糖核心-GlcNAc-(□1-6-Fuc)取代基，还称为GlcNAc(Fuc)。本文中，“核心-GlcNAc取代基”不应与“核心-GlcNAc”混淆。核心-GlcNAc在本文中定义为内部GlcNAc，其是包含多于两个糖的多糖或寡糖的一部分，即多糖或寡糖通过GlcNAc与抗体键合。
因此，包含如本文所定义的核心-N-乙酰葡糖胺取代基的抗体是包含如上所定义的单糖核心-GlcNAc取代基的抗体，或者如果所述核心-GlcNAc取代基是岩藻糖基化的，则它是二糖核心-GlcNAc(Fuc)取代基。如果核心-GlcNAc取代基或GlcNAc-S(F1)x取代基中的GlcNAc是岩藻糖基化的，则岩藻糖是与核心-GlcNAc取代基的O6的最常见连接的α-1,6。岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基表示核心-GlcNAc(Fuc)，岩藻糖基化的GlcNAc-S(F1)x取代基表示为GlcNAc(Fuc)-S(F1)x。
术语“核苷酸”在本文中以其通常的科学含义使用。术语“核苷酸”是指由核碱基、五碳糖(核糖或2-脱氧核糖)以及一个、二个或三个磷酸基团组成的分子。不含磷酸基团时，核碱基与糖构成核苷。因此，核苷酸也被称为核苷单磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。所述核碱基可为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。核苷酸的实例包括尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)。
术语“蛋白质”在本文中以其通常的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包含天然的和非天然的氨基酸。
术语“糖蛋白”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指包含一个或多个共价键合至蛋白质的单糖或寡糖链(“聚糖”)的蛋白质。聚糖可连接至蛋白质的羟基上(O-连接的聚糖)，例如连接至丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基上；或连接至蛋白质的酰胺官能团上(N-糖蛋白)，例如天冬酰胺或精氨酸；或连接至蛋白质的碳上(C-糖蛋白)，例如色氨酸。糖蛋白可包含多于一个聚糖，可包含一个或多个单糖和一个或多个寡糖聚糖的组合，并且可包含N-连接、O-连接和C-连接的聚糖的组合。据估计，所有蛋白质中超过50％的蛋白质具有一些糖基化的形式，因此被鉴定为糖蛋白。糖蛋白的实例包括PSMA(前列腺特异性膜抗原)、CAL(南极念珠菌脂肪酶(candida antartica lipase))、gp41、gp120、EPO(促红细胞生成素)、抗冻蛋白和抗体。
术语“聚糖”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指连接至蛋白质的单糖或寡糖链。因此，术语聚糖是指糖蛋白的碳水化合物部分。所述聚糖通过一个糖的C-1碳连接至蛋白质，所述聚糖可以不含其他取代(单糖)或可在其一个或多个羟基处被进一步取代(寡糖)。天然存在的聚糖通常包含1至约10个糖部分。然而，当更长的糖链连接至蛋白质时，所述糖链在本文中也被认为是聚糖。糖蛋白中的聚糖可为单糖。通常，糖蛋白的单糖聚糖由共价连接到蛋白质的单个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)或岩藻糖(Fuc)组成。聚糖也可为寡糖。糖蛋白的寡糖链可以是直链的或支链的。在寡糖中，直接连接至蛋白质的糖称为核心糖。在寡糖中，未直接连接至蛋白质且连接至至少两个其他糖的糖称为内糖。在寡糖中，未直接连接至蛋白质但连接至单个其他糖——即在其一个或多个其其他羟基上没有携带其他糖取代基——的糖称为末端糖。为避免疑义，在糖蛋白的寡糖中可存在多个末端糖，但仅有一个核心糖。聚糖可为O-连接的聚糖、N-连接的聚糖或C-连接的聚糖。在O-连接的聚糖中，通常通过丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基将单糖或寡糖聚糖键合至蛋白质的氨基酸中的O原子上。在N-连接的聚糖中，通过蛋白质的氨基酸中的N原子(通常通过天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)侧链中的酰胺氮)将单糖或寡糖聚糖键合至蛋白质。在C-连接的聚糖中，将单糖或寡糖聚糖键合至蛋白质的氨基酸中的C原子上，通常键合至色氨酸(Trp)的C原子上。
术语“抗体”在本文中以其通常的科学含义使用。抗体是通过免疫系统产生的能够识别和结合特定抗原的蛋白质。抗体是糖蛋白的一个实例。在本文中，术语抗体以其最宽泛的含义使用，并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、以及双链抗体和单链抗体。在本文中，术语“抗体”也意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌症抗原的抗体。术语“抗体”意指包括全抗体、以及抗体的抗原结合片段(例如来自经裂解的抗体的抗体Fab片段、F(ab’)2、Fv片段或Fc片段；scFv-Fc片段；小抗体；双抗体、双特异性抗体或scFv)。此外，所述术语包括遗传工程化抗体和抗体衍生物。抗体、抗体片段和遗传工程化抗体可通过本领域已知的方法获得。抗体的典型实例尤其包括，阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、托西莫单抗I131(tositumomab-I131)、西妥昔单抗(cetuximab)、替伊莫单抗(ibrituximab tiuxetan)、奥马珠单抗(omalizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、依库珠单抗(eculizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地舒单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)和布妥昔单抗(brentuximab)。在一个优选的实施方案中，包含核心-N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)的糖蛋白是包含核心-N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)的抗体，优选是单克隆抗体(mAb)。优选地，所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。更优选地，所述抗体是IgG抗体，最优选地，所述抗体是IgG1抗体。当所述抗体是全抗体时，抗体优选在每条重链上包含一个或多个，更优选一个核心-GlcNAc取代基，所述核心-GlcNAc取代基任选地是岩藻糖基化的。因此，所述全抗体优选包含两个或更多个，优选两个，任选岩藻糖基化的核心-GlcNAc取代基。当所述抗体是单链抗体或抗体片段(例如Fab片段)时，抗体优选包含一个或多个核心-GlcNAc取代基，其任选地是岩藻糖基化的。在包含核心-GlcNAc取代基的抗体中，所述核心-GlcNAc取代基可以位于抗体上的任何位置，条件是所述取代基不妨碍抗体的抗原结合位点。在一个优选的实施方案中，所述核心N-乙酰葡糖胺取代基存在于抗体的天然N-糖基化位点上。
接头在本文中被定义为连接化合物的两个或更多个元素的部分。例如在生物缀合物中，生物分子和靶分子通过接头彼此共价连接；在接头-缀合物中，反应性基团Q1通过接头与靶分子共价连接；在接头-构建体中，反应性基团Q1通过接头与反应性基团Q2共价连接。接头可包含一个或多个间隔基部分。
间隔基部分在本文中被定义为使接头的两部分(或更多部分)间隔开(即提供它们之间的距离)并且共价连接在一起的部分。所述接头可为例如，如下所定义的接头-构建体、接头-缀合物或生物缀合物的部分。
生物缀合物在本文中被定义为其中生物分子通过接头与靶分子共价连接的化合物。生物缀合物包含一个或多个生物分子和/或一个或多个靶分子。所述接头可包含一个或多个间隔基部分。抗体-缀合物是指其中生物分子是抗体的生物缀合物。
生物分子在本文中被定义为可自自然界分离的任何分子，或由较小分子构建模块组成的任何分子，所述较小分子构建模块为衍生自自然界的大分子结构的构件，特别是核酸、蛋白质、聚糖和脂质。在本文中，生物分子也可以称为目的生物分子(BOI)。生物分子的实例包括酶、(非催化的)蛋白质、多肽、肽、氨基酸、寡核苷酸、单糖、寡糖、多糖、聚糖、脂质和激素。
靶分子，也被称为目的分子(MOI)，在本文中被定义为具有所需特性的分子结构，所需特性在缀合时赋予至生物分子。
术语“其盐”意指当酸性质子(通常为酸的质子)通常被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)替换而形成的化合物。如果适用，所述盐是药学上可接受的盐，尽管这不是并不旨在用于给药至患者的盐所必需的。例如，在化合物的盐中，所述化合物可被无机酸或有机酸质子化以形成阳离子，同时所述无机酸或有机酸的缀合碱作为盐的阴离子组分。
术语“药学上可接受的”盐意指对于给药至患者(例如哺乳动物)是可接受的盐(对于给定的剂量方案，其为包含具有可接受的哺乳动物安全性的抗衡离子的盐)。这种盐可衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱，以及衍生自药学上可接受的无机酸或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域已知的多种有机和无机抗衡离子，并且包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，并且当分子包含碱性官能团时，所述盐为有机酸或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
在本文中，公开了磺酰胺接头和所述磺酰胺接头的缀合物。术语“磺酰胺接头”是指包含磺酰胺基(更具体地为酰基磺酰胺基[-C(O)-N(H)-S(O)2-N(R1)-]和/或氨基甲酰基磺酰胺基[-O-C(O)-N(H)-S(O)2-N(R1)-])的接头。
在本文中，术语“治疗指数”(TI)具有本领域技术人员公知的常规含义，并且是指对50％的人群有毒(即，以与目标适应症不相容的发病率或严重性引起副作用)的药物剂量(TD50)，除以在50％的人群中产生所需药理学效果的剂量(有效剂量或ED50)的比率。因此，TI＝TD50/ED50。治疗指数可以通过临床试验或例如通过血浆暴露试验来确定。还参见Muller等人,Nature Reviews Drug Discovery 2012,11,751-761。在早期发育阶段，候选药物的临床TI通常尚不清楚。然而，尽早了解候选药物的初步TI至关重要，因为TI是药物成功开发可能性的重要指标。在尽可能早的阶段识别具有潜在次优TI的候选药物有助于启动缓解或可能重新部署资源。在此早期阶段，TI通常定义为功效(小鼠异种移植物中的最小有效剂量)与安全性(小鼠或大鼠中的最大耐受剂量)之间的定量比。
在本文中，术语“治疗功效”表示物质达到某种治疗效果(例如减少肿瘤体积)的能力。可以测量治疗效果以确定物质可以达到所需效果的程度，通常与相同情况下的另一种物质相比较。治疗功效的合适量度是ED50值，其可以例如在临床试验期间确定或通过血浆暴露试验确定。在临床前治疗功效测定的情况下，生物缀合物(例如ADC)的治疗效果可以通过小鼠中源自患者的肿瘤异种移植物来验证，在这种情况下，功效是指ADC提供有益效果的能力。或者，所述ADC在啮齿动物安全性研究中的耐受性也可以是治疗效果的量度。
在本文中，术语“耐受性”是指不以与目标适应症不相容的发病率或严重性引起副作用的特定物质的最大剂量。对特定物质的耐受性的合适量度是TD50值，其可以例如在临床试验期间确定或通过血浆暴露试验确定。
缀合模式
在本发明的上下文中，“缀合模式”是指用于将靶分子D与生物分子B(特别是抗体AB)缀合的方法，以及指所得生物缀合物的结构特征(尤其是连接靶分子与生物分子的接头)——这是缀合方法的直接结果。因此，在一个实施方案中，缀合模式是指将靶分子与生物分子(特别是抗体)缀合的方法。在一个替代的实施方案中，缀合模式是指接头的结构特征和/或接头与生物分子的连接点，这是将靶分子与生物分子(特别是抗体)缀合的方法的直接结果。
在本发明的上下文中，缀合模式包括如下进一步定义的“核心-GlcNAc官能化”和“磺酰胺键”中的至少一个。优选地，缀合模式包括如下进一步定义的“核心-GlcNAc官能化”和“磺酰胺键”。
核心-GlcNAc官能化
在一个实施方案中，本发明的缀合模式被称为“核心-GlcNAc官能化”，其是指包括以下步骤的方法：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure BDA0001818785290000251
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团。
在本实施方案中，抗体通过聚糖缀合，所述聚糖被剪接成核心-GlcNAc残基(任选地被岩藻糖取代)。这个残基用包含1或2个官能团F1的糖衍生物S(F1)x官能化，所述官能团F1随后与存在于包含靶分子D的接头-缀合物上的官能团Q1反应。所得到的连接抗体与靶分子的接头L的结构特征(这是缀合方法的直接结果)包括：
(a)接头L与抗体AB的连接点位于特定氨基酸残基，其为在天然存在的抗体中糖基化的特定氨基酸残基或为通过抗体中的特定氨基酸残基突变而人工引入的糖基化位点。因此，可以具体选择接头与抗体的连接点，这提供了高度可预测的靶分子与抗体的比率(或DAR：“药物抗体比”)。
(b)接头L与抗体的核心-GlcNAc部分缀合，并具有通式结构–S–(M)pp–Z3–L2(D)r。在本文中，S是糖衍生物，其通常通过O4与核心-GlcNAc部分连接，并通过C2、C3、C4和C6中的任一个，优选通过C6与Z3连接，任选地通过间隔基M(即pp＝0或1)连接。Z3是通过Q1和F1之间的反应获得的连接基团。Q1、F1和Z3的选项是技术人员已知的，并在下面进一步详细讨论。Z3通过接头L2与至少一个靶分子D连接(即r≥1)。
(c)在一个优选的实施方案中，接头L(特别是接头L2)包含式(1)的基团或其盐，如对称为“磺酰胺键”的缀合模式所定义的。已经发现，当本实施方案的缀合模式与“磺酰胺键”缀合模式组合时，在改善所得生物缀合物的治疗指数方面获得了最佳结果。
发明人惊奇地发现使用用于将靶分子与抗体缀合的上述方法对抗体-缀合物的治疗指数具有有益效果。换句话说，具有本实施方案的缀合模式的抗体-缀合物的治疗指数相对于不具有本实施方案的缀合模式的抗体-缀合物具有改善的治疗指数。
本发明缀合模式的用途不同于制备抗体-缀合物的方法，其中所述缀合模式用于制备抗体-缀合物。尽管存在许多制备抗体-缀合物的缀合模式，但发明人发现，在保持抗体和靶分子恒定的同时选择特定的缀合模式有利地影响缀合物的治疗指数。
在称为“核心-GlcNAc官能化”的本发明缀合模式的上下文中，在一个实施方案中，所述缀合模式包括通过使靶分子(D)上的反应性基团Q1与生物分子(B)上的官能团F1反应，使得L包含式(1)的基团或其盐，来制备式(A)的生物缀合物的步骤：
B-L-D
(a)，
其中：
-B为生物分子；
-L为连接B和D的接头；
-D为靶分子；以及
-每个“-”的存在独立地为键或间隔基部分；
Figure BDA0001818785290000271
其中：
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S或NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为另一个靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
步骤(i)
在步骤(i)中，在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分。在本文中，糖蛋白通常是抗体，例如如下文进一步描述的已经剪接成核心-GlcNAc残基的抗体。
步骤(i)提供式(24)的经修饰的抗体：
Figure BDA0001818785290000272
Figure BDA0001818785290000281
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4。
在一个优选的实施方案中，y＝1、2或4，更优选y＝1或2(例如当AB是单链抗体时)，或者y＝2或4(例如当AB是双链抗体时)。最优选地y＝2。
在一个实施方案中，包含核心-GlcNAc取代基的抗体是式(21)，其中所述核心-GlcNAc取代基任选地是岩藻糖基化的，其中AB代表抗体，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，Fuc是岩藻糖，b为0或1且y为1或4，优选y为1或2。
Figure BDA0001818785290000282
这种包含核心-GlcNAc取代基的抗体是本领域已知的，并且可以通过技术人员已知的方法制备。在一个实施方案中，本发明的方法还包括在内切糖苷酶存在下将具有核心N-乙酰葡糖胺的抗体聚糖的去糖基化，以获得包含核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺和所述核心N-乙酰葡糖胺取代基任选地是岩藻糖基化的。根据聚糖的性质，可以选择合适的内切糖苷酶。内切糖苷酶优选选自EndoS、EndoA、EndoE、EfEndo18A、EndoF、EndoM、EndoD、EndoH、EndoT和EndoSH和/或其组合，优选EndoS、EndoA、EndoF、EndoM、EndoD、EndoH和EndoSH酶和/或其组合，其选择取决于聚糖的性质。在本发明的第四方面中，下文进一步定义EndoSH。在进一步优选的实施方案中，内切糖苷酶是EndoS、EndoS49、EndoF、EndoH、EndoSH或其组合，更优选EndoS、EndoS49、EndoF、EndoSH或其组合。在进一步优选的实施方案中，内切糖苷酶是EndoS、EndoF或其组合。在进一步优选的实施方案中，内切糖苷酶是EndoS。在另一个优选的实施方案中，内切糖苷酶是EndoS49。在另一个优选的实施方案中，内切糖苷酶是EndoSH。在本文中，EndoF通常是指EndoF1、EndoF2和EndoF3之一。
在步骤(i)中，修饰抗体(21a)(其中y＝1)产生包含一个GlcNAc-S(F1)x取代基的经修饰的抗体(22)，修饰抗体(21b)(其中y＝2)产生包含两个GlcNAc-S(F1)x取代基的经修饰的抗体(23)。在一个实施方案中，优选地，当AB是双链抗体时，y＝2或4。在一个实施方案中，优选地，当AB是单链抗体时，y＝1或2。
Figure BDA0001818785290000291
在一个优选的实施方案中，抗体AB能够靶向表达选自以下抗原的肿瘤：5T4(TPBG)、av-整联蛋白/ITGAV、BCMA、C4.4a、CA-IX、CD19、CD19b、CD22、CD25、CD30、CD33、CD37、CD40、CD56、CD70、CD74、CD79b、c-KIT(CD117)、CD138/SDC1、CEACAM5(CD66e)、Cripto、CS1、DLL3、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3(AGS-16)、EpCAM、EphA2、FGFR2、FGFR3、FOLR1(叶酸盐受体a)、gpNMB、鸟苷酰环化酶C(GCC)、HER2、Erb-B2、Lamp-1、Lewis Y抗原、LIV-1(SLC39A6、ZIP6)、间皮素(MSLN)、MUC1(CA6、huDS6)、MUC16/EA-125、NaPi2b、连接素-4、Notch3、P-钙粘蛋白、PSMA/FOLR1、PTK7、SLITRK6(SLC44A4)、STEAP1、TF(CD142)、Trop-1、Trop-2/EGP-1、Trop-3、Trop-4，优选表达HER2的肿瘤。
在优选的实施方案中，抗体AB能够靶向表达HER2的肿瘤，包括但不限于低表达HER2的肿瘤，更优选抗体AB选自曲妥珠单抗、margetuximab、培妥珠单抗、HuMax-Her2、厄马索单抗、HB-008、ABP-980、BCD-022、CanMab、Herzuma、HD201、CT-P6、PF-05280014、COVA-208、FS-102、MCLA-128、CKD-10101、HT-19及其功能类似物，最优选曲妥珠单抗。
S(F1)x定义为包含x个官能团F1的糖衍生物，其中x是1或2并且F1是能够与存在于接头-缀合物上的Q1反应以形成连接部分Z3的官能团。糖衍生物S(F1)x可包含1或2个官能团F1。当S(F1)x包含2个官能团F1时，每个官能团F1独立地选择，即一个S(F1)x可以包含不同的官能团F1。在一个实施方案中，x＝1。在一个实施方案中，x＝2。糖衍生物S(F1)x衍生自糖或糖衍生物S，例如氨基糖或另外衍生的糖。糖和糖衍生物的实例包括半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、葡糖醛酸(GlucA)和岩藻糖(Fuc)。氨基糖是其中羟基(OH)被氨基替换的糖，实例包括N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。另外衍生的糖的实例包括葡糖醛酸(GlucA)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。糖衍生物S(F1)x优选衍生自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡糖醛酸(GlucA)、岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，优选衍生自GlcNAc、Glc、Gal和GalNAc。更优选S(F1)x衍生自Gal或GalNAc，最优选S(F1)x衍生自GalNAc。
式S(F1)x-P的化合物(其中核苷单磷酸或核苷二磷酸P与糖衍生物S(F1)x连接)是本领域已知的。例如，Wang等人，Chem.Eur.J.2010,16,13343–13345,Piller等人,ACSChem.Biol.2012,7,753,Piller等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.2005,15,5459-5462和WO2009/102820(全部以引用的方式纳入本文)公开了许多化合物S(F1)x-P及其合成。在一个优选的实施方案中，S(F1)x-P中的核苷单磷酸酯或核苷二磷酸P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)，更优选P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)，最优选P＝UDP。
S(F1)x中的1或2个官能团F1可以通过几种方式与糖或糖衍生物S连接。1或2个官能团F1可以与糖或糖衍生物的C2、C3、C4和/或C6键合，而不是与羟基(OH)基团键合。应注意，由于岩藻糖在C6上缺少OH基团，如果F1与Fuc的C6键合，则F1取代H原子。当F1是叠氮基时，优选F1与C2、C4或C6键合。如上所述，S(F1)x中的一个或多个叠氮取代基可以与糖或糖衍生物S的C2、C3、C4或C6键合，而不是与羟基(OH)基团键合，或者在6-叠氮基岩藻糖(6-AzFuc)的情况下，不是与氢原子键合。替代性地或另外地，氨基糖衍生物的N-乙酰基取代基可被叠氮基乙酰基取代基取代。在一个优选的实施方案中，S(F1)x选自2-叠氮基乙酰胺基-2-脱氧-半乳糖(GalNAz)、2-叠氮基二氟乙酰胺基-2-脱氧-半乳糖(F2-GalNAz)、6-叠氮基-6-脱氧半乳糖(6-AzGal)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰胺基半乳糖(6-AzGalNAc或6-N3-GalNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰基半乳糖(4-AzGalNAc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰胺基-2-脱氧-半乳糖(6-AzGalNAz)、2-叠氮基乙酰胺基-2-脱氧-葡萄糖(GlcNAz)、6-叠氮基-6-脱氧葡萄糖(6-AzGlc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰胺基葡萄糖(6-AzGlcNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰胺基葡萄糖(4-AzGlcNAc)和6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰胺基2-脱氧-葡萄糖(6-AzGlcNAz)，更优选选自GalNAz、4-AzGalNAc和6-AzGalNAc。其中F1是叠氮基的S(F1)x-P的实例如下所示。当F1是酮基时，优选F1与C2键合，而不是与S的OH基团键合。或者，F1可以与氨基糖衍生物(优选2-氨基糖衍生物)的N原子键合。然后糖衍生物包含-NC(O)R36取代基。R36优选为任选取代的C2-C24烷基。更优选地，R36是乙基。在一个优选的实施方案中，S(F1)x选自2-脱氧-(2-氧代丙基)半乳糖(2-酮基Gal)、2-N-丙酰基半乳糖胺(2-N-丙酰基GalNAc)、2-N-(4-氧代戊酰基)半乳糖胺(2-N-LevGal)和2-N-丁酰基半乳糖胺(2-N-丁酰基GalNAc)，更优选2-酮基GalNAc和2-N-丙酰基GalNAc。其中F1是酮基的S(F1)x-P的实例如下所示。当F1是炔基，优选末端炔基或(杂)环炔基时，优选所述炔基存在于2-氨基糖衍生物上。其中F1是炔基的S(F1)x的实例是2-(丁-3-炔酸酰胺基)-2-脱氧-半乳糖。其中F1是炔基的S(F1)x-P的实例如下所示。
在一个实施方案中，F1选自叠氮基、酮基和炔基。叠氮基是叠氮化物官能团-N3。酮基是-[C(R37)2]oC(O)R36基团，其中R36是甲基或任选取代的C2-C24烷基，R37独立地选自氢、卤素和R36，o为0-24，优选为0-10，更优选为0、1、2、3、4、5或6。优选地，R37为氢。炔基优选为如上所定义的末端炔基或(杂)环炔基。在一个实施方案中，炔基是-[C(R37)2]oC≡C-R37基团，其中R37和o如上所定义；R37优选为氢。
在一个实施方案中，F1为叠氮化物或炔烃部分。最优选地，F1是叠氮基(-N3)。在一个实施方案中，F1是叠氮化物部分，Q1是(环)炔烃部分，Z3是三唑部分。
与叠氮基取代的或炔基取代的糖和糖衍生物连接的尿苷二磷酸S(F1)x-UDP的几个实例(25-28)如下所示。
Figure BDA0001818785290000321
优选地，S(F1)x-P选自GalNAz-UDP(25)、6-AzGal-UDP(26)、6-AzGalNAc-UDP(6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺-UDP)(27)、4-AzGalNAz-UDP、6-AzGalNAz-UDP、6-AzGlc-UDP、6-AzGlcNAz-UDP和2-(丁-3-炔酸酰胺基)-2-脱氧-半乳糖-UDP(28)。最优选地，S(F1)x-P是GalNAz-UDP(25)或6-AzGalNAc-UDP(27)。
能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分的合适催化剂是本领域已知的。合适的催化剂是因此该特定过程中的特定糖衍生物核苷酸S(F1)x-P是底物的催化剂。更具体地，催化剂催化β(1,4)-糖苷键的形成。优选地，催化剂选自半乳糖基转移酶和N-乙酰半乳糖氨基转移酶，更优选选自β(1,4)-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(GalNAcT)和β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)，最优选选自具有突变型催化结构域的β(1,4)-N-乙酰半乳糖氨基转移酶。合适的催化剂和其突变体公开在WO2014/065661、WO2016/022027和PCT/EP2016/059194(WO2016/170186)中，全部内容都通过引用并入本文中。在一个实施方案中，催化剂是野生型半乳糖基转移酶或N-乙酰半乳糖氨基转移酶，优选N-乙酰半乳糖氨基转移酶。在一个替代的实施方案中，催化剂是突变型半乳糖基转移酶或N-乙酰半乳糖氨基转移酶，优选突变型N-乙酰半乳糖氨基转移酶。WO 2016/022027和PCT/EP2016/059194(WO 2016/170186)中所述的突变型酶是特别优选的。
这些半乳糖基转移酶(突变型)酶催化剂能够识别作为受体的内部糖和糖衍生物。因此，糖衍生物S(F1)x在步骤(i)中与核心-GlcNAc取代基连接，而不论所述GlcNAc是否是岩藻糖基化的。
步骤(i)优选在合适的缓冲溶液——例如磷酸盐、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPES、tris和甘氨酸——中进行。合适的缓冲剂是本领域已知的。优选地，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或tris缓冲液。步骤(i)优选在约4至约50℃的温度下进行，更优选在约10至约45℃的温度下进行，甚至更优选在约20至约40℃的温度下进行，最优选在约30至约37℃的温度下进行。步骤(i)优选在约5至约9的pH下进行，优选在约5.5至约8.5的pH下进行，更优选在约6至约8的pH下进行。最优选地，步骤(i)在约7至约8的pH下进行。
步骤(ii)
在步骤(ii)中，使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团。这种反应在这样的条件下发生，使得反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应以使生物分子与接头-缀合物共价连接。接头-缀合物及其优选实施方案在下面进一步定义。接头L2优选包含式(1)的基团或其盐，并且所述接头在下文进一步定义。
经修饰的抗体上的官能团F1的互补官能团Q1是本领域已知的。优选地，反应性基团Q1和官能团F1能够在生物正交反应中反应，因为那些反应不会干扰在该反应过程中存在的生物分子。生物正交反应和其中适合的官能团是本领域技术人员已知的，例如已知于Gong和Pan,Tetrahedron Lett.2015,56,2123–2132，包括Staudinger连接和无铜点击化学。因此，优选Q1选自1,3-偶极子、炔烃、(杂)环辛炔、环辛烯、四嗪、酮、醛、烷氧基胺、肼和三苯基膦。例如，当F1是叠氮基时，叠氮化物修饰的抗体和接头-缀合物的连接优选通过环加成反应进行。然后，官能团Q1优选选自炔基，优选末端炔基和(杂)环炔基。例如，当F1是酮基时，酮修饰的抗体与接头-缀合物的连接优选通过与羟胺衍生物或肼的选择性缀合进行，分别产生肟或腙。然后，官能团Q1优选为伯氨基(例如，-NH2基团)、氨氧基(例如，-O-NH2)或肼基(例如，-N(H)NH2)。然后，接头-缀合物优选分别为H2N-L2(D)r、H2N-O-L2(D)r或H2N-N(H)-L2(D)r。例如，当F1是炔基时，炔烃修饰的抗体与接头-缀合物的连接优选通过环加成反应，优选1,3-偶极环加成反应进行。然后，官能团Q1优选为1,3-偶极子，例如叠氮化物、硝酮或氧化腈。然后，接头-缀合物优选为N3-L2(D)r。
在优选的实施方案中，在步骤(ii)中，本发明的叠氮化物修饰的抗体上的叠氮化物与接头-缀合物的炔基(优选末端炔基或(杂)环炔基)通过环加成反应进行反应。包含叠氮化物的分子与包含末端炔基或(杂)环炔基的分子的这种环加成反应是本领域中称为“点击化学”的反应之一。在包含末端炔基的接头-缀合物的情况下，所述环加成反应需要在合适的催化剂，优选Cu(I)催化剂的存在下进行。然而，在优选的实施方案中，接头-缀合物包含(杂)环炔基，更优选应变(杂)环炔基。当(杂)环炔基是应变(杂)环炔基时，不需要催化剂的存在，并且所述反应甚至可以通过称为应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)的反应自发地发生。这是本领域已知的“无金属点击化学”反应之一。应变(杂)环炔基是本领域已知的并且在下面更详细地描述。
因此，在优选的实施方案中，步骤(ii)包括使经修饰的抗体与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含(杂)环炔基和一个或多个目的分子，其中所述经修饰的抗体是包含GlcNAc-S(F1)x取代基的抗体，其中GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，其中S(F1)x是包含x个官能团F1的糖衍生物，其中F1为叠氮基且x为1或2，其中所述GlcNAc-S(F1)x取代基通过所述GlcNAc-S(F1)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1与抗体键合，并且其中所述GlcNAc任选地是岩藻糖基化的。在进一步优选的实施方案中，所述(杂)环炔基是应变(杂)环炔基。
目的分子D可以选自活性物质、报道分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米粒子、微粒和生物分子。
在D的上下文中，术语“活性物质”是指药理学或生物学物质，即具有生物学和/或药学活性的物质，例如药物、前药、诊断剂、蛋白质、肽、多肽、肽标签、氨基酸、聚糖、脂质、维生素、类固醇、核苷酸、核苷、多核苷酸、RNA或DNA。肽标签的实例包括细胞渗透性肽，如人乳铁蛋白或聚精氨酸。聚糖的实例为低聚甘露糖。氨基酸的实例为赖氨酸。
当靶分子为活性物质时，所述活性物质优选选自药物和前药。更优选地，所述活性物质选自药学活性化合物，尤其是低分子量至中等分子量的化合物(例如约200至约2500Da，优选约300至约1750Da)。在其他优选的实施方案中，所述活性物质选自细胞毒素、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素的实例包括秋水仙素(colchicine)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、蒽环类抗生素(anthracyclines)、喜树碱(camptothecins)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、紫杉烷类(taxanes)、刺孢霉素(calicheamycins)、微管溶素(tubulysins)、伊立替康(irinotecans)、烯二炔类(enediynes)、抑制肽、鹅膏蕈碱(amanitin)、deBouganin、多卡米星(duocarminsins)、美登素(maytansines)、阿里他汀(auristatins)、吲哚并苯并二氮杂卓(indolinobenzodiazepines)或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。考虑到其差的水溶性，优选的活性物质包括长春花生物碱、蒽环类抗生素、喜树碱、紫杉烷类、微管溶素、鹅膏蕈碱、多卡米星、美登素、阿里他汀、吲哚并苯并二氮杂卓和吡咯并苯并二氮杂卓，尤其是长春花生物碱、蒽环类抗生素、喜树碱、紫杉烷类、微管溶素、鹅膏蕈碱、美登素和阿里他汀。
术语“报告分子”在本文中是指容易检测其存在的分子，例如诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记物、造影剂、磁共振成像剂或质量标记物。
各种荧光团——也称为荧光探针——是本领域技术人员已知的。在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,第3版2013,第10章：“Fluorescent probes”,第；395–463页(以引用的方式纳入)中，更详细记载了几种荧光团。荧光团的实例包括Alexa Fluor(例如Alexa Fluor 555)、花青染料(例如Cy3或Cy5)和花青染料衍生物、香豆素衍生物、荧光素和荧光素衍生物、罗丹明和罗丹明衍生物、硼二吡咯亚甲基衍生物、芘衍生物、萘酰亚胺衍生物、藻胆蛋白衍生物(例如别藻蓝蛋白)、色霉素、镧系元素螯合物和量子点纳米晶体的所有种类。考虑到其差的水溶性，优选的荧光团包括花青染料、香豆素衍生物、荧光素及其衍生物、芘衍生物、萘酰亚胺衍生物、色霉素、镧系螯合物和量子点纳米晶体，尤其是香豆素衍生物、荧光素、芘衍生物和色霉素。
放射性同位素标记的实例包括99mTc、111In、114mIn、115In、18F、14C、64Cu、131I、125I、123I、212Bi、88Y、90Y、67Cu、186Rh、188Rh、66Ga、67Ga和10B，其任选地通过螯合部分连接，所述螯合部分例如DTPA(二亚乙基三胺五乙酸酐)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷N,N′,N″-三乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸)、DTTA(N1-(对-异硫氰酸根合苄基)-二亚乙基三胺-N1,N2,N3,N3-四乙酸)、去铁胺或DFA(N′-[5-[[4-[[5-(乙酰基羟基氨基)戊基]氨基]-1,4-二氧代丁基]羟基氨基]戊基]-N-(5-氨基戊基)-N-羟基丁二酰胺)或HYNIC(肼基烟酰胺)。同位素标记技术为本领域技术人员已知的，并且在G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,第3版.2013,第18章:“PEGylation and synthetic polymer modification”,第787–838页(以引用的方式纳入)中更详细地记载。
