CN108949924B - 基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法 - Google Patents
基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108949924B CN108949924B CN201810682300.0A CN201810682300A CN108949924B CN 108949924 B CN108949924 B CN 108949924B CN 201810682300 A CN201810682300 A CN 201810682300A CN 108949924 B CN108949924 B CN 108949924B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- dna
- rolling circle
- circle amplification
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 15
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 title claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 69
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 54
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims abstract description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 39
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 10
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 241001272684 Xanthomonas campestris pv. oryzae Species 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 claims description 2
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011181 potassium carbonates Nutrition 0.000 claims description 2
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 35
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 35
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 35
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 35
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 6
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HBGPNLPABVUVKZ-POTXQNELSA-N (1r,3as,4s,5ar,5br,7r,7ar,11ar,11br,13as,13br)-4,7-dihydroxy-3a,5a,5b,8,8,11a-hexamethyl-1-prop-1-en-2-yl-2,3,4,5,6,7,7a,10,11,11b,12,13,13a,13b-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]chrysen-9-one Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C(C)(C)[C@@H]1[C@H](O)C[C@]([C@]1(C)C[C@@H]3O)(C)[C@@H]2CC[C@H]1[C@@H]1[C@]3(C)CC[C@H]1C(=C)C HBGPNLPABVUVKZ-POTXQNELSA-N 0.000 description 1
- PFRGGOIBYLYVKM-UHFFFAOYSA-N 15alpha-hydroxylup-20(29)-en-3-one Natural products CC(=C)C1CCC2(C)CC(O)C3(C)C(CCC4C5(C)CCC(=O)C(C)(C)C5CCC34C)C12 PFRGGOIBYLYVKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- SOKRNBGSNZXYIO-UHFFFAOYSA-N Resinone Natural products CC(=C)C1CCC2(C)C(O)CC3(C)C(CCC4C5(C)CCC(=O)C(C)(C)C5CCC34C)C12 SOKRNBGSNZXYIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种缺失突变基因的荧光检测试剂盒，所述试剂盒包括：PNA捕获探针；DNA探针；锁式探针；DNA聚合酶；DNA连接酶；滚环扩增引物；荧光探针。本发明还提供了使用所述的试剂盒进行缺失突变基因荧光检测的方法，所述方法包括以下步骤：1)将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；2)使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；3)使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；4)使荧光探针与滚环扩增产物杂交，淬灭背景荧光后检测荧光强度的变化。
