CN108982858B - 一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒 - Google Patents
一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体EP1‑2、EP2‑3和EP2‑4、人proGRP标准蛋白、生物素标记的检测抗体EP3‑1‑biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、TMB显色液。可快速检测小细胞肺癌病人血清中的proGRP蛋白含量，由多功能酶标仪进行定量分析，结果准确可靠，为临床检验和基础研究提供了一种新的辅助工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学检测研究领域的试剂盒，具体涉及一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒。
背景技术
双夹心ELISA检测方法操作简单、高效、可靠、适用于大批样品快速筛选，基于单克隆抗体的双夹心ELISA较多克隆抗体更稳定，特异性更强。
线性抗原表位是抗原分子中能与相应淋巴细胞表面的受体结合的特殊化学基团，一般由几个氨基酸残疾序列组成。它能够引起免疫应答，决定抗原的特异性。多肽单独应用时的免疫原性低，可通过偶联到大分子上增强其免疫原性。HBV-C是乙型肝炎病毒核心颗粒，可自发形成二十面体的病毒样颗粒结构有利于诱发特异性的体液和细胞免疫反应，将外源性抗原表位插入至HBV-C内部免疫显性区，可诱导机体产生针对外源性抗原的特异性免疫应答。腺病毒也有高的免疫原性，将外源抗原表位插入至E1区和Hexon 区包装纯化出携带目的抗原表位的病毒颗粒从而增强多肽的免疫效果。
胃泌素释放肽(GRP)是由27个氨基酸组成的生物活性肽，在成人中仅存在于神经组织和肺的神经内分泌细胞中，且水平低。由于小细胞肺癌是神经内分泌起源的肿瘤，小细胞肺癌患者血清中可以检测到GRP显著升高。所以GRP可作为小细胞肺癌的诊断、病情监测、疗效评估、预后判断的敏感性和特异性指标。由于GRP的活性部分在血液中极不稳定会被迅速降解，临床检测比较困难，从而限制了它的应用。而胃泌素释放肽的前体结构 (proGRP)，在血清屮含量比较稳定，研究证实proGRP水平代表着GRP 基因表达的水平，可以作为小细胞肺癌的诊断指标。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种简便、灵敏度高、特异性强、适应大规模检测的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒。
为了实现上述任务，本发明通过以下技术方案得以实现：
一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：
96孔ELISA酶标板；
包被抗体，该包被抗体是由针对人proGRP中30-41aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP1-2以及针对人proGRP中69-80aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP2-3和EP2-4组成的混合物，混合比例为2：1：1，工作总浓度为 20μg/mL；
人proGRP标准蛋白，该人proGRP标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；
生物素标记的检测抗体，该生物素标记的EP3-1-biotin，是针对人 proGRP中83-94aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为5μg/mL；
Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。
根据本发明，所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6；
所述封闭液为含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；
所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；
所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.10％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；
所述底物液为TMB；
所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液。
进一步地，所述Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法获得。
所述的过碘酸钠方法是将HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的 HRP，然后Avidin与活化的HRP反应，得到Avidin与HRP的交联蛋白。
上述基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的构建方法，运用蛋白质三维结构预测软件预测proGRP的线性表位EP1：30-41aa； EP2：69-80aa；EP3：83-94aa，用偶联多肽的方法进行小鼠免疫。
使用的多肽偶联方法其一是通过原核表达融合HBV-C/表位小肽蛋白增强小肽的免疫原性；其二是通过使用表位小肽修饰Ad5腺病毒E1区与 Hexon区增强其免疫原性；其三是通过融合蛋白与修饰腺病毒交叉免疫小鼠，产生针对特定抗原表位的抗体。
根据申请人的试验表明，本发明构建的基于单克隆抗体检测人proGRP 的双夹心ELISA试剂盒，可以用于小细胞肺癌病人的血清学检测应用，可快速检测小细胞肺癌病人血清中proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白。
检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白具体包括以下步骤：
(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体EP1-2、EP2-3和 EP2-4按比例稀释成20μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；
(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、 1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入EP3-38D4-biotin，100μL/孔， 37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP 的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；