适合用作本发明化合物中靶分子D的聚合物为本领域技术人员已知的，并且在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,第3版.2013,第18章：“PEGylation and synthetic polymer modification”,第787–838页(以引用的方式纳入)中更详细地记载了几个实例。当靶分子D是聚合物时，优选靶分子D独立地选自聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙二醇(PPG)、聚环氧丙烷(PPO)、1,xx-二氨基烷烃聚合物(其中xx为烷烃中的碳原子数，优选xx为2至200、优选2至10范围内的整数)、(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷以及包含更长乙二醇链的等同物)、多糖(例如葡聚糖)、聚(氨基酸)(例如聚(L-赖氨酸))和聚(乙烯醇)。考虑到其差的水溶性，优选的聚合物包括1,xx-二氨基烷烃聚合物和聚(乙烯醇)。
适合用作靶分子D的固体表面为本领域技术人员已知的。固体表面为例如功能性表面(例如，纳米材料、碳纳米管、富勒烯或病毒壳体的表面)、金属表面(例如，钛、金、银、铜、镍、锡、铑或锌表面)、金属合金表面(其中合金来自例如铝、铋、铬、钴、铜、镓、金、铟、铁、铅、镁、汞、镍、钾、钚、铑、钪、银、钠、钛、锡、铀、锌和/或锆)、聚合物表面(其中聚合物为例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(二甲基硅氧烷)或聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺)、玻璃表面、硅氧烷表面、色谱载体表面(其中色谱载体为例如二氧化硅载体、琼脂糖载体、纤维素载体或氧化铝载体)等。当靶分子D为固体表面时，优选D独立地选自功能性表面或聚合物表面。
水凝胶为本领域技术人员已知的。水凝胶为由聚合物成分之间交联而形成的水溶胀网络。参见例如A.S.Hoffman,Adv.Drug Delivery Rev.2012,64,18(以引用的方式纳入)。当所述靶分子为水凝胶时，优选水凝胶由作为聚合物基底的聚(乙二醇)(PEG)组成。
适合用作靶分子D的微米颗粒和纳米颗粒为本领域技术人员已知的。在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,第3版.2013,第14章：“Microparticles and nanoparticles”,第549–587页(以引用的方式纳入)中记载了多种合适的微米颗粒和纳米颗粒。所述微米或纳米颗粒可为任意形状，例如球体、杆、管、立方体、三角形和椎体。优选地，所述微颗粒或纳米颗粒为球形。所述微米颗粒和纳米颗粒的化学组成可以改变。当靶分子D为微米颗粒或纳米颗粒时，所述微米颗粒或纳米颗粒为例如聚合微米颗粒或聚合纳米颗粒、二氧化硅微米颗粒或二氧化硅纳米颗粒、或金微米颗粒或金纳米颗粒。当所述颗粒为聚合微米颗粒或聚合纳米颗粒时，聚合物优选为聚苯乙烯或苯乙烯共聚物(例如苯乙烯和二乙烯基苯、丁二烯、丙烯酸酯和/或乙烯基甲苯的共聚物)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯基甲苯、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(pHEMA)或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸2-羟乙酯)[聚(EDGMA/HEMA)]。任选地，微米颗粒或纳米颗粒的表面例如使用洗涤剂，通过次级聚合物的接枝聚合或通过另一种聚合物或间隔基部分的共价连接等，进行改性。
靶分子D也可为生物分子。下面将更详细地描述生物分子及其优选实施方案。当靶分子D为生物分子时，优选生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。
下文进一步描述了根据第三方面的抗体-缀合物的D的优选选项。在本发明的上下文中，生物缀合物可含有多于一个的靶分子D，其可以相同或不同。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物可含有多于一个，优选两个，与相同S连接的靶分子(即x、r和q之一>1，优选x、r和q之一＝2)，优选地，与同一Z3连接的靶分子(即r和q之一>1，优选r和q之一＝2)。最优选地，在本实施方案的上下文中，r＝2。优选地，那些靶分子是不同的，更优选它们都是活性物质，更优选抗癌剂，最优选细胞毒素。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物包含两种不同的靶分子，优选两种不同的活性物质，更优选两种不同的抗癌剂，最优选两种不同的细胞毒素。
优选地，接头-缀合物包含(杂)环炔基。在优选的实施方案中，所述接头-缀合物具有式(31)：
Figure BDA0001818785290000381
其中：
-L2为如本文所定义的接头；
-D为靶分子；
-r为1-20；
-R31独立地选自氢、卤素、-OR35、-NO2、-CN、-S(O)2R35、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基任选被取代，其中两个取代基R31可以连接在一起形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，并且其中R35独立地选自氢、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基；
-X为C(R31)2、O、S或NR32，其中R32是R31或L2(D)r，并且其中L2、D和r如上所定义；
-q为0或1，条件是如果q为0，则X为NL2(D)r；和
-aa为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一个优选的实施方案中，所述接头-缀合物具有式(31b)：
Figure BDA0001818785290000382
其中：
-L2为如本文所定义的接头；
-D为靶分子；
-r为1-20；
-R31独立地选自氢、卤素、-OR35、-NO2、-CN、-S(O)2R35、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基任选被取代，其中两个取代基R31可以连接在一起形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，并且其中R35独立地选自氢、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基；
-X为C(R31)2、O、S或NR32，其中R32是R31或L2(D)r，并且其中L2、D和r如上所定义；
-q为0或1，条件是如果q为0，则X为NL2(D)r；
-aa为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
-aa'为0、1、2、3、4、5、6、7或8；和
-aa+aa'<10。
在进一步优选的实施方案中，aa+aa'为4、5、6或7，更优选aa+aa'为4、5或6，最优选aa+aa'为5。
在另一个优选的实施方案中，所述接头-缀合物具有式(31c)：
Figure BDA0001818785290000391
其中：
-L2为如本文所定义的接头；
-D为靶分子；
-r为1-20；
-q为0或1，条件是如果q为0，则X为NL2(D)r；和
-l为0-10。
在优选的实施方案中，如果q为1，则X为C(R31)2、O、S或NR31。
在另一个优选的实施方案中，a是5，即所述(杂)环炔基优选是(杂)环辛炔基。在另一个优选的实施方案中，X是C(R31)2或NR32。当X是C(R31)2时，优选R32是氢。当X是NR32时，优选R32是L2(D)r。在另一个优选的实施方案中，r为1至10，更优选r为1、2、3、4、5、6、7或8，更优选r为1、2、3、4、5或6，最优选r为1、2、3或4。
L2(D)r取代基可以存在于所述(杂)环炔基中的C原子上，或者，在杂环炔基的情况下，存在于所述杂环炔基的杂原子上。当(杂)环炔基包含取代基(例如，增环的环烷基)时，L2(D)r取代基也可以存在于所述取代基上。
将接头L2在一端连接至(杂)环炔基并且在另一端连接至靶分子以获得接头-缀合物的方法，取决于接头、(杂)环炔基和靶分子的确切性质。合适的方法是本领域已知的。
优选地，接头-缀合物包含(杂)环辛炔基，更优选应变(杂)环辛炔基。合适的(杂)环炔基部分是本领域已知的。例如，DIFO、DIFO2和DIFO3公开于US 2009/0068738中，其通过引用并入本文中。DIBO公开于WO2009/067663中，其通过引用并入本文中。DIBO可以任选地被硫酸化(S-DIBO)，如J.Am.Chem.Soc.2012,134,5381中所公开的。BARAC公开于J.Am.Chem.Soc.2010,132,3688–3690和US 2011/0207147中，均通过引用并入本文中。
包含(杂)环辛炔基的接头-缀合物的优选实例如下所示。
Figure BDA0001818785290000401
本领域已知的其他环辛炔部分是DIBAC(也称为ADIBO或DBCO)和BCN。DIBAC公开于Chem.Commun.2010,46,97–99中，其通过引用并入本文中。BCN公开于WO2011/136645中，其通过引用并入本文中。
在优选的实施方案中，所述接头-缀合物具有式(32)、(33)、(34)、(35)或(36)。在另一个优选的实施方案中，所述接头-缀合物具有式(37):
Figure BDA0001818785290000411
其中：
-R1、L2、D和r如上所定义；
-Y是O、S或NR32，其中R32如上所定义；
-R33独立地选自氢、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基；
-R34选自氢、Y-L2(D)r、-(CH2)nn-Y-L2(D)r、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基，所述烷基任选被一个或多个选自O、N和S的杂原子间隔，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基独立地任选被取代；和
-nn为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在进一步优选的实施方案中，R31是氢。在另一个优选的实施方案中，R33是氢。在另一个优选的实施方案中，n为1或2。在另一个优选的实施方案中，R34为氢、Y-L2(D)r或-(CH2)nn-Y-L2(D)r。在另一个优选的实施方案中，R32是氢或L2(D)r。在进一步优选的实施方案中，接头-缀合物具有式38：
Figure BDA0001818785290000412
其中Y、L2、D、nn和r如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，所述接头-缀合物具有式(39):
Figure BDA0001818785290000421
其中L2、D和r如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，所述接头-缀合物具有式(35):
Figure BDA0001818785290000422
其中L2、D和r如上所定义。
pp的值和M的性质取决于叠氮化物取代的糖或糖衍生物S(F1)x，其存在于与接头-缀合物连接的本发明的叠氮化物修饰的抗体中。如果S(F1)x中的叠氮化物存在于糖或糖衍生物的C2、C3或C4位置上(而不是糖OH基团)，则pp为0。如果S(F1)x为叠氮基乙酰胺基-2-脱氧糖衍生物，S(F1)x是例如GalNAz或GlcNAz，则pp为1且M为-N(H)C(O)CH2-。如果S(F1)x中的叠氮化物存在于糖或糖衍生物的C6位置上，则pp为0且M不存在。
接头(L2)，也称为连接单元，是本领域公知的。在如本文所述的接头-缀合物中，L与靶分子以及官能团Q1连接。L2可以例如选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基。所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代，且所述基团任选地被一个或多个杂原子(优选1至100个杂原子)间隔，所述杂原子优选选自O、S和NR35，其中R35独立地选自氢、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基。最优选地，所述杂原子是O。合适的连接单元的实例包括(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含更长乙二醇链的等价物)、聚乙二醇或聚环氧乙烷链、聚丙二醇或聚环氧丙烷链和1,xx-二氨基烷烃，其中xx是烷烃中的碳原子数。
另一类合适的接头包括可切割的接头。可切割的接头在本领域中是公知的。例如，Shabat等人,Soft Matter 2012,6,1073(通过引用并入到本文中)公开了可切割的接头，其包含经生物触发(例如，酶促裂解或氧化事件)释放的自我牺牲型部分。合适的可切割接头的一些实例是肽-接头，其在被蛋白酶(例如组织蛋白酶、纤溶酶或金属蛋白酶)特异性识别时被切割；或是基于糖苷的接头，其在被糖苷酶(例如葡糖醛酸酶)特异性识别时被切割，或是在贫氧、缺氧区域中被还原的硝基芳族化合物。
针对关于“磺酰胺键”的实施方案以及根据第三方面的抗体-缀合物的优选的接头L2在下文中进一步定义。优选的接头-缀合物也在下文中进一步定义。
步骤(ii)优选在约20至约50℃的温度下进行，更优选在约25至约45℃的温度下进行，甚至更优选在约30至约40℃的温度下进行，最优选在约32至约37℃的温度下进行。步骤(ii)优选在约5至约9，优选约5.5至约8.5，更优选约6至约8的pH下进行。最优选地，步骤(ii)在约7至约8的pH下进行。步骤(ii)优选在水中进行。更优选地，所述水是纯净水，甚至更优选如根据ISO 3696所定义的超纯水或I型水。合适的水是例如
Figure BDA0001818785290000432
水。优选将所述水缓冲，例如用磷酸盐缓冲盐水或tris缓冲。合适的缓冲剂是本领域技术人员已知的。在优选的实施方案中，步骤(ii)在
Figure BDA0001818785290000433
水中进行，其用磷酸盐缓冲盐水或tris缓冲。
在一个实施方案中，步骤(ii)的反应是(环)炔烃-叠氮化物缀合，以形成连接部分Z3，其由(10e)、(10i)、(10g)、(10j)或(10k)表示，优选由(10e)、(10i)、(10g)表示，最优选由(10g)表示，如由以下表示：
Figure BDA0001818785290000431
其中环A是7-10元(杂)环部分。连接部分(10e)、(10j)和(10k)可以存在于可能的两种区域异构体中的任一种中。
包含本发明的缀合模式或通过本发明的缀合模式获得的生物缀合物优选由式(40)或(40b)表示：
Figure BDA0001818785290000441
其中：
-AB是抗体，S是糖或糖衍生物，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺；
-R31独立地选自氢、卤素、-OR35、-NO2、-CN、-S(O)2R35、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基任选地被取代，其中两个取代基R31可以连接在一起形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，并且其中R35独立地选自氢、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基；
-X是C(R31)2、O、S或NR32，其中R32是R31或L2(D)r，其中L2是接头，且D如权利要求1中所定义；
-r为1-20；
-q为0或1，条件是如果q为0则X为NL2(D)r；
-aa是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
-aa'是0、1、2、3、4、5、6、7或8；和
-aa+aa'<10。
-b为0或1；
-pp为0或1；
-M是-N(H)C(O)CH2-、-N(H)C(O)CF2-、-CH2-、-CF2-或含有0-4个氟取代基的1,4-亚苯基，优选含有位于亚苯基的C2和C6上或位于亚苯基的C3和C5上的2个氟取代基的1,4-亚苯基；
-x是1或2；
-y是1-4；
-Fuc是岩藻糖。
在优选的实施方案中，本发明的抗体-缀合物具有式(41):
Figure BDA0001818785290000451
其中AB、L2、D、Y、S、M、x、y、b、pp、R32、GlcNAc、R31、R33、R34、nn和r如上所定义，并且其中所述N-乙酰葡糖胺任选地是岩藻糖基化的(b为0或1)。
在进一步优选的实施方案中，R31、R33和R34是氢且nn是1或2，在甚至更优选的实施方案中，x是1。
在另一个优选的实施方案中，抗体-缀合物具有式(42):
Figure BDA0001818785290000452
其中AB、L2、D、S、b、pp、x、y、M和GlcNAc如上所定义，并且其中所述N-乙酰葡糖胺任选地是岩藻糖基化的(b是0或1)；或根据区域异构体(42b)：
Figure BDA0001818785290000453
Figure BDA0001818785290000461
其中AB、L2、D、S、b、pp、x、y、M和GlcNAc如上所定义，并且其中所述N-乙酰葡糖胺任选地是岩藻糖基化的。
在另一个优选的实施方案中，抗体-缀合物具有式(35b):
Figure BDA0001818785290000462
其中AB、L2、D、S、b、pp、x、y、M和GlcNAc如上所定义，并且其中所述N-乙酰葡糖胺任选地是岩藻糖基化的。
在另一个优选的实施方案中，抗体-缀合物具有式(40c)：
Figure BDA0001818785290000463
其中AB、L2、D、S、b、pp、x、y、M和GlcNAc如上所定义，并且其中所述N-乙酰葡糖胺任选地是岩藻糖基化的。
在另一个优选的实施方案中，抗体-缀合物具有式(40d)：
Figure BDA0001818785290000464
Figure BDA0001818785290000471
其中AB、L2、D、S、b、pp、x、y、M和GlcNAc如上所定义，其中l为0-10，并且其中所述N-乙酰葡糖胺任选地是岩藻糖基化的。
磺酰胺键
在一个实施方案中，本发明的缀合模式被称为“磺酰胺键”，其指的是存在连接生物分子B和靶分子D的特定接头L。在本实施方案的上下文中，关于接头L的所有叙述优选地也适用于根据核心-GlcNAc官能化作为缀合模式的实施方案的接头，特别是接头L2。接头L包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000472
其中：
-a为0或1；和
-R1选自氢、C1–C24烷基、C3-C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳烷基，所述C1–C24烷基、C3-C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳烷基任选地被取代且任选被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1是另一个靶分子D，其中D任选通过间隔基部分与N连接。
当式(1)的基团包含盐时，所述盐优选为药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，本发明的接头L包含式(1)的基团或其盐，其中a是0。在该实施方案中，接头L因此包含式(2)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000473
其中R1如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，本发明的接头L包含式(1)的基团或其盐，其中a是1。在该实施方案中，接头L因此包含式(3)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000481
其中R1如上所定义。
在式(1)、(2)和(3)的基团中，R1选自氢、C1–C24烷基、C3-C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳烷基，所述C1–C24烷基、C3-C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳烷基任选地被取代且任选被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1是另一个靶分子D，其中D任选通过间隔部分与N连接；
在优选的实施方案中，R1是氢或C1-C20烷基，更优选R1是氢或C1-C16烷基，甚至更优选R1是氢或C1-C10烷基，其中烷基任选被取代且任选地被一个或多个选自O、S和NR3(优选O)的杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。在优选的实施方案中，R1是氢。在另一个优选的实施方案中，R1是C1-C20烷基，更优选C1-C16烷基，甚至更优选C1-C10烷基，其中烷基任选被一个或多个O原子间隔，并且其中烷基任选被-OH基团(优选末端-OH基团)取代。在该实施方案中，进一步优选R1是包含末端-OH基团的(聚)乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，R1选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基，更优选选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基，甚至更优选选自氢、甲基和乙基。甚至更优选R1是氢或甲基，最优选R1是氢。
在另一个优选的实施方案中，R1是另一个靶分子D。任选地，D通过一个或多个间隔部分与N连接。间隔部分(如果存在的话)定义为间隔(即在D和N之间提供一定距离)并共价连接D和N的部分。
靶分子D及其优选实施方案在上面更详细地定义。
为了获得式(A)的生物缀合物，可以以三种选择之一引入式(1)的基团。首先，包含式(1)的基团的接头L或其盐可以存在于由Q1-D表示的接头-缀合物中，其中L是Q1和D之间的间隔基。其次，包含式(1)的基团或其盐的接头L可以存在于由B-F1表示的生物分子中，其中L是B和F1之间的间隔基。第三，式(1)的基团或其盐可以在缀合反应自身期间形成。在后一种选择中，选择Q1和F1使得它们的反应产物(即连接基团Z3)包含式(1)的基团或其盐或是式(1)的基团或其盐。优选地，根据上述第一或第二选择引入式(1)的基团或其盐，最优选根据第一选择。在式(1)的基团或其盐在缀合反应期间已经如此存在的情况下，如上所述，对溶解度的积极影响和过程中聚集的缺乏改善了缀合反应的效率。在式(1)的基团或其盐存在于接头-缀合物中的情况下，甚至疏水性药物也可以容易地进行缀合反应。
接头-缀合物
接头-缀合物由Q1-D表示，优选由Q1-L-D表示，其中D是靶分子，L是如上进一步定义的连接Q1和D的接头，Q1是能够与生物分子上的官能团F1反应的反应性基团，并且每次出现的“-”独立地是键或间隔基部分。在一个实施方案中，“-”是如本文所定义的间隔基部分。在一个实施方案中，“-”是键，通常是共价键。接头-缀合物是其中靶分子与反应性基团Q1共价连接的化合物，优选通过接头或间隔基，最优选通过如上所定义的接头L共价连接。接头-缀合物可以通过存在于接头-构建体上的反应性基团Q2与存在于靶分子上的反应性基团的反应来获得。
优选地，式(1)的基团或其盐位于Q1和D之间。换句话说，反应性基团Q1与式(1)的基团的第一末端共价键合，并且靶分子D与式(1)的基团的第二末端共价键合。在本文中，“第一末端”和“第二末端”均指式(1)的基团的羰基末端或羧基末端或指式(1)的基团的磺酰胺末端，但逻辑上不是指相同的末端。
如本领域技术人员所理解的，本发明的接头-缀合物可包含多于一个，例如两个、三个、四个、五个等的靶分子D。因此，接头-缀合物可因此包含多于一个的“第二末端”。类似地，接头-缀合物可包含多于一个的反应性基团Q1，即接头-缀合物可包含多于一个的第一末端。当存在多于一个反应性基团Q1时，基团Q1可以相同或不同，并且当存在多于一个靶分子D时，靶分子D可以相同或不同。
因此，本发明的接头-缀合物也可以表示为(Q1)y’Sp(D)z，其中y'是1至10范围内的整数，z是1至10范围内的整数。在本文中：
-y'是1至10范围内的整数；
-z是1至10范围内的整数；
-Q1是能够与存在于生物分子上的官能团F1反应的反应性基团；
-D是靶分子；
-Sp是间隔基部分，其中间隔基部分定义为间隔(即在反应性基团Q1和靶分子D之间提供一定距离)并共价连接反应性基团Q1和靶分子D的部分，优选其中所述间隔基部分是如上所定义的接头L，且因此包含式(1)的基团或其盐。
优选地，y'为1、2、3或4，更优选y'为1或2，并且最优选地，y'为1。优选地，z为1、2、3、4、5或6，更优选z为1、2、3或4，甚至更优选z为1、2或3，甚至更优选z为1或2，并且最优选z为1。更优选地，y'为1或2，优选为1，并且z为1、2、3或4，甚至更优选y'为1或2，优选为1，并且z为1、2或3，甚至更优选y'为1或2，优选为1，并且z为1或2，并且最优选y'为1且z为1。在优选的实施方案中，接头-缀合物是式Q1Sp(D)4、Q1Sp(D)3、Q1Sp(D)2或Q1SpD。
优选地，D为“活性物质”或“药学活性物质”，并且是指药理学和/或生物学物质，即具有生物学和/或药学活性的物质，例如药物、前药、诊断剂。优选地，所述活性物质选自药物和前药。更优选地，所述活性物质是药学活性化合物，特别是低分子量至中等分子量的化合物(例如约200至约2500Da，优选约300至约1750Da)。在进一步优选的实施方案中，所述活性物质选自细胞毒素、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素的实例包括秋水仙素、长春花生物碱、蒽环类抗生素、喜树碱、多柔比星、柔红霉素、紫杉烷类、刺孢霉素、微管溶素、伊立替康、烯二炔类、抑制肽、鹅膏蕈碱、deBouganin、多卡米星、美登素、阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓(IBD)。优选的活性物质包括鹅膏蕈碱、蒽环类抗生素、喜树碱、紫杉烷类、微管溶素、鹅膏蕈碱、多卡米星、美登素、阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂卓或吲哚并苯并二氮杂卓(IBD)，尤其是鹅膏蕈碱、蒽环类抗生素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、美登素和阿里他汀。
所述接头-缀合物包含能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团Q1。官能团为本领域技术人员已知的，并且可被定义为能够向含有其的分子赋予特定性质的任何分子实体。例如，生物分子中的官能团可以构成氨基、硫醇基、羧酸、醇基、羰基、磷酸基团或芳族基团。生物分子中的官能团可以是天然存在的或通过特定技术(例如(生物)化学或遗传技术)被放置于生物分子中。被放置于生物分子中的官能团可以是自然界中天然存在的官能团，或者可以是通过化学合成制备的官能团，例如叠氮化物、末端炔或膦部分。在本文中，术语“反应性基团”可以指包括官能团的某一基团，也可以指官能团本身。例如，环辛炔基为包含官能团(即C-C三键)的反应性基团。类似地，N-马来酰亚胺基为包含C-C双键作为官能团的反应性基团。然而，官能团(例如叠氮基官能团、硫醇官能团或氨基官能团)在本文中也可称为反应性基团。
所述接头-缀合物可包含超过一个的反应性基团Q1。当所述接头-缀合物包含两个或更多个反应性基团Q1时，反应性基团Q1可彼此不同。优选地，所述接头-缀合物可包含一个反应性基团Q1。
存在于接头-缀合物中的反应性基团Q1能够与在生物分子中存在的官能团F1反应，以形成连接基团Z3。换言之，反应性基团Q1需要与在生物分子中存在的官能团F1互补。在本文中，任选在其他官能团的存在下，当反应性基团选择性地与官能团反应以形成连接基团Z3时，将所述反应性基团表示为与所述官能团“互补”。互补的反应性基团和官能团为本领域技术人员已知的，并在下文中更详细地描述。
在一个优选的实施方案中，反应性基团Q1选自：任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1,1-双(磺酰基甲基)-甲基羰基或其消除衍生物、碳酰卤(carbonylhalide)基、丙二烯酰胺基、1,2-醌基或三嗪基。
在一个优选的实施方案中，Q1为N-马来酰亚胺基。在Q1为N-马来酰亚胺基时，Q1优选为未取代的。因此，Q1优选为式(9a)，如下所示。这种马来酰亚胺基的优选实例是2,3-二氨基丙酸(DPR)马来酰亚胺基，其可以通过羧酸部分与接头-缀合物的其余部分连接。
在另一个优选的实施方案中，Q1为卤代N-烷基酰氨基。当Q1为卤代N-烷基酰氨基时，优选Q1为式(9b)，如下所示，其中k为1至10范围内的整数，且R4选自-Cl、-Br和-I。优选k为1、2、3或4，更优选k为1或2且最优选k为1。优选地，R4为-I或-Br。更优选k为1或2且R4为-I或-Br，最优选k为1且R4为-I或Br。
在另一个优选的实施方案中，Q1为磺酰基氧基N-烷基酰氨基。当Q1为磺酰基氧基N-烷基酰氨基时，优选Q1为式(9b)，如下所示，其中k为1至10范围内的整数，且R4选自-O-甲磺酰基、-O-苯磺酰基和-O-甲苯磺酰基。优选k为1、2、3或4，更优选k为1或2，甚至更优选k为1。最优选k为1且R4选自-O-甲磺酰基、-O-苯磺酰基和-O-甲苯磺酰基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为酯基。当Q1为酯基时，优选酯基为活化酯基。活化酯基为本领域技术人员已知的。活化酯基在本文中被定义为包含良好的离去基团的酯基，其中酯羰基与所述良好的离去基团键合。良好的离去基团为本领域技术人员已知的。进一步优选，所述活化酯为式(9c)，如下所示，其中R5选自-N-琥珀酰亚胺基(NHS)、-N-磺基-琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)、-(4-硝基苯基)、-五氟苯基或-四氟苯基(TFP)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为碳酸酯基。当Q1为碳酸酯基时，优选碳酸酯基为活化的碳酸酯基。活化的碳酸酯基为本领域技术人员已知的。活化的碳酸酯基在本文中被定义为包含良好的离去基团的碳酸酯基，其中碳酸酯羰基与所述良好的离去基团键合。进一步优选，所述碳酸酯基为式(9d)，如下所示，其中R7选自-N-琥珀酰亚胺基、-N-磺基-琥珀酰亚胺基、-(4-硝基苯基)、-五氟苯基或-四氟苯基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9e)的磺酰卤基，其中X选自F、Cl、Br和I。优选X为Cl或Br，更优选Cl。
在另一个优选的实施方案中，Q1为硫醇基(9f)、或硫醇基的衍生物或前体。硫醇基也可称为巯基。当Q1为硫醇基的衍生物或前体时，硫醇衍生物优选为如下所示的式(9g)、(9h)或(9zb)，其中R8为任选取代的C1–C12烷基或C2-C12(杂)芳基，V为O或S且R16为任选取代的C1–C12烷基。更优选R8为任选取代的C1–C6烷基或C2–C6(杂)芳基，并且甚至更优选R8为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基或苯基。甚至更优选地，R8为甲基或苯基，最优选甲基。更优选R16为任选取代的C1–C6烷基，甚至更优选R16为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基，最优选甲基。当Q1为式(9g)或(9zb)的硫醇衍生物，并且Q1与生物分子上的反应性基团F1反应时，在该过程中所述硫醇衍生物被转化成硫醇基团。当Q1为式(9h)时，Q1为-SC(O)OR8或-SC(S)OR8，优选SC(O)OR8,其中R8及其优选实施方案如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，Q1为烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并且其中烯基任选地被取代。烯基可为末端或内部烯基。所述烯基可包含超过一个的C-C双键，如果如此，优选包含两个C-C双键。当烯基为二烯基时，进一步优选由一个C-C单键分隔两个C-C双键(即优选二烯基为共轭二烯基)。优选地，所述烯基为C2-C24烯基，更优选C2-C12烯基，甚至更优选C2-C6烯基。进一步优选，烯基为末端烯基。更优选地，所述烯基为如下所示的式(9i)，其中l为0至10范围内的整数，优选在0至6范围内的整数，且p为0至10范围内的整数，优选0至6。更优选地，l为0、1、2、3或4，更优选l为0、1或2并且最优选l为0或1。更优选地，p为0、1、2、3或4，更优选p为0、1或2并且最优选p为0或1。尤其优选，p为0且l为0或1，或p为1且l为0或1。
在另一个优选的实施方案中，Q1为炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并且其中炔基任选地被取代。炔基可为末端或内部烯基。优选地，所述炔基为C2-C24炔基，更优选C2-C12炔基，甚至更优选C2-C6炔基。进一步优选，炔基为末端炔基。更优选地，所述炔基为如下所示的式(9j)，其中l为0至10范围内的整数，优选在0至6范围内的整数。更优选地，l为0、1、2、3或4，更优选l为0、1或2并且最优选l为0或1。在进一步优选的实施方案中，炔基是式(9j)，其中l为3。
在另一个优选的实施方案中，Q1为环烯基。所述环烯基任选地被取代。优选，所述环烯基为C3-C24环烯基，更优选C3-C12环烯基，并且甚至更优选C3-C8环烯基。在一个优选的实施方案中，所述环烯基为反式-环烯基，更优选反式-环辛烯基(也称为TCO基)，并且最优选如下所示的式(9zi)或(9zj)的反式-环辛烯基。在另一个优选的实施方案中，所述环烯基为环丙烯基，其中所述环丙烯基任选地被取代。在另一个优选的实施方案中，所述环烯基为降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基，其中所述降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基任选地被取代。在其他优选的实施方案中，所述环烯基为如下所示的式(9k)、(9l)、(9m)或(9zc)，其中T为CH2或O，R9独立地选自氢、直链或支链C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基，且R19选自氢和氟代烃。优选地，R9独立地为氢或C1-C6烷基，更优选R9独立地为氢或C1-C4烷基。甚至更优选，R9独立地为氢或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选，R9独立地为氢或甲基。在其他优选的实施方案中，R19选自氢和-CF3、-C2F5、-C3F7和-C4F9,，更优选氢和-CF3。在其他优选的实施方案中，所述环烯基为式(9k)，其中一个R9为氢且另一个R9为甲基。在另一个进一步优选的实施方案中，所述环烯基为式(9l)，其中两个R9都为氢。在这些实施方案中，进一步优选l为0或1。在另一个优选的实施方案中，所述环烯基为式(9m)的降冰片烯基(T为CH2)或氧杂降冰片烯基(T为O)，或式(9zc)的降冰片二烯基(T为CH2)或氧杂降冰片二烯基(T为O)，其中R9为氢且R19为氢或-CF3，优选-CF3。
在另一个优选的实施方案中，Q1为(杂)环炔基。所述(杂)环炔基任选地被取代。优选地，所述(杂)环炔基为(杂)环辛炔基，即杂环辛炔基或环辛炔基，其中所述(杂)环辛炔基任选地被取代。在进一步优选的实施方案中，(杂)环辛炔基被一个或多个卤原子，优选氟原子取代，更优选(杂)环辛炔基被一个氟原子取代，如在单氟-环辛炔(MFCO)中。优选地，所述单氟-环辛炔基团是式(9zo)。在进一步优选的实施方案中，所述(杂)环辛炔基为式(9n)，也称为DIBO基团，或为式(9o)，也称为DIBAC基团，或为式(9p)，也称为BARAC基团，或为式(9zk)，也称为COMBO基团，所有基团均如下所示，其中U为O或NR9，并且R9的优选实施方案如上所定义。(9n)中的芳族环任选地在一个或多个位置处被O-磺酰化，而(9o)和(9p)的环可在一个或多个位置处被卤代。对于(9n)而言，U优选为O。
在一个特别优选的实施方案中，化合物(4b)中与R1连接的氮原子为杂环炔基的环中的氮原子(例如(9o)中的氮原子)。换言之，化合物(4b)中c、d和g为0，R1和Q1与它们所连接的氮原子一起形成杂环炔基，优选杂环辛炔基，最优选式(9o)或(9p)的杂环辛炔基。此处，(9o)的羰基部分被式(1)的基团的磺酰基替换。或者，与R1连接的氮原子和式(9n)中被指定为U的原子是同一原子。换言之，当Q1为式(9n)时，U可为式(1)的基团的右侧氮原子，或U＝NR9且R9为式(1)的基团的剩余部分，以及R1为环辛炔部分。