Description
技术领域
本申请涉及一种基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法，属于化学和生物传感技术领域。
背景技术
基因序列缺失突变是由于DNA分子中发生碱基对的缺失引起的基因结构改变，是基因突变中的一种，人体中的基因缺失往往诱发多种疾病，如表皮生长因子(EGFR)的18-21号外显子发生基因缺失，诱发肺癌尤其是非小细胞肺癌的产生。伴随着疾病的发生发展，人体病变组织或者血液中缺失突变基因成为临床疾病快速、精确诊断的重要生理指标。目前，qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链式反应)和第二代基因测序技术是针对缺失突变基因主要的检测方法。qRT-PCR技术可以实现几个DNA分子的扩增，具有很高的灵敏度和专一性，然而主要缺陷在于反应过程需要精确控温，实验条件要求较高，不适合现场使用；第二代基因测序技术需要专业且昂贵的设备进行数据采集和解析，从而限制其广泛应用。
滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)是现阶段应用最广泛的恒温扩增技术之一，以环形DNA为模板，以寡聚核苷酸(与部分环状模板互补)为引物，在有链置换作用的DNA聚合酶(如phi 29DNA polymerase)作用下，引物延伸一个循环至起始延伸处置换下旧的DNA链而继续进行下一个循环，如此多次循环，生成含有大量重复序列的DNA长链。滚环扩增凭借其高特异性、高灵敏度和易操作等性质被大量应用于免疫芯片检测、细胞原位检测、全基因组DNA检测、单核苷酸多态性检测等多种领域中。
本发明结合滚环扩增技术、氧化石墨烯荧光淬灭技术和荧光检测法，设计一个针对缺失突变基因的检测体系，其检测限达到1pM，与其他检测缺失突变基因的检测方法相比，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、快速的特点。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种缺失突变基因的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、DNA聚合酶、滚环扩增引物和荧光探针。
优选地，所述PNA捕获探针是与靶基因缺失突变位点附近靠近3’端的10至25个碱基序列完全互补的PNA序列，所述PNA序列的羧基端与靶基因5’端碱基互补，所述PNA序列的氨基端与靶基因3’端碱基互补。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的PNA捕获探针羧基端(CONH2)连接1-5个聚乙二醇单甲醚(mPEG)单体以增加水溶性。
优选地，所述DNA探针是与靶基因缺失突变位点两端部分序列完全互补的DNA序列；其中，所述DNA探针与靶基因杂交时，与靶基因缺失突变位点处对应的部分是以单链形式存在的单链区。
本发明中的DNA探针与正常基因杂交形成完全互补的DNA双链，而与缺失突变基因杂交时，DNA探针中间部分不结合，以单链形式存在。
优选地，所述锁式探针的5’端和3’端与所述DNA探针的单链区完全互补，所述锁式探针的5’端和3’端的与所述DNA探针单链区的连接点位于所述DNA探针单链区的中心。
优选地，所述DNA聚合酶和所述滚环扩增引物能够对由所述锁式探针和所述DNA探针单链区组成的环状DNA进行滚环扩增。
所述锁式探针和所述DNA探针单链区在DNA连接酶的作用下能够形成环状的DNA，以进行后续的滚环扩增。
优选地，所述荧光探针是带有荧光标记的DNA信号探针，所述荧光探针能够与所述环状DNA的滚环扩增产物上的重复片段序列结合。
优选地，所述DNA连接酶选自E·coli DNA连接酶、T4DNA连接酶中的至少一种；更优选为T4DNA连接酶。
所述DNA聚合酶选自phi29DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I中的至少一种；更优选为phi 29DNA聚合酶。
所述滚环扩增引物选自与环状DNA互补配对碱基序列中的至少15个以上碱基。
根据本发明的另一个方面提供使用所述试剂盒进行基因缺失突变荧光检测的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；
2)使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；
3)使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；
4)使荧光探针与滚环扩增产物杂交，淬灭背景荧光后检测荧光强度的变化。
优选地，所述步骤1)中固定PNA捕获探针的方法包括，向孔板加入PNA探针和固定液，室温震荡孵育1.5-2.5小时，加入屏蔽液，继续震荡孵育20-40分钟，用缓冲液清洗后加入PBS密封保存备用。
PNA捕获探针固定的孔板包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板，孔板底部带有活性羧基，在碱性条件下能与氨基反应形成酰胺键。
在本发明的一个优选实施方式中，孵育后分别采用PBST和PBS溶液清洗3次，再加入PBS缓冲液进行保存。
优选地，所述固定液选自碳酸氢钠固定液、碳酸钠固定液、碳酸氢钾固定液、碳酸钾固定液中的至少一种，所述屏蔽液选自赖氨酸屏蔽液、精氨酸屏蔽液、天冬酰胺屏蔽液、谷氨酰胺屏蔽液中的至少一种，所述PNA探针的浓度为80-120μM，PNA探针和固定液的体积比为1：(80-120)。
优选地，所述步骤1)中，PNA捕获探针与靶基因杂交的方法包括，加入阻断液后在室温下震荡孵育20-40分钟，使用缓冲液清洗后加入不同浓度的靶基因，继续震荡孵育后使用缓冲液清洗。
本发明中，使用缓冲液清洗后加入的靶基因，浓度可以包括1fM-100nM。