(6)化学发光：向所述酶标板中加入显色液，100μL/孔；
(7)显色：加入显色液后，37℃避光显色5分钟，置于酶标仪中检测 450nm吸光值。
本发明的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，其创新点在于，运用生物信息学方法预测B细胞表位，得到针对性强的单克隆抗体，构建更加灵敏的proGRP双夹心ELISA试验方法。
与现有技术相比，带来的有益技术效果在于：
(1)采用线性表位制备单克隆抗体的策略以及融合蛋白与修饰腺病毒免疫策略可以为单克隆抗体的制备提供新思路。
(2)所采用包被抗体和酶标抗体均为针对proGRP的单克隆抗体，较多克隆抗体更稳定，特异性更强；
(3)可快速检测小细胞肺癌病人血清中的proGRP蛋白含量，由多功能酶标仪进行定量分析，结果准确可靠，为临床检验和基础研究提供了一种新的辅助工具。
附图说明
图1是基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的抗体最优配对筛选；
图2是基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的捕获抗体组合优化；
图3是基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的优化图，其中A图为包被抗体浓度优化图；B图为包被抗体各比例优化图；C 图为检测抗体浓度优化图；D图为Aviding-HRP交联蛋白工作浓度优化图；
图4是基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒灵敏度检测图。
图5是基于单克隆抗体检测小细胞肺癌患(SCLC)者及非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清中proGRP水平的检测图，其中A图为SCLC与NSCLC 血清中proGRP水平比较图；B图为经过治疗的SCLC血清中proGRP水平与未经治疗的SCLC血清中proGRP水平比较图。
以下结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，该试剂盒是基于新型免疫策略构建方法获得，该新型免疫策略构建方法的优点是：
第一方面，运用生物信息学方法预测B细胞表位，得到针对性强的单克隆抗体，构建更加灵敏的proGRP双夹心ELISA试验方法。
第二方面，利用蛋白质三维结构预测软件预测proGRP的线性表位EP1： 30-41aa；EP2：69-80aa；EP3：83-94aa，用偶联多肽的方法增强多肽的免疫原性。
其中，增强多肽的免疫原性的方法其一是通过原核表达融合HBV-C与表位小肽蛋白增强小肽的免疫原性；其二是通过使用表位小肽修饰Ad5腺病毒E1区与Hexon区增强其免疫原性；其三是通过融合蛋白与修饰腺病毒联合免疫小鼠，产生针对特定抗原表位的抗体。
第三方面，采用单克隆抗体是运用杂交瘤细胞技术，通过不同线性表位的融合蛋白和腺病毒分别免疫小鼠，将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过细胞克隆化与间接ELISA方法获得：
EP1两株抗体：EP1-1：NO1-5 48F6、EP1-2：NO3-1 42D1；
EP2四株抗体：EP2-1：NO1-2 36B9、EP2-2：NO2-1 37B11、EP2-3： NO4-2 31C9、EP2-4：NO5-1 43B1；
EP3一株抗体：EP3-1：NO2-3 38D4
再对上述七株单克隆抗体进行辣根过氧化酶(HRP)标记，将包被抗体与酶标抗体分别进行双夹心抗体配对，筛选出最佳单克隆抗体配对，即：包被抗体EP1-2和生物素标记的检测抗体EP3-1；
所构建的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，该试剂盒的内容物组成如下：
96孔ELISA酶标板；
包被抗体，该包被抗体是由针对人proGRP中30-41aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP1-2以及针对人proGRP中69-80aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP2-3和EP2-4组成的混合物，混合比例为2：1：1，工作总浓度为 20μg/mL；
人proGRP标准蛋白，该人proGRP标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；
生物素标记的检测抗体，该生物素标记的EP3-1-biotin，是针对人 proGRP中83-94aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为5μg/mL；
Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。
其中：
(1)用包被缓冲液将包被抗体EP1-2、EP2-3和EP2-4按2：1：1比例稀释，总工作浓度为20μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
(2)人proGRP标准蛋白，通过真核蛋白纯化的方法获得；
(3)生物素标记的检测抗体EP3-1-biotin，通过生物素标记试剂盒 (Thermo公司售)获得，最优的工作浓度：5μg/mL。
(4)Avidin与HRP的交联蛋白，通过过碘酸钠法是HRP与过碘酸钠 (NaIO4)反应，获得活化的HRP；Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin 与HRP的交联蛋白。
(5)包被缓冲液，0.05M的碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)；
(6)封闭液，含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH值为 7.4)；
(7)样品及检测抗体稀释液，含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)；
(8)ELISA酶标板洗涤液，含体积分数为0.10％Tween-20的PBS (PBST，pH值为7.4)；
(9)底物液，含TMB的底物缓冲液；
(10)显色液，TMB显色液；
本实施例给出的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，可以用于小细胞肺癌病人的血清学的检测应用。即检测重组的proGRP 蛋白以及天然的人proGRP蛋白。