在另一个优选的实施方案中，Q1为任选取代的二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，也称为BCN基团。优选地，所述二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团为如下所示的式(9q)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为能够在狄尔斯-阿尔德反应中反应的共轭(杂)二烯基。优选的(杂)二烯基包括任选取代的四嗪基、任选取代的1,2-醌基和任选取代的三嗪基。更优选地，所述四嗪基为式(9r)，如下所示，其中R9选自氢、直链或支链的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基。优选地，R9为氢、C1-C6烷基或C4-C10(杂)芳基，更优选R9为氢、C1-C4烷基或C4-C6(杂)芳基。甚至更优选地，R9为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基或吡啶基。甚至更优选地，R9为氢、甲基或吡啶基。更优选地，所述1,2-醌基为式(9zl)或(9zm)。所述三嗪基可为任意位置异构体。更优选地，所述三嗪基为1,2,3-三嗪基或1,2,4-三嗪基，其可经任何可能的位点连接，如式(9zn)中所示的。作为三嗪基，所述1,2,3-三嗪是最优选的。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9s)的叠氮基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为适合于进行施陶丁格连接反应(Staudingerligation reaction)的任选取代的三芳基膦基。优选地，所述膦基为如下所示的式(9t)，其中R10为(硫)酯基。当R10为(硫)酯基时，优选R10为-C(O)-V-R11，其中V为O或S且R11为C1-C12烷基。优选地，R11为C1-C6烷基，更优选C1-C4烷基。最优选地，R11为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9u)的氧化腈基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为硝酮基。优选地，所述硝酮基为如下所示的式(9v)，其中R12选自直链或支链的C1-C12烷基和C6-C12芳基。优选地，R12为C1-C6烷基，更优选R12为C1-C4烷基。甚至更优选地，R12为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选地，R12为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为腈亚胺基。优选地，所述腈亚胺基为如下所示的式(9w)或(9zd)，其中R13选自直链或支链的C1-C12烷基和C6-C12芳基。优选地，R13为C1-C6烷基，更优选R13为C1-C4烷基。甚至更优选地，R13为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选R13为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为重氮基。优选地，所述重氮基为如下所示的式(9x)，其中R14选自氢或羰基衍生物。更优选地，R14为氢。
在另一个优选的实施方案中，Q1为酮基。更优选地，所述酮基为如下所示的式(9y)，其中R15选自直链或支链的C1-C12烷基和C6-C12芳基。优选地，R15为C1-C6烷基，更优选R15为C1-C4烷基。甚至更优选R15为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选R15为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为(O-烷基)羟氨基。更优选地，所述(O-烷基)羟氨基为如下所示的式(9z)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为肼基。优选地，所述肼基为如下所示的式(9za)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为卤代N-马来酰亚胺基或磺酰化N-马来酰亚胺基。当Q1为卤代或磺酰化N-马来酰亚胺基时，Q1优选为如下所示的式(9ze)，其中R6独立地选自氢、F、Cl、Br、I、-SR18a和-OS(O)2R18b，其中R18a是任选取代的C4-C12(杂)芳基，优选苯基或吡啶基，且R18b选自任选取代的C1-C12烷基和C4-C12(杂)芳基，优选甲苯基或甲基，条件是至少一个R6不为氢。当R6为卤素时(即当R6为F、Cl、Br或I时)，优选R6为Br。在一个实施方案中，卤代N-马来酰亚胺基是卤代的2,3-二氨基丙酸(DPR)马来酰亚胺基，其可以通过羧酸部分与接头-缀合物的其余部分连接。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9zf)的碳酰卤，其中X选自F、Cl、Br和I。优选地，X为Cl或Br，并且最优选地，X为Cl。
在另一个优选的实施方案中，Q1为式(9zg)的丙二烯酰胺基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为式(9zh)的1,1-双(磺酰基甲基)甲基羰基，或其消除衍生物，其中R18选自任选取代的C1-C12烷基和C4-C12(杂)芳基。更优选地，R18为任选取代的C1-C6烷基或C4-C6(杂)芳基，并且最优选苯基。
Figure BDA0001818785290000571
Figure BDA0001818785290000581
其中k、l、X、T、U、V、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R18和R19如上所定义。
在如下文所述的本发明的缀合方法的优选实施方案中，缀合通过环加成实现，所述环加成如狄尔斯-阿尔德反应或1,3-偶极环加成，优选1,3-偶极环加成。根据该实施方案，反应性基团Q1(以及生物分子上的F1)选自在环加成反应中具有反应性的基团。此处，反应性基团Q1和F1为互补的，即在环加成反应中它们能够相互反应，所得到的环状部分为连接基团Z3。
对于狄尔斯-阿尔德反应，F1和Q1中的一个为二烯，且F1和Q1中的另一个为亲二烯体。正如本领域技术人员所理解的，在狄尔斯-阿尔德反应的上下文下，术语“二烯”是指1,3-(杂)二烯，并且包括共轭二烯(R2C＝CR–CR＝CR2)、亚胺(例如R2C＝CR–N＝CR2或R2C＝CR–CR＝NR、R2C＝N–N＝CR2)和羰基(例如R2C＝CR–CR＝O或O＝CR–CR＝O)。使用含N-二烯和含O-二烯的杂-狄尔斯-阿尔德反应是本领域技术人员已知的。本领域中已知的适用于狄尔斯-阿尔德反应的任何二烯均可用作反应性基团Q1或F1。优选的二烯包括如上所述的四嗪，如上所述的1,2-醌和如上所述的三嗪。尽管本领域中已知的适用于狄尔斯-阿尔德反应的任何亲二烯体均可用作反应性基团Q1或F1，但是所述亲二烯体优选为如上所述的烯烃或炔烃基团，最优选炔烃基团。对于通过狄尔斯-阿尔德反应的缀合，优选F1为二烯且Q1为亲二烯体。此处，当Q1为二烯时，F1为亲二烯体；当Q1为亲二烯体时，F1为二烯。最优选地，Q1为亲二烯体，优选Q1为或包含炔基，且F1为二烯，优选四嗪、1,2-醌或三嗪基团。
对于1,3-偶极环加成，F1和Q1中的一个为1,3-偶极体，且F1和Q1中的另一个为亲偶极体。本领域中已知的适用于1,3-偶极环加成的任何1,3-偶极体均可用作反应性基团Q1或F1。优选的1,3-偶极体包括叠氮基、硝酮基、氧化腈基、腈亚胺基和重氮基。尽管本领域中已知的适用于1,3-偶极环加成的任何亲偶极体均可用作反应性基团Q1或F1，但是所述亲偶极体优选为烯烃或炔烃基团，最优选炔烃基团。对于通过1,3-偶极环加成的缀合，优选F1为1,3-偶极体且Q1为亲偶极体。在本文中，当Q1为1,3-偶极体时，F1为亲偶极体；当Q1为亲偶极体时，F1为1,3-偶极体。最优选地，Q1为亲偶极体，优选Q1为或包含炔基，且F1为1,3-偶极体，优选叠氮基。
因此，在一个优选的实施方案中，Q1选自亲偶极体和亲二烯体。优选地，Q1为烯基或炔基。在一个特别优选的实施方案中，Q1包含炔基，优选选自如上所述的炔基、如上所述的环烯基、如上所述的(杂)环炔基，以及二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，更优选Q1选自如上所定义的以及下文描述的式(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9zk)和(9zo)，例如选自式(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)和(9zk)，更优选选自式(9n)、(9o)、(9p)、(9q)和(9zk)或选自式(9j)、(9n)、(9q)和(9zo)。最优选地，Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，优选式(9q)的基团。已知这些基团在与本文所述的叠氮官能化的生物分子的缀合中是高效的，并且当本发明的磺酰胺接头用于这种接头-缀合物中时，任何聚集均被有利地减小至最低。
如上文所述，在接头-缀合物中，Q1能够与生物分子上存在的反应性基团F1反应。反应性基团Q1的互补反应性基团F1为本领域技术人员已知的，并且在下文中进行更详细的描述。F1和Q1之间的反应及其包含连接基团Z3的相应产物的一些代表性实例示于附图5中。
如上所述，在本发明的接头-缀合物中，D和Q1共价连接，优选通过如上文所定义的接头L进行共价连接。D与接头的共价连接可通过例如在所述D上存在的官能团F2与在所述接头上存在的反应性基团Q2的反应来发生。用于连接D与接头的合适的有机反应为本领域技术人员已知的，与反应性基团Q2互补的官能团F2也是本领域技术人员已知的。因此，D可通过连接基团Z与接头连接。
术语“连接基团”在本文中是指将化合物的一部分与同一化合物的另一部分连接的结构元素。正如本领域技术人员所理解的，连接基团的性质取决于获得所述化合物的各部分之间的连接所采用的有机反应的类型。例如，当R-C(O)-OH的羧基与H2N-R’的氨基反应以形成R-C(O)-N(H)-R’时，R通过连接基团Z与R’连接，并且Z可由基团-C(O)-N(H)-表示。
反应性基团Q1可以类似的方式与接头连接。因此，Q1可通过连接基团Z与间隔基部分连接。
在本领域中已知有大量的反应用于靶分子与接头的连接，以及用于反应性基团Q1与接头的连接。因此，多种连接基团Z均可存在于接头-缀合物中。
在一个实施方案中，接头-缀合物为下式的化合物：
(Q1)y(Zw)Sp(Zx)(D)z,
其中：
-y’为1至10范围内的整数；
-z为1至10范围内的整数；
-Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
-D为靶分子；
-Sp为间隔基部分，其中间隔基部分被定义为使Q1和D间隔(即在它们之间提供一定的距离)且使它们共价连接的部分；
-Zw为使Q1连接到所述间隔基部分的连接基团；
-Zx为使D连接到所述间隔基部分的连接基团；以及
其中所述间隔基部分为接头L，且因此包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团为如上所定义。
在一个优选的实施方案中，式(1)的基团中a为0。在另一个优选的实施方案中，式(1)的基团中a为1。
y’和z的优选实施方案为如上述(Q1)ySp(D)z中所定义。进一步优选，所述化合物为式Q1(Zw)Sp(Zx)(D)4、Q1(Zw)Sp(Zx)(D)3、Q1(Zw)Sp(Zx)(D)2或Q1(Zw)Sp(Zx)D，更优选Q1(Zw)Sp(Zx)(D)2或Q1(Zw)Sp(Zx)D且最优选Q1(Zw)Sp(Zx)D，其中Zw和Zx为如上所定义。
优选地，Zw和Zx独立地选自-O-、-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR2-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NR2、-NR2C(O)-、-NR2C(O)O-、-NR2C(O)NR2-、-SC(O)-、-SC(O)O-、-SC(O)NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-OS(O)2-、-OS(O)2O-、-OS(O)2NR2-、-OS(O)-、-OS(O)O-、-OS(O)NR2-、-ONR2C(O)-、-ONR2C(O)O-、-ONR2C(O)NR2-、-NR2OC(O)-、-NR2OC(O)O-、-NR2OC(O)NR2-、-ONR2C(S)-、-ONR2C(S)O-、-ONR2C(S)NR2-、-NR2OC(S)-、-NR2OC(S)O-、-NR2OC(S)NR2-、-OC(S)-、-OC(S)O-、-OC(S)NR2-、-NR2C(S)-、-NR2C(S)O-、-NR2C(S)NR2-、-SS(O)2-、-SS(O)2O-、-SS(O)2NR2-、-NR2OS(O)-、-NR2OS(O)O-、-NR2OS(O)NR2-、-NR2OS(O)2-、-NR2OS(O)2O-、-NR2OS(O)2NR2-、-ONR2S(O)-、-ONR2S(O)O-、-ONR2S(O)NR2-、-ONR2S(O)2O-、-ONR2S(O)2NR2-、-ONR2S(O)2-、-OP(O)(R2)2-、-SP(O)(R2)2-、-NR2P(O)(R2)2-，及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基被任选地取代。
D和Q1的优选实施方案如上所定义。
在一个实施方案中，所述接头-缀合物为式(4a)或(4b)的化合物，或其盐：
Figure BDA0001818785290000611
Figure BDA0001818785290000621
其中：
-a独立地为0或1；
-b独立地为0或1；
-c为0或1；
-d为0或1；
-e为0或1；
-f为1至150范围内的整数；
-g为0或1；
-i为0或1；
-D为靶分子；
-Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
-Sp1为间隔基部分；
-Sp2为间隔基部分；
-Sp3为间隔基部分；
-Sp4为间隔基部分；
-Z1为连接基团，其将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接；
-Z2为连接基团，其将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接；以及
-R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C1–C24(杂)芳基、C1–C24烷基(杂)芳基和C1–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基；或
-R1为D、-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]或-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]，其中D为另一个靶分子且Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
在一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为1。在另一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为0。
如上所述，Z1为将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接的连接基团，以及Z2为将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接的连接基团。如上文更详细描述的，术语“连接基团”是指将化合物的一部分与同一化合物的另一部分连接的结构元素。
在式(4a)的化合物中，连接基团Z1——当存在(即当d为1)时——将式(4a)的化合物的Q1(任选地通过间隔基部分Sp3)与O原子或C(O)基团(任选地通过间隔基部分Sp2)连接。更具体地，当Z1存在(即d为1)时，并且当Sp3和Sp2不存在(即g为0且c为0)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的Q1与O原子(a为1)或C(O)基团(a为0)连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3存在(即g为1)且Sp2不存在(即c为0)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的间隔基部分Sp3与O原子(a为1)或C(O)基团(a为0)连接。当Z1存在(即d为1)时，并且当Sp3和Sp2存在(即g为1且c为1)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的间隔基部分Sp3与间隔基部分Sp2连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3不存在(即g为0)且Sp2存在(即c为1)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的Q1与间隔基部分Sp2连接。
在式(4b)的化合物中，连接基团Z1——当存在(即当d为1)时——将式(4b)的接头-缀合物中的Q1(任选地通过间隔基部分Sp3)与N(R1)基团的N原子(任选地通过间隔基部分Sp2)连接。更具体地，当Z1存在(即当d为1)时，并且当Sp3和Sp2不存在(即g为0且c为0)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的Q1与N(R1)基团的N原子连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3存在(即g为1)且Sp2不存在(即c为0)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的间隔基部分Sp3与N(R1)基团的N原子连接。当Z1存在(即当d为1)时，并且当Sp3和Sp2存在(即g为1且c为1)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的间隔基部分Sp3与间隔基部分Sp2连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3不存在(即g为0)且Sp2存在(即c为1)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的Q1与间隔基部分Sp2连接。
在式(4a)的化合物中，当c、d和g都为0时，则式(4a)的接头-缀合物中的Q1与O原子(当a为1时)或与C(O)基团(当a为0时)直接连接。
在式(4b)的化合物中，当c、d和g都为0时，则式(4b)的接头-缀合物中的Q1与N(R1)基团的N原子直接连接。
在式(4a)的化合物中，连接基团Z2——当存在(即当e为1)时——将式(4a)的接头-缀合物的D(任选地通过间隔基部分Sp4)与N(R1)基团的N原子(任选地通过间隔基部分Sp1)连接。更具体地，当Z2存在(即e为1)时，并且当Sp1和Sp4不存在(即b为0且i为0)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的D与N(R1)基团的N原子连接。当Z2存在(即当e为1)、Sp4存在(即i为1)且Sp1不存在(即b为0)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的间隔基部分Sp4与N(R1)基团的N原子连接。当Z2存在(即当e为1)时，并且当Sp1和Sp4存在(即b为1且i为1)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的间隔基部分Sp1与间隔基部分Sp4连接。当Z2存在(即当e为1)、Sp4不存在(即i为0)且Sp1存在(即b为1)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的D与间隔基部分Sp1连接。
在式(4a)的化合物中，当b、e和i都为0时，则式(4a)的接头-缀合物中的D与N(R1)基团的N原子直接连接。
在式(4b)的化合物中，当b、e和i都为0时，则式(4b)的接头-缀合物中的D与O原子(当a为1时)或与C(O)基团(当a为0时)直接连接。
正如本领域技术人员所理解的，连接基团的性质取决于获得所述化合物的各特定部分之间的连接所采用的有机反应的类型。大量的有机反应可用于将反应性基团Q1与间隔基部分连接，以及用于将靶分子与间隔基部分连接。因此，存在多种连接基团Z1和Z2。
在(4a)和(4b)的接头-缀合物的一个优选的实施方案中，Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-SS-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR2-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NR2、-NR2C(O)-、-NR2C(O)O-、-NR2C(O)NR2-、-SC(O)-、-SC(O)O-、-S-C(O)NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-OS(O)2-、-OS(O)2O-、-OS(O)2NR2-、-OS(O)-、-OS(O)O-、-OS(O)NR2-、-ONR2C(O)-、-ONR2C(O)O-、-ONR2C(O)NR2-、-NR2OC(O)-、-NR2OC(O)O-、-NR2OC(O)NR2-、-ONR2C(S)-、-ONR2C(S)O-、-ONR2C(S)NR2-、-NR2OC(S)-、-NR2OC(S)O-、-NR2OC(S)NR2-、-OC(S)-、-OC(S)O-、-OC(S)NR2-、-NR2C(S)-、-NR2C(S)O-、-NR2C(S)NR2-、-SS(O)2-、-SS(O)2O-、-SS(O)2NR2-、-NR2OS(O)-、-NR2OS(O)O-、-NR2OS(O)NR2-、-NR2OS(O)2-、-NR2OS(O)2O-、-NR2OS(O)2NR2-、-ONR2S(O)-、-ONR2S(O)O-、-ONR2S(O)NR2-、-ONR2S(O)2O-、-ONR2S(O)2NR2-、-ONR2S(O)2-、-OP(O)(R2)2-、-SP(O)(R2)2-、-NR2P(O)(R2)2-，及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
如上所述，在式(4a)或(4b)的化合物中，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4为间隔基部分。Sp1、Sp2、Sp3和Sp4可独立地存在或不存在(b、c、g和i独立地为0或1)。Sp1(如果存在)，可不同于Sp2(如果存在)，可不同于Sp3和/或Sp4(如果存在)。
间隔基部分为本领域技术人员已知的。合适的间隔基部分的实例包括(聚)乙二醇二胺(例如，1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含更长的乙二醇链的等同物)，聚乙二醇链或聚环氧乙烷链，聚丙二醇链或聚环氧丙烷链，以及1,xx-二氨基烷烃(其中xx为烷烃中碳原子的数目)。
另一类合适的间隔基部分包括可裂解的间隔基部分，或可裂解的接头。所述可裂解的接头是在本领域中众所周知的。例如，Shabat et al.,Soft Matter2012,6,1073——以引用方式纳入本文——公开了包含在生物学引发(例如酶裂解或氧化事件)时释放自我牺牲型部分的可裂解接头。一些合适的可裂解接头的实例为在还原时裂解的二硫化物接头，在蛋白酶(例如组织蛋白酶、血纤维蛋白溶酶或金属蛋白酶)的特异性识别下裂解的肽接头，或在糖苷酶(例如葡萄糖醛酸苷酶)特异性识别下裂解的基于糖苷的接头，或在贫氧、缺氧区域中被还原的硝基芳族化合物。在本文中，合适的可裂解的间隔基部分也包括包含特定的、可裂解的氨基酸序列的间隔基部分。实例包括例如包含Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)或Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)部分的间隔基部分。
在式(4a)和(4b)的接头-缀合物的一个优选实施方案中，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和/或Sp4——如果存在——包含氨基酸序列。包含氨基酸序列的间隔基部分为本领域技术人员已知的，并且也可被称为肽接头。实例包括包含Val-Cit部分(例如Val-Cit-PABC、Val-Cit-PAB、Fmoc-Val-Cit-PAB等)的间隔基部分。优选地，将Val-Cit-PABC部分用于所述接头-缀合物中。
在式(4a)和(4b)的接头-缀合物的一个优选实施方案中，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被上述定义的一个或多个杂原子间隔时，优选所述基团被一个或多个O原子，和/或被一个或多个S-S基团间隔。
更优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C100亚烷基、C2-C100亚烯基、C2-C100亚炔基、C3-C100亚环烷基、C5-C100亚环烯基、C8-C100亚环炔基、C7-C100烷基亚芳基、C7-C100芳基亚烷基、C8-C100芳基亚烯基和C9-C100芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C50亚烷基、C2-C50亚烯基、C2-C50亚炔基、C3-C50亚环烷基、C5-C50亚环烯基、C8-C50亚环炔基、C7-C50烷基亚芳基、C7-C50芳基亚烷基、C8-C50芳基亚烯基和C9-C50芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20亚环烷基、C5-C20亚环烯基、C8-C20亚环炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在这些优选实施方案中，进一步优选所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，优选氢或甲基。
最优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在该实施方案中，进一步优选所述亚烷基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O和/或S——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，优选氢或甲基。
因此，优选的间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4包括-(CH2)n-、-(CH2CH2)n-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)nCH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)n-，其中n为1至50范围内的整数，优选在1至40范围内，更优选在1至30范围内，甚至更优选在1至20范围内，并且甚至更优选在1至15范围内。更优选地，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至更优选1、2、3或4。
由于Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地选择，因此Sp1(如果存在)，可不同于Sp2(如果存在)，可不同于Sp3和/或Sp4(如果存在)。
上文更详细地描述了反应性基团Q1。在式(4a)和(4b)的接头-缀合物中，优选反应性基团Q1选自：任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、碳酰卤基、丙二烯酰胺基和1,1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物。在其他优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)或(9zk)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zo)及其优选实施方案如上所定义。在一个优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)、(9t)、(9zh)、(9zo)或(9r)。在一个甚至更优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9j)、(9n)、(9o)、(9q)、(9p)、(9t)、(9zh)、(9zo)或(9s)，并且在一个特别优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9q)、(9n)、(9o)、(9p)、(9t)、(9zo)或(9zh)及其优选实施方案，如上所定义。
在式(4a)和(4b)的接头-缀合物中，靶分子D和靶分子D的优选实施方案如上所定义。
如上所述，R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，或R1为D、-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]或-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]，其中D是另一个靶分子且Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
在一个优选的实施方案中，R1为氢或C1-C20烷基，更优选R1为氢或C1-C16烷基，甚至更优选R1为氢或C1-C10烷基，其中所述烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基。在其他优选的实施方案中，R1为氢。在另一个优选的实施方案中，R1为C1-C20烷基，更优选C1-C16烷基，甚至更优选C1-C10烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个O原子间隔，并且其中所述烷基任选地被-OH基——优选末端-OH基——取代。在该实施方案中，进一步优选R1为包含末端-OH基的聚乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，R1为C1-C12烷基，更优选C1-C6烷基，甚至更优选C1-C4烷基，并且甚至更优选R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。
在另一个优选的实施方案中，R1为另一个靶分子D、-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]或-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]，其中D为靶分子且Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。当R1为D或-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]时，进一步优选所述接头-缀合物为式(4a)。在该实施方案中，接头-缀合物(4a)包含两个靶分子D，其可为相同或不同的。当R1为-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]时，在-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]中的Sp1、b、Z2、e、Sp4、i和D可与N(R1)的N原子连接的-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]中的Sp1、b、Z2、e、Sp4、i和D相同或不同。在一个优选的实施方案中，在N(R1)的N原子上的两个-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]和-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]是相同的。
当R1为-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]时，进一步优选所述接头-缀合物为式(4b)。在该实施方案中，接头-缀合物(4b)包含两个靶分子Q1，其可为相同或不同的。当R1为-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]时，在-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]中的Sp2、c、Z1、d、Sp3、g和D可与N(R1)的N原子连接的另一个-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]中的Sp1、b、Z2、e、Sp4、i和Q1相同或不同。在一个优选的实施方案中，在N(R1)的N原子上的-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]是相同的。
在式(4a)和(4b)的接头-缀合物中，f为1至150范围内的整数。因此，所述接头-缀合物可包含超过一个的式(1)的基团，所述式(1)的基团如上所定义。当存在超过一个的式(1)的基团时，即当f为2或更大时，则a、b、Sp1和R1独立地选择。换言之，当f为2或更大时，每个a独立地为0或1，每个b独立地为0或1，每个Sp1可为相同或不同的，并且每个R1可为相同或不同的。在一个优选的实施方案中，f为1至100范围内的整数，优选在1至50范围内，更优选在1至25范围内，并且甚至更优选在1至15范围内。更优选地，在该实施方案中，f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，甚至更优选f为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选f为1、2、3、4、5或6，甚至更优选f为1、2、3或4，并且最优选f为1。在另一个优选的实施方案中，f为2至150范围内的整数，优选在2至100范围内，更优选在2至50范围内，更优选在2至25范围内，并且甚至更优选在2至15范围内。更优选地，在该实施方案中，f为2、3、4、5、6、7、8、9或10，甚至更优选f为2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选f为2、3、4、5或6，甚至更优选f为2、3或4，并且最优选f为2。
如上所述，在一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为0。因此，所述接头-缀合物也可为式(6a)或(6b)的化合物，或其盐：
Figure BDA0001818785290000701
其中a、b、c、d、e、f、g、i、D、Q1、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2和R1，及其优选实施方案，如上文(4a)和(4b)中所定义。
如上所述，在另一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为1。因此，所述接头-缀合物也可为式(7a)或(7b)的化合物，或其盐：
Figure BDA0001818785290000702
Figure BDA0001818785290000711
其中a、b、c、d、e、f、g、i、D、Q1、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2和R1，及其优选实施方案，如上文(4a)和(4b)中所定义。
当在式(4a)的接头-缀合物中Sp4不存在时(即当i为0时)，D与Z2连接(当e为1时)、与Sp1连接(当e为0且b为1时)或与N(R1)连接(当e为0且b为0时)。当在式(4b)的接头-缀合物中Sp4不存在时(即当i为0时)，D与Z2连接(当e为1时)、与Sp1连接(当e为0且b为1时)或与O原子连接(当a为1且b和e为0时)或与C(O)基连接(当a为0且b和e为0时)。因此，所述接头-缀合物也可以为式(4c)或(4d)的化合物，或其盐：
Figure BDA0001818785290000712
其中a、b、c、d、e、f、g、D、Q1、Sp1、Sp2、Sp3、Z1、Z2和R1，及其优选实施方案，如上文(4a)和(4b)中所定义。
在一个优选的实施方案中，在式(4c)或(4d)的接头-缀合物中，a为0。在另一个优选的实施方案中，在式(4c)或(4d)的接头-缀合物中，a为1。
在接头-缀合物的一个具体实施方案中，尤其是在(4a)、(4b)、(4c)、(4d)、(6a)、(6b)、(7a)或(7b)的接头-缀合物中，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，并且Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj))或(9zk)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zo)及其优选实施方案如上所定义。在一个优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)(9t)、(9zh)、(9zo)或(9r)。在甚至进一步优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9t)、(9zh)、(9zo)或(9s)，并且在一个特别优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9q)、(9n)、(9p)、(9t)、(9zh)、(9zo)或(9o)及其优选实施方案，如上所定义。
接头L，如优选包含在如上所定义的式(4a)、(4b)、(4c)、(4d)、(6a)、(6b)、(7a)或(7b)的接头-缀合物中，如上所定义的接头可分别由式(8a)和(8b)表示：
Figure BDA0001818785290000721
正如本领域技术人员所理解的，间隔基部分(8a)和(8b)的优选实施方案可取决于例如所述接头-缀合中反应性基团Q1和D的性质、制备所述接头-缀合物的合成方法(例如在靶分子上互补官能团F2的性质)、使用所述接头-缀合物制备的生物缀合物的性质(例如在生物分子上互补官能团F1的性质)。
当Q1为例如如上所定义的式(9n)、(9o)、(9p)、(9q)或(9zk)的环辛炔基时，则优选Sp3存在(g为1)。
当例如接头-缀合物通过反应性基团Q2——式(9n)、(9o)、(9p)、(9q)或(9zk)的环辛炔基——与叠氮基官能团F2反应来制备时，优选Sp4存在(i为1)。
此外，优选Sp1、Sp2、Sp3和Sp4中的至少一个是存在的，即b、c、g和i中的至少一个不为0。在另一个优选的实施方案中，Sp1和Sp4中的至少一个以及Sp2和Sp3中的至少一个是存在的。