优选地，所述阻断液选自小牛胸腺DNA或鲑鱼精DNA的BLBs，更优选含有鲑鱼精DNA的BLBs阻断液。
优选地，所述步骤3)中，环化的方法包括，加入DNA连接酶、连接缓冲液和双蒸水在35-40℃的条件下孵育1-2小时后，再于55-65℃的条件下孵育15-25分钟使所述DNA连接酶失活。
优选地，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶，所述DNA连接酶的浓度为5-9U/μL，所述连接酶缓冲液是10×T4DNA连接缓冲液，所述DNA连接酶、连接缓冲液和双蒸水的加入体积比为2：(2-4)：(24-26)。
优选地，所述步骤3)中滚环扩增的方法包括，加入滚环扩增引物、DNA聚合酶、聚合缓冲液、牛血清白蛋白、dNTP和双蒸水，在35-40℃下孵育0.5-1.5小时，再于55-65℃的条件下孵育15-25分钟使所述DNA聚合酶失活。
优选地，所述DNA聚合酶为phi 29DNA聚合酶，所述聚合酶的浓度为1-5U/μL，所述聚合缓冲液是10×phi 29DNA反应缓冲液；滚环扩增引物、DNA聚合酶、聚合缓冲液、牛血清白蛋白、dNTP和双蒸水的加入体积比为1：(1-5)：(10-20)：1：1：(42-56)。
优选地，所述步骤4)中，荧光探针与所述滚环扩增产物的体积比为1：(20-30)，所述荧光探针与所述滚环扩增产物混合孵育1-2小时。
优选地，所述淬灭剂是浓度为80-120μg/ml的氧化石墨烯。
优选地，所述淬灭包括，将荧光探针与滚环扩增产物杂交的产物冷却后，加入淬灭剂、结合缓冲液和双蒸水。
优选地，所述结合缓冲液是10×GO binding buffer，所述淬灭剂、结合缓冲液和双蒸水的加入体积比为(10-20)：10：(50-60)。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的试剂盒，能够提供基于滚环扩增技术的基因缺失突变荧光检测中所涉及到的关键试剂。
2)本申请所提供的检测方法，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、快速的特点。
附图说明
图1为本发明中检测方法的原理图。
图2为检测9个浓度梯度下EGFR缺失突变基因的荧光强度检测结果。
图3为检测9个浓度梯度下EGFR缺失突变基因的浓度与荧光强度关系曲线图。
图4为本发明中检测方法的滚环扩增阴性对照实验跑胶结果。
图5为滚环扩增阴性对照实验的荧光强度检测结果。
图6为滚环扩增阴性对照实验中不同对照组的荧光强度对比直方图。
图7为本发明中检测方法的检测探针阴性对照荧光强度检测结果。
图8为检测探针阴性对照实验中不同对照组的荧光强度对比直方图。
图9为在10nM EGFR正常基因存在下，不同浓度EGFR缺失突变基因的荧光强度检测结果。
图10为在10nM EGFR正常基因存在下，不同浓度EGFR缺失突变基因的浓度与荧光强度关系曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
实施例1
PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、荧光探针和滚环扩增引物的设计与合成
选择EGFR基因缺失位点附近靠近3’端的10-25个碱基序列为对象，设计一条与之完全互补的PNA序列作为PNA捕获探针，羧基端(CONH2)与EGFR缺失突变基因5’端碱基互补配对，氨基端(NH2)与EGFR缺失突变基因3’端碱基互补配对，羧基端引入1-5个mPEG以增加水溶性，用MBHA树脂在HBTU和DIEA条件下按照碱基序列逐一缩合，经裂解、纯化和结构表征用于后续检测；DNA探针、锁式探针和滚环扩增引物由上海杰李生物技术有限公司合成，详细碱基序列如表1所示：
表1 EGFR缺失突变基因和正常基因、探针以及引物序列
实施例2
EGFR缺失突变基因的荧光检测
(1)96孔板上PNA捕获探针的固定
每孔中加入1μL100μM PNA捕获探针和100μL NaHCO3固定液，PNA捕获探针的终浓度为1.0μM，室温下震荡(600-700rpm)孵育2小时，后加入50μL赖氨酸屏蔽液，继续室温震荡(600-700rpm)0.5小时，用300μL 1×PBST清洗四次，250μL 1×PBS清洗四次，250μL 1×PBS储存备用，用时将250μL 1×PBS除去，加入200μL BLBs阻断液，室温震荡(600-700rpm)0.5小时，后除去阻断液，直接用于下一步检测；
(2)EGFR缺失突变基因的捕获
在100μL体系中加入EGFR缺失突变基因和1×PBS缓冲液配置成9个浓度梯度(0fM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM)，每个浓度5个重复，室温震荡(600-700rpm)15分钟，将EGFR缺失突变基因与PNA捕获探针杂交而固定在孔板上，用200μL 1×PBS清洗四次；
(3)DNA探针与EGFR缺失突变基因的杂交
将1μL10μM DNA探针加入到99μL 1×PBS缓冲液中，与靶基因进行杂交，室温震荡(600-700rpm)15分钟，用200μL 1×PBS清洗四次；
(4)锁式探针与DNA探针的杂交
将1μL10μM锁式探针加入到99μL 1×PBS缓冲液中，与DNA探针上未结合的单链区杂交，室温震荡(600-700rpm)15分钟，用200μL 1×PBS清洗四次；
(5)T4DNA连接酶连接
每组中加入4μL 7.0U/μL的T4DNA连接酶、10μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和36μL双蒸水，16℃下静置孵育1小时，后置于65℃下20分钟使T4DNA连接酶失活；
(6)滚环扩增
每组中加入1μl 100μM引物、2μL 1.0U/μL phi 29DNA聚合酶、10μL 10×phi29DNA聚合反应缓冲液、1μl 10mg/ml BSA、1μl 10mM dNTP、35μL双蒸水，37℃下静置孵育3小时，后置于65℃下20分钟使phi 29DNA聚合酶失活；