检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白具体包括以下步骤：
(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体EP1-2、EP2-3和 EP2-4按2：1：1比例稀释，总工作浓度为20μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；
(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、 1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入检测抗体EP3-1-biotin，100μ L/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP 的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；
(6)化学发光：向所述酶标板中加入显色液，100μL/孔；
(7)显色：加入显色液后，37℃避光显色5分钟，置于酶标仪中检测 450nm吸光值。
以下是发明人给出的具体实施例，本发明并不限于以下的实施例。
实施例1：双夹心ELISA抗体配对的筛选
(1)包被抗体：将纯化后的针对人proGRP各表位的单克隆抗体，浓度为10μg/mL，按照100μL/孔包被，4℃过夜；
(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；
(3)加proGRP蛋白样品：向所述酶标板中加入proGRP蛋白样品，100 μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入生物素标记的单克隆抗体，100 μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP 的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；
(6)显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min；
(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后,酶标仪405 nm处读数。
配对结果如图1所示，其中适用于检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的最优配对抗体为：①包被抗体EP1-2和生物素标记的检测抗体EP3-1 (本试剂盒所采用的抗体对)；②包被抗体EP1-1和生物素标记的检测抗体 EP3-1。
实施例2：双夹心ELISA抗体配对的优化
(1)包被抗体：将纯化后的针对人proGRP各表位的单克隆抗体，单独或者混合至总浓度为10μg/mL，按照100μL/孔包被，4℃过夜；
(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；
(3)加proGRP蛋白样品：向所述酶标板中加入proGRP蛋白样品，100 μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入单克隆抗体EP3-1，100μL/孔， 37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP 的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；
(6)显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min；
(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后，酶标仪 450nm处读数。
配对结果如图2所示，其中适用于检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的最优配对抗体为：①包被抗体EP1-2、EP2-3和EP2-4和生物素标记的检测抗体EP3-1(本试剂盒所采用的抗体对)；②包被抗体EP1-1、EP2-3 和EP2-4和生物素标记的检测抗体EP3-1。
实施例3：Avidin与HRP蛋白交联
通过过碘酸钠法将Avidin与HRP进行交联，具体为：
首先HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的HRP；Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin与HRP的交联蛋白。
实施例4：双夹心ELISA试剂盒优化
(1)包被抗体浓度优化
包被抗体选用EP1-1、EP2-3和EP2-4，将混合单克隆抗体按照40μg/mL， 30μg/mL，25μg/mL，20μg/mL，15μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μ g/mL、2.5μg/mL浓度梯度进行包被，封闭后，加入proGRP蛋白反应1h，将检测抗体EP3-1-Biotin加入检测孔中，37℃、1h后，洗涤3-5次，在反应孔中加入Avidin-HRP，37℃、1h后，洗涤5-6次，加入底物液进行显色，反应3-5min后将反应孔中加入终止液，于405nm处测量OD值。测量OD 值减空白OD值最大的为较优的包被抗体浓度，结果如图3的A图所示， 20μg/mL为最佳包被浓度。
(2)包被抗体比例优化
包被抗体选用EP1-1、EP2-3、和EP2-4，总工作浓度为20ug/ml，三株抗体分别按照1：1：1，2：1：1，3：1：1，4：1：1，1：2：1，1：3：1， 1：4：1，1：1：2，1：1：3，1：1：4，2：2：1，3：3：1，4：4：1各比例进行包被，封闭后，加入proGRP蛋白反应1h，将检测抗体EP3-1加入检测孔中，37℃、1h后，洗涤3-5次，在反应孔中加入Avidin-HRP，37℃、 1h后，洗涤5-6次，加入底物液进行显色，反应3-5min后将反应孔中加入终止液，于405nm处测量OD值。测量OD值减空白OD值最大的为较优的包被抗体浓度，结果如图3的B图所示，2：1：1为最佳包被比例。
(3)检测抗体的优化
检测抗体选用针对EP3单克隆抗体EP3-1，使用生物素(Biotin)对EP3-1 抗体进行标记，获得检测抗体EP3-1-Biotin。
对检测抗体EP3-1-Biotin的浓度进行优化，将检测抗体EP3-1-Biotin按照10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.319μ g/mL，按照上述方法进行检测。选择测量OD值最大同时检测抗体最低浓度为最佳稀释浓度，结果如图3的C图所示，5μg/mL为最佳工作浓度。