当f为2或更大时，优选Sp1存在(b为1)。
当包含在以下更详细描述的本发明的生物缀合物中时，接头部分(8a)和(8b)的这些优选实施方案也适用于接头-缀合物。
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4的优选实施方案如上所定义。
生物分子
生物分子由B-F1表示，其中B是生物分子，F1是能够与接头-缀合物上的反应性基团Q1反应的官能团，“-”是键或间隔基部分。或者，生物分子是由式(24)表示的经修饰的抗体，其中F1是能够与接头-缀合物上的反应性基团Q1反应的官能团。由式(24)表示的经修饰的抗体及其优选实施方案在上面详细定义。
在一个实施方案中，“-”是如本文所定义的间隔基部分。在一个实施方案中，“-”是键，通常是共价键。生物分子也可称为“目的生物分子”(BOI)。生物分子可以是天然存在的生物分子，其中官能团F1已经存在于目的生物分子中，例如硫醇、胺、醇或羟基酚单元。然后通过如上定义的第一种方法发生与接头-缀合物的缀合。或者，生物分子可以是经修饰的生物分子，其中官能团F1特异性地结合至目的生物分子中，并且通过该工程化功能(即如上定义的生物缀合的两阶段方法)发生与接头-缀合物的缀合。已知生物分子的这种修饰以纳入特定的官能团，例如，来自WO2014/065661，其全部内容通过引用并入本文中。
在本发明的生物缀合物中，生物分子B优选选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。更优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖和酶。更优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽和聚糖。最优选地，生物分子B是抗体或其抗原结合片段。
官能团F1能够与接头-缀合物上的反应性基团Q1反应以形成连接基团Z3。对于技术人员而言，清楚哪个官能团F1能够与互补的反应性基团Q1反应。与如上定义的和本领域技术人员已知的反应性基团Q1互补的官能团F1在下面更详细地描述。F1和Q1之间的反应的一些代表性实例及其包含连接基团Z3的相应产物描述于图5中。
在制备本发明的生物缀合物的方法中，存在于接头-缀合物中的反应性基团Q1通常与官能团F1反应。生物分子中可存在超过一个的官能团F1。当存在两个或更多个官能团时，所述基团可以相同或不同的。在另一个优选的实施方案中，所述生物分子包含两个或更多个官能团F，其可为相同或不同的，以及两个或更多个官能团与接头-缀合物的互补反应性基团Q反应。例如，包含两个官能团F(即F1和F2)的生物分子可与两个包含官能团Q1的接头-缀合物(其可为相同或不同的)反应，以形成生物缀合物。
生物分子中官能团F1的实例包括氨基、硫醇基、羧酸、醇基、羰基、磷酸基或芳族基团。生物分子中的官能团可以是天然存在的或通过特定技术(例如(生物)化学或遗传技术)被放置于生物分子中。被放置于生物分子中的官能团可以是自然界中天然存在的官能团，或者可以是通过化学合成制备的官能团，例如叠氮化物、末端炔、环丙烯部分或膦部分。鉴于通过环加成的缀合的优选模式，优选F1为能够在环加成中反应的基团，例如二烯、亲二烯体、1,3-偶极体或亲偶极体，优选F1选自1,3-偶极体(通常为叠氮基、硝酮基、氧化腈基、腈亚胺基或重氮基)或亲偶极体(通常为烯基或炔基)。在本文中，当Q1为亲偶极体时，F1为1,3-偶极体；当Q1为1,3-偶极体时，F1为亲偶极体；或当Q1为亲二烯体时，F1为二烯；当Q1为二烯时，F1为亲二烯体。最优选地，F1为1,3-偶极体，优选F1为或包含叠氮基。
图2示出了放置于生物分子中的官能团的几个实例。图2示出了半乳糖胺的UDP糖的衍生物的几种结构，其可以是例如在2-位上经过巯基丙酰基(11a)、叠氮基乙酰基(11b)或叠氮基二氟乙酰基(11c)修饰的，或者可以是在N-乙酰半乳糖胺(11d)的6-位上经过叠氮基修饰的。在一个实施方案中，官能团F1是巯基丙酰基、叠氮基乙酰基或叠氮基二氟乙酰基。
图3示意性地示出了任何UDP-糖11a-d如何可在半乳糖基转移酶突变体或GalNAc转移酶的作用下与包含GlcNAc部分12的糖蛋白(例如其聚糖被内切糖苷酶剪接的单克隆抗体)连接，从而在GalNAc衍生物和GlcNAc之间产生β-糖苷1-4连接(分别为化合物13a-d)。
天然存在的官能团F1的优选实例包括硫醇基和氨基。通过化学合成制备的用于纳入生物分子的官能团的优选实例包括酮基、末端炔基、叠氮基、环(杂)炔基、环丙烯基、或四嗪基。
如上所述，互补的反应性基团Q1和官能团F1为本领域技术人员已知的，并且Q1和F1的几种合适的组合已在上文描述并示于图5中。互补的基团Q1和F1的列表公开于G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,第3版.2013(ISBN:978-0-12-382239-0)的第3章的第230-232页的表3.1中，并且该表的内容以引用的方式明确纳入本文中。
生物缀合物
生物缀合物在本文中被定义为其中生物分子通过接头与靶分子D共价连接的化合物。生物缀合物包含一个或多个生物分子和/或一个或多个靶分子。所述接头可包含一个或多个间隔基部分。本发明的生物缀合物通过用于制备本发明生物缀合物的方法来方便地制备，其中将包含反应性基团Q1的接头-缀合物缀合到包含官能团F1的生物分子。在该缀合反应中，基团Q1和F1相互反应以形成连接基团Z3，其将靶分子D和生物分子B连接。因此，本文所述的接头-缀合物和生物分子的所有优选实施方案均等同地适用于本发明的生物缀合物，除了所有所述的Q1和F1以外，其中本发明的生物缀合物含有Q1和F1的反应产物，即连接基团Z3。在一个方面，本发明还涉及本文所述的生物缀合物，优选抗体-缀合物。
本发明的生物缀合物具有式(A)：
B-L-D
(A)，
其中：
-B是生物分子，优选抗体AB；
-L是连接B和D的接头；
-D是目的分子；和
-每次出现的“-”独立地是键或间隔基部分。
在第一优选的实施方案中，生物缀合物可通过定义为“核心-GlcNAc官能化”的缀合模式，即通过如上所定义的步骤(i)和(ii)获得。在第二优选的实施方案中，式(A)的生物缀合物具有包含式(1)的基团或其盐的接头L：
Figure BDA0001818785290000761
其中：
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基；或R1为靶分子D，其中D任选地通过间隔基部分与N连接。
在一个实施方案中，“-”是如本文所定义的间隔基部分。在一个实施方案中，“-”是键，通常是共价键。
在优选的实施方案中，生物缀合物由B-Z3-L-D表示，其中B、L、D和“-”如上所定义，Z3是可通过Q1与F1反应获得的连接基团。优选地，Z3部分可通过环加成反应获得，优选1,3-偶极环加成反应，最优选Z3是1,2,3-三唑环，其位于间隔基部分中，优选在B和L之间，最优选在B和式(1)的基团的羰基或羧基末端之间的间隔基部分。
当本发明的生物缀合物包含式(1)的基团的盐时，所述盐优选为药学上可接受的盐。
本发明的缀合物可包含超过一个的靶分子。类似地，生物缀合物可包含超过一个的生物分子。生物分子B和靶分子D，及其优选的实施方案，已在上文更详细描述。如上文中更详细描述的，本发明的生物缀合物中D的优选实施方案对应于本发明的接头-缀合物中D的优选实施方案。如上文中更详细描述的，本发明的生物缀合物中接头(8a)或(8b)的优选实施方案对应于接头-缀合物中接头的优选实施方案。如上文中更详细描述的，本发明的生物缀合物中B的优选实施方案对应于本发明的生物分子中B的优选实施方案。
本发明的生物缀合物也可定义为其中生物分子通过间隔基部分与靶分子缀合的生物缀合物，其中所述间隔基部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团如上所定义。
本发明的生物缀合物也可表示为(B)ySp(D)z，其中y为1至10范围内的整数，并且z为1至10范围内的整数。
因此，本发明也涉及下式的生物缀合物：
(B)ySp(D)z，
其中：
-y’为1至10范围内的整数；
-z为1至10范围内的整数；
-B为生物分子；
-D为靶分子；
-Sp为间隔基部分，其中间隔基部分被定义为使生物分子B和靶分子D间隔(即在它们之间提供一定的距离)且使它们共价连接的部分；且其中所述间隔基部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团如上所定义。
在优选的实施方案中，所述间隔基部分还包含通过环加成反应(优选1,3-偶极环加成反应，最优选1,2,3-三唑环)可获得的部分，该部分位于B和所述式(1)的基团之间。
优选地，y’为1、2、3或4，更优选y’为1或2，最优选y’为1。优选地，z为1、2、3、4、5或6，更优选z为1、2、3或4，甚至更优选z为1、2或3，甚至更优选z为1或2，并且最优选z为1。更优选地，y’为1或2，优选1，且z为1、2、3或4；甚至更优选y’为1或2，优选1，且z为1、2或3；甚至更优选y’为1或2，优选1，且z为1或2；并且最优选y’为1且z为1。在一个优选的实施方案中，所述生物缀合物为式BSp(D)4、BSp(D)3、BSp(D)2或BSpD。在另一个优选的实施方案中，所述生物缀合物为式BSp(D)8、BSp(D)4或BSp(D)2，更优选BSp(D)4或BSp(D)2。
如上所述，本发明的生物缀合物包含如上所定义的式(1)的基团或其盐。在优选的实施方案中，生物缀合物包含其中a为0的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述生物缀合物包含式(2)的基团或其盐，其中(2)如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，所述生物缀合物包含其中a为1的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述生物缀合物包含式(3)的基团或其盐，其中(3)如上所定义。
在本发明的生物缀合物中，R1、间隔基部分Sp、以及R1和Sp的优选实施方案如上文对于本发明的接头-缀合物中所定义。
在优选的实施方案中，所述生物缀合物为式(5a)或(5b)，或其盐：
Figure BDA0001818785290000781
其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、D、Sp1、Sp2、Sp3、Z1、Z2、Z3和R1，及其优选实施方案如上文(4a)和(4b)的接头-缀合物中所定义；以及
-h为0或1；
-Z3为连接基团，其将B与Sp3、Z1、Sp2、O或C(O)连接；且
-B为生物分子。
优选地，h为1。
生物分子B的优选实施方案如上所定义。
当本发明的生物缀合物为(5a)或(5b)的盐时，所述盐优选为药学上可接受的盐。
Z3为连接基团。如上所述，本文中的术语“连接基团”是指将化合物的一部分与同一化合物的另一部分连接的结构元素。通常，生物缀合物通过在接头-缀合物中存在的反应性基团Q1与在生物分子中存在的官能团F1的反应来制备。正如本领域技术人员所理解的，连接基团Z3的性质取决于为建立生物分子和接头-缀合物之间的连接而使用的有机反应的类型。换言之，Z3的性质取决于所述接头-缀合物的反应性基团Q1的性质，以及所述生物分子中的官能团F1的性质。由于存在大量的不同的化学反应可用于建立生物分子与接头-缀合物之间的连接，因此，Z3存在许多的可能性。
图5示出了，当包含Q1的接头-缀合物与包含互补官能团F1的生物分子缀合时，F1和Q1的合适的组合的几个实例，以及在生物缀合物中存在的连接基团Z3的几个实例。
当F1为例如硫醇基时，互补基团Q1包括N-马来酰亚胺基和烯基，并且相应的连接基团Z3如图5所示。当F1为硫醇基时，互补基团Q1还包括丙二烯酰胺基。
当F1为例如氨基时，互补基团Q1包括酮基和活化酯基，并且相应的连接基团Z3如图5所示。
当F1为例如酮基时，互补基团Q1包括(O-烷基)羟氨基和肼基，并且相应的连接基团Z3如图5所示。
当F1为例如炔基时，互补基团Q1包括叠氮基，并且相应的连接基团Z3如图5所示。
当F1为例如叠氮基时，互补基团Q1包括炔基，并且相应的连接基团Z3如图5所示。
当F1为例如环丙烯基、反-环辛烯基或环辛炔基时，互补基团Q1包括四嗪基，并且相应的连接基团Z3如图5所示。在这些特定的情况下，Z3仅为中间体结构，并且将排出N2，从而生成二氢哒嗪(来自与烯烃的反应)或哒嗪(来自与炔烃的反应)。
F1和Q1的其他合适的组合以及所得连接基团Z3的性质为本领域技术人员已知的，并且例如记载于G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,第3版.2013(ISBN:978-0-12-382239-0)(尤其是第3章、第229-258页)(以引用的方式纳入)中。适用于生物缀合方法的互补的反应性基团的列表公开于G.T.Hermanson,“BioconjugateTechniques”,Elsevier,第3版.2013(ISBN:978-0-12-382239-0)的第3章的第230-232页的表3.1中，并且该表的内容以引用的方式明确纳入本文中。
在(5a)和(5b)的生物缀合物中，优选Z3、Sp3、Z1和Sp2中的至少一个是存在的，即h、g、d和c中至少一个不为0。也优选Sp1、Z2和Sp4中的至少一个是存在的，即b、e和i中至少一个不为0。更优选地，Z3、Sp3、Z1和Sp2中的至少一个是存在的，并且Sp1、Z2和Sp4中的至少一个是存在的，即优选b、e和i中至少一个不为0，并且h、g、d和c中至少一个不为0。
制备生物缀合物的方法
在本发明的多个方面，本发明的生物缀合物通常通过如本文所定义的用于制备生物缀合物的方法获得。由于式(1)的基团或其盐在生物缀合物的接头L中的存在是本发明的关键，可以使用任何制备生物缀合物的方法，只要所获得的生物缀合物包含如本文定义的接头L即可。式(1)的基团可以存在于B和Z3之间的接头L中，即它源自生物分子，或存在于Z3和D之间的接头L中，即它源自接头-缀合物，或Z3是式(1)的基团或包含式(1)的基团，即缀合时形成式(1)的基团。优选地，式(1)的基团存在于B和Z3之间或Z3和D之间的接头L中，最优选地，式(1)的基团存在于Z3和D之间的接头L中。同样，在本发明的上下文中，精确的缀合模式，包括Q1和F1的性质，具有很大的灵活性。用于将BOI与MOI缀合的许多技术是本领域技术人员已知的并且可以在本发明的上下文中使用。在一个实施方案中，缀合方法包括如上所定义的步骤(i)和(ii)。
在一个实施方案中，缀合模式选自图5中所示的任何缀合模式，即选自硫醇-烯烃缀合(优选半胱氨酸-烯烃缀合，优选其中烯烃是侧链烯烃(–C＝CH2)或马来酰亚胺部分，最优选马来酰亚胺部分)形成连接部分Z3，其可表示为(10a)或(10b)；选自氨基-(活化的)羧酸缀合(其中(活化的)羧酸由-C(O)X表示，其中X是离去基团)形成连接部分Z3，其可表示为(10c)；选自酮-肼基缀合(优选乙酰基-肼基缀合)形成连接部分Z3，其可表示为(10d)，其中Y＝NH；选自酮-氧基氨基缀合(优选乙酰基-氧基氨基缀合)形成连接部分Z3，其可表示为(10d)，其中Y＝O；选自炔烃-叠氮化物缀合(优选其中炔烃是侧链炔烃(-C≡CH)或环辛炔部分，最优选环辛炔部分)形成连接部分Z3，其可表示为(10e)、(10f)、(10i)、(10g)、(10j)或(10k)；选自烯烃-1,2,4,5-四嗪缀合或炔烃-1,2,4,5-四嗪缀合，形成连接部分Z3，可表示为(10h)，从中将消除N2，产生二氢哒嗪产品。特别优选的缀合模式是半胱氨酸-烯烃缀合和炔烃-叠氮化物缀合，更优选半胱氨酸-马来酰亚胺缀合和环辛炔-叠氮化物缀合。
本发明的生物缀合物通常通过以下方法来制备，所述方法包括使如本文所定义的接头-缀合物的反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应的步骤，也称为生物分子。上文更详细地描述了接头-缀合物和生物分子及其优选实施方案。这种方法是本领域技术人员已知的缀合或生物缀合。图1示出了生物分子缀合的一般概念：将包含一个或多个官能团F1的目的生物分子(BOI)与(过量的)通过特定的接头与反应性基团Q1共价连接的靶分子D(也称为目的分子或MOI)温育。在生物缀合方法中，发生F1和Q1之间的化学反应，由此形成了包含BOI和MOI之间的共价键的生物缀合物。所述BOI可为例如肽/蛋白质、聚糖或核酸。
生物缀合反应通常包括使接头-缀合物的反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应的步骤，其中形成式(A)的生物缀合物，其中接头L包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000811
其中：
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，或R1为另一个靶分子D，其任选地通过间隔基部分与N连接。
在优选的实施方案中，所述生物缀合物通过环加成制备，例如(4+2)-环加成(例如狄尔斯-阿尔德反应)或(3+2)-环加成(例如1,3-偶极环加成)。优选地，所述缀合为狄尔斯-阿尔德反应或1,3-偶极环加成。优选的狄尔斯-阿尔德反应为反电子需求的狄尔斯-阿尔德环加成。在另一个优选的实施方案中，使用1,3-偶极环加成，更优选炔烃-叠氮化合物环加成，并且最优选其中Q1为或包含炔基且F1为叠氮基。环加成(例如狄尔斯-阿尔德反应和1,3-偶极环加成)在本领域中是已知的，并且技术人员知道如何去实施。
当Q1与F1反应时，形成生物分子与源自接头-缀合物的靶分子之间的共价连接。互补的反应性基团Q1和官能团F1已在上下文中更详细描述。
在制备生物缀合物的方法的优选实施方案中，式(1)的基团中a为0。因此，在该实施方案中，所述接头-缀合物包含式(2)的基团，如上所定义。在制备生物缀合物的方法的另一个优选实施方案中，式(1)的基团中a为1。因此，在该实施方案中，所述接头-缀合物包含式(3)的基团，如上所定义。
生物分子已在上文中更详细描述。优选地，在本发明的方法中，所述生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。更优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖和酶。更优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽和聚糖。最优选地，B为抗体或其抗原结合片段。
在制备生物缀合物的方法中，优选反应性基团Q1选自任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1,1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、碳酰卤基和丙二烯酰胺基。
在其他优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)或(9zk)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zo)及其优选实施方案如上文对于本发明的接头-缀合物中所定义。更优选地，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)、(9t)、(9ze)、(9zh)、(9zo)或(9r)。甚至更优选地，Q1为式(9a)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9t)、(9ze)、(9zh)、(9zo)或(9s)，并且最优选地，Q1为式(9a)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9ze)、(9zh)、(9zo)或(9o)，及其优选实施方案，如上所定义。
在一个特别优选的实施方案中，Q1包含炔基，优选选自如上所述的炔基、如上所述的环烯基、如上所述的(杂)环炔基以及二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，更优选Q1选自如上所定义的式(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9zo)和(9zk)。最优选地，Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，优选式(9q)的基团。
在制备生物缀合物的方法的其他优选实施方案中，所述接头-缀合物为式(4a)或(4b)，或其盐：
Figure BDA0001818785290000831
Figure BDA0001818785290000841
其中：
-a独立地为0或1；
-b独立地为0或1；
-c为0或1；
-d为0或1；
-e为0或1；
-f为1至150范围内的整数；
-g为0或1；
-i为0或1；
-D为靶分子；
-Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
-Sp1为间隔基部分；
-Sp2为间隔基部分；
-Sp3为间隔基部分；
-Sp4为间隔基部分；
-Z1为连接基团，其将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接；
-Z2为连接基团，其将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接；以及
-R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基；或R1为D、-[(Sp1)b(Z2)e(Sp4)iD]或-[(Sp2)c(Z1)d(Sp3)gQ1]，其中D为靶分子且Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地为间隔基部分，换言之，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4可彼此不同。Sp1、Sp2、Sp3和Sp4可存在或不存在(b、c、g和i独立地为0或1)。然而，优选Sp1、Sp2、Sp3和Sp4中的至少一个是存在的，即优选b、c、g和i中的至少一个不为0。
如果存在，优选Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被如上所定义的一个或多个杂原子间隔时，优选所述基团被一个或多个O原子，和/或被一个或多个S-S基团间隔。
更优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C100亚烷基、C2-C100亚烯基、C2-C100亚炔基、C3-C100亚环烷基、C5-C100亚环烯基、C8-C100亚环炔基、C7-C100烷基亚芳基、C7-C100芳基亚烷基、C8-C100芳基亚烯基和C9-C100芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C50亚烷基、C2-C50亚烯基、C2-C50亚炔基、C3-C50亚环烷基、C5-C50亚环烯基、C8-C50亚环炔基、C7-C50烷基亚芳基、C7-C50芳基亚烷基、C8-C50芳基亚烯基和C9-C50芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20亚环烷基、C5-C20亚环烯基、C8-C20亚环炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在这些优选实施方案中，进一步优选所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，优选氢或甲基。
最优选地，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在该实施方案中，进一步优选所述亚烷基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O和/或S-S——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，优选氢或甲基。
特别优选的间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4包括-(CH2)n-、-(CH2CH2)n-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)nCH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)n-，其中n为1至50范围内的整数，优选在1至40范围内，更优选在1至30范围内，甚至更优选在1至20范围内，并且甚至更优选在1至15范围内。更优选地，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至更优选1、2、3或4。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，在式(4a)或(4b)的接头-缀合物中，间隔基部分Sp1、Sp2、Sp3和/或Sp4——如果存在——包含氨基酸序列。包含氨基酸序列的间隔基部分为本领域技术人员已知的，也可被称为肽接头。实例包括包含Val-Ala部分或Val-Cit部分的间隔基部分，例如Val-Cit-PABC、Val-Cit-PAB、Fmoc-Val-Cit-PAB等。
如上所述，Z1和Z2为连接基团。在本发明方法的一个优选的实施方案中，Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR2-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NR2、-NR2C(O)-、-NR2C(O)O-、-NR2C(O)NR2-、-SC(O)-、-SC(O)O-、-SC(O)NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-OS(O)2-、-OS(O)2O-、-OS(O)2NR2-、-OS(O)-、-OS(O)O-、-OS(O)NR2-、-ONR2C(O)-、-ONR2C(O)O-、-ONR2C(O)NR2-、-NR2OC(O)-、-NR2OC(O)O-、-NR2OC(O)NR2-、-ONR2C(S)-、-ONR2C(S)O-、-ONR2C(S)NR2-、-NR2OC(S)-、-NR2OC(S)O-、-NR2OC(S)NR2-、-OC(S)-、-OC(S)O-、-OC(S)NR2-、-NR2C(S)-、-NR2C(S)O-、-NR2C(S)NR2-、-SS(O)2-、-SS(O)2O-、-SS(O)2NR2-、-NR2OS(O)-、-NR2OS(O)O-、-NR2OS(O)NR2-、-NR2OS(O)2-、-NR2OS(O)2O-、-NR2OS(O)2NR2-、-ONR2S(O)-、-ONR2S(O)O-、-ONR2S(O)NR2-、-ONR2S(O)2O-、-ONR2S(O)2NR2-、-ONR2S(O)2-、-OP(O)(R2)2-、-SP(O)(R2)2-、-NR2P(O)(R2)2-及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在本发明的特别优选的实施方案中，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，并且其中Q1为式(9a)、(9j)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9ze)、(9zh)、(9zo)或(9o)：
Figure BDA0001818785290000871
Figure BDA0001818785290000881
其中：
-I为0至10范围内的整数；
-R10为(硫)酯基；以及
-R18选自任选取代的C1-C12烷基和C4-C12(杂)芳基。
图4中描述了制备生物缀合物的方法的实施方案。图4示出了经修饰的抗体13a-d如何可通过与马来酰亚胺的亲核加成(对于3-巯基丙酰基-半乳糖胺修饰的13a，生成硫醚缀合物14，或对于与工程化的半胱氨酸残基缀合，生成硫醚缀合物17)或在使用环辛炔试剂的应变促进的环加成条件下(对于13b、13c或13d，分别生成三唑15a、15b或16)，来进行生物缀合过程。
在使用磺酰胺接头代替典型的聚乙二醇(PEG)间隔基的情况下，除了提高本发明的生物缀合物的治疗指数之外，制备如本文所述的生物缀合物以及本发明的接头-缀合物和磺酰胺接头的方法的另外的优点是改善缀合效率。磺酰胺基(尤其是酰基磺酰胺基或氨基甲酰基磺酰胺基)的另一优点在于其高极性，这在缀合之前、期间和之后对包含这种基团的接头的溶解性以及对作为整体的构建体都将产生积极作用。鉴于这种增加的极性，使用含本发明的磺酰胺接头的接头-缀合物的缀合尤其适合于将疏水性靶分子缀合到生物分子上。磺酰胺的高极性在将疏水性部分缀合至目的生物分子的情况下也具有积极影响，已知其在缀合期间需要大量的有机共溶剂和/或诱导生物缀合物的聚集。高含量的共溶剂(最高达25％的DMF或甚至50％的DMA、聚丙二醇、或DMSO)可在缀合过程中诱导蛋白质变性，和/或在制造过程中可能需要特殊的设备。因此，在生物缀合物的形成中，通过在接头-缀合物中的靶分子和反应性基团Q1之间的间隔基中使用本发明的磺酰胺接头，有效地解决了生物缀合物中的疏水性连接部分所伴随的聚集问题。本发明的磺酰胺接头及其在生物缀合方法中的用途的另一个优点在于其易于合成且产率高。
为了证明使用本发明的磺酰胺接头的这些有益效果，参考PCT/NL2015/050697(WO2016/053107)，特别是参考其中的表1-3，图11-14、23和24以及实施例57、58、60和61。将PCT/NL2015/050697(WO 2016/053107)的这些表、图和实施例并入本文中。
应用
本发明因此在第一方面涉及包含至少一种如上所定义的“核心-GlcNAc官能化”和“磺酰胺键”的缀合模式用于提高生物缀合物的治疗指数的用途。本方面的发明也可以称为提高生物缀合物的治疗指数的方法。在优选的实施方案中，缀合模式用于通过接头L将生物分子B与靶分子D连接起来，其中所述缀合模式包括：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的糖蛋白，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure BDA0001818785290000891
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的糖蛋白与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团。
在本文中，生物分子优选是抗体，生物缀合物优选是抗体-缀合物。
在本文中，与不包含本发明的缀合模式或可通过本发明的缀合模式获得的生物缀合物相比，治疗指数提高。因此，在第一个实施方案中，与不通过如上所定义的步骤(i)和(ii)获得的生物缀合物，或者-换句话说-不含连接抗体与靶分子所得的接头L的结构特征的生物缀合物相比，治疗指数提高，这些是缀合过程的直接结果。因此，在第二个实施方案中，与式(A)的生物缀合物(其中接头L不包含式(1)的基团或其盐)相比，治疗指数提高。
发明人惊奇地发现，当使用本发明的缀合模式时，即使所有其他因素，即使是生物分子的类型和靶分子的类型和生物分子-靶分子比率保持恒定，本发明的生物缀合物的治疗指数也显著提高。提高的治疗指数可以仅归因于本发明的缀合模式。提高的治疗指数优选是在癌症治疗中，特别是在靶向表达HER2的肿瘤中提高的治疗指数。
本发明第一方面的方法也可以称为提高生物缀合物的治疗指数的方法，其包括提供具有本发明的缀合模式的生物缀合物的步骤。
本发明人发现，包含在本发明的生物缀合物中的本发明的缀合模式对治疗指数的两个方面具有影响：(a)治疗功效和(b)耐受性。因此，用于提高治疗指数的本发明的用途或方法优选用于(a)提高治疗功效，和/或(b)提高式(A)的生物缀合物的耐受性。优选地，生物缀合物是抗体-缀合物，并且本发明的用途或方法用于提高抗体-缀合物的治疗指数，优选用于(a)提高抗体-缀合物的治疗功效，和/或(b)提高抗体-缀合物的耐受性。在一个实施方案中，本发明的方法或用途是用于提高生物缀合物(优选抗体-缀合物)的治疗功效。在一个实施方案中，本发明的方法或用途是用于提高生物缀合物(优选抗体-缀合物)的耐受性。
因此，在一个实施方案中，根据第一方面的用途或方法是用于提高式(A)的生物缀合物的治疗功效。在本文中，“提高治疗功效”也可以表述为“降低有效剂量”、“降低ED50值”或“提高保护指数”。同样，在一个实施方案中，根据第一方面的方法是用于提高式(A)的生物缀合物的耐受性。在本文中，“提高耐受性”也可以表述为“提高最大耐受剂量(MTD)”、“提高TD50值”、“提高安全性”或“降低毒性”。在一个特别优选的实施方案中，根据第一方面的方法是用于(a)提高治疗功效和(b)提高式(A)的生物缀合物的耐受性。
根据第一方面的方法在很大程度上是非医学的。在一个实施方案中，所述方法是用于提高生物缀合物的治疗指数的非医学或非治疗性方法。
本发明的第一方面也可以称为用于改善生物缀合物的治疗指数(治疗功效和/或耐受性)的缀合模式，其中所述缀合模式如上所定义。在一个实施方案中，本方面称为根据如上所定义的“核心-GlcNAc官能化”用于改善式(A)的生物缀合物的治疗功效的缀合模式，其中L和(A)如上所定义。在一个实施方案中，本方面称为用于改善生物缀合物(优选抗体-缀合物)的治疗指数(治疗功效和/或耐受性)的缀合模式。换句话说，第一方面涉及制备生物缀合物(优选抗体-缀合物)的缀合模式用于改善生物缀合物的治疗指数(治疗功效和/或耐受性)的用途。根据第一方面的发明还可以称为缀合模式在生物缀合物(优选抗体-缀合物)中或在制备生物缀合物(优选抗体-缀合物)中用于提高抗体-缀合物的治疗指数(治疗功效和/或耐受性)的用途。如本文所定义的用途可以称为非医学或非治疗性用途。
在一个实施方案中，根据本发明第一方面使用的方法、用途或缀合模式还包括将本发明的生物缀合物施用给有需要的受试者，特别是患有与HER2表达相关的病症的患者，例如，选自乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌或胃癌。在一个实施方案中，受试者是癌症患者，更合适地是患有表达HER2的肿瘤的患者。生物缀合物(如抗体-药物-缀合物)的用途在癌症治疗领域中是众所周知的，并且本发明的生物缀合物在这方面特别适合。
通常，生物缀合物以治疗有效剂量给药。给药可以以单剂量或可以例如每月给药1至4次，优选每月给药1至2次。在优选的实施方案中，给药每3或4周进行一次，最优选每4周进行一次。鉴于提高的治疗功效，相较于常规生物缀合物治疗期间的情况，给药可能发生的频率较低。如本领域技术人员所理解的，本发明的生物缀合物的剂量可取决于许多因素，并且本领域技术人员可通过常规实验确定最佳剂量方案。生物缀合物通常以0.01-50mg/kg受试者的体重的剂量给药，更准确地0.03-25mg/kg或最准确地0.05-10mg/kg，或者0.1-25mg/kg或0.5-10mg/kg。在一个实施方案中，通过静脉内注射进行给药。
靶向表达HER2的细胞的方法
本发明在第二方面涉及靶向表达HER2的细胞，包括但不限于低表达HER2的细胞的方法，其包括给予本发明的生物缀合物。表达HER2的细胞也可称为表达HER2的肿瘤细胞。有需要的受试者最优选是癌症患者。生物缀合物(如抗体-药物-缀合物)在癌症治疗领域中的用途是众所周知的，并且本发明的生物缀合物在这方面特别适合。所述方法通常适用于治疗癌症。以上详细描述了本发明的生物缀合物，其同样适用于在本发明第二方面中使用的生物缀合物。本发明的第二方面还可以称为本发明的生物缀合物，其用于在有需要的受试者中靶向表达HER2的细胞。换句话说，第二方面涉及本发明的生物缀合物在制备在有需要的受试者中用于靶向表达HER2的细胞的药物的用途。
在本方面的上下文中，表达HER2的细胞的靶向包括治疗、成像、诊断表达HER2的细胞(特别是表达HER2的肿瘤)，防止表达HER2的细胞(特别是表达HER2的肿瘤)的增殖，包含和减少表达HER2的细胞(特别是表达HER2的肿瘤)的一种或多种。最优选地，本方面用于治疗表达HER2的肿瘤。
在一个实施方案中，本方面涉及治疗有需要的受试者的方法。本发明的第二方面还可以称为本发明的生物缀合物用于治疗有需要的受试者，优选用于治疗癌症。换句话说，第二方面涉及本发明的生物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗有需要的受试者，优选用于治疗癌症。
在本方面的上下文中，所述受试者适当地患有与HER2表达相关的病症，特别是选自以下的病症：乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌或胃癌。
在本方面的上下文中，优选靶分子D是抗癌剂，优选细胞毒素。
在根据第二方面的方法中，生物缀合物通常以治疗有效剂量给药。给药可以以单剂量或可以例如每月给药1至4次，优选每月给药1至2次。在优选的实施方案中，给药每3或4周进行一次，最优选每4周进行一次。如本领域技术人员所理解的，本发明的生物缀合物的剂量可取决于许多因素，并且本领域技术人员可通过常规实验确定最佳剂量方案。生物缀合物通常以0.01-50mg/kg受试者的体重的剂量给药，更准确地0.03-25mg/kg或最准确地0.05-10mg/kg，或者0.1-25mg/kg或0.5-10mg/kg。在一个实施方案中，通过静脉内注射进行给药。
鉴于提高的治疗功效，相较于用常规生物缀合物和/或以较低剂量的治疗，给药可以较不频繁地发生。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物的给药剂量低于相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的TD50，优选剂量为相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的TD50的至多99-90％，更优选至多89-60％，甚至更优选至多59-30％，最优选至多29-10％。在一个实施方案中，相较于对于相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物将进行的给药，本发明的生物缀合物的给药发生频率较低，优选给药事件的数量为相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的给药事件的数量的至多75％，更优选至多50％。或者，鉴于提高的耐受性，相较于用常规生物缀合物的治疗，可以以较高剂量进行给药。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物的给药剂量高于相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的TD50，优选剂量为相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的TD50的至多25-50％，更优选至多50-75％，最优选至多75-100％。