(7)荧光信号检测
取20μl滚环扩增产物与1μl 10μM荧光探针在85℃下孵育1分钟，室温震荡(600-700rpm)冷却15分钟，再加入20μl 100μg/ml氧化石墨烯、10μl 10×氧化石墨烯结合缓冲液和49μl双蒸水，室温震荡(600-700rpm)10分钟，严格避光操作，最后用荧光光谱仪在648nm激发光波长下测量体系发射光谱的变化，并记录不同浓度靶基因存在时的荧光强度。结果如图2和3所示，随着检测EGFR缺失突变基因浓度的增加，检测到的荧光强度也随之增强，最低检测灵敏度达到1pM。
实施例3
EGFR缺失突变基因荧光检测的阴性对照
(1)96孔板上PNA捕获探针的固定
每孔中加入1μL100μM PNA捕获探针和99μL NaHCO3固定液，PNA捕获探针的终浓度为1.0μM，室温下震荡(600-700rpm)孵育2小时，后加入50μL赖氨酸屏蔽液，继续室温震荡(600-700rpm)0.5小时，用300μL 1×PBST清洗四次，250μL 1×PBS清洗四次，250μL 1×PBS储存备用，用时将250μL 1×PBS除去，加入200μL BLBs阻断液，室温震荡(600-700rpm)0.5小时，后除去阻断液，直接用于下一步检测；
(2)EGFR基因的捕获
在96孔板中将该实验分成5个组：a、b、c、d、e，其中a、c、d组中加入1μL 1μM EGFR缺失突变基因，b组中加入1μL 1μM EGFR正常基因以作阴性对照，e组中不加靶标基因以作空白对照，再分别加入1×PBS缓冲液配置成100μL体系，每组五个重复，室温震荡(600-700rpm)15分钟，将EGFR基因与PNA捕获探针杂交而固定在孔板上，用200μL1×PBS清洗四次；
(3)DNA探针与EGFR基因的杂交
在a、b、d和e这四组中分别加入1μL10μM DNA探针，c组不加DNA探针以作空白对照，每组均加入1×PBS缓冲液配置成100μL体系，与靶基因进行杂交，室温震荡(600-700rpm)15分钟，用200μL 1×PBS清洗四次；
(4)锁式探针与DNA探针的杂交
在a、b、c和e这四组中分别加入1μL10μM锁式探针，d组不加锁式探针以作空白对照，每组均加入1×PBS缓冲液配置成100μL体系，与DNA探针上未结合的单链区杂交，室温震荡(600-700rpm)15分钟，用200μL 1×PBS清洗四次；
(5)T4DNA连接酶连接
每组中加入4μL 7.0U/μL的T4DNA连接酶、10μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和36μL双蒸水，16℃下静置孵育1小时，后置于65℃下20分钟使T4DNA连接酶失活；
(6)滚环扩增
每组中加入1μl 100μM引物、2μL 1.0U/μL phi 29DNA聚合酶、10μL 10×phi29DNA聚合反应缓冲液、1μl 10mg/ml BSA、1μl 10mM dNTP、35μL双蒸水，37℃下静置孵育3小时，后置于65℃下20分钟使phi 29DNA聚合酶失活；
(7)聚丙烯酰胺凝胶成像
配制10％的聚丙烯酰胺凝胶(1.5ml 40％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、0.6ml 10×TAE-Mg缓冲液、60μL 10％APS、8μL TEMED和3.9ml双蒸水)，用凝胶电泳系统在110V电压下跑胶1.5小时，500bp Marker作对照，经GelRed染色30分钟，将凝胶置于凝胶成像分析系统中，在紫外灯下检测滚环扩增产物，结果如图4所示，表明EGFR缺失突变基因的阳性对照有滚环扩增产物；EGFR正常基因作为阴性对照和无靶标基因作为空白对照这两种情况下均无滚环扩增产物；对DNA探针和锁式探针也做了空白对照，结果表明均无滚环扩增产物。通过此实验表明该检测体系对EGFR缺失突变基因检测的准确性。
(8)荧光信号检测
取20μl滚环扩增产物与1μl 10μM荧光探针在85℃下孵育1分钟，室温震荡(600-700rpm)冷却15分钟，再加入20μl 100μg/ml氧化石墨烯、10μl 10×氧化石墨烯结合缓冲液和49μl双蒸水，室温震荡(600-700rpm)10分钟，严格避光操作，最后用荧光光谱仪在648nm激发光波长下测量体系发射光谱，记录阳性对照、阴性对照和空白对照条件下的各自荧光强度。结果(如图5和6所示)表明阳性对照组的荧光强度最强，平均值达到112.7，而阴性对照组和空白对照组无明显荧光强度，DNA探针和锁式探针空白对照组也无明显荧光强度，该荧光信号检测结果与跑胶结果相吻合，再次证明该检测体系应用于EGFR缺失突变基因检测的准确性和实用性。
实施例4
EGFR缺失突变基因荧光检测的检测探针阴性对照
该实验分成5个组：1、2、3、4、5，每组中均加入1μl 10μM荧光探针，1和2组中不加任何检测基因，3、4和5组中分别加入20μl 10nM EGFR缺失突变基因滚环扩增产物、20μl 10nMEGFR正常基因滚环扩增产物和1μl 10μM锁式探针，每组5个重复，在85℃下孵育1分钟，室温震荡(600-700rpm)冷却15分钟，每组加入10μl 10×氧化石墨烯结合缓冲液，除1组外其他四组均加入20μl 100μg/ml氧化石墨烯，最后加入双蒸水配置成100μl检测体系。室温震荡(600-700rpm)10分钟，严格避光操作，用荧光光谱仪在648nm激发光波长下测量体系发射光谱，记录阳性对照、阴性对照和空白对照条件下的各自荧光强度。结果如图7和8所示，这表明在无检测基因和氧化石墨烯存在的情况下100nM荧光探针的荧光强度平均值为295.22，阳性对照组的荧光强度平均值为112.7，而阴性对照组(4和5组)以及空白对照组(2组)无明显荧光强度，这不仅说明荧光探针在100nM浓度下足够检测滚环扩增产物，而且也证明该荧光探针可用于EGFR缺失突变基因滚环产物的荧光检测。
实施例5
混合基因中EGFR缺失突变基因的荧光检测
(1)96孔板上PNA捕获探针的固定