(4)Aviding-HRP交联蛋白优化
使用优化的包被抗体浓度包被、封闭后，加入梯度稀释的proGRP真核表达蛋白，37℃、1h后，洗涤3-5次，在待测孔中检测抗体EP3-1-Biotin， 37℃、1h后，洗涤3-5次，分别加入Avidin-HRP交联蛋白，37℃、1h后，洗涤5-6次，再加入显色液进行反应，于450nm处测量，结果如图3的D 所示，0.9μg/mL为Aviding-HRP交联蛋白最佳工作浓度。
(5)检测灵敏度的确定
使用优化的包被抗体浓度包被、封闭后，加入梯度稀释的proGRP真核表达蛋白，37℃、1h后，洗涤3-5次，在待测孔中检测抗体EP3-1-Biotin， 37℃、1h后，洗涤3-5次，分别加入Avidin-HRP交联蛋白，37℃、1h后，洗涤5-6次，再加入显色液进行反应，于450nm处测量，结果如图4所示，可检测灵敏度为105.281pg/ml-13.476ng/ml。
实施例5：基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的检测方法
(1)包被ELISA酶标板：包被缓冲液将包被抗体包被抗体选用EP1-1、 EP2-3和EP2-4，按照2：1：1比例稀释成20μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；
(3)加待检测样品：将待测样品进行适当稀释，加入所述的酶标板中， 100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入EP3-1-Biotin，100μL/孔，37℃、 1-2h后，洗涤3-5次，并甩干；
(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP 的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；
(6)显色：向所述酶标板中加入显色液，100μL/孔；加入显色液后， 37℃避光显色5分钟，置于酶标仪中检测450nm吸光值。
结果如图5A所示，SCLC患者血清中proGRP水平明显高于NSCLC患者；图5B表示经过化疗后小细胞患者血清中的proGRP水平会显著降低。
Claims (4)
1.一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：
96孔ELISA酶标板；
包被抗体，该包被抗体是由针对人proGRP中30-41aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP1-1以及针对人proGRP中69-80aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP2-3和EP2-4组成的混合物，混合比例为2：1：1，工作总浓度为20μg/mL；
人proGRP标准蛋白，该人proGRP标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；
生物素标记的检测抗体，该生物素标记的EP3-1-biotin，是针对人proGRP中83-94aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为5μg/mL；
Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液；其中：
所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6；
所述封闭液为含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；
所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；
所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.10％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；
所述底物液为TMB；
所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液；
所述的Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法获得。
2.如权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的过碘酸钠方法是将HRP与过碘酸钠反应，获得活化的HRP，然后Avidin与活化的HRP反应，得到Avidin与HRP的交联蛋白。
3.权利要求1或2所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的构建方法，其特征在于，运用蛋白质三维结构预测软件预测proGRP的线性表位EP1：30-41aa；EP2：69-80aa；EP3：83-94aa，用偶联多肽的方法进行小鼠免疫；所述多肽偶联方法其一是通过原核表达融合HBV-C/表位小肽蛋白增强小肽的免疫原性；其二是通过使用表位小肽修饰Ad5腺病毒E1区与Hexon区增强其免疫原性；其三是通过融合蛋白与修饰腺病毒交叉免疫小鼠，产生针对特定抗原表位的抗体。
4.权利要求1或2所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒用于制备小细胞肺癌病人的血清学检测试剂盒的应用，所述小细胞肺癌病人的血清学检测是检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白；
检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白具体步骤包括：
(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体EP1-1、EP2-3和EP2-4按比例稀释成20μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；
(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入检测抗体EP3-1-biotin，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；
(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；
(6)化学发光：向所述酶标板中加入显色液，100μL/孔；
(7)显色：加入显色液后，37℃避光显色5分钟，置于酶标仪中检测450nm吸光值。
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