鉴于提高的治疗功效，相较于用常规生物缀合物和/或以较低剂量的治疗，给药可以较不频繁地发生。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物的给药剂量低于相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的ED50，优选剂量为相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的ED50的至多99-90％，更优选至多89-60％，甚至更优选至多59-30％，最优选至多29-10％。在一个实施方案中，相较于对于相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物将进行的给药，本发明的生物缀合物的给药发生频率较低，优选给药事件的数量为相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的给药事件的数量的至多75％，更优选至多50％。或者，鉴于提高的耐受性，相较于用常规生物缀合物的治疗，可以以较高剂量进行给药。在一个实施方案中，本发明的生物缀合物的给药剂量高于相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的TD50，优选剂量为高于相同但不包含本发明的缀合模式的生物缀合物的TD50的至多1.1-1.49倍，更优选至多1.5至1.99倍，甚至更优选2至4.99倍，最优选至多5至10倍。
在一个实施方案中，根据本方面使用的用途或方法或缀合模式是用于治疗有需要的受试者的生物缀合物，其中所述生物缀合物由式(A)表示：
B–L–D
(A)，
其中：
-B为生物分子；
-L为连接B和D的接头；
-D为靶分子；以及
-每个“-”的存在独立地为键或间隔基部分，
其中L包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000941
其中：
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S或NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为另一个靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
本发明的抗体-缀合物
在第三方面，本发明涉及抗体-缀合物，其特别适合于靶向表达HER2的肿瘤。本发明的抗体-缀合物包含通过接头L与靶分子D连接的抗体AB，其中抗体-缀合物包含本发明的缀合模式或可通过本发明的缀合模式获得。特别地，本发明的抗体-缀合物可通过以下方式获得：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure BDA0001818785290000951
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团。
在本文中，抗体AB能够靶向表达HER2的肿瘤，靶分子D选自紫杉烷类、蒽环类抗生素、喜树碱、埃博霉素类(epothilones)、丝裂霉素C(mytomycin)、考布他汀(combretastatin)、长春花生物碱、美登木素生物碱、刺孢霉素和烯二炔类、多卡米星、微管溶素、毒伞肽(amatoxins)、多拉司他汀(dolastatin)和阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白和肽和细胞毒素(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂，及其类似物或前药。或者，靶分子D是细胞毒素。在本方面的一个实施方案中，靶分子D选自美登木素生物碱、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、烯二炔类、阿里他汀和蒽环类抗生素。在本方面的优选实施方案中，靶分子D是美登木素生物碱或吡咯并苯并二氮杂卓二聚体，更优选选自MMAD、MMAE、MMAF及其功能类似物的阿里他汀，或选自DM1、DM3、DM4和Ahx-May或其任何功能衍生物的美登木素生物碱，最优选D＝Ahx-May或其任何功能衍生物。或者，D为吡咯并苯并二氮杂卓二聚体。
如上所定义的步骤(i)和(ii)的优选实施方案同样适用于本发明的抗体-缀合物。技术人员知道如何将这些优选特征转化为本发明抗体-缀合物的结构特征。在优选的实施方案中，本方面的抗体-缀合物为式(A)，并且优选接头L含有式(1)的基团或其盐，其中(A)和(1)如本文所定义。
以上描述了S(F1)x的优选选项。在一个优选的实施方案中，S(F1)x是6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺(6-AzGalNAc或6-N3-GalNAc)。
在优选的实施方案中，能够靶向表达HER2的肿瘤的抗体AB选自曲妥珠单抗、margetuximab、培妥珠单抗、HuMax-Her2、厄马索单抗、HB-008、ABP-980、BCD-022、CanMab、Herzuma、HD201、CT-P6、PF-05280014、COVA-208、FS-102、MCLA-128、CKD-10101、HT-19，及其功能类似物。更优选地，能够靶向表达HER2的肿瘤的抗体AB是曲妥珠单抗或其功能类似物。。
在特别优选的实施方案中，抗体AB是曲妥珠单抗，并且靶分子D选自美登木素生物碱、阿里他汀和吡咯并苯并二氮杂卓二聚体，优选选自MMAD、MMAE、MMAF及其功能类似物的阿里他汀，或选自DM1、DM3、DM4和Ahx-May及其功能衍生物的美登木素生物碱。最优选，D＝Ahx-May。
在优选的实施方案中，抗体-缀合物由式(40)或(40b)表示：
Figure BDA0001818785290000961
其中：
-R31独立地选自氢、卤素、-OR35、-NO2、-CN、-S(O)2R35、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基任选被取代，其中两个取代基R31可以连接在一起形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，并且其中R35独立地选自氢、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基；
-X是C(R31)2、O、S或NR32，其中R32是R31或L2(D)r，其中L2是接头，且D如权利要求1中所定义；
-r为1-20；
-q为0或1，条件是如果q为0则X为NL2(D)r；
-aa是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
-aa'是0、1、2、3、4、5、6、7或8；和
-aa+aa'<10。
-b为0或1；
-pp为0或1；
-M是-N(H)C(O)CH2-、-N(H)C(O)CF2-、-CH2-、-CF2-或含有0-4个氟取代基的1,4-亚苯基，优选含有位于亚苯基的C2和C6上或位于亚苯基的C3和C5上的2个氟取代的1,4-亚苯基基；
-y是1-4；
-Fuc是岩藻糖。
优选地，aa＝2、aa'＝3、X＝C(R31)2(即，存在稠合的环辛烯环)，其中一个R31＝H且另一个R31与存在于式(20b)的结构中的另外的R31取代基连接在一起，以形成共有环辛烯部分的碳原子5和6(当与三唑环共有的碳原子编号为1和2时)的增环的环丙基环。在优选的实施方案中，抗体是如上所定义的式(41)、(42)、(42b)、(35b)、(40c)和(40d)中的任一个。
本发明的抗体-缀合物的优选特征如上所定义，特别是在作为缀合模式的“核心-GlcNAc官能化”的步骤(ii)及其产物的描述中。
在一个实施方案中，本方面的抗体-缀合物是由式(A)表示的生物缀合物：
B–L–D
(A)，
其中：
-B为生物分子；
-L为连接B和D的接头；
-D为靶分子；以及
-每个“-”的存在独立地为键或间隔基部分，
其中L包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001818785290000981
其中：
-a为0或1；以及
-R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S或NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为另一个靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
本方面的优选的抗体-缀合物在下文中作为缀合物(I)–(XXIV)列出。在一个实施方案中，本方面的抗体-缀合物选自下文定义为(I)–(VII)的缀合物，优选选自下文定义为(I)-(X)的缀合物，更优选选自下文定义为(I)-(VI)的缀合物。
(I)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物82)；
(II)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2)3–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物83)；
(III)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物81)；
(IV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May；
(V)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May(缀合物84)；
(VI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Ala–，D＝PBD(缀合物85)；
(VII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物96)；
(VIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物95)；
(IX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物97)；
(X)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物98)；
(XI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9n)，其中U＝O，L2＝–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May。
(XII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9zo)，L2＝–C(O)–NH–(CH2)4–C(O)–NH–(CH2)5–O–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9j)，其中l＝3，L2＝–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XVI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Dox；
(XVII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAF；
(XVIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XIX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝MMAF；
(XXI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Dox；
(XXII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Ahx-May；
(XXIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE；和
(XXIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE。
技术人员理解，此处定义为(I)–(XXIV)的抗体-缀合物不含F1＝N3，也不含Q1＝(9j)、(9n)、(9q)或(9zo)，但包含由F1和Q1之间的反应产生的连接基团Z3。更具体地，如上所定义的抗体-缀合物(I)–(VI)和(XIV)至(XXIV)为式(40b)，其中S＝GalNAc、y＝2、x＝1、b＝0或1、pp＝0(即M不存在)、aa＝2、aa'＝3、X＝C(R31)2，其中一个R31＝H且另一个R31与存在于式(40b)的结构中的另外的R31取代基连接在一起，以形成共有环辛烯部分的碳原子5和6(当与三唑环共有的碳原子编号为1和2时，参见上述结构(9q))的稠合环丙基环，q＝1、r＝1或2且D和L2如上所定义。更具体地，如上定义的抗体-缀合物(VII)和(VIII)为式(40b)，其中S＝GalNAc、y＝2、x＝1，b＝0或1、pp＝1、M＝-N(H)C(O)CH2-、aa＝2、aa'＝3、X＝C(R31)2，其中一个R31＝H且另一个R31与式(40b)的结构中存在的另外的R31取代基连接在一起形成共享环辛烯部分的碳原子5和6的稠合环丙基环(当与三唑环共有的碳原子编号为1和2时，参见上述结构(9q))，q＝1、r＝1或2且D和L2如上所定义。更具体地，如上定义的抗体-缀合物(IX)和(X)为式(40b)，其中S＝GalNAc、y＝2、x＝1，b＝0或1、pp＝1、M＝-N(H)C(O)CF2-、aa＝2、aa'＝3、X＝C(R31)2，其中一个R31＝H且另一个R31与式(40b)的结构中存在的另外的R31取代基连接在一起形成共享环辛烯部分的碳原子5和6的稠合环丙基环(当与三唑环共有的碳原子编号为1和2时，参见上述结构(9q))，q＝1、r＝1或2且D和L2如上所定义。更具体地，如上定义的抗体-缀合物(XI)为式(40b)，其中S＝GalNAc、y＝2、x＝1，b＝0或1、pp＝0(即M不存在)、aa＝3、aa'＝2、X＝C(R31)2，其中R31＝H，其中两个稠合的苯环分别与环辛烯部分的碳原子3+4和7+8稠合且{L2(D)r}q与碳原子5或6连接(当与三唑环共有的碳原子编号为1和2时，参见上述结构(10k))，q＝1、r＝1且D和L2如上所定义。更具体地，如上定义的抗体-缀合物(XII)为式(40b)，其中S＝GalNAc、y＝2、x＝1，b＝0或1、pp＝0(即M不存在)、aa＝0、aa'＝5、X＝C(R31)2，其中一个R31＝F且另一个R31提供与{L2(D)r}q的连接，q＝1、r＝1且D和L2如上所定义。更具体地，如上定义的抗体-缀合物(XIII)为式(40d)，其中S＝GalNAc、y＝2、x＝1、b＝0或1、pp＝0(即M不存在)、l＝3、q＝1、r＝1且D和L2如上所定义。
与已知的抗体-缀合物相比，本方面的抗体-缀合物具有改善的治疗指数，其中治疗指数优选用于治疗表达HER2的肿瘤。改善的治疗指数可以采取改善的治疗功效和/或改善的耐受性的形式。在一个实施方案中，与用于治疗表达HER2的肿瘤的已知抗体-缀合物相比，本方面的抗体-缀合物具有改善的治疗功效。在一个实施方案中，与用于治疗表达HER2的肿瘤的已知的抗体-缀合物相比，本方面的抗体-缀合物具有改善的耐受性。
本发明的抗体-缀合物在其他方面也优于已知的抗体-缀合物。发明人已发现本发明的抗体-缀合物表现出提高的稳定性(即它们随时间表现出较少的降解)。本发明人还发现本发明的抗体-缀合物表现出减少的聚集问题(即它们随时间表现出较少的聚集)。鉴于其改善的治疗指数、提高的稳定性和减少的聚集，本发明的抗体-缀合物是对现有技术抗体-缀合物的显著改进。因此，本发明还涉及如本文所定义的缀合模式用于改善生物缀合物(通常为抗体-缀合物)的稳定性的用途。因此，本发明还涉及如本文所定义的缀合模式用于减少生物缀合物(通常为抗体-缀合物)的聚集的用途。
内切糖苷酶融合酶
在第四方面，本发明涉及包含两种内切糖苷酶的融合酶。在具体实例中，两种内切糖苷酶EndoS和EndoH通过接头——优选-(Gly4Ser)3-(His)6-(Gly4Ser)3-接头——连接。本发明的融合酶也称为EndoSH。本发明的酶与SEQ ID NO:1具有至少50％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:1具有至少70％、更优选至少80％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:1具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。同一性可以通过本领域已知的已知方法和/或计算机程序方法，例如可从NCBI和其他来源公开获得的BLASTP(BLASTManual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))容易地计算。优选地，本发明的酶(与SEQ ID NO:1具有上述序列同一性)具有EndoS和EndoH活性。最优选地，本发明的酶与SEQ ID NO:1具有100％的序列同一性。
还包括的是EndoS和EndoH的融合酶，其中接头被另一个本领域已知的合适的接头替换，其中所述接头可以是刚性的或柔性的。优选地，所述接头是柔性接头，其允许相邻蛋白质结构域彼此相对自由地移动。优选地，所述柔性接头由氨基酸残基如甘氨酸、丝氨酸、组氨酸和/或丙氨酸组成，并且长度为3至59个氨基酸残基，优选10至45或15至40个氨基酸残基，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸残基，或20至38、25至37或30至36个氨基酸残基。任选地，融合酶与标签共价连接或包含标签，所述标签便于如本领域已知的纯化和/或检测，例如Fc-标签、FLAG-标签、聚(His)-标签、HA-标签和Myc-标签。
糖蛋白的剪接是本领域已知的，例如由WO 2007/133855或WO 2014/065661已知。本发明的酶表现出EndoS和EndoH活性，并且能够剪接核心-GlcNAc单元上的糖蛋白(例如抗体)上的聚糖，仅留下糖蛋白上的核心-GlcNAc残基(EndoS活性)以及分离高甘露糖聚糖(EndoH活性)。出人意料的是，融合酶的两种活性在约7-8的pH下平稳地起作用，而单体EndoH需要6的pH以最佳地操作。本发明的融合酶可以通过本领域的常规技术制备，例如将包含酶编码序列的表达载体(例如质粒)引入到宿主细胞(例如大肠杆菌)中用于表达，从中可以分离酶。制备和纯化本发明的融合酶的可能方法在实施例3-5中给出，并且其功能在实施例6中得到证实，其中曲妥珠单抗在单一步骤中被有效剪接。
融合蛋白EndoSH的序列表示(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0001818785290001051
(接头有下划线，EndoH序列以斜体表示)
实施例
下表1和2提供了制备的生物缀合物的概述。
表1：生物缀合物的通用结构
Figure BDA0001818785290001061
表2：示例性生物缀合物列表
Figure BDA0001818785290001062
Figure BDA0001818785290001071
Figure BDA0001818785290001081
注释：
*用于制备生物缀合物的反应配偶体(参见下面的实施例)。
**表1中定义的一般结构和S(F1)x的结构。6-N3-GalNAc＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺；GalNAz＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖；F2-GalNAz＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖。
还原的单克隆抗体的RP-HPLC分析：在RP-HPLC分析之前，通过将10μg(经修饰的)IgG溶液在37℃下与10mM DTT和100mM Tris pH 8.0以50μL的总体积温育15分钟来还原样品。向还原的样品中加入49％CAN、49％MQ和2％甲酸(50μL)的溶液。反相HPLC在Agilent1100HPLC上进行，其使用ZORBAX Phoroshell 300SB-C8 1x75 5μm(AgilentTechnologies)柱，以1ml/min在70℃下使用从25至50％缓冲液B的16.9分钟线性梯度(具有缓冲液A＝90％MQ、10％CAN、0.1％TFA和缓冲液B＝90％CAN、10％MQ、0.1％TFA)运行。
单克隆抗体的质谱分析：在质谱分析之前，将IgG用DTT处理(其允许分析轻链和重链)或用FabricatorTM(可从Genovis，Lund，Sweden商购获得)处理(其允许分析Fc/2片段)。为了分析轻链和重链，将20μg(经修饰的)IgG溶液在37℃下与100mM DTT以4μL的总体积温育5分钟。如果存在，在这些条件下，叠氮官能团被还原为胺。为了分析Fc/2片段，将20μg(经修饰的)IgG溶液在37℃下与FabricatorTM(1.25U/μL)在pH 6.6的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以10μL的总体积温育1小时。在还原或Fabricator-消化后，使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)将样品用milliQ洗涤三次，得到的最终样品体积约为40μL。接下来，通过JEOL AccuTOF上的电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)分析样品。使用Magtran软件获得去卷积的光谱。
蛋白质组分的制备：实施例1-2
实施例1：曲妥珠单抗的瞬时表达和纯化
曲妥珠单抗通过Bioceros(Utrecht，Netherlands)由稳定CHO细胞系表达。使用填充有50mL蛋白A琼脂糖的XK 26/20柱纯化上清液(2.5L)。在单次运行中，将0.5L上清液上样到柱上，然后用至少10倍柱体积的25mM Tris pH 7.5、150mM NaCl洗涤。用0.1M甘氨酸pH2.7洗脱滞留蛋白。立即用1.5M Tris-HCl pH 8.8中和洗脱的产物，并用25mM Tris pH 8.0透析。接下来，使用Vivaspin Turbo 15超滤单元(Sartorius)将产物浓缩至约20mg/mL，并在进一步使用前储存在-80℃下。
实施例2：His-TnGalNAcT(33-421)的瞬时表达和纯化
His-TnGalNAcT(33-421)(由SEQ ID NO:3表示)通过Evitria(苏黎世，瑞士)以5L规模在CHO K1细胞中瞬时表达。使用填充有25mL Ni琼脂糖excel(GE Healthcare)的XK16/20柱纯化上清液。每次运行将约1.5L上清液上样到柱上，然后用至少10倍柱体积的缓冲液A(20mM Tris缓冲液、5mM咪唑、500mM NaCl，pH 7.5)洗涤。用缓冲液B(20mM Tris、500mMNaCl、500mM咪唑，pH 7.5)洗脱滞留蛋白。使用HiPrep H26/10脱盐柱(GE Healthcare)将洗脱级分的缓冲液更换为25mM Tris pH 8.0。使用Vivaspin Turbo 4超滤单元(Sartorius)将纯化的蛋白质浓缩至至少3mg/mL，并在进一步使用前储存在-80℃下。
His-TnGalNAcT(33-421)的序列(SEQ.ID NO:3)：
Figure BDA0001818785290001091
实施例3-5：内切糖苷酶EndoSH的制备
实施例3：将融合蛋白EndoSH克隆到pET22B表达载体中
含有NdeI-HindIII位点之间的EndoS-(G4S)3-(His)6-(G4S)3-EndoH(EndoSH)编码序列的pET22B-载体(EndoSH由SEQ ID NO:1表示)获自Genscript。EndoSH融合蛋白的DNA序列由EndoS的编码残基48-995组成，其通过N-末端连接的甘氨酸-丝氨酸(GS)接头与EndoH的编码残基41-313融合。甘氨酸-丝氨酸(GS)接头包含-(G4S)3-(His)6-EF-(G4S)3-形式，允许两种酶的间隔，同时引入IMAC-纯化标签。
实施例4：融合蛋白EndoSH的大肠杆菌表达
EndoSH融合蛋白(由SEQ ID NO:1表示)的表达始于质粒(pET22b-EndoSH)向BL21细胞的转化。下一步是用BL21细胞接种500mL培养物(LB培养基+Ampilicin)。当OD600达到0.7时，用1mM IPTG(500μL的1M储备溶液)诱导培养物。
实施例5：从大肠杆菌中纯化融合蛋白EndoSH
在16℃下过夜诱导后，通过离心沉淀培养物。将沉淀重悬于40mL PBS中，并在冰上与5ml溶菌酶(10mg/mL)一起温育30分钟。半小时后，加入5ml 10％Triton-X-100并在冰上超声处理(10分钟)。超声处理后，通过离心(10分钟，8000xg)除去细胞碎片，然后通过0.22μM孔径的过滤器过滤。将可溶性提取物上样到HisTrap HP 5mL柱(GE Healthcare)上。首先用缓冲液A(20mM Tris缓冲液、20mM咪唑、500mM NaCl，pH 7.5)洗涤柱子。用缓冲液B(20mMTris、500mM NaCl、250mM咪唑，pH 7.5，10mL)洗脱滞留蛋白。通过SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶(12％)上分析级分。合并含有纯化的靶标蛋白的级分，通过在4℃下过夜透析，将缓冲液更换为20mM Tris pH 7.5和150mM NaCl。使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)将纯化的蛋白浓缩至至少2mg/mL。在进一步使用之前将产物储存在-80℃下。
曲妥珠单抗的重建：实施例6-7：
在PCT/NL2015/050697(WO 2016/053107)中描述了适合作为用于本发明的方法中的生物分子的以下经修饰的生物分子的制备：
·曲妥珠单抗(GalNAz)2 13b(实施例12、13、15、16-1)；
·曲妥珠单抗(F2-GalNAz)2 13c(实施例1、7-13、16-2)
实施例6：通过融合蛋白EndoSH制备经修剪的曲妥珠单抗
用融合蛋白EndoSH进行曲妥珠单抗(通过Bioceros(Utrecht，Netherlands)进行的经CHO细胞中的稳定表达获得的)的聚糖修剪。因此，将曲妥珠单抗(100.8mL，2g，19.85mg/mL(在25mM Tris pH 8.0中))与EndoSH(5.26mL，20mg，3.8mg/mL(在25mM Tris pH7.5中))在37℃下温育约16h。fabricator消化的样品的质谱分析示出Fc/2片段的一个主要峰(观测到的质量为24135Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于核心-GlcNAc(Fuc)-取代的曲妥珠单抗。
实施例7：曲妥珠单抗(6-N3-GalNAc)2 13d的制备
经修剪的曲妥珠单抗(11.8mg/mL，其通过如上文实施例6中所述的曲妥珠单抗的EndoSH处理获得)与底物6-N3-GalNAc-UDP(3.3mM，可从GlycoHub商购获得)和His-TnGalNAcT(33-421)(0.75mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl pH 8.0中在30℃下温育。将反应在30℃下温育过夜。使用AKTA净化器-10(GE Healthcare)使用填充有50mL蛋白A琼脂糖的XK 26/20柱从反应混合物中纯化生物分子13d。立即用1.5M Tris-HCl pH 8.8中和洗脱的Ig G，并用PBS pH 7.4透析。接下来，使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)浓缩Ig G至浓度为28.5mg/mL。fabricator消化的样品的质谱分析示出Fc/2片段的一个主要峰(观测到的质量为24363Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于核心6-N3-GalNAc-GlcNAc(Fuc)-取代的曲妥珠单抗。
接头-缀合物合成：实施例8-23：
参考PCT/NL2015/050697(WO 2016/053107)用于合成以下化合物，其适合作为用于本发明的方法中的接头-缀合物或其模型：
·化合物18(实施例20)；
·化合物20(实施例21、23-25)；
·化合物21(实施例26-27)；
·化合物23(实施例29-31)；
·化合物26(实施例36-38)；
·化合物30(实施例43-1、32)；
·化合物33(实施例36-37、47)；
·化合物34(实施例36、37、48)；
·化合物35(实施例36-37、49)；
·化合物36(实施例29、50)；
·化合物37(实施例51-53)；
·化合物38(实施例29、54-55)；
·化合物39(实施例29、54、56)。
Figure BDA0001818785290001121
实施例8：化合物101的制备
向在THF和水的混合物(80mL/80mL)中的BCN-OSu溶液(1.00g，3.43mmol)中加入γ-氨基丁酸(0.60g，5.12mmol)和Et3N(1.43mL，1.04g，10.2mmol)。将混合物搅拌4h，然后加入DCM(200mL)和饱和NH4Cl水溶液(80mL)。分离后，用DCM(2×200mL)萃取水层。干燥(Na2SO4)合并的有机层并浓缩。残余物用柱色谱法纯化(MeOH的DCM溶液0→10％)。得到为无色稠油状物的产物BCN-GABA(730mg，2.61mmol，76％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.81(bs,1H),4.15(d,J＝8.4Hz,2H),3.30–3.21(m,2H),2.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.35–2.16(m,6H),1.85(五重峰,J＝6.9Hz,2H),1.64–1.51(m,2H),1.35(五重峰,J＝8.4Hz,1H),1.00–0.90(m,2H)
实施例9：化合物102的制备
将氯磺酰异氰酸酯(CSI；0.91mL，1.48g，10mmol)加入到冷却的(-78℃)叔丁醇(5.0mL，3.88g，52mmol)的Et2O(50mL)溶液中。将反应混合物温热至室温并浓缩。将残余物悬浮在DCM(200mL)中，随后加入Et3N(4.2mL，3.0g，30mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.0mL，1.05g；10mmol)。将所得混合物搅拌10min并浓缩。将残余物用柱色谱法(MeOH的DCM溶液0→10％)纯化两次。得到为无色稠油状物的产物(2.9g，10mmol，100％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.75(bs,1H),3.79–3.74(m,2H),3.67–3.62(m,2H),3.61–3.57(m,2H),3.35–3.28(m,2H),1.50(s,9H)。
实施例10：化合物103的制备
向102(2.9g，10mmol)的DCM(40mL)溶液中加入Ac2O(2.9mL，3.11g，30.5mmol)和Et3N(12.8mL，9.29g，91.8mmol)。将反应混合物搅拌2h，用饱和NaHCO3水溶液(50mL)洗涤并干燥(Na2SO4)。将残余物用柱色谱法(20％→100％EtOAc的庚烷溶液)纯化两次。得到为无色油状物的产物(2.5g，7.7mmol，77％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.48(bs,1H),4.25–4.20(m,2H),3.70–3.60(m,4H),3.33–3.23(m,2H),2.10(s,3H),1.50(s,9H)
实施例11：化合物104的制备
向103(80mg，0.25mmol)的DCM(8mL)溶液中加入TFA(2mL)。40min后，浓缩反应混合物。将残余物溶于甲苯(30mL)中并浓缩混合物。得到为无色油状物的产物(54mg，0.24mmol，95％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.15(bs,2H),4.26–4.18(m,2H),3.71–3.60(m,4H),3.35–3.27(m,2H),2.08(s,3H)。
实施例12：化合物105的制备
向BCN-GABA(101)(67mg，0.24mmol)和104(54mg，0.24mmol)在DCM(20mL)中的混合物中加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI.HCl；55mg，0.29mmol)和DMAP(2.8mg，23μmol)。将混合物搅拌16，并用饱和NH4Cl水溶液(20mL)洗涤。分离后，将水层用DCM(20mL)萃取。干燥合并的有机层(Na2SO4)并浓缩。用柱色谱(MeOH的DCM溶液0→10％)纯化残余物。得到为无色稠油状物的产物(50mg，0.10mmol，42％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.83–5.72(m,1H),5.14–5.04(m,1H),4.23–4.19(m,2H),4.15(d,J＝8.1Hz,2H),3.67–3.57(m,4H),3.29–3.18(m,4H),2.41–2.32(m,2H),2.31–2.15(m,6H),2.10(s,3H),1.85(五重峰,J＝6.6Hz,2H),1.65–1.49(m,2H),1.38–1.28(m,1H),1.00–0.89(m,2H)
实施例13：化合物106的制备
向105(50mg，0.10mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入K2CO3(43mg，0.31mmol)。将混合物搅拌3h，并用饱和NH4Cl水溶液(20mL)稀释。用DCM(3×20mL)萃取混合物。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。得到无色膜状产物(39mg，0.088mmol，88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)6.25(bs,1H),5.26–5.18(m,1H),4.15(d,J＝8.0Hz,2H),3.77–3.71(m,2H),3.63–3.53(m,4H),3.33–3.27(m,2H),3.27–3.17(m,2H),2.45–2.34(m,2H),2.34–2.14(m,6H),1.85(五重峰,J＝6.7hz,2H),1.65–1.48(m,2H),1.41–1.28(m,1H),1.01–0.88(m,2H)。
实施例14：化合物107的制备
向106(152mg，0.34mmol)的DCM(20mL)溶液中加入对硝基苯基氯甲酸酯(PNP-COCl；69mg，0.34mmol)和吡啶(28μL，27mg，0.34mmol)。将混合物搅拌1.5h并浓缩。用柱色谱(50％→100％EtOAc的庚烷溶液)纯化残余物。得到为无色稠油状物的产物(98mg，0.16mmol，47％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.31–8.26(m,2H),7.46–7.40(m,2H),5.69–5.59(m,1H),4.98–4.91(m,1H),4.46–4.42(m,2H),4.18(d,J＝8.1Hz,2H),3.79–3.75(m,2H),3.69–3.64(m,2H),3.33–3.24(m,4H),2.39–2.31(m,2H),2.32–2.18(m,6H),1.84(五重峰,J＝6.3Hz 2H),1.65–1.50(m,2H),1.35(quintet,J＝8.5Hz,1H),1.01–0.91(m,2H)。
实施例15：接头-缀合物80的制备
向Val-Cit-PABC-Ahx-May.TFA(20mg；15.6μmol)的DMF(0.50mL)溶液中加入三乙胺(6.5μL；4.7mg；47μmol)和107(19mg，31μmol)的DMF(311μL)溶液。将混合物静置20h，并加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(13.7μL，14mg，94μmol)。2h后，加入额外的2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(13.7μL，14mg，94μmol)。1.5h后，通过RPHPLC(C18，30％→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化反应混合物。所得产物另外通过二氧化硅柱色谱法(DCM→MeOH/DCM)纯化。得到为白色膜状物的所需产物(16mg，9.9μmol，63％)。C77H110ClN12O22S+(M-H2O+H+)的LCMS(ESI+)计算值为1621.73，实测值为1621.74。
实施例16：化合物109的制备