每孔中加入1μL100μM PNA捕获探针和100μL NaHCO3固定液，PNA捕获探针的终浓度为1.0μM，室温下震荡(600-700rpm)孵育2小时，后加入50μL赖氨酸屏蔽液，继续室温震荡(600-700rpm)0.5小时，用300μL 1×PBST清洗四次，250μL 1×PBS清洗四次，250μL 1×PBS储存备用，用时将250μL 1×PBS除去，加入200μL BLBs阻断液，室温震荡(600-700rpm)0.5小时，后除去阻断液，直接用于下一步检测；
(2)EGFR基因的捕获
9个浓度梯度的EGFR缺失突变基因均混合1μL1μM EGFR正常基因，用1×PBS缓冲液配置成0fM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM的100μL体系，每个浓度5个重复，室温震荡(600-700rpm)15分钟，将EGFR混合基因与PNA捕获探针杂交而固定在孔板上，用200μL 1×PBS清洗四次；
(3)DNA探针与EGFR混合基因的杂交
将1μL10μM DNA探针加入到99μL 1×PBS缓冲液中，与EGFR混合基因进行杂交，室温震荡(600-700rpm)15分钟，用200μL 1×PBS清洗四次；
(4)锁式探针与DNA探针的杂交
将1μL10μM锁式探针加入到99μL 1×PBS缓冲液中，与DNA探针上未结合的单链区杂交，室温震荡(600-700rpm)15分钟，用200μL 1×PBS清洗四次；
(5)T4DNA连接酶连接
每组中加入4μL 7.0U/μL的T4DNA连接酶、10μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和36μL双蒸水，16℃下静置孵育1小时，后置于65℃下20分钟使T4DNA连接酶失活；
(6)滚环扩增
每组中加入1μl 100μM引物、2μL 1.0U/μL phi 29DNA聚合酶、10μL 10×phi29DNA聚合反应缓冲液、1μl 10mg/ml BSA、1μl 10mM dNTP、35μL双蒸水，37℃下静置孵育3小时，后置于65℃下20分钟使phi 29DNA聚合酶失活；
(7)荧光信号检测
取20μl滚环扩增产物与1μl 10μM荧光探针在85℃下孵育1分钟，室温震荡(600-700rpm)冷却15分钟，再加入20μl 100μg/ml氧化石墨烯、10μl 10×氧化石墨烯结合缓冲液和49μl双蒸水，室温震荡(600-700rpm)10分钟，严格避光操作，最后用荧光光谱仪在648nm激发光波长下测量体系发射光谱的变化，并记录不同浓度靶基因存在时的荧光强度。结果如图9和10所示，随着EGFR缺失突变基因浓度的增加，检测到的滚环扩增产物荧光强度也随之增强，最低检测灵敏度达到1pM。这表明在10nM EGFR正常基因存在下该检测方法依然准确、有效和可靠。该实验的设计模拟了真实的检测样本情况，为患者非小细胞肺癌组织中EGFR缺失突变基因的检测奠定基础。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所
中国科学院宁波材料技术与工程研究所
<120> 基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法
<130> 20180627
<141> 2018-06-27
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 1
ttcccgtcgc tatcaacgaa agccaacaag gaaatcctcg atgtgagttt 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 2
tccttgttgg ctttcggaga tgttgcttct cttaattcct tgatagcgac gggaa 55
<210> 3
<211> 98
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 3
aagcaacatc tcaactatca taagactcgt catgtctcag cagcttctaa cggtcactaa 60
tacgactcac tataggttct ggaaagcgga attaagag 98
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 4
gctgagacat gacgagtc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 5
ctaacggtca ctaatacg 18
Claims (17)
1.一种基因缺失突变的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、DNA连接酶、DNA聚合酶、滚环扩增引物和荧光探针；
所述DNA探针是与靶基因缺失突变位点两端部分序列完全互补的DNA序列；其中，所述DNA探针与靶基因杂交时，与靶基因缺失突变位点处对应的部分是以单链形式存在的单链区；
所述PNA捕获探针的序列为：H2NOC-CTACACTCAAA-(mPEG)3-NH2；
所述DNA探针的序列为：
5’-TCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCTTAATTCCTTGATAGCGACGGGAA-3’；
所述锁式探针的序列为：
5’-P-AAGCAACATCTCAACTATCATAAGACTCGTCATGTCTCAGCAGCTTCTAACGGTCACTAATACGACTCACTATAGGTTCTGGAAAGCGGAATTAAGAG-3’；
所述滚环扩增引物的序列为：
5’-GCTGAGACATGACGAGTC-3’；
所述荧光探针的序列为：