向2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇(539mg，2.79mmol)的DCM(100mL)溶液中加入BCN-OSu(0.74g，2.54mmol)和Et3N(1.06mL，771mg，7.62mmol)。将所得溶液搅拌2.5h，并用饱和NH4Cl水溶液(100mL)洗涤。分离后，水相用DCM(100mL)萃取，将合并的有机相干燥(Na2SO4)并浓缩，用柱色谱法(MeOH的DCM溶液0→10％)纯化残余物。得到为无色油状物的产物(965mg，2.61mmol，定量)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.93(bs,1H),4.14(d,J＝8.0Hz,2H),3.77–3.69(m,4H),3.68–3.59(m,8H),3.58–3.52(m,2H),3.42–3.32(m,2H),2.35–2.16(m,6H),1.66–1.51(m,2H),1.36(五重峰,J＝8.7Hz,1H),0.99–0.87(m,2H)。
实施例17：化合物110的制备
向109(0.96g，2.59mmol)的DCM(50mL)溶液中加入氯甲酸对硝基苯酯(680mg，3.37mmol)和Et3N(1.08mL，784mg，7.75mmol)。将混合物搅拌16h并浓缩。将残余物用柱色谱法(20％→70％EtOAc的庚烷溶液(柱1)和20％→100％EtOAc的庚烷溶液(柱2))纯化两次。得到为浅黄色稠油状物的产物(0.91g，1.70mmol，66％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.31–8.26(m,2H),7.42–7.37(m,2H),5.19(bs,1H),4.47–4.43(m,2H),4.15(d,J＝8.0Hz,2H),3.84–3.80(m,2H),3.74–3.61(m,8H),3.59–3.53(m,2H),3.42–3.32(m,2H),2.35–2.16(m,6H),1.66–1.50(m,2H),1.40–1.30(m,1H),1.00–0.85(m,2H)。
实施例18：接头-缀合物77的制备
向Val-Cit-PABC-Ahx-May.TFA(23.4mg；18.2μmol)的DMF(0.50mL)溶液中加入三乙胺(6.5μL；4.7mg；47μmol)和110(12.5mg，23.4μmol)的DMF(373μL)溶液。将混合物静置42h，并加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(13.7μL，14mg，94μmol)。4h后，通过RP HPLC(C18，30％→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化反应混合物。所得产物另外通过二氧化硅柱色谱法(DCM→MeOH/DCM)纯化。得到为无色膜状物的所需产物(19.5mg，12.5μmol，68％)。C77H110ClN10O21S+(M-H2O+H+)的LCMS(ESI+)计算值为1545.75，实测值为1546.82。
实施例19：接头-缀合物78的制备
向Val-Cit-PABC-Ahx-May.TFA(20mg；15.6μmol)的DMF(0.50mL)溶液中加入三乙胺(6.5μL；4.7mg；47μmol)以及化合物99(通过如在PCT/NL2015/050697(WO 2016/053107)的实施例50中公开并根据其制备的化合物58的活化制备；24mg，46μmol)的DMF(293μL)溶液。将混合物静置21h，加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(14μL，14mg，96μmol)。2h后，加入额外的2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(7μL，7.1mg，48μmol)。1h后，将反应混合物通过RPHPLC(C18，30％→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化。另外，通过二氧化硅柱色谱法(DCM→MeOH/DCM 1/4)纯化获得的产物。得到为无色膜状物的所需产物(16mg，10μmol，64％)。C73H103ClN11O21S+(M-H2O+H+)的LCMS(ESI+)计算值为1536.67，实测值为1536.75。
Figure BDA0001818785290001161
实施例20-1：70的制备
在氮气气氛下，向BCN-OH(2.0g，13.31mmol)的DCM(200mL)溶液中加入氯磺酰基异氰酸酯(1.16mL，13.31mmol)并将所得溶液在室温下搅拌30min。然后，滴加Et3N(3.7mL，26.62mmol)，然后滴加2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.47mL，14.64mmol)。15min后，加入饱和NH4Cl水溶液(200mL)并分离各层。将水相用DCM(2×150mL)萃取，将合并的有机层用硫酸钠干燥、过滤并真空浓缩。快速色谱法(0-10％MeOH的DCM溶液)得到产物(2.87g，7.96mmol，60％)。1H-NMR(400MHz,CD3OD):δ4.30(d,J＝8.4Hz,2H),3.72-3.67(m,2H),3.61(t,J＝5.2Hz,2H),3.59-3.55(m,2H),3.25(t J＝5.2Hz,2H),2.38-2.20(m,6H),1.74-1.58(m,2H),1.45(五重峰,J＝8.8Hz,1H),1.07-0.95(m,2H)。
实施例20-2：72的制备
向70(47mg，0.13mmol)的DCM(10mL)搅拌溶液中加入CSI(11μL，18mg，0.13mmol)。30min后，加入Et3N(91μL，66mg，0.65mmol)和二乙醇胺(16mg，0.16mmol)的DMF(0.5mL)溶液(得到中间体71)。30min后，加入对硝基苯基氯甲酸酯(52mg，0.26mmol)和Et3N(54μL，39mg，0.39mmol)。再过4.5h后，浓缩反应混合物，并通过梯度柱色谱法(33→66％EtOAc/庚烷(1％AcOH))纯化残余物，得到为无色油状物的72(88mg，0.098mmol，75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.28–8.23(m,4H),7.42–7.35(m,4H),4.52(t,J＝5.4Hz,4H),4.30(d,J＝8.3Hz,2H),4.27–4.22(m,2H),3.86(t,J＝5.3Hz,4H),3.69–3.65(m,2H),3.64–3.59(m,2H),3.30–3.22(m,2H),2.34–2.14(m,6H),1.62–1.46(m,2H),1.38(quintet,J＝8.7Hz,1H),1.04–0.92(m,2H)。
实施例21：接头-缀合物73的制备
将72(3.9mg，4.3μmol)和Et3N(3.0μL，2.2mg，21.5μmol)的DMF(1mL)溶液加入到Val-Cit-PABC-Ahx-May.TFA(10mg，8.6μmol)的DMF(100μL)溶液中。使混合物反应过夜并随后浓缩。通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)/的H2O溶液(1％AcOH))纯化残余物，得到产物73(3.9mg，1.32μmol，31％)。C136H196Cl2N22O43S2(M+2H+)/2的LRMS(ESI+)m/z计算值为1480.13；实测值为1480.35。C85H119ClN14O31S2(M+2H+)/2的LRMS(ESI+)m/z计算值为965.36；实测值为965.54。作为副产物，分离出73的单-Ahx-May取代的衍生物(未示出)。C85H119ClN14O31S2 2+m/z的LRMS(ESI+)计算值为965.36；实测值为965.54。
Figure BDA0001818785290001181
实施例22：75的制备
向NH2-Val-Ala-OH(16mg，0.085mmol)的DMF(0.5mL)悬浮液中加入99(22mg，0.042mmol)的DMF(0.5mL)溶液和Et3N(21mg，29μL，0.21mmol)。将所得反应混合物搅拌26h并倒入DCM(10mL)和磷酸钾缓冲液(pH 3.0，10mL)的混合物中。分离后，用DCM(20mL)萃取水相。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。通过柱色谱法(50％EtOAc的庚烷溶液→EtOAc(1％AcOH的洗脱液))纯化残余物。得到为无色膜状物的产物(18mg，31μmol，75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.02(d,J＝7.1Hz,1H),6.29(bs,1H),5.92(d,J＝9.0Hz,1H),4.56(五重峰,J＝7.1Hz,1H),4.42–4.35(m,1H),4.28(d,J＝8.2Hz,2H),4.10–4.01(m,2H),3.72–3.55(m,4H),3.35–3.25(m,2H),2.35–2.10(m,6H),1.63–1.48(m,2H),1.45(d,J＝7.2Hz,3H),1.39(五重峰,J＝8.9Hz,1H),1.02–0.94(m,2H),0.97(d,J＝6.8Hz,3H),0.92(d,J＝6.8Hz,3H)。
实施例23：接头-缀合物76的制备
向含有2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(2.6mg，11μmol)的小瓶中加入75(6.1mg，11μmol)在MeOH和DCM(5/95，1.0mL)的混合物中的溶液。将所得混合物放置30min。向反应混合物中加入在MeOH和DCM(5/95，0.5mL)的混合物中的NH2-PBD(5.0mg，6.9μmol)。将所得混合物静置74h并浓缩。通过硅胶色谱法(DCM→MeOH/DCM 1/9)纯化残余物。得到为无色膜状物的产物(2.6mg，2.03μmol)。C66H76N9O16S+(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值为1282.51，实测值为1282.70。
抗体-药物-缀合物制备：实施例24-32
实施例24：13b与30的缀合以获得缀合物96(VII)
通过将作为接头-缀合物的化合物30与作为生物分子的经修饰的生物分子13b缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗(叠氮化物)2(13b)(15.5mL，255mg，16.47mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入DMA(1.45mL)和化合物30(255μL，40mM的DMA溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的HiLoad 26/600 Superdex200 PG柱(GE Healthcare)上纯化。还原样品的质谱分析示出一种主要重链产物(观察到的质量为50938Da，总重链片段的约80％)，对应于缀合的重链。
实施例25：13b与33的缀合以获得缀合物95(VIII)
通过将作为接头-缀合物的化合物33与作为生物分子的经修饰的生物分子13b缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗(叠氮化物)2(13b)(607μL，10mg，16.47mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入MilliQ(50μL)和化合物33(10μL，40mM的DMA溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的Superdex20010/300GL(GE Healthcare)上纯化。还原样品的质谱分析示出一种主要重链产物(观察到的质量为50982Da，总重链片段的约80％)，对应于缀合的重链。
实施例26：13c与30的缀合以获得缀合物98(X)
通过将作为接头-缀合物的化合物30与作为生物分子的经修饰的生物分子13c缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗(叠氮化物)2(13c)(14.25mL，250mg，17.55mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入DMA(1.4mL)和化合物30(250μL，40mM的DMA溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的HiLoad 26/600Superdex200 PG柱(GE Healthcare)上纯化。还原样品的质谱分析示出一种主要重链产物(观察到的质量为50969Da，总重链片段的约70％)，对应于缀合的重链。
实施例27：13c与33的缀合以获得缀合物97(IX)
通过将作为接头-缀合物的化合物33与作为生物分子的经修饰的生物分子13c缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗(叠氮化物)2(13c)(14.25mL，250mg，17.55mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入化合物33(188μL，40mM的DMA溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的HiLoad 26/600 Superdex200PG柱(GE Healthcare)上纯化。还原样品的质谱分析示出一种主要重链产物(观察到的质量为51020Da，总重链片段的约90％)，对应于缀合的重链。
实施例28：13d与78的缀合以获得缀合物82(I)
通过将作为接头-缀合物的化合物78与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(8.18mL，270mg，33.0mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(7.12mL)、DMF(2.48mL)和化合物78(225μL，40mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的HiLoad 26/600 Superdex200 PG柱(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为25921Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为1.90。
实施例29：13d与80的缀合以获得缀合物83(II)
通过将作为接头-缀合物的化合物80与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(8.18mL，270mg，33.0mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(7.12mL)、DMF(2.49mL)和化合物80(210μL，40mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育约40h，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的HiLoad 26/600 Superdex200 PG柱(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为26010Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为1.93。
实施例30：13d与77的缀合以获得缀合物81(III)
通过将作为接头-缀合物的化合物77与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(8.18mL，270mg，33.0mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(5.328mL)、DMF(4.28mL)和化合物77(225μL，40mM的DMF溶液)。在室温下温育过夜后，RP-HPLC分析表明反应不完全。将另外的化合物77(45μL，40mM的DMF溶液)加入到反应混合物中，然后在室温下温育过夜。将反应物用PBS pH 7.4(0.5L)透析，并在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的HiLoad26/600Superdex200 PG柱(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为25931Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为1.91。
实施例31：13d与73的缀合以获得缀合物84(V)
通过将作为接头-缀合物的化合物73与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(4.09mL，135mg，33.0mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(2.66mL)、DMF(2.14mL)和化合物73(113μL，40mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后用PBS pH 7.4(0.5L)透析，并在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的HiLoad 26/600 Superdex200 PG(GEHealthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为227331Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.78。
实施例32：13d与76的缀合以获得缀合物85(VI)
通过将作为接头-缀合物的76与作为生物分子的经修饰的生物分子13d缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(320μL，7.2mg，22.5mg/mL在PBSpH 7.4中的溶液)的溶液中加入76(44.5μL，10mM的DMF溶液)和DMF(66μL)。将反应物在室温下温育过夜两次，然后用PBS(1mL)稀释并用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜旋转过滤器(Millipore)浓缩。接下来，在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的HiLoad 26/600Superdex200 PG柱(GEHealthcare)上纯化缀合物。fabricatorTM处理后样品的质谱分析示出一种主要Fc/2产物(观察到的质量为25649Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合物85。
实施例33-39：功效、耐受性和稳定性研究
实施例33a：HER2功效研究[T226PDX-模型]
将雌性SHO小鼠(Crl：SHO-Prkdcscid Hrhr，在实验阶段开始时为6至9周龄，获自Charles River实验室(法国)，重15-25克)在皮下组织中移植20mm3肿瘤(T226)片段。在移植过程中包括重量至少为17g的健康小鼠。根据肿瘤体积将小鼠分配到不同组，以在每个治疗分组中给出均匀的平均和中值肿瘤体积。将具有固定的生长肿瘤且肿瘤体积为60至200mm3的5只小鼠的组静脉内注射载体，Kadcyla(1.3mg/kg(mpk))，ADC 81、82、83和84(以9mg/kg)。每周两次测量肿瘤，持续60天。肿瘤体积的结果示于图8A中(示出中值数据)。
实施例33b：HER2功效研究[HBCx-13b PDX-模型]
将雌性SHO小鼠(Crl：SHO-Prkdcscid Hrhr，在实验阶段开始时为6至9周龄，获自Charles River实验室(法国)，重15-25克)在皮下组织中移植20mm3肿瘤(HBCx-13b)片段。当肿瘤体积在62至256mm3范围内时，根据肿瘤体积分配小鼠，以在每个治疗分组中给出均匀的平均和中值肿瘤体积。将五只小鼠的组静脉内注射两次(在第0天和第8天)载体，ADC95、96、97或98(6mg/kg)的药剂。肿瘤体积的结果示于图8C中(示出中值数据)。
实施例33c：HER2功效研究[HBCx-15PDX-模型]
将雌性SHO小鼠(Crl：SHO-Prkdcscid Hrhr，在实验阶段开始时为6至9周龄，获自Charles River实验室(法国)，重15-25克)在皮下组织中移植20mm3肿瘤(HBCx-15)片段。当肿瘤体积在62至256mm3范围内时，根据肿瘤体积分配小鼠，以在每个治疗分组中给出均匀的平均和中值肿瘤体积。将五只小鼠的组静脉内注射单一剂量的载体、Kadcyla(以9mg/kg)或85(以0.5mg/kg)。肿瘤体积的结果示于图8B中(示出平均值数据)。
实施例33d：HER2功效研究[T226PDX-模型]
将雌性SHO小鼠(Crl：SHO-Prkdcscid Hrhr，在实验阶段开始时为6至9周龄，获自Charles River实验室(法国)，重15-25克)在皮下组织中移植20mm3肿瘤(T226)片段。在移植过程中包括重量至少为17g的健康小鼠。根据肿瘤体积将小鼠分配到不同组，以在每个治疗分组中给出均匀的平均和中值肿瘤体积。将具有固定的生长肿瘤且肿瘤体积为60至200mm3的5只小鼠的组静脉内注射载体、Kadcyla(以3和9mg/kg(mpk))或84(以3和9mg/kg)。每周两次测量肿瘤，持续60天。肿瘤体积的结果示于图8D中(示出平均值数据)。
实施例34a：HER2耐受性研究
将Sprague Dawley大鼠(每组3只雄性和3只雌性，OFA：SD，在实验阶段开始时为6周龄，获自Charles River实验室，Saint-Germain-Nuelles，法国)用97((1)以20mg/kg和(2)40mg/kg)或98((1)以20mg/kg和(2)40mg/kg)，使用引入尾静脉的微量输注装置(2mL/kg，以1mL/min)静脉内(推注)注射进行治疗。一组动物(对照)用载体处理。给药后，将所有动物维持5天的观察期。在第5天处死存活的动物。每只动物在随机化/选择时、在给药前(第0天)以及第2天和第4天时进行称重。所有动物(包括任何已发现死亡或处死的濒死者)都接受完整的尸检程序。对所有动物进行肝、脾和坐骨神经的组织病理学检查。收集血液样品(包括处死的濒死者动物的血液样品)，并测定血液学以及血清临床化学参数。结果表明，动物能够同样耐受本发明的缀合物(97)和具有现有技术接头的缀合物(98)。未观察到血小板计数和体重的显著差异，而Kadcyla处理的大鼠的这两个参数迅速下降。
实施例34b：HER2耐受性研究
将Sprague Dawley大鼠(每组32只雌性，在实验阶段开始时为6周龄，获自CharlesRiver实验室，USA)用ADC 84(以20mg/kg(mpk)、35mpk、50mpk和60mpk)或ADC 81、82和83(以40mg/kg(mpk))、70mpk、100mpk和120mpk)，使用引入尾静脉的微量输注装置(2mL/kg，以1mL/min)静脉内(推注)注射进行治疗。一组动物(对照)用载体处理，另一组用Kadcyla(以20mg/kg(mpk)、35mpk、50mpk和60mpk)处理。给药后，将所有动物维持12天的观察期。在第12天处死存活的动物。每只动物在随机化/选择时、在给药前(第0天)和处理后的所有日期进行称重。所有动物(包括任何已发现死亡或处死的濒死者)都接受完整的尸检程序。对所有动物进行肝、脾和坐骨神经的宏观组织病理学检查。收集血液样品(包括处死的濒死者动物的血液样品)，并测定两种血液学参数。每个ADC的不同剂量方案的大鼠体重减轻百分比的结果如图7所示。从这些结果清楚地看出，发现对于Kadcyla，基于体重的MTD介于50mpk和60mpk之间，而对于ADC 84(DAR4)，基于体重的MTD>60mpk。对于ADC 81、82和83(所有DAR2)，发现基于体重的MTD>120mpk，对于任一个在最高剂量水平下的这些ADC没有观察到显著的体重损失。
实施例35-37：接头-缀合物44的制备
Figure BDA0001818785290001241
实施例35：化合物42的合成
在氮气下，向DIBO(0.220g，1.00mmol，1.00当量)的DCM(15.0mL)溶液中滴加氯代磺酰基异氰化物(CSI，88.1μL，1.00mmol，1.00当量)。将所得反应混合物在室温下搅拌20min，然后滴加Et3N(282μL，2.00mmol，2.00当量)。将反应混合物搅拌5min，然后加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(2-AEE，112μL，1.10mmol，1.10当量)。在室温下搅拌20min后，通过加入饱和NH4Cl水溶液(pH 4.0，30.0mL)使反应停止。将所得混合物用DCM(25mL，2x)和EtOAc(20mL，2x)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)，然后真空浓缩。通过快速柱色谱法(0-7％MeOH/DCM)纯化残余物，得到为浅黄色油状物的化合物42(422mg，98％)。1H NMR(CDCl3):7.60-7.57(m,1H),7.47-7.40(m,2H),7.40-7.27(m,5H),5.55-5.51(m,1H),3.60-3.53(m,4H),3.48-3.42(m,2H),3.35-3.28(m,6H),3.28-3.22(m,2H),2.93-2.82(m,1H)。C21H22N2NaO6S+(M+Na+)的LCMS(ESI+)计算值为453.11，实测值为452.98。
实施例36：化合物43的合成
在氮气下，向化合物42(0.192g，0.446mmol，1.00当量)的DCM(30.0mL)溶液中滴加氯代磺酰基异氰化物(CSI，38.8μL，0.446mmol，1.00当量)。将所得反应混合物在室温下搅拌20min，然后滴加Et3N(311μL，2.23mmol，5.00当量)。将所得反应混合物在室温下搅拌5min，然后加入二乙醇胺(DEA，51.3μL，0.535mmol，1.20当量)的DMF(1.5mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌60min，然后加入4-硝基苯基氯甲酸酯(0.180g，0.893mmol，2.00当量)和另外的Et3N(187μL，1.34mmol，3.01当量)。将所得反应混合物搅拌18h，然后真空浓缩。通过快速柱色谱法(0-6％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到为白色固体的化合物43(187mg)。1HNMR(CDCl3):8.29-8.18(m,5H),7.41-7.28(m,11H),5.85-5.72(m,1H),5.61-5.55(s,1H),4.59-4.49(t,J＝5.26Hz,1H),4.47-4.36(t,J＝5.35Hz,4H),4.18-4.08(m,2H),3.78-3.67(t,J＝5.33Hz,4H),3.65-3.49(m,4H),3.35-3.25(m,2H),3.26-3.15(m,1H),3.01-2.93(m,1H)。C40H38N6NaO19S2 +(M+Na+)的LCMS(ESI+)计算值为993.15，实测值为992.97。
实施例37：接头-缀合物44的制备
向化合物43(11.4mg，11.7μmol，1.00当量)的DCM(0.400mL)溶液中加入Et3N(6.00μL，58.7μmol，5.00当量)，然后加入Val-Cit-PAB-Maytansin·TFA(vc-PABC-May.TFA，30.0mg，23.4μmol，2.00当量)的DMF(450μL)溶液。将所得反应混合物在室温下放置96h。用2,2-(亚乙二氧基)双(乙胺)(15.0μL，99.7μmol，8.52当量)停止反应，并在室温下放置2h。然后通过HPLC纯化混合物。真空浓缩收集的级分，得到为浅粉色固体的化合物44(10.9mg)。C140H190Cl2N22O37S2 2+(M-2H2O-2CO2+2H+)的LCMS(ESI+)计算值为1453.13，实测值为1453.23。
实施例38-41：接头-缀合物48的制备
Figure BDA0001818785290001261
实施例38：化合物45的合成
将二噁烷(30mL)和饱和NaHCO3水溶液(60mL)混合，并将所得悬浮液用玻璃过滤器过滤。向该溶液中加入5-氨基-1-戊醇(2.03g，19.7mmol，1.00当量)，然后加入Fmoc-Cl(5.16g，19.9mmol，1.01当量)的二噁烷(30mL)溶液。使反应在室温下搅拌2.5h，然后用1MHCl水溶液(300mL)停止反应。将混合物用EtOAc(600mL)萃取，并将有机层用1M HCl(250mL)水溶液、饱和NaHCO3水溶液(150mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过快速柱色谱法(0-2％MeOH的CHCl3溶液)纯化残余物，得到为白色固体的化合物45(5.39g，84％)。1H NMR(CDCl3):7.77(d,J＝7.47Hz,2H),7.59(d,J＝7.53Hz,2H),7..46-7.37(m,2H),7.37-7.28(m,2H),4.86-4.74(bs,1H),4.51-4.36(m,2H),4.21(t,J＝6.91Hz,1H),3.65(q,J＝5.29Hz,2H),3.26-3.03(m,2H),1..61-1.48(m,4H),1.48-1.26(m,3H)。
实施例39：化合物46的合成
在氮气下，向化合物45(0.397g，1.22mmol，1.00当量)的DCM(55.0mL)溶液中滴加氯代磺酰基异氰化物(CSI，106μL，1.22mmol，1.00当量)，将所得反应混合物在室温下搅拌20min。滴加Et3N(0.850mL，6.10mmol，5.00当量)并将混合物在室温下搅拌10min，然后加入二乙醇胺(DEA，0.144g，1.37mmol，1.12当量)的DMF(1.7mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后加入4-硝基苯基氯甲酸酯(0.492g，2.44mmol，2.00当量)和另外的Et3N(0.340mL，2.44mmol，2.00当量)。将所得反应混合物搅拌18h，然后真空浓缩。将残余物用DCM(100mL)稀释并加入饱和NH4Cl水溶液(pH＝3.3，50mL)。分离所得的双相系统，用DCM(50mL)萃取水层。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，然后真空浓缩。通过快速柱色谱法(0-5％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，然后通过快速柱色谱法(65％EtOAc的庚烷溶液)进行第二次纯化，得到为白色粉末的化合物46(342mg)。1H NMR(CDCl3):8.54-8.32(bs,1H),8.27-8.21(m,4H),7.76(d,J＝7.38Hz,2H),7.59(d,J＝7.53Hz,2H),7.42-7.33(m,6H),7.33-7.27(m,2H),4.86(t,J＝5.72Hz,1H),4.51(t,J＝5.45Hz,4H),4.43(d,J＝6.81,2H),4.21(t,J＝6.58,1H),4.17-4.09(m,2H),3.84(t,J＝5.46Hz,4H),3.19(q,J＝7.50Hz,2H),1.72-1.63(m,2H),1.63-1.48(m,2H),1.48-1.36(m,2H)。
实施例40：化合物47的合成
向含有化合物46(10.0mg，11.5μmol，1.00当量)的小瓶中加入Et3N(8.00μL，57.7μmol，5.00当量)溶液和Val-Cit-PABC-Maytansin·TFA(vc-PABC-May.TFA，30.0mg，23.4μmol，2.02当量)的DMF(450μL)溶液。将所得反应混合物在室温下放置72h。用2,2-(亚乙二氧基)-双(乙胺)(15.0μL，99.7μmol，8.67当量)停止反应，并放置1.5h。接着，加入哌啶(10.0μL，101μmol，8.76当量)，将混合物在室温下放置1h，然后通过HPLC纯化。真空浓缩收集的级分，得到为浅黄色油状物的化合物47(10.0mg)。C129H186Cl2N22O37S2 2+(M-2H2O-2CO2+2H+)的LCMS(ESI+)计算值为1289.62，实测值为1290.15。
实施例41：接头-缀合物48的制备
向化合物47(1.00mg，0.370μmol，1.00当量)的DMF(50.0μL)溶液中加入10％v/vEt3N的DMF溶液(3.6μL，2.58μmol，6.98当量)，然后加入OSu活化的单氟取代的环辛炔(MFCO-Apa-OSu(获自Berry&Associates，Dexter，USA)，0.140mg，0.368μmol，0.99当量)的DMF(5μL)溶液。将所得混合物在室温下放置6h，然后通过HPLC纯化。真空浓缩收集的级分，得到为白色固体的化合物48(0.95mg)。C141H205Cl2FN22O40S2+(M+2H+)的UPLC-MS(ESI+)计算值为1484.19，实测值为1484.3。
实施例42-44：连接物-缀合物51的制备
Figure BDA0001818785290001281
实施例42：化合物49的合成
向4-戊炔-1-醇(0.931mL，10.0mmol，1.00当量)的DCM(150mL)溶液中滴加氯磺酰基异氰化物(CSI，0.870mL，10.0mmol，1.00当量)。将所得反应混合物在室温下搅拌15min，然后缓慢加入Et3N(2.80mL，20.0mmol，2.00当量)。将反应混合物搅拌6min，然后加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(2-AEE，1.11mL，11.0mmol，1.10当量)。在室温下搅拌13min后，通过加入饱和NH4Cl水溶液(pH 3.75，150mL)使反应停止。将所得混合物用DCM(150mL，2x)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)，然后真空浓缩。通过快速柱色谱法(1-10％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到为黄色油状物的化合物49(392mg)。1H NMR(CDCl3):6.10-5.90(bs,1H),4.37-4.25(t,J＝6.21Hz,2H),3.81-3.73(m,2H),3.63(t,J＝4.52Hz,2H),3.61-3.56(m,2H),3.43-3.27(m,2H),2.38-2.25(m,2H),2.00(t,J＝2.70,Hz,1H),1.90(p,J＝6.45Hz,2H)。
实施例43：化合物50的合成
在氮气下，向化合物49(0.258g，0.877mmol，1.00当量)的DCM(60.0mL)溶液中滴加氯磺酰基异氰化物(CSI，76.0μL，0.877mmol，1.00当量)，将所得反应混合物在室温下搅拌15min。滴加Et3N(0.611mL，4.39mmol，5.00当量)并将混合物在室温下搅拌5min，然后加入二乙醇胺(DEA，100μL，1.04mmol，1.19当量)的DMF(5mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌35min，然后加入4-硝基苯基氯甲酸酯(0.356g，1.77mmol，2.00当量)和另外的Et3N(0.367mL，2.63mmol，3.00当量)。将所得反应混合物搅拌18h，然后真空浓缩。将残余物用DCM(50mL)稀释并加入饱和NH4Cl水溶液(20mL)。分离所得的双相系统，用DCM(50mL，2x)和EtOAc(50mL，2x)萃取水层。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，然后真空浓缩。通过快速柱色谱法(0-6％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到为黄色油状物的化合物50(265mg，～67％纯度)，其含有约30％DMF，其不经进一步纯化而使用。1H NMR(CDCl3):8.30-8.21(m,4H),7.42-7.34(m,4H),5.92-5.80(m,1H),4.57-4.45(m,4H),4.31-4.27(m,2H),4.27-4.23(m,2H),3.85(m,J＝5.42Hz,4H),3.76-3.70(m,1H),3.70-3.64(m,2H),3.64-3.58(m,3H),3.35-3.21(m,2H),2.33-2.23(m,2H),2.02-1.96(m,1H),1.92-1.83(m,2H)。
实施例44：接头-缀合物51的制备
向化合物50(15.1mg，11.6μmol，1.00当量)的DCM(0.400mL)溶液中加入Et3N(8.15μL，58.4μmol，5.04当量)，然后加入Val-Cit-PABC-Maytansine·TFA(vc-PABC-May.TFA，30.0mg，23.4μmol，2.02当量)的DMF(450μL)溶液。将所得反应混合物在室温下放置48h。用2,2-(亚乙二氧基)双(乙胺)(15.0μL，99.7μmol，8.60当量)停止反应，并在室温下放置2h，然后真空浓缩。将残余物溶于总共900μL的DMF中，然后通过HPLC纯化。真空浓缩收集的级分，得到为粉红色/红色固体的化合物51(13.1mg)。C129H186Cl2N22O37S2 2+(M-2H2O-2CO2+2H+)的LCMS(ESI+)计算值为1385.11，实测值为1385.33。
实施例45-49：接头-缀合物59的制备
Figure BDA0001818785290001301
实施例45：55的合成
向99(1.44g，2.74mmol)的DCM溶液(120mL)中加入二氨基乙醇(0.35g，3.29mmol)的DMF(8mL)溶液和Et3N(0.83g，1.15mL，8.22mmol)。将所得混合物搅拌18h并加入饱和NH4Cl水溶液。分离后，水相用二氯甲烷(3×120mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。通过硅胶色谱法(0→15％MeOH的DCM溶液)纯化残余物。合并含有所需产物的级分并浓缩。将残余物溶于EtOAc(100mL)中并浓缩。得到为无色膜状物的所需产物(0.856g，1.74mmol，64％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 6.28(bs,1H),4.33–4.30(m,2H,4.28(d,2H,J＝8.2Hz),3.89–3.81(m,4H),3.70–3.64(m,2H),3.63–3.58(m,2H),3.52(t,4H,J＝5.0Hz),3.32(t,2H,J＝4.8Hz),2.36–2.18(m,6H),1.64–1.50(m,2H),1.39(quintet,1H,J＝8.6Hz),1.05–0.94(m,2H)。
实施例46：56的合成
向55(635mg，1.29mmol)的DCM(40mL)溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(520mg，2.58mmol)和Et3N(0.65g，0.90mL)。将所得混合物搅拌20h并浓缩。通过硅胶色谱(第1柱：50％→100％EtOAc的庚烷溶液；第二柱：50％→100％EtOAc(1％AcOH))纯化残余物。合并含有所需产物的级分并浓缩。将残余物溶于DCM(2mL)中，加入庚烷(8mL)并浓缩混合物。得到为白色固体的所需产物(306mg，0.37mmol，29％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.31–8.25(m,4H),7.44–7.37(m,4H),5.74–5.68(m,1H),4.53–4.45(m,4H),4.36–4.31(m,2H),4.26(m,2H,J＝8.2Hz),3.80–3.71(m,4H),3.70–3.65(m,2H),3.62–3.57(m,2H),3.28(q,2H,J＝4.8Hz),2.35–2.15(m,6H),1.60–1.50(m,2H),1.36(五重峰,1H,J＝8.7Hz),1.04–0.94(m,2H)。
实施例47：57的合成
向55(80mg，0.163mmol)的DCM(10mL)溶液中加入氯磺酰异氰酸酯(CSI，46mg，18μL，0.33mmol)、Et3N(82.8mg，114μL，0.815mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(43mg，41μL，0.41mmol)。搅拌2h后，加入水(10mL)并分离各层。向水相中加入EtOAc后，通过小心加入HCl水溶液(1N)将水相的pH调节至4.0。分离各层，用EtOAc(20mL)萃取水相。萃取期间水层的pH为4。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。通过硅胶色谱法(0→20％MeOH的DCM溶液)纯化产物。合并含有所需产物的级分并浓缩。将残余物溶于EtOAc(6mL)中，并浓缩混合物(2x)。得到为无色稠油状物的所需产物(53mg，0.058mmol，36％)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δppm4.36–4.22(m,8H),3.75–3.50(m,20H),3.25–3.20(m,6H),2.34–2.14(m,6H),1.70–1.55(m,2H),1.44(五重峰,1H,J＝8.7Hz),1.04–0.94(m,2H)。
实施例48：58的合成
向57(49mg，54μmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入DCM(5mL)、4-硝基苯基氯甲酸酯(22mg，107μmol)和Et3N(27mg，38μL，270μmol)。将混合物搅拌2天，浓缩，并通过硅胶色谱法(0→10％MeOH的DCM溶液2×)纯化残余物。得到为无色膜状物的所需产物(4.5mg，3.6μmol，14％)。另外，从第一次硅胶柱纯化，合并含有中间体单-4-硝基苯基碳酸酯官能化产物的级分并浓缩。将所得单官能化产物(27mg，25μmol)重新溶解在DCM(2mL)中，并加入4-硝基苯基氯甲酸酯(5.1mg，25μmol)和Et3N(7.6mg，10μL，75μmol)。将所得混合物搅拌19h，加入更多的4-硝基苯基氯甲酸酯(6.5mg，32μmol)。将混合物再搅拌4.5h并浓缩。通过二氧化硅柱色谱法纯化残余物，得到另外的为无色膜状物的所需产物(11mg，8.9μmol，35％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.31–8.25(m,4H),7.44–7.39(m,4H),6.18(bs,1H),6.05–5.96(m,1H),5.94–5.84(m,1H),4.47–4.43(m,4H),4.37–4.24(m,8H),3.80–3.76(m,4H),3.72–3.52(m,12H),3.37–3.29(m,6H),2.36–2.16(m,6H),1.65–1.45(m,2H),1.38(五重峰,1H,J＝8.6Hz),1.03–0.93(m,2H)。
实施例49：接头-缀合物59的制备
向58(15.5mg，12.5μmol)的DMF(400μL)溶液中加入Et3N(6.3mg，8.7μL)和vc-PABC-May.TFA(32mg，25μmol)的DMF(480μL)溶液。将所得混合物静置2天，然后加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(14.6μL，15mg，100μmol)停止反应。2h后，通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)的H2O溶液(1％AcOH))纯化反应混合物，得到为白色固体的所需产物(18.1mg，5.5μmol，44％)。
C144H212Cl2N25O45S3 3+((M-2CO2-2H2O)+3H+)/3的LCMS(ESI+)计算值为1059.12，实测值为1059.71。
实施例50-51：接头-缀合物54的制备
Figure BDA0001818785290001321
实施例50-1：53a的合成
向110(0.15g；0.28mmol)的DCM(20mL)溶液中加入二乙醇胺(47mg；0.45mmol)的DMF(1mL)溶液和Et3N(117μL；85mg；0.84mmol)。将所得混合物在室温下搅拌16h，用饱和NH4Cl水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过快速柱色谱法(DCM→MeOH/DCM 1/9)纯化残余物。得到为无色油状物的产物(95mg；0.19mmol；68％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.63(bs,1H),4.32–4.27(m,2H),4.14(d,2H,J＝8.0Hz),3.89–3.77(m,4H),3.73–3.68(m,2H),3.67–3.60(m,8H),3.58–3.53(m,2H),3.52–3.44(m,4H),3.40–3.32(m,2H),2.35–2.15(m,6H),1.65–1.50(m,2H),1.42–1.30(m,1H),0.99–0.88(m,2H)。
实施例50-2：53b的合成
向53a(93mg，0.19mmol)的DCM(20mL)溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(94mg，0.47mmol)和三乙胺(132μL；96mg；0.95mmol)。将所得反应混合物搅拌17h，用水(10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过快速柱色谱法(DCM→MeOH/DCM 1/9)纯化残余物。得到为浅色油状物的所需产物(45mg；0.054mmol；28％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.30–8.23(m,4H),7.42–7.33(m,4H),5.32–5.23(m,1H),4.44(t,4H,J＝5.4Hz),4.32–4.26(m,2H),4.14(d,2H,J＝8.0Hz),3.78–3.67(m,6H),3.67–3.57(m,8H),3.54(t,2H,J＝5.1Hz),3.40–3.30(m,2H),2.33–2.13(m,6H),1.64–1.46(m,2H),1.41–1.27(m,1H),0.99–0.86(m,2H)。
实施例51：接头缀合物54的制备
向vc-PABC-Ahx-May(5.3mg，4.1μmol)的DMF(499μL)溶液中加入Et3N(1.4μL，1.0mg，10.3μmol)和53b(1.7mg，2.0μmol)的DMF(128μL)溶液。将所得混合物加热至35℃，放置20min，加热至45℃并放置21h。加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(6.0μL，6.1mg，41μmol)，1h后，通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH))纯化混合物。得到为白色固体的所需产物(3.0mg，1.04μmol，52％)。C140H202Cl2N20O41 2+(M+2H+)/2的LCMS(ESI+)计算值为1444.69，实测值为1446.78。
实施例52：接头-缀合物60的制备
Figure BDA0001818785290001331
将56的溶液(17μL，53mg/mL的DMF溶液，1.11μmol)、vc-PABC-Ahx-May.TFA的溶液(286μL，10mg/mL的DMF溶液，2.22μmol，2当量)和Et3N的溶液(7.7μL，10％的DMF溶液，5.5μmol，5当量)一起加入，混合并在室温下不搅拌静置23h。将反应混合物用2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(1.3μL，8.9μmol，8当量)淬火，并静置1h。通过制备型HPLC(30至90％MeCN的水溶液，1％AcOH，50个级分，产物存在于级分34和35中)纯化粗产物。产量：1.8mg(57％)。精确质量＝2878.28。LC-MS(C18Waters，25min)：Rt＝14.07min；实测值m/z＝935、920、701、485。
实施例53-54：接头-缀合物62的制备
Figure BDA0001818785290001341
实施例53：化合物61的合成
将56的溶液(1250μL，80mM的DMF溶液，100μmol)、vc-PAB-OH的溶液(80mg，210μmol，2.1当量，在2mL DMF中)和Et3N(84μL，600μmol，6当量)一起加入并在室温下搅拌40h。加入双-(对硝基苯基)碳酸酯((PNP)2CO，183mg，600μmol，6当量)和Et3N(84μL，600μmol，6当量)，并将混合物在室温下搅拌16h。然后通过二氧化硅柱色谱法(12g二氧化硅，45个级分，20mL/级分，20mL/min，0至15％MeOH的DCM溶液，产物存在于级分26-32中，Rf(DCM/MeOH，9/1)＝0.14)纯化混合物。产量：96.6mg(无色油状物，59％)。精确质量＝1631.61。LC-MS(C18Waters,25min):Rt＝14.72min；实测值m/z＝985、906、756、633、611、559、579。
实施例54：接头-缀合物62的制备
将61(116μL，20mM的DMF溶液，2.3μmol)的溶液加入到含有盐酸多柔比星(5.4mg，9.3μmol，4当量)、Et3N(51μL，10％的DMF溶液，37μmol，16当量)和DMF(400μL)的溶液中。将所得溶液混合并在室温下不搅拌静置4h。通过制备型HPLC(30至90％MeCN的水溶液，1％AcOH，50个级分，产物存在于级分26-27中)纯化粗制反应混合物。产量：2.9mg(红色固体，52％)。摩尔重量＝2441.50；精确质量＝2439.90。LC-MS(C18Waters，25min)：Rt＝11.98min；m/z＝1243。
实施例56-58：接头-缀合物63-66的制备
实施例55：接头-缀合物63的制备
Figure BDA0001818785290001351
向vc-PABC-MMAF.TFA(5.5mg，4.4μmol)的DMF(529μL)溶液中加入Et3N(1.1mg，1.5μL，11μmol)和56(1.8mg，2.2μmol)的DMF(34μL)溶液。将所得混合物静置19h。加入另外的Et3N(1.1mg，1.5μL)并将混合物再静置23h，之后加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(2.6μL，2.6mg，18μmol)停止反应。4h后，通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化混合物。得到为无色膜状物的所需产物(3.6mg，1.3μmol，58％)。(C138H226N23O37S3+)/3((M+3H+)/3)的LCMS(ESI+)计算值为939.85，实测值为940.47。
实施例56：接头-缀合物64的制备
Figure BDA0001818785290001352
向vc-PABC-MMAE.TFA(32.3mg，26μmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入Et3N(7.4mg，10μL，72.6μmol)和56(20mg，24.2μmol)的DMF(500μL)溶液。将所得混合物用DMF(200μL)稀释并静置19h。加入DCM(1mL)后，通过二氧化硅柱色谱法(DCM→20％MeOH的DCM溶液(2x))纯化所得混合物，得到两种产物。得到为白色无色膜状物的单官能化产物(15.9mg，8.8μmol，36％)(1臂具有vc-PABC-MMAE且1臂具有PNP，64a)。(C86H130N14O26S2+)/2((M+2H+)/2的LCMS(ESI+)计算值为903.45，实测值为904.15。得到为白色无色膜状物的双官能化产物(64)(8.4mg，3.0μmol，12％)。(C138H220N23O35S3+)/3((M+3H+)/3)的LCMS(ESI+)计算值为930.53，实测值为931.18a。
实施例57：接头-缀合物65的制备
Figure BDA0001818785290001361
将vc-PABC-MMAE.TFA(10mg，8.9μmol)的DMF(0.5mL)溶液和Et3N(2.8mg，3.1μL，28μmol)加入到72(4.0mg，4.5μmol)中。将所得混合物静置20.5h，然后加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(13μL，14mg，92μmol)停止反应。3.5h后，通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化混合物。得到为白色固体的所需产物(8.8mg，3.1μmol，68％)。(C138H221N24O37S2 3+)/3((M+3H+)/3)的LCMS(ESI+)计算值为956.85，实测值为957.71。
实施例58：接头-缀合物66的制备
向vc-PABC-MMAF.TFA(1.4mg，1.11μmol)的溶液中加入10％Et3N的DMF溶液(4.6μL，0.34mg，3.33μmol)和64a(2.0mg，1.11μmol)的DMF(111μL)溶液。将所得混合物静置22h。2.5h后加入10体积％的2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)的DMF溶液(6.5μL，0.66mg，4.5μmol)以停止反应。通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化粗制混合物。得到为白色固体的所需产物(1.8mg，0.64μmol，58％)。(C138H217N23O36S2+)/2((M+2H+)/2)的LCMS(ESI+)计算值为1402.28，实测值为1403.47。
实施例59-60：接头-缀合物68的制备
Figure BDA0001818785290001371
实施例59：化合物67的合成
将盐酸多柔比星(66mg，86μmol)和Et3N(36μL，258μmol，3当量)的DMF(2mL)溶液以及Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP(获自Iris Biotech，Marktredwitz，德国，50mg，86μmol，1当量)的DMF(2mL)溶液一起加入，并在室温下搅拌88h。除了将多柔比星与vc-PAB-PNP偶联外，当反应进行更长的时间时也发生Fmoc去保护。将混合物真空浓缩至400μL的体积，并通过二氧化硅柱色谱法(12g二氧化硅，45个级分，20mL/级分，10mL/min，0至50％MeOH的DCM溶液，产物存在于级分20-23中，Rf(DCM/MeOH，4/1)＝0.04)纯化。将合并的级分20-23真空浓缩(27mg)，并通过制备型HPLC进一步纯化(5至95％MeCN的水溶液，1％AcOH，50个级分，产物存在于级分21-28中)。产量：18.8mg(红色固体，23％)。摩尔重量＝948.98；精确质量＝948.38。LC-MS(C18Waters，25min)：Rt＝9.13min；m/z＝949。
实施例60：接头-缀合物68的制备
向vc-PABC-Dox(1.7mg，1.8μmol)的DMF(44μL)溶液中加入10％Et3N的DMF溶液(4.6μL，0.34mg，3.33μmol)和64a(2.0mg，1.11μmol)的DMF(111μL)溶液。将所得混合物静置23h。加入10体积％2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)的DMF溶液(6.5μL，0.66mg，4.5μmol)以停止反应。2h后，通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化混合物。合并含有产物的级分并浓缩，然后通过硅胶色谱法(0→20％MeOH的DMF溶液)纯化，得到2.6mg(0.99μmol)所需产物，C126H179N19Na2O39S2+的计算值为1330.61，实测值为1331.07。
实施例61-63：接头-缀合物的制备69、111和112的制备
实施例61：接头-缀合物69的制备
向vc-PABC-Ahx-May.TFA(1.4mg，1.11μmol)的DMF(70μL)溶液加入10％Et3N的DMF溶液(4.6μL，0.34mg，3.33μmol)和64a(2.0mg，1.11μmol)的DMF(111μL)溶液。将所得混合物静置2天。加入10体积％2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)的DMF溶液(6.5μL，0.66mg，4.5μmol)以停止反应。2.5h后，通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化混合物。得到为白色固体的所得产物(2.6mg，0.92μmol，83％)。C136H203ClN22Na2O35S2+((M-CO2-H2O)+2Na＝)/2的LCMS(ESI+)的计算值为1408.70，实测值为1409.65。
实施例62：接头-缀合物111的制备
将54(4.7mg，8.9μmol)的DMF(200μL)溶液和Et3N(2.7mg，3.7μL)加入到vc-PABC-MMAE.TFA(10mg，8.9μmol)中。将所得混合物静置23h。然后加入2,2'-(亚乙二氧基)双(乙胺)(13μL，14mg，92μmol)以停止反应。4h后，通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)的水溶液(1％AcOH))纯化混合物。得到为无色膜状物的所需产物(10.7mg，7.1μmol，80％)。C74H117N12O19S+(M+H+)的LCMS(ESI+)的计算值为1509.83，实测值为1510.29。
实施例63：接头-缀合物112的制备
向vc-PABC-MMAE.TFA(13.9mg，11.2μmol)的DMF(400μL)溶液中加入Et3N(3.4μL，2.5mg，24.3μmol)和110(3.0mg，5.6μmol)的DMF(200μL)溶液。用DMF(50μL)稀释反应混合物。25min后，加入另外的Et3N(0.80mg，1.1μL)和110(2.2mg，4.2μmol)的DMF(33μL)溶液。将所得混合物静置17h，然后通过反相(C18)HPLC色谱法(30→90％MeCN(1％AcOH)/水溶液(1％AcOH))纯化混合物。得到为无色膜状物的所需产物(10.9mg，7.2μmol，73％)。C78H124N11O19+(M+H+)的LCMS(ESI+)的计算值为1518.91，实测值为1519.09。
实施例64-78：抗体-药物-缀合物的制备
实施例64：13d与44的缀合以获得缀合物XI
通过将作为接头-缀合物的化合物44与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(4.239mL，120mg，28.31mg/ml在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(1.761mL)、DMF(1.680mL)和化合物44(0.320mL，10mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的HiLoad 26/600 Superdex200 PG(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27398Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.77。
实施例65：13d与48的缀合以获得缀合物XII
通过将作为接头-缀合物的化合物48与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(10μL，330μg，33.0mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入丙二醇(2.5μL)和化合物48(2.5μL，10mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27336Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为1.40。
实施例66：13d与51的缀合以获得缀合物XIII
通过将作为接头-缀合物的化合物51与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(12.25μL，286μg，23.34mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(11.85μL)和化合物51(7.60μL，2mM的DMF溶液)。在单独的管中，向CuSO4的溶液中(35.5μL，在PBS pH 7.4中的15mM溶液)加入三[(1-羟丙基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(THPTA)(6.7μL，160mM的DMF溶液)、盐酸氨基胍(26.6μL，在PBS pH7.4中的100mM溶液)和抗坏血酸钠(20μL，在PBS pH 7.4中的400mM溶液)。将THPTA-CuSO4络合物混合并在室温下温育10min。将等份的THPTA-CuSO4络合物(6.3μL)加入到含有曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)和化合物51的溶液中。将反应物混合并在室温下温育。2h后，通过旋转过滤(Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，Millipore)将缓冲液更换为PBS pH 7.4，以除去THPTA-CuSO4络合物和过量的炔烃。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27261Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.69。
实施例67：13d与59的缀合以获得缀合物XIV
通过将作为接头-缀合物的化合物59与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(4.769mL，135mg，28.31mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(1.981mL)、DMF(1.890mL)和化合物59(360μL，10mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27668Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.68。
实施例68：13d与60的缀合以获得缀合物XV
通过将作为接头-缀合物的化合物60与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(4.769mL，135mg，28.31mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入丙二醇(4.95mL)和化合物60(270μL，20mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27248Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.54。
实施例69：13d与63的缀合以获得缀合物XVII
通过将作为接头-缀合物的化合物63与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(8.18mL，270mg，33.0mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(7.12mL)、DMF(2.48mL)和化合物63(225μL，40mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为25921Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为1.90。
实施例67：13d与68的缀合以获得缀合物XXI
通过将作为接头-缀合物的化合物68与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(129μL，2.57mg，19.85mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入化合物68(60μL，10mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的Superdex20010/300GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为26980Da，总Fc/2片段的约80％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.55。
实施例71：13d与62的缀合以获得缀合物XVI
通过将作为接头-缀合物的化合物62与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(202μL，4.0mg，19.9mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入丙二醇(170μL)和化合物62(32μL，10mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为26806Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.70。
实施例72：13d与64的缀合以获得缀合物XVIII
通过将作为接头-缀合物的化合物64与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(360μL，7.0mg，19.5mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(13.5μL)、DMF(81.6μL)和化合物64(11.7μL，20mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27155Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.58。
实施例73：13d与65的缀合以获得缀合物XIX
通过将作为接头-缀合物的化合物65与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(334μL，6.67mg，20.0mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入DMF(100μL)和化合物65(11.13μL，20mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27238Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.58。
实施例74：13d与66的缀合以获得缀合物XX
通过将作为接头-缀合物的化合物66与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(353μL，7.0mg，19.9mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(210μL)、DMF(44.7μL)和化合物66(48.6μL，9.6mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27169Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。
实施例75：13d与69的缀合以获得缀合物XXII
通过将作为接头-缀合物的化合物69与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(360μL，7.0mg，19.5mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入DMF(23.4μL)和化合物69(93.3μL，10mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GE Healthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27200Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。
实施例76：13d与111的缀合以获得缀合物XXIII
通过将作为接头-缀合物的化合物111与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(360μL，7.0mg，19.5mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(60.1μL)、DMF(42.0μL)和化合物111(4.67μL，40mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为25874.2Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.69。
实施例77：13d与112的缀合以获得缀合物XXIV
通过将作为接头-缀合物的化合物21与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(235μL，6.7mg，28.5mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(99μL)、DMF(100.3μL)和化合物112(11.2μL，40mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育过夜，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上的Superdex20010/300 GL(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为25884Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.72。
实施例78：13d与54的缀合以获得缀合物IV
通过将作为接头-缀合物的化合物与作为生物分子的叠氮化物修饰的曲妥珠单抗缀合，制备本发明的生物缀合物。向曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(13d)(235μL，6.7mg，28.5mg/mL在PBS pH 7.4中的溶液)的溶液中加入丙二醇(190μL)和化合物54(45μL，10mM的DMF溶液)。将反应物在室温下温育36h，然后在AKTA净化器-10(GEHealthcare)上在HiLoad26/600 Superdex200 PG(GE Healthcare)上纯化。fabricator消化的样品的质谱分析示出一种主要产物(观察到的质量为27254Da，总Fc/2片段的约90％)，其对应于缀合的Fc/2片段。还原样品的RP-HPLC分析表明平均DAR为3.46。
序列表
<110> 西纳福克斯股份有限公司
<120> 用于靶向HER2肿瘤的具有改善的治疗指数的新型抗体-缀合物
<130> P6062003PCT
<150> EP16154712.0
<151> 2016-02-08
<150> EP16154739.3
<151> 2016-02-08
<150> EP16173595.6
<151> 2016-06-08
<150> JP2016-155929
<151> 2016-08-08
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Met Pro Ser Ile Asp Ser Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys
1 5 10 15
Glu Phe Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val
20 25 30
Lys Glu Ile Leu Ala Lys Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu
35 40 45
Leu Ala Lys Met Lys Ile Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His
50 55 60
Gly Pro Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser
65 70 75 80
Asp Pro Thr Glu Lys Asp Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys
85 90 95
Glu Val Asp Leu Ala Phe Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser
100 105 110
Leu Phe Trp Lys Glu Leu Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys
115 120 125
Gln Gly Thr Arg Val Ile Arg Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly
130 135 140
Gly Asp Asn Ser Gly Ile Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr
145 150 155 160
Pro Glu Gly Asn Lys Ala Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val
165 170 175
Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp Gly Leu Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser
180 185 190
Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser
195 200 205
Ile Gln Val Phe Glu Glu Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val
210 215 220
Asp Lys Ser Arg Leu Phe Ile Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys
225 230 235 240
Asn Pro Leu Ile Glu Arg Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val