Cy5-CTAACGGTCACTAATACG-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PNA捕获探针是与靶基因缺失突变位点附近靠近3’端的10至25个碱基序列完全互补的PNA序列，所述PNA序列的羧基端与靶基因5’端碱基互补，所述PNA序列的氨基端与靶基因3’端碱基互补。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述锁式探针的5’端和3’端与所述DNA探针的单链区完全互补，所述锁式探针的5’端和3’端的与所述DNA探针单链区的连接点位于所述DNA探针单链区的中心。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶和所述滚环扩增引物能够对由所述锁式探针形成的环状DNA进行滚环扩增。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针是带有荧光标记的DNA信号探针，所述荧光探针能够与环状DNA滚环扩增产物的重复片段序列结合。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA连接酶选自E·coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶中的至少一种；
所述DNA聚合酶选自phi29 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、DNA 聚合酶I中的至少一种。
7.使用权利要求1-6中任意一项所述的试剂盒进行非诊断治疗目的的基因缺失突变荧光检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；
2）使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；
3）使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；
4）使荧光探针与滚环扩增产物杂交，淬灭背景荧光后检测荧光强度的变化。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1）中固定PNA捕获探针的方法包括，向孔板加入PNA探针和固定液，室温震荡孵育1.5-2.5小时，加入屏蔽液，继续震荡孵育20-40分钟，用缓冲液清洗后加入PBS密封保存备用。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述固定液选自碳酸氢钠固定液、碳酸钠固定液、碳酸氢钾固定液、碳酸钾固定液中的至少一种，所述屏蔽液选自赖氨酸屏蔽液、精氨酸屏蔽液、天冬酰胺屏蔽液、谷氨酰胺屏蔽液中的至少一种。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，PNA捕获探针与靶基因杂交的方法包括，加入阻断液后在室温下震荡孵育20-40分钟，使用缓冲液清洗后加入不同浓度的靶基因，继续震荡孵育后使用缓冲液清洗。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述阻断液选自小牛胸腺DNA或鲑鱼精DNA的BLBs。
12.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3）中，环化的方法包括，加入DNA连接酶、连接缓冲液和双蒸水在35-40℃的条件下孵育1-2小时后，再于55-65℃的条件下孵育15-25分钟使所述DNA连接酶失活。
13.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶，所述连接酶缓冲液是10 × T4 DNA 连接缓冲液。
14.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3）中滚环扩增的方法包括，加入滚环扩增引物、DNA聚合酶、聚合缓冲液、牛血清白蛋白、dNTP和双蒸水，在35-40℃下孵育0.5-1.5小时，再于55-65℃的条件下孵育15-25分钟使所述DNA聚合酶失活。
15.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为phi 29 DNA聚合酶，所述聚合缓冲液是10 × phi 29 DNA反应缓冲液。
16.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述淬灭包括，将荧光探针与滚环扩增产物杂交的产物冷却后，加入淬灭剂、结合缓冲液和双蒸水。
17.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述淬灭剂是浓度为80-120μg/ml的氧化石墨烯。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810682300.0A CN108949924B (zh) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810682300.0A CN108949924B (zh) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108949924A CN108949924A (zh) | 2018-12-07 |
| CN108949924B true CN108949924B (zh) | 2021-10-08 |
Family
ID=64487498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810682300.0A Active CN108949924B (zh) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108949924B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12129516B2 (en) | 2020-02-07 | 2024-10-29 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| CN113767176A (zh) | 2018-12-10 | 2021-12-07 | 10X基因组学有限公司 | 成像系统硬件 |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| EP3976820A1 (en) | 2019-05-30 | 2022-04-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| WO2021092433A2 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| CN111154838B (zh) * | 2019-12-16 | 2020-12-29 | 浙江医药高等专科学校 | 一种cfDNA的荧光检测试剂盒和应用有该试剂盒的检测方法 |
| EP3891300B1 (en) | 2019-12-23 | 2023-03-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rna-templated ligation |
| US20210190770A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-24 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
| US12110541B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing high-resolution spatial arrays |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| WO2021216708A1 (en) | 2020-04-22 | 2021-10-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using targeted rna depletion |
| AU2021275906A1 (en) | 2020-05-22 | 2022-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| EP4153775B1 (en) | 2020-05-22 | 2024-07-24 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
| US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
| EP4162074B1 (en) | 2020-06-08 | 2024-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| EP4446430A2 (en) | 2020-06-10 | 2024-10-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| EP4172362B1 (en) | 2020-06-25 | 2024-09-18 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of dna methylation |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| EP4214330A1 (en) * | 2020-10-22 | 2023-07-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| WO2022140028A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| WO2022177367A1 (ko) * | 2021-02-18 | 2022-08-25 | 한국과학기술원 | 등온증폭 및 형광 링 패턴에 기반한 표적 핵산의 다중 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법 |
| EP4347879A1 (en) | 2021-06-03 | 2024-04-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| WO2023034489A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| CN114456802B (zh) * | 2022-02-18 | 2023-04-07 | 南京农业大学 | 一种比率型银纳米簇荧光探针及其制备方法与应用 |
| CN117089605B (zh) * | 2023-05-08 | 2024-05-03 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种基于fq-rca的rna等温实时基因分型方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104017861A (zh) * | 2014-04-23 | 2014-09-03 | 常州方圆制药有限公司 | 核酸检测方法 |
| CN104955963A (zh) * | 2012-11-14 | 2015-09-30 | 欧凌科公司 | Rca报告探针及其用于检测核酸分子的用途 |
-
2018
- 2018-06-27 CN CN201810682300.0A patent/CN108949924B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104955963A (zh) * | 2012-11-14 | 2015-09-30 | 欧凌科公司 | Rca报告探针及其用于检测核酸分子的用途 |