245 250 255
Gln Val Tyr Gly Ser Gln Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser
260 265 270
Asn Arg Pro Glu Lys Thr Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys
275 280 285
Tyr Ile Arg Pro Glu Gln Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu
290 295 300
Asn Ala Gln Glu Gly Asn Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp
305 310 315 320
Glu Asp Lys Ala Asn Gly Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala
325 330 335
Glu Arg Tyr Ala Arg Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly
340 345 350
Ile Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys
355 360 365
Lys Tyr Ala Lys Gln Lys Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe
370 375 380
His Ser Asp Tyr Ser Val Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys
385 390 395 400
Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala
405 410 415
Leu Arg Glu Ala Val Met Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu
420 425 430
Glu Arg Phe Asn Gly Thr Leu Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser
435 440 445
Leu Glu Gly Leu Asn Lys Phe Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile
450 455 460
Gly Leu Ser Arg Ile Thr Lys Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn
465 470 475 480
Met Lys Pro Gly Lys Asp Thr Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys
485 490 495
Lys Asp Asn Lys Glu Glu Pro Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys
500 505 510
Val Ser Gly Leu Thr Gly Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp
515 520 525
Arg Glu Thr Leu Ala Gly Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu
530 535 540
Lys Val Asp Ile Ser Gly Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu
545 550 555 560
Asn Arg Gln Ile Phe Asp Thr Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val
565 570 575
Gly Ser Asn Glu Gln Thr Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly
580 585 590
His Tyr Pro Asp Thr Tyr Gly Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala
595 600 605
Asn Glu Lys Val Asp Leu Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr
610 615 620
Asn Gln Gly Thr Leu Ile Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln
625 630 635 640
Asn His Lys Ile Ala Gly Arg Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr
645 650 655
Asn Asn Phe Lys Val Ser Tyr Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp
660 665 670
Ser Thr Leu Gly Thr Thr Thr Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu
675 680 685
Glu Thr Tyr Lys Val Asp Phe Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala
690 695 700
Val His Thr Ala Lys Val Ile Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val
705 710 715 720
Asn Leu Ala Glu Gly Ala Thr Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val
725 730 735
Asn Ala Arg Lys Val Phe Asp Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn
740 745 750
Ile Ser Leu Gly Trp Asp Ser Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys
755 760 765
Glu Asp Gly Leu Ile Lys His Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg
770 775 780
Asn Pro Glu Thr Thr Asn Lys Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile
785 790 795 800
Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Asn Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn
805 810 815
Lys Phe Asp Asp Glu Lys Tyr Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala
820 825 830
Gln Gly Glu Arg Ala Thr Ala Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr
835 840 845
Ser Lys Tyr Trp Arg Val Val Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser
850 855 860
Ser Pro Val Val Pro Glu Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn
865 870 875 880
Ala Asp Thr Ile Met Lys Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln
885 890 895
Gln Lys Asp Lys Phe Ser Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys
900 905 910
Glu Met Ala Leu Glu Thr Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr
915 920 925
Ala Ile Asn Ala Asn Ala Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg
930 935 940
Gln Leu Leu Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
945 950 955 960
Gly Gly Gly Ser His His His His His His Glu Phe Gly Gly Gly Gly
965 970 975
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Val
980 985 990
Lys Gln Gly Pro Thr Ser Val Ala Tyr Val Glu Val Asn Asn Asn Ser
995 1000 1005
Met Leu Asn Val Gly Lys Tyr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Gly Asn Ala
1010 1015 1020
Phe Asp Val Ala Val Ile Phe Ala Ala Asn Ile Asn Tyr Asp Thr Gly
1025 1030 1035 1040
Thr Lys Thr Ala Tyr Leu His Phe Asn Glu Asn Val Gln Arg Val Leu
1045 1050 1055
Asp Asn Ala Val Thr Gln Ile Arg Pro Leu Gln Gln Gln Gly Ile Lys
1060 1065 1070
Val Leu Leu Ser Val Leu Gly Asn His Gln Gly Ala Gly Phe Ala Asn
1075 1080 1085
Phe Pro Ser Gln Gln Ala Ala Ser Ala Phe Ala Lys Gln Leu Ser Asp
1090 1095 1100
Ala Val Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp Asp Glu Tyr
1105 1110 1115 1120
Ala Glu Tyr Gly Asn Asn Gly Thr Ala Gln Pro Asn Asp Ser Ser Phe
1125 1130 1135
Val His Leu Val Thr Ala Leu Arg Ala Asn Met Pro Asp Lys Ile Ile
1140 1145 1150
Ser Leu Tyr Asn Ile Gly Pro Ala Ala Ser Arg Leu Ser Tyr Gly Gly
1155 1160 1165
Val Asp Val Ser Asp Lys Phe Asp Tyr Ala Trp Asn Pro Tyr Tyr Gly
1170 1175 1180
Thr Trp Gln Val Pro Gly Ile Ala Leu Pro Lys Ala Gln Leu Ser Pro
1185 1190 1195 1200
Ala Ala Val Glu Ile Gly Arg Thr Ser Arg Ser Thr Val Ala Asp Leu
1205 1210 1215
Ala Arg Arg Thr Val Asp Glu Gly Tyr Gly Val Tyr Leu Thr Tyr Asn
1220 1225 1230
Leu Asp Gly Gly Asp Arg Thr Ala Asp Val Ser Ala Phe Thr Arg Glu
1235 1240 1245
Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Val Arg Thr Pro
1250 1255
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Pro Leu Arg Thr Tyr Leu Tyr Thr Pro Leu
20 25 30
Tyr Asn Ala Thr Gln Pro Thr Leu Arg Asn Val Glu Arg Leu Ala Ala
35 40 45
Asn Trp Pro Lys Lys Ile Pro Ser Asn Tyr Ile Glu Asp Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Ser Ile Lys Asn Ile Ser Leu Ser Asn His Thr Thr Arg Ala Ser
65 70 75 80
Val Val His Pro Pro Ser Ser Ile Thr Glu Thr Ala Ser Lys Leu Asp
85 90 95
Lys Asn Met Thr Ile Gln Asp Gly Ala Phe Ala Met Ile Ser Pro Thr
100 105 110
Pro Leu Leu Ile Thr Lys Leu Met Asp Ser Ile Lys Ser Tyr Val Thr
115 120 125
Thr Glu Asp Gly Val Lys Lys Ala Glu Ala Val Val Thr Leu Pro Leu
130 135 140
Cys Asp Ser Met Pro Pro Asp Leu Gly Pro Ile Thr Leu Asn Lys Thr
145 150 155 160
Glu Leu Glu Leu Glu Trp Val Glu Lys Lys Phe Pro Glu Val Glu Trp
165 170 175
Gly Gly Arg Tyr Ser Pro Pro Asn Cys Thr Ala Arg His Arg Val Ala
180 185 190
Ile Ile Val Pro Tyr Arg Asp Arg Gln Gln His Leu Ala Ile Phe Leu
195 200 205
Asn His Met His Pro Phe Leu Met Lys Gln Gln Ile Glu Tyr Gly Ile
210 215 220
Phe Ile Val Glu Gln Glu Gly Asn Lys Asp Phe Asn Arg Ala Lys Leu
225 230 235 240
Met Asn Val Gly Phe Val Glu Ser Gln Lys Leu Val Ala Glu Gly Trp
245 250 255
Gln Cys Phe Val Phe His Asp Ile Asp Leu Leu Pro Leu Asp Thr Arg
260 265 270
Asn Leu Tyr Ser Cys Pro Arg Gln Pro Arg His Met Ser Ala Ser Ile
275 280 285
Asp Lys Leu His Phe Lys Leu Pro Tyr Glu Asp Ile Phe Gly Gly Val
290 295 300
Ser Ala Met Thr Leu Glu Gln Phe Thr Arg Val Asn Gly Phe Ser Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Met Ser Tyr Arg Leu
325 330 335
Lys Lys Ile Asn Tyr His Ile Ala Arg Tyr Lys Met Ser Ile Ala Arg
340 345 350
Tyr Ala Met Leu Asp His Lys Lys Ser Thr Pro Asn Pro Lys Arg Tyr
355 360 365
Gln Leu Leu Ser Gln Thr Ser Lys Thr Phe Gln Lys Asp Gly Leu Ser
370 375 380
Thr Leu Glu Tyr Glu Leu Val Gln Val Val Gln Tyr His Leu Tyr Thr
385 390 395 400
His Ile Leu Val Asn Ile Asp Glu Arg Ser
405 410

Claims (23)

1.包含通过接头L与靶分子D连接的抗体AB的抗体-缀合物，其可通过以下方式获得：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure FDA0003728587920000011
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团，
其中抗体AB能够靶向表达HER2的肿瘤，靶分子D选自紫杉烷类、蒽环类抗生素、喜树碱、埃博霉素类、丝裂霉素C、考布他汀、长春花生物碱、美登木素生物碱、刺孢霉素和烯二炔类、多卡米星、微管溶素、毒伞肽、多拉司他汀和阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白和肽、激酶抑制剂、MEK抑制剂、或KSP抑制剂，
其中接头L2包含式(1)的基团或其盐：
Figure FDA0003728587920000012
其中：
-a为0或1；以及
-R1为氢或另一个靶分子D，其中靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
2.权利要求1的抗体-缀合物，其中所述抗体能够靶向表达HER2的肿瘤且选自曲妥珠单抗、margetuximab、培妥珠单抗、HuMax-Her2、厄马索单抗、HB-008、ABP-980、BCD-022、CanMab、Herzuma、HD201、CT-P6、PF-05280014、COVA-208、FS-102、MCLA-128、CKD-10101和HT-19。
3.权利要求1的抗体-缀合物，其中抗体AB为曲妥珠单抗且靶分子D选自由美登木素生物碱、阿里他汀和吡咯并苯并二氮杂卓二聚体。
4.权利要求3的抗体-缀合物，其中靶分子D为选自MMAD、MMAE和MMAF的阿里他汀，或选自DM1、DM3、DM4和Ahx-May的美登木素生物碱。
5.包含通过接头L与靶分子D连接的抗体AB的抗体-缀合物，其可通过以下方式获得：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure FDA0003728587920000021
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团，
其中：
(I)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物82)；
(II)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2)3–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物83)；
(III)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物81)；
(IV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May；
(V)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May(缀合物84)；
(VI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Ala–，D＝PBD(缀合物85)；
(VII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物96)；
(VIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物95)；
(IX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物97)；
(X)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物98)；
(XI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9n)，其中U＝O，L2＝–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9zo)，L2＝–C(O)–NH–(CH2)4–C(O)–NH–(CH2)5–O–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9j)，其中l＝3，L2＝–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XVI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Dox；
(XVII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAF；
(XVIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XIX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝MMAF；
(XXI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Dox；
(XXII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Ahx-May；
(XXIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE；和
(XXIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE，
其中(9q)具有以下结构：
Figure FDA0003728587920000061
6.一种由于缀合模式具有提高的治疗指数的生物缀合物的制备方法，其中所述缀合模式用于通过接头L将生物分子B与靶分子D连接，其中所述缀合模式包括：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的糖蛋白，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure FDA0003728587920000062
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表能够靶向表达HER2的肿瘤的抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的糖蛋白与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中靶分子D为抗癌剂且接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团，
其中接头L2包含式(1)的基团或其盐：
Figure FDA0003728587920000071
其中：
-a为0或1；以及
-R1为氢或为另一个靶分子D，其中靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
7.权利要求6的方法，其中步骤(ii)的反应是(环)炔烃-叠氮化物缀合反应，以形成由(10e)、(10i)、(10g)、(10j)或(10k)表示的连接部分Z3，如下所示：
Figure FDA0003728587920000072
其中环A是7-10元(杂)环部分。
8.权利要求7的方法，其中Z3由(10g)表示。
9.权利要求6的方法，其中F1之一是叠氮化物部分，Q1是(环)炔烃部分且Z3是三唑部分。
10.权利要求6的方法，其中x为1或2。
11.权利要求10的用途，其中x为1。
12.权利要求6的方法，其中S(F1)x是6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺。
13.权利要求6的方法，其中抗体-缀合物由式(40)或(40b)表示：
Figure FDA0003728587920000081
其中：
-R31独立地选自氢、卤素、-OR35、-NO2、-CN、-S(O)2R35、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基任选被取代，其中两个取代基R31可以连接在一起形成增环的环烷基或增环的(杂)芳烃取代基，并且其中R35独立地选自氢、卤素、C1–C24烷基、C6–C24(杂)芳基、C7–C24烷基(杂)芳基和C7–C24(杂)芳烷基；
-X是C(R31)2、O、S或NR32，其中R32是R31或L2(D)r，其中L2是接头，且D如权利要求1中所定义；
-r为1-20；
-q为0或1，条件是如果q为0则X为N-L2(D)r；
-aa是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
-aa'是0、1、2、3、4、5、6、7或8；和
-aa+aa'<10；
-b为0或1；
-pp为0或1；
-M是-N(H)C(O)CH2-、-N(H)C(O)CF2-、-CH2-、-CF2-或含有0-4个氟取代基的1,4-亚苯基；
-y是1-4；
-Fuc是岩藻糖
或其中所述抗体-缀合物由式(40d)表示：
Figure FDA0003728587920000091
其中AB、L2、D、S、b、pp、x、y和M如上所定义，且其中l为0-10。
14.一种由于缀合模式具有提高的治疗指数的生物缀合物的制备方法，其中所述缀合模式用于通过接头L将生物分子B与靶分子D连接，其中所述缀合模式包括：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的糖蛋白，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure FDA0003728587920000092
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的糖蛋白与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团，
其中：
(I)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物82)；
(II)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2)3–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物83)；
(III)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物81)；
(IV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May；
(V)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May(缀合物84)；
(VI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Ala–，D＝PBD(缀合物85)；
(VII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物96)；
(VIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物95)；
(IX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物97)；
(X)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物98)；
(XI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9n)，其中U＝O，L2＝–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9zo)，L2＝–C(O)–NH–(CH2)4–C(O)–NH–(CH2)5–O–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9j)，其中l＝3，L2＝–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XVI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Dox；
(XVII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAF；
(XVIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XIX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝MMAF；
(XXI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Dox；
(XXII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Ahx-May；
(XXIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE；和
(XXIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE，
其中(9q)具有以下结构：
Figure FDA0003728587920000131
15.权利要求6或14的方法，其中抗体-缀合物的提高的治疗指数涉及：
(a)提高抗体-缀合物的治疗功效；和/或
(b)提高抗体-缀合物的耐受性。
16.缀合物在制备用于靶向表达HER2的细胞的方法中的药物中的用途，其中抗体-缀合物包含通过接头L与靶分子D连接的抗体AB，其中所述抗体-缀合物可通过以下获得：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure FDA0003728587920000132
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团，
其中抗体AB能够靶向表达HER2的肿瘤且靶分子D为抗癌剂，并且其中接头L2包含式(1)的基团或其盐：
Figure FDA0003728587920000141
其中：
-a为0或1；以及
-R1为氢或为另一个靶分子D，其中靶分子任选地通过间隔基部分与N连接。
17.权利要求16的用途，其中靶分子D是细胞毒素。
18.权利要求16的用途，其中所述生物缀合物包含两种不同的靶分子D。
19.权利要求16的用途，其中所述生物缀合物包含两种不同的细胞毒素D。
20.缀合物在制备用于靶向表达HER2的细胞的方法中的药物中的用途，其中抗体-缀合物包含通过接头L与靶分子D连接的抗体AB，其中所述抗体-缀合物可通过以下获得：
(i)在催化剂存在下使含有1-4个核心N-乙酰葡糖胺部分的糖蛋白与式S(F1)x-P的化合物接触，以获得式(24)的经修饰的抗体，其中S(F1)x为含有x个能够与官能团Q1反应的官能团F1的糖衍生物，x为1或2以及P为核苷单磷酸酯或核苷二磷酸酯，并且其中催化剂能够将S(F1)x部分转移至核心-GlcNAc部分：
Figure FDA0003728587920000142
Figure FDA0003728587920000151
其中S(F1)x和x如上所定义；AB代表抗体；GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；Fuc为岩藻糖；b为0或1；以及y为1、2、3或4；以及
(ii)使经修饰的抗体与含有能够与官能团F1反应的官能团Q1的接头-缀合物和通过接头L2连接至Q1的靶分子D反应，以获得抗体-缀合物，其中接头L包括S–Z3–L2以及其中Z3为由Q1与F1之间的反应产生的连接基团，
其中：
(I)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物82)；
(II)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2)3–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物83)；
(III)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–，D＝Ahx-May(缀合物81)；
(IV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May；
(V)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，D的每次出现＝Ahx-May(缀合物84)；
(VI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Ala–，D＝PBD(缀合物85)；
(VII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物96)；
(VIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物95)；
(IX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物97)；
(X)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝2-叠氮基二氟乙酰氨基-2-脱氧半乳糖，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–，D＝Ahx-May(缀合物98)；
(XI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9n)，其中U＝O，L2＝–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9zo)，L2＝–C(O)–NH–(CH2)4–C(O)–NH–(CH2)5–O–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9j)，其中l＝3，L2＝–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Ahx-May；
(XVI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝Dox；
(XVII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAF；
(XVIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XIX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–NH–S(O)2–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D)2，每次出现D＝MMAE；
(XX)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝MMAF；
(XXI)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Dox；
(XXII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–N(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D1)(CH2–CH2–O–C(O)–Val–Cit–PABC–D2)，D1＝MMAE且D2＝Ahx-May；
(XXIII)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–S(O)2–NH–(CH2–CH2–O)2–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE；和
(XXIV)AB＝曲妥珠单抗，其中S(F1)x连接至与氨基酸N300连接的核心-GlcNAc，S(F1)x＝6-叠氮基-6-脱氧-N-乙酰半乳糖胺，Q1为式(9q)，L2＝–CH2–O–C(O)–NH–(CH2–CH2–O)4–C(O)–Val–Cit–PABC–D，每次出现D＝MMAE，
其中(9q)具有以下结构：
Figure FDA0003728587920000181
21.权利要求16或20的用途，其中所述靶向表达HER2的细胞包括治疗、成像、诊断表达HER2的细胞，防止表达HER2的细胞的增殖，包含和减少表达HER2的细胞中的一种或多种。
22.权利要求21的用途，其中表达HER2的细胞为表达HER2的肿瘤。
23.权利要求16或20的用途，其中受试者患有选自以下的病症：乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌。
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