| CN104017861A (zh) * | 2014-04-23 | 2014-09-03 | 常州方圆制药有限公司 | 核酸检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Activating Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Underlying Responsiveness of Non–Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib;Thomas J. Lynch, M.D.,等;《The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE》;20040520;第350卷(第21期);第2129-2139页 * |
| DNA的滚环扩增技术研究进展;王晓亮等;《食品工业科技》;20120511;第33卷(第16期);第358页摘要、第358页右栏最后一段至第360页右栏第2段 * |
| Fluorometric Detection of MicroRNA Using Isothermal Gene Amplification and Graphene Oxide;Chaesun Hong等;《Analytical chemistry》;20160223;第88卷(第6期);第2999-3004页 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12129516B2 (en) | 2020-02-07 | 2024-10-29 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108949924A (zh) | 2018-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108949924B (zh) | 基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法 | |
| US11680286B2 (en) | Tag-sequence-attached two-dimensional cDNA library device, and gene expression analysis method and gene expression analysis apparatus each utilizing same | |
| JP6397065B2 (ja) | 単分子検出アッセイおよびその使用 | |
| KR101769893B1 (ko) | 혼성화에 의한 ｄｎａ 염기서열화 방법 | |
| WO2018184531A1 (zh) | 腹泻相关病原体多重rt-pcr联合基因芯片检测试剂盒 | |
| WO2011001496A1 (ja) | 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット | |
| JP6169603B2 (ja) | 単一分子のハイブリダイゼーションおよび操作によるｄｎａの検出および定量法 | |
| CN103937896B (zh) | 一种snp分型方法及试剂盒 | |
| US20200283831A1 (en) | Ided double-stranded probes for detection of nucleic acid and uses of same | |
| JP2006514826A (ja) | 核酸を分析するためのラボ・オン・チップシステム | |
| CN116356079A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 | |
| RU2528247C2 (ru) | Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления | |
| JPH05503215A (ja) | Ｄｎａ配列を即時に蛍光検出する方法 | |
| JPWO2003100095A1 (ja) | 標的核酸の検出法 | |
| JP2005253389A (ja) | 核酸検出方法 | |
| CN106555010A (zh) | 人类乳头瘤病毒检测试剂盒及检测方法 | |
| CN117210584A (zh) | 一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的试剂盒 | |
| CN114729347A (zh) | 未分化标记基因高灵敏度检测法 | |
| CN103981258B (zh) | 一种易感基因snp位点检测方法及试剂盒 | |
| US20030073091A1 (en) | Use of generic oligonucleotide microchips to detect protein-nucleic acid interactions | |
| CN111154838B (zh) | 一种cfDNA的荧光检测试剂盒和应用有该试剂盒的检测方法 | |
| WO2006093150A1 (ja) | シグナル増幅方法 | |
| CN115976197A (zh) | 基于CRISPR-Cas13快速检测痛风ABCG2 SNP基因型的试剂盒及方法 | |
| US20090035776A1 (en) | Method and Kit for Hla-B Genotyping Based on Real-Time Pcr | |
| CN1782096B (zh) | 利用zip编码的pna芯片及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |