CN108884020A

CN108884020A - 氨基酸及肽共轭物以及共轭过程

Info

Publication number: CN108884020A
Application number: CN201780021838.0A
Authority: CN
Inventors: 玛格丽特·安妮·布林布尔; 杰弗里·马丁·威廉斯; 彼得·罗德里克·邓巴; 丹尼尔·弗登
Original assignee: Auckland Uniservices Ltd
Current assignee: Auckland Uniservices Ltd
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2018-11-23
Also published as: TW201735952A; AU2017223267B2; AU2017223267A1; WO2017145097A3; IL261112A; BR112018017174A2; JP7161404B2; AU2021254527A1; EP3419962A4; WO2017145097A2; US20190046636A1; CA3014515A1; SG11201807036QA; US11464853B2; JP2019509280A; KR20180128915A; EP3419962A2; EA201891639A1

Abstract

本发明涉及氨基酸及肽共轭物、制备氨基酸及肽共轭物的方法、通过所述方法生产的共轭物以及包含所述共轭物的医药组合物。本发明还意欲涵盖在受试者中引起免疫反应的方法及对受试者进行接种的方法、所述共轭物用于其的用途、以及所述共轭物在制造用于其的药物中的用途。

Description

氨基酸及肽共轭物以及共轭过程

技术领域

本发明涉及氨基酸及肽共轭物、制备氨基酸及肽共轭物的方法、通过所述方法生产的共轭物、包含所述共轭物的医药组合物、在受试者中引起免疫反应的方法及对受试者进行接种的方法、所述共轭物用于其的用途以及所述共轭物在制造用于其的药物中的用途。本发明也涉及制备可用于合成本发明的氨基酸及肽共轭物的化合物的方法以及涉及此类化合物。

背景技术

合成肽疫苗通常包含蛋白质抗原的免疫原性部分的合成复本。这种疫苗开发方法具有许多优点，包括易于合成、避免潜在的毒性生物副产物以及表征简便。

开发肽疫苗的关键问题在于作为唯一疫苗组分的肽展现不出免疫原性。通常需要在疫苗中包含佐剂，用以激活先天免疫系统的各组成部分(例如弗氏佐剂(Freund'sadjuvant))。

肽疫苗设计中的另一替代策略是发明其中相关肽表位共价联接到适宜佐剂的自佐疫苗。与抗原与外部佐剂的简单共制剂相比，此类自佐疫苗可具有增强的抗原吸收、递呈及树突细胞成熟。

已开发数种自佐疫苗，但所述疫苗的制备会很复杂。

对新的自佐疫苗以及制造自佐疫苗的新方法的需要不断增长。本发明的目的是在一定程度上满足所述需要；及/或至少为公众提供有用的选择。

自以下仅通过举例说明给出的描述可明了本发明的其他目的。

本说明书中包含的对文献、法案、材料、装置、对象等的任何讨论仅出于为本发明提供背景的目的。不应将其视为承认任何或所有所述事项形成现有技术基础的一部分或是在优先日期之前存在的与本发明相关的领域中的常见一般知识。

发明内容

在一个方面中，本发明总体上是在于一种式(I)的氨基酸或肽共轭化合物：

其中

m及w分别独立地为0至7的整数且v为0至5的整数，

其限制条件为：

m、v与w的和至少为3；且

m与w的和为0至7；

n为1或2；

Z¹及Z²分别独立地选自由O–、–NR–、–S–、–S(O)–、–SO₂–、–C(O)O–、–OC(O)–、–C(O)NR–、–NRC(O)–、–C(O)S–、–SC(O)–、–OC(O)O–、–NRC(O)O–、–OC(O)NR–及–NRC(O)NR–组成的群组；

R¹、R²、R^x、R^y、R⁴、R⁵、R⁶及R⁷在m、v、w及n的每一情形下均分别独立地为氢或C1-6脂族基；

R、R³及R⁸分别独立地为氢或C1-6脂族基；

R⁹为氢、C1-6脂族基、氨基保护基、L³–C(O)–或A²；

L¹及L²分别独立地选自C5-21脂族基或C4-20杂脂族基；

L³为C1-21脂族基或C2-20杂脂族基；

A¹为氨基酸、肽、OH、OP¹、NH₂或NHP²，其中P¹为羧基保护基，且其中P²为羧酰胺(carboxamide)保护基；

A²为氨基酸或肽；

其中R、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R^x、R^y、L¹、L²及L³其中的任一者中存在的任一脂族基或杂脂族基视需要经取代；

或其医药上可接受的盐或溶剂合物。

除非另有规定或上下文另有说明，否则本文中所描述的实施例或优选例其中的任一者可涉及单独的本文中方面中的任一者或与本文中所描述任何一或多个实施例或优选例组合。

在多个不同实施例中，

R¹、R²、R^x、R^y、R⁴、R⁵、R⁶及R⁷在m、v、w、及n的每一情形下均分别独立地为氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或C3-6环烷基；

R、R³及R⁸分别独立地为氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或C3-6环烷基；

R⁹为氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、氨基保护基、L³–C(O)或A²；

L¹及L²分别独立地选自C5-21烷基、C5-21烯基、C5-21炔基或C4-20杂烷基；

L³为C1-21烷基、C5-21烯基、C5-21炔基、C3-6环烷基或C2-20杂烷基；

A¹为氨基酸、肽、OH、OP¹、NH₂或NHP²，其中P¹为羧基保护基，且其中P²为羧酰胺保护基；

A²为氨基酸或肽；

其中R、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R^x、R^y、L¹、L²及L³其中的任一者中存在的任一烷基、烯基、炔基、环烷基或杂烷基视需要经取代。

在多个不同实施例中，

R¹、R²、R^x、R^y、R⁴、R⁵、R⁶及R⁷在m、v、w、及n的每一情形下均分别独立地为氢、C1-6烷基、C2-6烯基或C3-6环烷基；

R、R³及R⁸分别独立地为氢、C1-6烷基、C2-6烯基或C3-6环烷基；

R⁹为氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C3-6环烷基、氨基保护基、L³–C(O)或A²；

L¹及L²分别独立地选自C5-21烷基、C5-21烯基或C4-20杂烷基；

L³为C1-21烷基、C5-21烯基、C3-6环烷基或C2-20杂烷基；

A²为氨基酸或肽；

其中R、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R^x、R^y、L¹、L²及L³其中的任一者中存在的任一烷基、烯基、环烷基或杂烷基视需要经取代。

在多个不同实施例中，

R¹、R²、R^x、R^y、R⁴、R⁵、R⁶及R⁷在m、v、w、及n的每一情形下均分别独立地为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基；

R、R³及R⁸分别独立地为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基；

R⁹为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、氨基保护基、L³–C(O)或A²；

L¹及L²分别独立地选自C5-21烷基、C5-21烯基或C4-20杂烷基；

L³为C1-21烷基、C2-21烯基、C3-6环烷基或C2-20杂烷基；

A²为氨基酸或肽；

在多个不同实施例中，

R、R³及R⁸分别独立地为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基；

R⁹为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、氨基保护基、L³–C(O)或A²；

L¹及L²分别独立地选自C5-21烷基或C4-20杂烷基；

L³为C1-21烷基、C3-6环烷基或C2-20杂烷基；

A²为氨基酸或肽；

其中R、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R^x、R^y、L¹、L²及L³其中的任一者中存在的任一烷基、环烷基或杂烷基视需要经取代。

在多个不同实施例中，Z¹及Z²分别独立地选自由–C(O)O–、–C(O)NR–及–C(O)S–组成的群组。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为式(IA)的化合物：

在多个不同实施例中，v为0至4、0至3或0至2，或v为0或1，举例而言为0。

在某些实施例中，v为0至3。在例示性实施例中，v为0。

在多个不同实施例中，m及w分别独立地为0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。

在多个不同实施例中，m及w分别独立地为0至5。

在某些实施例中，m及w分别独立地为1至4。

在多个不同实施例中，m为1至6，例如2至6、1至5或2至5。在多个不同实施例中，m为1至5。在多个不同实施例中，m为1至3。在例示性实施例中，m为2。

在多个不同实施例中，w为1或2。在例示性实施例中，w为1。

在多个不同实施例中，m与w的和为0至6、0至5、0至4、0至3、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。

在多个不同实施例中，m与w的和为2至7。

在某些实施例中，m与w的和为2至5。

在例示性实施例中，m与w的和为3。

在多个不同实施例中，v为0至3；m及w分别独立地为0至5；且m与w的和为2至7。

在多个不同实施例中，v为1或0；m及w分别独立地为0至5；且m与w的和为2至7。

在多个不同实施例中，v为1或0；m及w分别独立地为1至4；且m与w的和为2至7。

在多个不同实施例中，v为1或0；m及w分别独立地为1至4；且m与w的和为2至5。

在某些实施例中，v为1或0；m为1至6；且w为1或2。在某些实施例中，v为1或0；m为1至5；且w为1或2。

在某些实施例中，v为0或1；m为1至3；且w为1或2。

在例示性实施例中，v为0；m为2；且w为1。

在例示性实施例中，n为1。

在某些实施例中，L¹及L²分别独立地为C5-21脂族基，例如C9-21脂族基、C11-21脂族基、或C11-、C13-、C15-、C17-或C19-脂族基。

在某些实施例中，L¹及L²分别独立地为C5-21烷基。

在多个不同实施例中，L¹及L²分别独立地为C9-21烷基。在另一实施例中，L¹及L²分别独立地为C11-21烷基。

在多个不同例示性实施例中，L¹及L²分别独立地为C11、C13、C15、C17或C19烷基，较佳地为正烷基。

在多个不同特别意欲涵盖的实施例中，L¹及L²分别独立地为C15烷基。

在多个不同实施例中，L¹及L²分别独立地为9至21个碳原子的直链。

在例示性实施例中，L¹及L²分别独立地为C15直链烷基。

在一些实施例中，L³为C1-21烷基。

在多个不同实施例中，L³为甲基或C15直链烷基。

在例示性实施例中，L³为甲基(亦即，R⁹为乙酰基)。

在一些实施例中，所述氨基保护基为Boc、Fmoc、Cbz(苄氧羰基)、Nosyl(邻-或对-硝基苯基磺酰基)、Bpoc(2-(4-联苯基)异丙氧羰基)及Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚己基)乙基)。

在多个不同实施例中，所述氨基保护基为Boc或Fmoc。

在一些实施例中，所述氨基保护基为Fmoc。

在一些实施例中，所述羧基保护基为第三丁基、苄基或烯丙基。

在多个不同实施例中，所述羧酰胺保护基为Dmcp或三苯甲基。

在多个不同实施例中，R¹及R²在m的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢。在多个不同特别意欲涵盖的实施例中，R¹及R²在m的每一情形下均分别为氢。

在多个不同实施例中，R³为C1-6烷基或氢。在多个不同特别意欲涵盖的实施例中，R³为氢。

在多个不同实施例中，R⁴及R⁵在w的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢，较佳为氢。在多个不同特别意欲涵盖的实施例中，R⁴及R⁵在w的每一情形下均分别为氢。

在多个不同实施例中，R^x及R^y在v的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢。在多个不同特别意欲涵盖的实施例中，R^x及R^y在v的每一情形下均分别为氢。

在多个不同实施例中，R⁶及R⁷在n的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢。在多个不同特别意欲涵盖的实施例中，R⁶及R⁷分别为氢。

在多个不同实施例中，R⁸独立地为C1-6烷基或氢。在例示性实施例中，R⁸为氢。

在多个不同实施例中，R⁹为C1-6烷基、氢、氨基保护基、L³–C(O)或A²。在例示性实施例中，R⁹为氢、氨基保护基、L³–C(O)或A²。

在多个不同实施例中，R⁸为氢且R⁹为氢、氨基保护基、L³–C(O)或A²。

在多个不同实施例中，R⁸及R⁹分别为氢；或R⁹为L³–C(O)或A²。

在多个不同例示性实施例中，R⁸为氢且R⁹为L³–C(O)。在多个不同特别意欲涵盖的实施例中，R⁹为L³–C(O)，其中L³为甲基。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为式(IF)的化合物：

其中m为2至6的整数，较佳为2；且

其余变量为如所述式(I)的化合物或其任何实施例中所定义。

在多个不同实施例中，所述式(IF)的化合物为式(IF-1)的化合物：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为式(IB)的化合物：

其中

k为0至4的整数；且

R^a、R^b及R^c分别独立地为氢或C1-6脂族基。

在多个不同实施例中，所述式(IB)的化合物为式(IC)的化合物：

在多个不同实施例中，k为0至3、0至2、0至1、1至4、1至3或1至2，或k为0或1。

在某些实施例中，k为0至3。

在某些实施例中，k为0或1。

在例示性实施例中，k为0。

在某些实施例中，k等于v。

在多个不同实施例中，R^a、R^b及R^c分别独立地为氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或C3-6环烷基。

在多个不同实施例中，R^a、R^b及R^c分别独立地为氢、C1-6烷基、C2-6烯基或C3-6环烷基。

在多个不同实施例中，R^a、R^b及R^c分别独立地为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基。

在多个不同实施例中，R^a、R^b及R^c分别独立地选自氢或C1-6烷基，较佳为氢。在例示性实施例中，R^a、R^b及R^c分别为氢。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为式(ID)的化合物：

在某些实施例中，所述化合物为式(ID)的化合物，其中L¹及L²分别为C15直链烷基。

在多个不同实施例中，L¹及L²分别独立地为C11-21烷基；m为2；v为0；w为1；R¹及R²在每一情形下均分别为氢；R³为氢；且R⁴及R⁵分别为氢。

在多个不同实施例中，n为1；R⁶、R⁷及R⁸分别为氢；且R⁹为氢、氨基保护基、L³–C(O)或A²。

在多个不同实施例中，n为1；R⁶、R⁷及R⁸分别为氢；且R⁹为氢、氨基保护基或L³–C(O)，其中L³为C15直链烷基或甲基。

在多个不同实施例中，L¹及L²分别独立地为C11-21烷基；m为2；v为0；w为1；R¹及R²在每一情形下均分别为氢；R³为氢；R⁴及R⁵分别为氢；n为1；R⁶、R⁷及R⁸分别为氢；且R⁹为氢、氨基保护基或L³–C(O)，其中L³为C15直链烷基或甲基。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IE)：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IEE)：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IE-1)：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IEE-1)：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IE-2)：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IEE-2)：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IEE-3)：

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物具有式(IEE-4)：

在多个不同实施例中，与脂质部分共轭的所述氨基酸或肽共轭物的氨基酸为半胱氨酸残基。

所属领域的技术人员将理解，在某些实施例中，L¹-Z¹-及L²-Z²-部分可为脂肪酸基团，例如脂肪酸酯。在多个不同实施例中，所述部分可为饱和或不饱和的脂肪酸酯。在一些实施例中，脂肪酸为饱和的。

在多个不同实施例中，所述脂肪酸为C4-22脂肪酸。在一些实施例中，所述脂肪酸为C6-22脂肪酸。

在某些实施例中，所述脂肪酸为C10-22脂肪酸。在某些特别意欲涵盖的实施例中，所述脂肪酸为C12-22脂肪酸。在多个不同例示性实施例中，所述脂肪酸为C12、C14、C16、C18或C20脂肪酸。

在一些实施例中，所述脂肪酸为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、棕榈油酸、油酸、反油酸、亚油酸、α-亚麻酸及花生四烯酸。

在多个不同实施例中，所述脂肪酸为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸。

在某些例示性实施例中，所述脂肪酸为棕榈酸(且L¹-Z¹-及L²-Z²-部分分别为棕榈酰基)。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为氨基酸共轭物。

在一些实施例中，A¹为OH、OP¹、NH₂或NHP²及/或R⁹为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、氨基保护基或L³-C(O)。

在一些实施例中，A¹为OP¹或OH及/或R⁹为氢、氨基保护基或L³–C(O)。

在多个不同实施例中，A¹为OH、OP¹、NH₂或NHP²且R⁹为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、氨基保护基或L³–C(O)。

在多个不同实施例中，A¹为OH或OP¹，且R⁹为氢、氨基保护基或L³–C(O)。

在多个不同实施例中，R⁹为氢、氨基保护基或L³–C(O)。在一些实施例中，R⁹为氢或L³–C(O)。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为肽共轭物。

在多个不同实施例中，A¹及/或A²为氨基酸或肽。

在一些实施例中，A¹及/或A²为肽。

在一个实施例中，A¹及/或A²为包含表位的肽。

在一些实施例中，A¹及/或A²为包含肽表位的肽。

在另一实施例中，A¹及/或^A2为肽，其中所述肽包含肽表位。

在一些实施例中，A¹及/或A²为经表位取代的肽。

在一些实施例中，所述表位经由连接基结合至肽。

在某些实施例中，A¹为肽。

在某些例示性实施例中，A¹为肽且R⁹不为A²(亦即，R⁹不为氨基酸或肽)。

在多个不同实施例中，所述肽包含表位。

在多个不同实施例中，所述表位为肽表位。

在某些实施例中，所述表位经由连接基偶合或结合。

在多个不同实施例中，与脂质部分共轭的所述肽共轭物的氨基酸为N端氨基酸残基。

在多个不同实施例中，A¹为丝氨酸或包含丝氨酸作为第一N端氨基酸残基的肽。

在一些实施例中，A¹为包含丝氨酸作为第一N端氨基酸残基的肽。

在多个不同实施例中，所述肽共轭物包含一或多个增溶基。

在一些实施例中，所述增溶基包含在肽链中含有二或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。

在多个不同实施例中，所述增溶基为在肽链中含有二或更多个连续亲水性氨基酸残基的序列的氨基酸序列。

在多个不同实施例中，所述二或更多个亲水性氨基酸残基与所述丝氨酸残基相毗邻。

在一些实施例中，A¹及/或A²为包含增溶基的肽。

在多个不同实施例中，A¹及/或A²为包含增溶基的肽，所述增溶基包含在肽链中含有二或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。

在某些实施例中，A¹为包含增溶基的肽，所述增溶基包含在肽链中含有二或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。

在一些实施例中，A¹为包含丝氨酸作为第一N端氨基酸残基并包含增溶基的肽，所述增溶基包含在肽链中含有二或更多个与丝氨酸毗邻的亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述化合物包含连接体(linker)或其一或多个氨基酸。在一些实施例中，所述肽包含连接体或其一或多个氨基酸。

在一些实施例中，所述肽包含肽表位，所述肽表位经由连接体结合至与脂质部分结合的氨基酸。

在一些实施例中，所述肽包含二或更多个表位。

在一些实施例中，所述肽包含肽抗原。

在一些实施例中，所述连接体为长度为约2至20个、2至18个、2至16个、2至14个、2至12个、2至10个或2至8个氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述式(1)的化合物包含3或更多个、4或更多个或5或更多个连续氨基酸。

在多个不同实施例中，所述肽共轭物为脂肽。

在一些实施例中，A¹及/或A²分别独立地为包含约8至220个、8至200个、8至175个、8至150个、8至125个、8至100个、8至90个、8至80个、8至70个、8至60个、8至50个、8至40个、8至30个、8至25个、8至20个或8至15个氨基酸的肽。在一个例示性实施例中，A¹及A²分别独立地为包含约8至60个氨基酸的肽。

在有的实施例中，A¹及/或A²分别独立地为包含约8至220个、8至200个、8至175个、8至150个、8至125个、8至100个、8至90个、8至80个、8至70个、8至60个、8至50个、8至40个、8至30个、8至25个、8至20个或8至15个氨基酸的肽。

在有的实施例中，A¹及/或A²分别独立地为包含约5至150个、5至125个、5至100个、5至75个、5至60个、5至50个、5至40个、5至30个、5至25个、5至20个、8至150个、8至125个、8至100个、8至75个、8至60个、8至50个、8至40个、8至30个、8至25个或8至20个氨基酸的肽。

在一些实施例中，A¹及/或A²分别独立地为肽，其中所述肽包含8至60个氨基酸。

在一些实施例中，A¹及/或A²分别独立地为包含肽表位或经肽表位取代的肽，其中所述肽表位包含8至60个氨基酸。

适宜的肽表位包括但并不仅限于在2015年12月22日提出申请的WO 2016/103192中所描述的肽表位，WO 2016/103192的全文并入本文中供参考。

在多个不同实施例中，所述肽包含一或多个EBV LMP2表位、基本上由其组成或由其组成。在多个不同实施例中，所述一或多个EBV LMP2表位为MHCI表位。在多个不同实施例中，所述肽包含一或多个选自由SEQ ID NO 76至SEQ ID NO 101其中的任一者组成的群组的EBV LMP2表位。在多个不同实施例中，所述肽包括包含8或更多个来自SEQ ID NO1至SEQID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。在多个不同实施例中，所述肽包括包含12或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。在多个不同实施例中，所述肽包括包含15或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽，或包含20或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。

在多个不同实施例中，所述肽包括重组肽，所述重组肽包含12或更多个来自SEQID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成。在多个不同实施例中，所述重组肽包含15或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成，或包含20或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成。

在多个不同实施例中，所述肽包含氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者组成的群组。

在多个不同实施例中，所述肽包含氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由下列组成的群组

(a)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQID NO:1]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(b)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ IDNO:2]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(c)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:3]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(d)8或更多个来自序列SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:4]的连续氨基酸残基，

(e)8或更多个来自序列DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:5]的连续氨基酸残基，

(f)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:6]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(g)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQID NO:7]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(h)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ IDNO:8]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(i)8或更多个来自序列SKKKKSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:9]的连续氨基酸残基，

(j)8或更多个来自序列SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:10]的连续氨基酸残基，

(k)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ IDNO:11]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(l)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:12]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(m)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:13]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(n)8或更多个来自序列SKKKKSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:14]的连续氨基酸残基，

(o)8或更多个来自序列SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:15]的连续氨基酸残基，

(p)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:16]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(q)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:17]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(r)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:18]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(s)8或更多个来自序列SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:19]的连续氨基酸残基，

(t)8或更多个来自序列DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:20]的连续氨基酸残基，

(u)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL

[SEQ ID NO:21]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(v)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ ID NO:22]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(w)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQID NO:23]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(x)8或更多个来自序列SKKKKLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ IDNO:24]的连续氨基酸残基，

(y)8或更多个来自序列LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ ID NO:25]的连续氨基酸残基，

(z)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:26]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(aa)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:27]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(bb)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:28]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(cc)8或更多个来自序列SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:29]的连续氨基酸残基，

(dd)8或更多个来自序列LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ IDNO:30]的连续氨基酸残基，

(ee)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ IDNO:31]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(ff)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:32]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(gg)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:33]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(hh)8或更多个来自序列SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:34]的连续氨基酸残基，

(ii)8或更多个来自序列LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:35]的连续氨基酸残基，

(jj)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:36]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(kk)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQID NO:37]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(ll)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ IDNO:38]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(mm)8或更多个来自序列SKKKKLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:39]的连续氨基酸残基，

(nn)8或更多个来自序列LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:40]的连续氨基酸残基，

(oo)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:41]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(pp)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:42]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(qq)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:43]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(rr)8或更多个来自序列SKKKKLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:44]的连续氨基酸残基，

(ss)8或更多个来自序列LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:45]的连续氨基酸残基，

(tt)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ ID NO:46]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(uu)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ ID NO:47]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(vv)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ ID NO:48]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(ww)8或更多个来自序列SKKKKFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ ID NO:49]的连续氨基酸残基，

(xx)8或更多个来自序列FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQID NO:50]的连续氨基酸残基，

(yy)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:51]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(zz)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:52]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(aaa)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:53]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(bbb)8或更多个来自序列SKKKKLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:54]的连续氨基酸残基，

(ccc)8或更多个来自序列LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:55]的连续氨基酸残基，

(ddd)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:56]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(eee)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:57]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(fff)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:58]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(ggg)8或更多个来自序列SKKKKSGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:59]的连续氨基酸残基，

(hhh)8或更多个来自序列SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:60]的连续氨基酸残基，

(iii)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:61]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(jjj)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:62]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(kkk)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:63]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(lll)8或更多个来自序列SKKKKSNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:64]的连续氨基酸残基，

(mmm)8或更多个来自序列SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:65]的连续氨基酸残基，

(nnn)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:66]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(ooo)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:67]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(ppp)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:68]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(qqq)8或更多个来自序列SKKKKGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:69]的连续氨基酸残基，

(rrr)8或更多个来自序列GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:70]的连续氨基酸残基，

(sss)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:71]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(ttt)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:72]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(uuu)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:73]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S或亲水性氨基酸，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(vvv)8或更多个来自序列SKKKKAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:74]的连续氨基酸残基，

(www)8或更多个来自序列AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:75]的连续氨基酸残基，

(xxx)SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:75其中的任一者的序列，

(yyy)8或更多个来自下列其中的任一者的序列的连续氨基酸残基

ESNEEPPPPY[SEQ ID NO:76]，

SNEEPPPPY[SEQ ID NO:77]，

HSDYQPLGT[SEQ ID NO:78]，

PLGTQDQSL[SEQ ID NO:79]，

PLGTQDQSLY[SEQ ID NO:80]，

LGTQDQSLY[SEQ ID NO:81]，

GTQDQSLYL[SEQ ID NO:82]，

GTQDQSLYL[SEQ ID NO:83]，

GTQDQSLYLG[SEQ ID NO:84]，

QSLYLGLQH[SEQ ID NO:85]，

SLYLGLQHD[SEQ ID NO:86]，

GLQHDGNDGL[SEQ ID NO:87]，

GNDGLPPPPY[SEQ ID NO:88]，

GLPPPPYSP[SEQ ID NO:89]，

GLPPPPYSPR[SEQ ID NO:90]，

PRDDSSQHIY[SEQ ID NO:91]，

RDDSSQHIY[SEQ ID NO:92]，

HIYEEAGRG[SEQ ID NO:93]，

ILLARLFLY[SEQ ID NO:94]，

SSCSSCPLSKI[SEQ ID NO:95]，

LLWTLVVLL[SEQ ID NO:96]，

FLYALALLL[SEQ ID NO:97]，

CLGGLLTMV[SEQ ID NO:98]，

LIVDAVLQL[SEQ ID NO:99]，

LTAGFLIFL[SEQ ID NO:100]，

TVCGGIMFL[SEQ ID NO:101]，

(zzz)SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:101其中的任一者的序列，

(aaaa)或者以上(a)至(zzz)中的二或更多者的任一组合。

在一个例示性实施例中，所述肽包含一或多个衍生自潜伏膜蛋白2(LatentMembrane Protein 2，LMP2)、例如衍生自全长EBV LMP2(氨基酸1-497)的表位。在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述肽包含氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由下列组成的群组：8或更多个来自SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74或75其中的任一者的连续氨基酸残基。

在另一特别意欲涵盖的实施例中，所述肽包含氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由下列组成的群组：12或更多个来自SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74或75其中的任一者的连续氨基酸残基。

在另一特别意欲涵盖的实施例中，所述肽包含氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由下列组成的群组：15或更多个、18或更多个、20或更多个或者25或更多个来自SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74或75其中的任一者的连续氨基酸残基。

在一个实施例中，所述肽包含氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由下列组成的群组：SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74或75其中的任一者。

在另一特别意欲涵盖的实施例中，所述肽包含氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由下列组成的群组：15或更多个、18或更多个、20或更多个或者25或更多个来自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:75其中的任一者的氨基酸残基。

在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:75其中的任一者组成的群组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:101其中的任一者组成的群组的氨基酸序列。在一个实例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至SEQ IDNO:93其中的任一者组成的群组的氨基酸序列。

在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:101其中的任何二或更多者组成的群组的氨基酸序列。在一个实例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:93其中的任何二或更多者组成的群组的氨基酸序列。

在多个不同实施例中，所述肽包含选自由下列组成的群组的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成：

(a)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL[SEQ ID NO:102]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(b)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL[SEQ ID NO:103]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(c)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL[SEQID NO:104]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(d)8或更多个来自序列SKKKKGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL[SEQID NO:105]的连续氨基酸残基，

(e)SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:105其中的任一者的序列，

(f)8或更多个来自序列GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL[SEQ ID NO:106]的连续氨基酸残基，

(g)SEQ ID NO:106的序列，

(h)8或更多个来自序列LAMPFATPM[SEQ ID NO:107]的连续氨基酸残基，

(i)SEQ ID NO:107的序列，

(j)8或更多个来自序列FATPMEAEL[SEQ ID NO:108]的连续氨基酸残基，

(k)SEQ ID NO:108的序列，

(l)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR[SEQ IDNO:109]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(m)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR[SEQ ID NO:110]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(n)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR[SEQ ID NO:111]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(o)8或更多个来自序列SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR[SEQ ID NO:112]的连续氨基酸残基，

(p)SEQ ID NO:109至SEQ ID NO:112其中的任一者的序列，

(q)8或更多个来自序列VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR[SEQ ID NO:113]的连续氨基酸残基，

(r)SEQ ID NO:113的序列，

(s)8或更多个来自序列EFTVSGNIL[SEQ ID NO:114]的连续氨基酸残基，

(t)SEQ ID NO:114的序列，

(u)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄LQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR[SEQID NO:115]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(v)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃LQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR[SEQ IDNO:116]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(w)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂LQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR[SEQ ID NO:117]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(x)8或更多个来自序列SKKKKLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR[SEQ ID NO:118]的连续氨基酸残基，

(y)SEQ ID NO:115至SEQ ID NO:118其中的任一者的序列，

(z)8或更多个来自序列LQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR[SEQ ID NO:119]的连续氨基酸残基，

(aa)SEQ ID NO:119的序列，

(bb)8或更多个来自序列SLLMWITQCFLPVF[SEQ ID NO:120]的连续氨基酸残基，

(cc)SEQ ID NO:120的序列，

(dd)8或更多个来自序列SLLMWITQC[SEQ ID NO:121]的连续氨基酸残基，

(ee)SEQ ID NO:121的序列，

(ff)或者以上(a)至(ee)中的二或更多者的任何组合。

在一个例示性实施例中，所述肽表位衍生自NY-ESO-1。在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述肽包含氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由8或更多个来自SEQ ID NO:106、107、108、113、114、119、120及121其中的任一者的连续氨基酸残基组成的群组。

在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:106、107、108、113、114、119、120及121其中的任一者组成的群组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:106、113及119其中的任一者组成的群组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:105、112及118其中的任一者组成的群组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在多个不同实施例中，所述肽包含一或多个卵白蛋白蛋白质(ovalbuminprotein)表位、基本上由其组成或由其组成。在多个不同实施例中，所述一或多个卵白蛋白蛋白质为MHCI表位。在多个不同实施例中，所述一或多个卵白蛋白蛋白质为MHCII表位。

在多个不同实施例中，所述肽包含下列、基本上由其组成或由其组成：

(a)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT[SEQ ID NO:124]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，Xaa₃不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₄不存在或为一或多个亲水性氨基酸，

(b)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT[SEQ IDNO:125]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，Xaa₂不存在或为亲水性氨基酸，且Xaa₃不存在或为1至10个亲水性氨基酸，

(c)8或更多个来自序列Xaa₁Xaa₂KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT[SEQ ID NO:126]的连续氨基酸残基，其中Xaa₁不存在或为S，且Xaa₂不存在或为1至4个亲水性氨基酸，

(d)8或更多个来自序列SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT[SEQ ID NO:127]的连续氨基酸残基，

(e)SEQ ID NO:124至SEQ ID NO:127其中的任一者的序列，

(f)8或更多个来自序列KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT[SEQ ID NO:128]的连续氨基酸残基，

(g)SEQ ID NO:128的序列，

(h)8或更多个来自序列SIINFEKL[SEQ ID NO:129]的连续氨基酸残基，

(i)SEQ ID NO:129的序列，

(j)8或更多个来自序列ISQAVHAAHAEINEAGR[SEQ ID NO:130]的连续氨基酸残基，

(k)SEQ ID NO:130的序列，

(l)或者以上(a)至(k)中的任何二或更多者的任何组合。

在多个不同实施例中，所述肽包含一或多个选自由SEQ ID NO:124至SEQ ID NO:130其中的任一者组成的群组的卵白蛋白蛋白质表位。在多个不同实施例中，所述肽包括包含8或更多个来自SEQ ID NO:124至SEQ ID NO:130其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。

在多个不同实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:124至SEQ ID NO:130其中的任一者组成的群组的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。

在一个实施例中，所述肽共轭物包含二或更多个表位，例如二或更多个肽表位。

在一些实施例中，所述肽共轭物包含抗原肽。

在特别意欲涵盖的实施例中，所述肽为合成肽。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为分离的式(I)的化合物。

在多个不同实施例中，所述式(I)的化合物为纯的、经纯化的或实质纯的式(I)的化合物。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种制备式(XV)的化合物的方法，所述方法包含使

式(XVI)的环氧化物：

式(III)的包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体：

在有效地使所述环氧化物与所述含氨基酸共轭配偶体共轭并提供所述式(XV)的化合物的条件下反应：

其中

X¹⁰为L¹–Z¹–、–OH、–SH、–NHR、HNRC(O)O-、P¹⁰–O–、P¹¹–S–、P¹²–NR–或P¹²-NRC(O)O-；

X¹¹为X¹⁰或当X¹⁰为P¹⁰-O-、P¹¹-S-、P¹²–NR–或P¹²-NRC(O)O-且所述条件有效地移除P¹⁰、P¹¹或P¹²时为–OH、–SH、–NHR、或HNRC(O)O-；

P¹⁰、P¹¹及P¹²分别独立地为保护基；

m为2至6的整数；且

n、L¹、Z¹、R、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹及A¹为如所述式(I)的化合物或其任何实施例中所定义；或其盐或溶剂合物。

在多个不同实施例中，m为2至5、2至4或2至3。在例示性实施例中，m为2。

在多个不同实施例中，X¹⁰为L¹–Z¹–或–OH、–SH、–NHR、P¹⁰–O–、P¹¹–S–或P¹²–NR–；且X¹¹为X¹⁰或–OH、–SH或–NHR。

在多个不同实施例中，X¹⁰为L¹–Z¹–、–OH或P¹⁰–O–；且X¹¹为X¹⁰或–OH。

在多个不同实施例中，X¹⁰为L¹–C(O)O–、OH或P¹⁰–O–；且X¹¹为L¹–C(O)O–、P¹⁰–O–或OH。

在多个不同实施例中，X¹⁰为L¹–C(O)O–或P¹⁰–O–；且X¹¹为L¹–C(O)O–、P¹⁰–O–或OH。

在例示性实施例中，X¹⁰为P¹⁰–O–；且X¹¹为P¹⁰–O–或OH。

在多个不同实施例中，R⁹不为氢及/或A¹不为OH。

在多个不同实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体为包含15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少或者3个或更少的氨基酸残基的含肽共轭配偶体。

在多个不同实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体的C端由羧基保护基或羧酰胺保护基保护及/或所述含氨基酸共轭配偶体的Nα-氨基由氨基保护基保护。

在例示性实施例中，R⁹为氨基保护基。

在多个不同实施例中，A¹为OP¹或NHP²。在某些实施例中，A1为OP¹。

在例示性实施例中，R⁹为氨基保护基以及A¹为OP¹。

在多个不同实施例中，所述方法包含使环氧化物与含氨基酸共轭配偶体在例如强酸等酸的存在下反应。

在某些实施例中，所述酸包括氢氯酸、硫酸或其混合物。

在某些实施例中，所述酸包括刘易斯酸(lewis acid)，例如三氟化硼(BF₃)。

在有的实施例中，所述方法包含使环氧化物与含氨基酸共轭配偶体在中性条件下反应。

在多个不同实施例中，中性条件包含质子溶剂，例如醇，如乙醇。

在有的实施例中，所述方法包含使环氧化物与含氨基酸共轭配偶体在例如弱碱等碱的存在下反应。

在一些实施例中，所述碱为有机碱，例如三乙胺。

在多个不同实施例中，所述方法包含通过使式(XVII)的烯烃：

在有效地环氧化所述烯烃的条件下与氧化剂反应而提供所述环氧化物。

在多个不同实施例中，所述氧化剂为过氧化物，例如有机过氧化物，如间-氯过氧苯甲酸，或为有机N-氧化物，例如吡啶N-氧化物。

在多个不同实施例中，所述方法包含通过使式(XVII-A)的化合物(其中LG为离去基)：

在有效地进行环氧化的条件下与碱反应而提供所述环氧化物。

在多个不同实施例中，所述式(XVII-A)的化合物自L-天冬氨酸制备。

在多个不同实施例中，所述方法还包含提供所述式(XVI)的环氧化物的单个立体异构体或富立体异构(stereoisomerically enriched)混合物。

在多个不同实施例中，提供所述式(XVI)的环氧化物的单个立体异构体或富立体异构混合物包含解析所述环氧化物的外消旋混合物。

在多个不同实施例中，所述方法包含提供所述式(XVII-A)的化合物的单个立体异构体或富立体异构混合物。

在多个不同实施例中，所述方法包含通过一或多个额外合成步骤将所述式(XV)的化合物转化为本发明的式(IF)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物：

在多个不同实施例中，所述方法包含通过一或多个额外合成步骤将所述式(XV)的化合物转化为本发明的式(IF-1)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物：

在多个不同实施例中，所述一或多个合成步骤包含将与联接R³的碳结合的羟基转化为L²–Z²–。

在多个不同实施例中，所述一或多个合成步骤包含将所述式(XV)的化合物酰化以使L²–C(O)–替代所述与联接R³的碳结合的羟基的氢原子。

在多个不同实施例中，X¹¹为P¹⁰–O–或OH；且所述一或多个合成步骤包含将所述式(XV)的化合物酰化以使L¹–C(O)–替代X¹¹的P¹⁰或羟基的氢原子；及/或将所述式(XV)的化合物酰化以使L²–C(O)–替代所述与联接R³的碳结合的羟基的氢原子。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种式(XV)的化合物：

其中

X¹¹为L¹–Z¹–、–OH、–SH、–NHR、HNRC(O)O-、P¹⁰–O–、P¹¹–S–、P¹²–NR–或P¹²-NRC(O)O-；

P¹⁰、P¹¹及P¹²分别独立地为保护基；

m为2至6的整数；且

在另一方面中，本发明总体上是在于式(XV)或(XVI)的化合物在合成本发明的式(IF)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物中的用途。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种制作式(XX)的化合物的方法，所述方法包含使

式(XXI)的化合物：

式(III)的含硫醇的含氨基酸的共轭配偶体：

在有效地使式(XXI)的化合物与含氨基酸共轭配偶体共轭并提供式(XX)的化合物的条件下反应：

其中

R^m及Rⁿ分别独立地为氢、C1-6烷基、芳基或杂芳基；

LG为离去基；

m及w分别独立地为0至7的整数且v为0至5的整数，

其限制条件为：

m、v及w的和至少为3；且

m与w的和为0至7；且

n、R^x、R^y、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹及A¹为如所述式(I)的化合物或其任何实施例中所定义；或其盐或溶剂合物。

在多个不同实施例中，R^m及Rⁿ分别独立地选自氢、C1-6烷基或芳基。

在某些实施例中，R^m为氢、C1-6烷基或芳基；且Rⁿ为C1-6烷基或芳基。

在多个不同实施例中，所述离去基为卤代基(例如氯代、溴代或碘代)或磺酸酯(例如甲苯磺酸酯或甲磺酸酯)。

在多个不同实施例中，m及v使得所述化合物包含5元至7元环缩醛。

在某些实施例中，所述环缩醛为6元环缩醛。

在多个不同实施例中，所述环缩醛为5元环缩醛且w为大于1的整数。

在多个不同实施例中，m为2且v为1。

在多个不同实施例中，R⁹不为氢及/或A¹不为OH。

在例示性实施例中，R⁹为氨基保护基。

在多个不同实施例中，A¹为OP¹或NHP²。在某些实施例中，A¹为OP¹。

在例示性实施例中，R⁹为氨基保护基且A¹为OP¹。

在多个不同实施例中，所述方法包含使所述式(XXI)的化合物与所述式(III)的含氨基酸共轭配偶体在碱的存在下反应。

在多个不同实施例中，所述碱包含有机胺，例如三乙胺、N-甲基吗啉或柯林碱。

在多个不同实施例中，所述式(XXI)的环缩醛以单个立体异构体或富立体异构混合物的形式提供。

在多个不同实施例中，所述方法包含通过一或多个额外合成步骤将所述式(XX)的化合物转化为本发明的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物：

在多个不同实施例中，所述方法包含通过一或多个额外合成步骤将所述式(XX)的化合物转化为本发明的式(IA)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物：

在多个不同实施例中，所述一或多个合成步骤包含移除所述式(XX)的化合物中的缩醛以提供式(XXIII-1)的化合物：

在多个不同实施例中，其中R^m为视需要经取代的芳基，例如苯基或经甲氧基取代的苯基，所述方法包含移除所述式(XX)的化合物中的缩醛以提供式(XXIII-2)或(XXIII-3)的化合物：

在多个不同实施例中，所述一或多个合成步骤包含将所述式(XXIII-1)的化合物中与联接R¹及R²的碳结合的羟基转化为L¹-Z¹-，及或将所述与联接R^x及R^y的碳结合的羟基转化为L²-Z²。

在多个不同实施例中，所述一或多个合成步骤包含

将所述式(XXIII-2)的化合物中与联接R^x及R^y的碳结合的羟基转化为L²-Z²-，移除所述R^mRⁿCH-基以提供羟基，以及将所述羟基转化为L¹-Z¹；或

将所述式(XXIII-2)的化合物中与联接R^x及R^y的碳结合的羟基转化为L¹-Z¹-，移除所述R^mRⁿCH-基以提供羟基，以及将所述羟基转化为L²-Z²-。

在多个不同实施例中，将所述羟基转化为L¹-Z¹-或L²-Z²-包含进行酰化以使L¹-C(O)-或L²-C(O)-替代所述羟基的氢原子。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种式(XX)的化合物：

其中

R^m及Rⁿ分别独立地为氢、C1-6烷基、芳基或杂芳基；

m及w分别独立地为0至7的整数且v为0至5的整数，

其限制条件为：

m、v及w的和至少为3；且

m与w的和为0至7；且

在另一方面中，本发明总体上是在于式(XX)或(XXI)的化合物在合成本发明的式(IA)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物中的用途。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种制备本发明的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物的方法，所述方法包含使

包含碳碳双键的第一含脂质共轭配偶体，

包含碳碳双键的第二含脂质共轭配偶体，以及

包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体

在有效地使所述第一含脂质共轭配偶体及所述第二含脂质共轭配偶体共轭至所述含氨基酸共轭配偶体并提供所述式(I)的氨基酸或肽共轭物或其盐或溶剂合物的条件下反应，

其中在所述氨基酸或肽共轭物中，来自所述含氨基酸共轭配偶体的硫醇的硫原子共轭至来自所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子，而来自所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子共轭至来自所述第二含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子。

在一个实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体为含肽共轭配偶体，且所述含脂质共轭配偶体偶合至所述含肽共轭配偶体的肽。

在一些实施例中，所述含脂质共轭配偶体共轭至所述含氨基酸共轭配偶体的氨基酸或所述含肽共轭配偶体的肽。

在某些实施例中，所述含脂质共轭配偶体共轭至所述含氨基酸共轭配偶体的氨基酸。

相应地，在另一方面中，本发明总体上是在于一种制备本发明的式(I)的肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物的方法，所述方法包含使

包含碳碳双键的第一含脂质共轭配偶体，

包含碳碳双键的第二含脂质共轭配偶体，以及

包含硫醇的含肽共轭配偶体

在有效地使所述第一含脂质共轭配偶体及所述第二含脂质共轭配偶体共轭至所述含肽共轭配偶体并提供所述式(I)的肽共轭物或其盐或溶剂合物的条件下反应，

其中在所述肽共轭物中，来自所述含肽共轭配偶体的硫醇的硫原子共轭至来自所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子，而来自所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子共轭至来自所述第二含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子。

在多个不同实施例中，所述共轭物为脂肽，因而所述方法是为了制备脂肽。

在多个不同实施例中，所述第一含脂质共轭配偶体及所述第二含脂质共轭配偶体具有相同的结构(亦即，所述第一含脂质共轭配偶体与所述第二含脂质共轭配偶体是完全相同的)。

在多个不同实施例中，所述方法包含使所述硫醇的硫原子共轭至所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子且然后使来自与所述硫醇共轭的碳碳双键的碳原子共轭至所述第二含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子。

在多个不同实施例中，所述第一含脂质共轭配偶体为式(IIA)的化合物：

所述第二含脂质共轭配偶体为式(IIB)的化合物：

所述含氨基酸共轭配偶体包含式(III)的结构：

其中R^a、R^b、R^c、L¹、L²、Z¹、Z²、R¹、R²、R^x、R^y、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、A¹、k、v及n为如所述式(I)的化合物或其任何实施例中所定义。

在多个不同实施例中，所述氨基酸或肽共轭物为式(IB)的化合物：

在多个不同实施例中，所述含脂质共轭配偶体对于所述含氨基酸共轭配偶体是化学计量过量的。

在多个不同实施例中，所述含脂质共轭配偶体(合并)与所述含氨基酸共轭配偶体的摩尔比为至少7:1。

在多个不同实施例中，所述第一含脂质共轭配偶体为式(IIA-1)的化合物：

所述第二含脂质共轭配偶体为式(IIB)的化合物：

所述含氨基酸共轭配偶体包含式(III)的结构：

所述共轭物为式(IC)的化合物：

在多个不同实施例中，L¹为C11-21烷基；k为0至3，较佳为0；且R^a、R^b及R^c分别为氢。

在多个不同实施例中，L²为C11-21烷基；v为0至3，较佳为0；且R³、R⁴及R⁵分别为氢。

在多个不同实施例中，n为1；R⁶、R⁷及R⁸分别为氢；且R⁹为氢、氨基保护基、L³-C(O)或A²。

在多个不同实施例中，n为1；R⁶、R⁷及R⁸分别为氢；且R⁹为氢、氨基保护基或L³-C(O)，其中L³为C15直链烷基或甲基。

在多个不同实施例中，式(IIA)的化合物及式(IIB)的化合物分别为棕榈酸乙烯酯。

在多个不同实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体为半胱氨酸、经保护的半胱氨酸(包括Nα-胺及/或羧基保护半胱氨酸)或包含半胱氨酸残基(包括Nα-胺及/或羧基保护半胱氨酸残基)的肽，例如N端半胱氨酸残基(Nα-胺保护半胱氨酸残基)。

在一些实施例中，所述包含使棕榈酸乙烯酯与例如Fmoc-Cys-OH、Boc-Cys-OH、Fmoc-Cys-OP1或Boc-Cys-OP1等Nα-氨基保护半胱氨酸反应。在一些实施例中，所述Nα-氨基保护半胱氨酸的羧基被保护。

在一个实施例中，有效地使所述含脂质共轭配偶体共轭至所述含氨基酸共轭配偶体的条件包含一或多个自由基的产生。在一个实施例中，有效地使所述含脂质共轭配偶体共轭至所述含肽共轭配偶体的条件包含一或多个自由基的产生。

在一些实施例中，一或多个自由基的产生是以热及/或光化学方式引发。在某些实施例中，一或多个自由基的产生是通过自由基引发剂的热及/或光化学降解而引发。在例示性实施例中，一或多个自由基的产生是通过热引发剂的热降解或光化学引发剂的光化学降解而引发。

在一些实施例中，自由基引发剂的热降解包含在适宜的温度下加热反应混合物。在一些实施例中，在约40℃至约200℃、约50℃至约180℃、约60℃至约150℃、约65℃至约120℃、约70℃至约115℃、约75℃至约110℃或约80℃至约100℃的温度下加热反应混合物。在有的实施例中，在至少约40℃、至少约50℃、至少约60℃或至少约65℃的温度下加热反应混合物。在一个特别意欲涵盖的实施例中，在约90℃的温度下加热反应混合物。

在一些实施例中，自由基引发剂的光化学降解包含用紫外光进行辐照，所述紫外光较佳具有与自然存在的氨基酸的侧链兼容的频率。在一个特别意欲涵盖的实施例中，紫外光具有约365奈米的波长。在例示性实施例中，自由基引发剂的光化学降解在约环境温度下进行。

在一个特别意欲涵盖的实施例中，热引发剂为2,2'-偶氮二异丁腈(AIBN)。在一个特别意欲涵盖的实施例中，光引发剂为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)。

在某些实施例中，反应在液体介质中进行。在一个实施例中，液体介质包含溶剂。在一个实施例中，溶剂选自由N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、1,2-二氯乙烷及其混合物组成的群组。在一个特别意欲涵盖的实施例中，溶剂包含NMP、DMF、DMSO或其混合物。

在一个特别意欲涵盖的实施例中，溶剂包含DMSO或NMP。在一个例示性实施例中，溶剂包含NMP。

在一些实施例中，反应在一或多种添加剂的存在下进行，所述一或多种添加剂抑制副产物的形成及/或改善期望的式(I)的产物化合物的产率或向所述期望的式(I)的产物化合物的转化。

在多个不同实施例中，一或多种添加剂为外源硫醇、酸、有机硅烷或其任何二或更多者的组合。

在一些例示性实施例中，外源或外生硫醇选自由还原型麸胱甘肽(GSH)、2,2’-(乙烯二氧)双乙硫醇(DODT)、1,4-二硫代苏糖醇(DTT)、蛋白质及位阻硫醇组成的群组。在一个特别意欲涵盖的实施例中，外源或外生硫醇为DTT。在一些实施例中，外源或外生硫醇为位阻硫醇，例如第三丁基硫醇。

在多个不同实施例中，酸添加剂为强无机或有机酸。在多个不同实施例中，酸为强有机酸。在多个不同实施例中，酸为三氟乙酸(TFA)。

在多个不同实施例中，有机硅烷为三烷基硅烷，例如三异丙基硅烷(TIPS)。

在一些实施例中，一或多种添加剂选自由TFA、第三丁基硫醇、TIPS及其任何二或更多者的组合组成的群组。

在某些实施例中，一或多种添加剂为酸与外源硫醇、例如TFA与第三丁基硫醇的组合。

在有的实施例中，一或多种添加剂为酸与有机硅烷、例如TFA与TIPS的组合。

在有的实施例中，一或多种添加剂为外源硫醇与有机硅烷及视需要酸的组合，例如t-BuSH与TIPS及TFA的组合。

在一些实施例中，反应进行的持续时间为约5分钟至约48小时、5分钟至约24小时、约5分钟至约12小时、约5分钟至约6小时、约5分钟至约3小时、5分钟至2小时或者约5分钟至约1小时。在例示性实施例中，反应进行的持续时间为约5分钟至约1小时。在一些实施例中，反应进行到直至所述共轭配偶体其中的一至少消耗约70％、80％、90％、95％、97％、99％或100％为止。

在某些实施例中，反应在实质无氧的条件下进行。

在多个不同实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体为含肽共轭配偶体。

在一个实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体包含表位。在一个实施例中，所述含肽共轭配偶体包含表位，例如肽表位。

在一个实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体包含二或更多个表位。在一个实施例中，所述含肽共轭配偶体包含二或更多个表位。

在一个实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体由肽组成。

在一个实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体由含有肽表位的肽组成。在一个实施例中，所述含肽共轭配偶体由肽组成。在一个实施例中，所述含肽共轭配偶体由含有肽表位的肽组成。

在一些实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体包含表位，所述表位与所述共轭配偶体的氨基酸结合。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含表位，所述表位与所述含肽共轭配偶体的肽结合。在一些实施例中，所述表位经由连接基与肽结合。

在一些实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体包含肽表位，所述肽表位经由连接基与所述共轭配偶体的氨基酸结合。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含肽表位，所述肽表位经由连接基与所述肽结合。

在一些实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体及/或所述含肽共轭配偶体包含抗原肽。

在一个实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体及/或肽共轭物包含合成肽。在一些实施例中，所述合成肽是通过包含固相肽合成(solid phase peptide synthesis，SPPS)的方法制备的肽。

在多个不同实施例中，所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽的氨基酸以提供肽共轭物。

在多个不同实施例中，所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽的氨基酸以提供肽共轭物。

在多个不同实施例中，所述肽包含表位。在多个不同实施例中，所述表位为肽表位。

在一些实施例中，所述方法还包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽以提供肽共轭物。

在一些实施例中，偶合肽包含分别地偶合一或多个氨基酸及/或一或多个肽。

在一些实施例中，所述方法还包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽，以便提供包含连接基或其一或多个氨基酸的肽共轭物。

在一些实施例中，所述方法还包含将所述包含连接基或其一或多个氨基酸的肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽，以便提供包含肽表位的肽共轭物，所述肽表位经由连接基结合至与脂质部分共轭的氨基酸。

在一些实施例中，所述肽共轭物的与脂质部分共轭的氨基酸为N端氨基酸残基。

在一些实施例中，所述方法还包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽，以便提供包含肽表位的肽共轭物。

在一些实施例中，所述方法还包含将表位偶合至所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸。

在一些实施例中，所述方法还包含将肽表位偶合至所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸。

在一些实施例中，所述表位经由连接基偶合或结合。

在一些实施例中，所述方法还包含将表位偶合至所述肽共轭物的肽。

在一些实施例中，所述方法还包含将肽表位偶合至所述肽共轭物的肽。

在一些实施例中，所述表位经由连接基与肽结合。

在多个不同实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体由氨基酸组成，例如由半胱氨酸(包括Nα-氨基及/或C端经保护半胱氨酸)组成。

在多个不同实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体的C端由保护基保护及/或所述含氨基酸共轭配偶体的Nα-氨基由保护基保护。

在多个不同实施例中，所述氨基酸的C端的羧基由羧基保护基或羧酰胺保护基保护及/或所述氨基酸的Nα-氨基由氨基保护基保护。

在多个不同实施例中，所述氨基酸的C端的羧基由羧基保护基保护及/或所述氨基酸的Nα-氨基由氨基保护基保护。

在一些实施例中，所述肽的C端的羧基由羧基保护基保护及/或所述肽的Nα-氨基由氨基保护基保护。

在一些实施例中，所述含硫醇的氨基酸残基为末端氨基酸残基。在一些实施例中，所述含硫醇的氨基酸残基为N端残基。

在一些实施例中，A¹及/或R⁹为不同于氨基酸或肽的基团，且所述方法包含偶合氨基酸或肽以便用所述氨基酸或肽替代A¹及/或R⁹。

在一些实施例中，A¹为不同于氨基酸或肽的基团，且所述方法包含偶合氨基酸或肽以便使所述氨基酸或肽替代A¹。

在一些实施例中，A¹为OH、OP¹、NH₂或NHP²及/或R⁹为氢、氨基保护基或L³-C(O)，且所述方法包含偶合氨基酸或肽以便使所述氨基酸或肽替代A¹及/或R⁹。

在一些实施例中，A¹为OH、OP¹、NH₂或NHP²且R⁹为氢、氨基保护基或L³-C(O)，且所述方法包含偶合氨基酸或肽以便使所述氨基酸或肽替代A¹及/或R⁹。

在一些实施例中，偶合氨基酸或肽提供含肽表位的肽共轭物。在一些实施例中，偶合氨基酸或肽提供含连接基或其一或多个氨基酸的肽共轭物。在一些实施例中，偶合氨基酸或肽提供含肽表位的肽共轭物，所述肽表位经由连接基结合至与脂质部分共轭的氨基酸。

在一些实施例中，与脂质部分共轭的所述含硫醇的氨基酸的Nα-氨基被酰化。在一些实施例中，含硫醇的所述含氨基酸共轭配偶体中的R⁹为L³-C(O)-。

在某些实施例中，所述方法还包含酰化与脂质部分共轭的所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸残基的Nα-氨基。在某些实施例中，所述方法还包含用例如乙酰(acetyl)等C2-20脂肪酸酰化Nα-氨基。

在一些实施例中，R⁹为氢或氨基保护基，且所述方法还包含酰化所述氨基酸共轭物或肽共轭物，以便使L³-C(O)替代R⁹处的氢或氨基保护基。

在一些实施例中，酰化所述氨基酸共轭物或肽共轭物以便使L³-C(O)替代R⁹处氨基保护基包含移除R⁹处的氨基保护基，以在R⁹处提供氢。

在某些实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体的氨基酸包含硫醇。在某些实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸残基包含硫醇。

在某些实施例中，所述硫醇为半胱氨酸残基的硫醇。

在某些实施例中，所述半胱氨酸残基为末端残基。在某些实施例中，所述半胱氨酸残基为N端残基。

在一些实施例中，所述半胱氨酸残基的氨基被酰化。

在一个实施例中，所述氨基被C2-20脂肪酸酰化。

在一个例示性实施例中，所述C2-20脂肪酸为乙酰或棕榈酰。在另一例示性实施例中，所述C2-20脂肪酸为乙酰。

在一些实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体及/或肽共轭物包含8至220个、8至200个、8至175个、8至150个、8至125个、8至100个、8至90个、8至80个、8至70个、8至60个、8至50个、8至40个、8至30个、8至25个、8至20个或8至15个氨基酸。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含8至220个、8至200个、8至175个、8至150个、8至125个、8至100个、8至90个、8至80个、8至70个、8至60个、8至50个、8至40个、8至30个、8至25个、8至20个或8至15个氨基酸。

在一个例示性实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体及/或肽共轭物包含含有8至60个氨基酸的肽。在一个例示性实施例中，所述肽包含8至60个氨基酸。

在有的实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体及/或肽共轭物包含5至220个、8至220个、5至175个、8至175个、8至150个、10至150个、15至125个、20至100个、20至80个、20至60个、25至100个、25至80个、25至60个、30至80个、40至60个或50至60个氨基酸。在有的实施例中，所述含肽共轭配偶体包含5至220个、8至220个、5至175个、8至175个、8至150个、10至150个、15至125个、20至100个、20至80个、20至60个、25至100个、25至80个、25至60个、30至80个、40至60个或50至60个氨基酸。

在有的实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体及/或肽共轭物包含5至150个、5至125个、5至100个、5至75个、5至60个、5至50个、5至40个、5至30个、5至25个、5至20个、8至150个、8至125个、8至100个、8至75个、8至60个、8至50个、8至40个、8至30个、8至25个或8至20个氨基酸。在有的实施例中，所述含肽共轭配偶体包含5至150个、5至125个、5至100个、5至75个、5至60个、5至50个、5至40个、5至30个、5至25个、5至20个、8至150个、8至125个、8至100个、8至75个、8至60个、8至50个、8至40个、8至30个、8至25个或8至20个氨基酸。

在多个不同实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体为短肽。在一些实施例中，所述短肽包含少于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或3个氨基酸。

在一个实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体及/或肽共轭物包含一或多个增溶基。在一个实施例中，所述含肽共轭配偶体包含一或多个增溶基。

在某些实施例中，所述增溶基为在肽链中包含二或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施例中，所述增溶基为在肽链中包含二或更多个连续亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。在一个实施例中，所述亲水性氨基酸残基为阳离子氨基酸残基。在一个实施例中，所述阳离子氨基酸残基为精氨酸或赖氨酸残基。在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述阳离子氨基酸残基为赖氨酸残基。在一个实施例中，所述序列包含2至20个、2至15个、2至10个、3至7个或3至5个氨基酸。在一个实施例中，所述增溶基为三-、四-、五-、六-或七-赖氨酸序列。在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述增溶基为四赖氨酸序列。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含氨基酸共轭配偶体包含丝氨酸残基，所述丝氨酸残基毗邻与脂质部分共轭的氨基酸残基。在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽包含丝氨酸残基，所述丝氨酸残基毗邻与脂质部分共轭的氨基酸残基。在一个例示性实施例中，与脂质部分共轭的氨基酸残基为N端。在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述肽还包含毗邻所述丝氨酸残基的二或更多个亲水性氨基酸残基的连续序列。

在某些实施例中，所述肽共轭物及/或含氨基酸共轭配偶体包含毗邻所述丝氨酸残基的二或更多个亲水性氨基酸残基的连续序列。

在某些实施例中，所述肽共轭物及/或含氨基酸共轭配偶体仅包含天然存在的氨基酸。在某些实施例中，所述含肽共轭配偶体仅包含天然存在的氨基酸。在有的实施例中，所述肽中75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、97％或以上或者99％或以上的氨基酸残基为天然存在的氨基酸。

在有的实施例中，所述肽共轭物及/或含氨基酸共轭配偶体中75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、97％或以上或者99％或以上的氨基酸残基为天然存在的氨基酸。

在例示性实施例中，所述肽共轭物及/或含氨基酸共轭配偶体包含含有肽表位的肽。在例示性实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽包含一或多个肽表位。

在多个不同实施例中，所述肽包含一或多个EBV LMP2表位、基本上由其组成或由其组成。在多个不同实施例中，所述一或多个EBV LMP2表位为MHCI表位。在多个不同实施例中，所述肽包含一或多个选自由SEQ ID NO 76至SEQ ID NO 101其中的任一者组成的群组的EBV LMP2表位。在多个不同实施例中，所述肽包括包含12或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。在多个不同实施例中，所述肽包括包含15或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽，或包含20或更多个来自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO75其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。

在一个例示性实施例中，所述肽表位衍生自NY-ESO-1。在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述肽包含选自由8或更多个来自SEQ ID NO:106、107、108、113、114、119、120及121其中的任一者的连续氨基酸残基组成的群组的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在多个不同实施例中，所述肽包含一或多个NY-ESO-1表位、基本上由其组成或由其组成。在多个不同实施例中，所述一或多个NY-ESO-1表位为MHCI表位。在多个不同实施例中，所述肽包含选自由8或更多个来自SEQ ID NO:106、107、108、113、114、119、120及121其中的任一者的连续氨基酸残基组成的群组的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。在多个不同实施例中，所述肽包括包含12或更多个来自SEQ ID NO:106、107、108、113、114、119、120及121其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。在多个不同实施例中，所述肽包括包含15或更多个来自SEQ ID NO:106、107、108、113、114、119、120及121其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽，或包含20或更多个来自SEQ IDNO:106、107、108、113、114、119、120及121其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸或由其组成的肽。

在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述含肽共轭配偶体的氨基酸的反应性功能基未被保护。

在某些实施例中，所述肽共轭物的一或多个氨基酸的一或多个反应性功能基未被保护。

在某些实施例中，所述氨基酸共轭物的氨基酸的一或多个反应性功能基未被保护。

在某些实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体的一或多个氨基酸的一或多个反应性功能基未被保护。

在某些实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体包含肽，其中所述肽的氨基酸的侧链的反应性功能基未被保护，除待反应的硫醇以外的任何硫醇除外。

在某些特别意欲涵盖的实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸的反应性功能基未被保护。

在某些特别意欲涵盖的实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸的反应性功能基未被保护，除待反应的硫醇以外的任何硫醇除外。

所属领域的技术人员将理解，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽可如本文中所述视需要经取代、修饰或结合至如本文中所述的多种其他部分，以提供所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体。

在一些实施例中，所述方法包含

通过固相肽合成(SPPS)合成肽的氨基酸序列；

通过固相肽合成将氨基酸共轭物的氨基酸或肽共轭物的氨基酸偶合至所述固相结合肽，以便提供包含肽表位的肽共轭物、包含连接基或其一或多个氨基酸的肽共轭物、或包含经由连接基结合至与脂质部分共轭的氨基酸的肽表位的肽共轭物。

在一些实施例中，所述方法包含

使所述含脂质共轭配偶体与含氨基酸共轭配偶体反应以提供氨基酸或肽共轭物；

通过固相肽合成(SPPS)合成肽的氨基酸序列；

通过固相肽合成将所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸偶合至所述固相结合肽，以便提供包含肽表位的肽共轭物、包含连接基或其一或多个氨基酸的肽共轭物、或包含经由连接基结合至与脂质部分共轭的氨基酸的肽表位的肽共轭物。

在一些实施例中，所述方法还包含酰化所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物其中的任一者的与脂质部分共轭的氨基酸的Nα-氨基。

在一些实施例中，所述方法包含自固相载体裂解所述肽共轭物。

在一些实施例中，所述方法包含

通过固相肽合成(SPPS)合成所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸序列；以及

根据本文中所述实施例其中的任一者使所述含脂质共轭配偶体与含肽共轭物配偶体反应。

在例示性实施例中，所述方法包含

通过SPPS合成所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸序列，

自固相载体裂解所述肽；以及

在一个实施例中，所述含肽共轭配偶体在与含脂质共轭配偶体反应之前未经纯化。

在一些实施例中，一或多个保护基在将肽自固相载体裂解时被移除。在某些实施例中，所述肽中存在的所有保护基均被移除。

在一个实施例中，SPPS为Fmoc-SPPS。

在一些实施例中，具有所述待反应硫醇的所述含肽共轭配偶体的肽中的氨基酸残基为N端氨基酸残基，且所述方法包含在自固相裂解肽之前对N端氨基进行酰化。在特别意欲涵盖的实施例中，所述N端残基为半胱氨酸残基。

在一个实施例中，所述方法还包含自反应介质分离所述肽共轭物并视需要纯化所述肽共轭物。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种制备肽共轭物的方法，所述方法包含

提供本发明的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其盐或溶剂合物，以及

将所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽的氨基酸以提供肽共轭物。

在多个不同实施例中，所述产物肽共轭物为本发明的式(I)的化合物或其医药上可接受的盐。

在多个不同实施例中，所述氨基酸共轭物的氨基酸在降低所述氨基酸的α-碳处的差向异构的条件偶合。在多个不同实施例中，所述条件使得按摩尔计少于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％的氨基酸被差向异构。在多个不同实施例中，降低差向异构的条件包括使用PyBOP作为偶合剂。在多个不同实施例中，所述条件包括使用PyBOP及2,4,6-三甲基吡啶。

在另一方面中，本发明总体上是在于本发明的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其盐或溶剂合物在合成免疫原性肽共轭物中的用途。

在多个不同实施例中，所述免疫原性肽共轭物为本发明的式(I)的化合物或其医药上可接受的盐。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种通过本发明的方法生产的本发明的氨基酸共轭物或肽共轭物。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种通过本发明的方法生产的肽共轭物。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种组合物，所述组合物包含本发明的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其盐或溶剂合物。

在多个不同实施例中，所述组合物包含分离的、纯的、经纯化的或实质上经纯化的式(I)的化合物或其盐或溶剂合物。

在多个不同实施例中，所述组合物包含按重量计至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的式(I)的化合物或其盐或溶剂合物。

在多个不同实施例中，所述组合物不含或实质上不含除式(I)的化合物以外的含氨基酸或肽化合物。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种医药组合物，所述医药组合物包含有效量的本发明的式(I)的肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物以及医药上可接受的载剂。

在多个不同实施例中，所主张的医药组合物包含有效量的二或更多种本发明的式(I)的肽共轭化合物。

在一个实施例中，所述医药组合物为免疫原性组合物。

在一个实施例中，所述医药组合物不包含外来佐剂。

在一些实施例中，所述医药组合物为疫苗。

在一个实施例中，所述医药组合物包含有效量的二或更多种本发明的肽共轭物，例如所述医药组合物包含有效量的三或更多种本发明的肽共轭物。

在一个实施例中，所述医药组合物包含有效量的一或多种本发明的肽共轭物以及一或多种本文中所述的肽或其任何组合。举例而言，所述医药组合物包含有效量的二或更多种本发明的肽共轭物以及一或多种本文中所述的肽，或有效量的一或多种本发明的肽共轭物以及二或更多种本文中所述的肽。

在另一方面中，本发明总体上是在于一种在受试者中进行接种或引起免疫反应的方法，包含施予所述受试者有效量的一或多种本发明的式(I)的肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物、或有效量的本发明的医药组合物。

在另一方面中，本发明总体上是在于一或多种本发明的式(I)的肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物或本发明的医药组合物在制造用于在受试者中进行接种或引起免疫反应的药物中的用途。

在另一方面中，本发明总体上是在于一或多种本发明的式(I)的肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物或本发明的医药组合物用于在受试者中进行接种或引起免疫反应。

在另一方面中，本发明总体上是在于一或多种本发明的式(I)的肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物或本发明的医药组合物用于在受试者中接种或引起免疫反应的用途。

在多个不同实施例中，所述方法、用途、一或多种化合物或医药组合物用于在受试者中引起免疫反应。

在多个不同实施例中，所述方法、用途、一或多种化合物或医药组合物用于对受试者进行接种。

在一些实施例中，所述方法包含施予所述受试者有效量的一或多种如本文中所述的肽以及一或多种本发明的肽共轭物或二或更多种本发明的肽共轭物，例如一或多种肽与一或多种肽共轭物的组合。

在一些实施例中，一或多种如本文中所述的肽以及一或多种本发明的肽共轭物或二或更多种本发明的肽共轭物，例如一或多种肽与一或多种肽共轭物的组合，用于在受试者中进行接种或引起免疫反应或用于制造用于在在受试者中接种或引起免疫反应的药物。

在一些实施例中，使用或施与二或更多种肽共轭物。

在一些实施例中，二或更多种肽共轭物、或一或多种肽以及一或多种肽共轭物同时、依序或分开使用或施与。

本文中所述的化合物中可能存在不对称中心。所述不对称中心可命名为(R)或(S)，这根据手性碳原子处三维空间中取代基的构型而定。所述化合物的所有立体化学异构形式，包括立体异构、对映异构及差向异构形式、以及d-异构体及l-异构体、及其混合物(包括立体化学异构体的富对映异构及富立体异构混合物)均在本发明的范围内。

单种对映异构体可自市售对映纯起始材料以合成方式制备或通过制备对映异构混合物并将所述混合物解析为单种对映异构体而制备。解析方法包含将所述对映异构混合物转化为非对映异构体的混合物并通过例如重结晶或色谱法以及本领域熟知的任何其他适宜方法等分离所述非对映异构体。具有所规定的立体化学结构的起始材料可商购或可制得且必要时通过本领域熟知的技术解析。

本文中所述化合物也可以作为构象异构体或几何异构体存在，包括顺式(cis)、反式(trans)、同侧(syn)、反侧(anti)、E型(entgegen，E)及Z型(zusammen，Z)异构体。所有此类异构体及其混合物均在本发明的范围内。

所述化合物的任何互变异构体或其混合物也在本发明的范围内。所属领域的技术人员将理解，很多种功能基及其他结构可展现出互变异构。实例包括但并不仅限于酮-烯醇、亚胺-烯胺以及硫酮/烯硫醇(thioketone/enethiol)互变异构。

本文中所述的化合物也可作为“稀-稀”同位素体(isotopologue)及等同位素体(isotopomer)存在，其中所述化合物中的一或多个原子用不同的同位素替代。适宜的同位素包括，例如¹H、²H(D)、³H(T)、¹²C、¹³C、¹⁴C、¹⁶O及¹⁸O。对所属领域的技术人员将明了将此类同位素纳入本文中所述化合物中的程序。本文中所述化合物的“稀-稀”同位素体及等同位素体也在本发明的范围内。

也在本发明的范围内者为本文中所述化合物的盐，包括医药上可接受的盐。此类盐包括酸加成盐、碱加成盐、及碱性含氮基的四级盐。

酸加成盐可通过使呈自由碱形式的化合物与无机或有机酸反应而制备。无机酸的实例包括但并不仅限于氢氯酸、氢溴酸、硝酸、硫酸及磷酸。有机酸的实例包括但并不仅限于乙酸、三氟乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、硬脂酸、水杨酸、甲烷磺酸、苯磺酸、羟乙基磺酸、磺氨酸、己二酸、丁酸及特戊酸。

碱加成盐可通过使呈自由酸形式的化合物与无机或有机碱反应而制备。无机碱加成盐的实例包括碱金属盐、碱土金属盐或其他生理上可接受的金属盐，例如铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐或锌盐。有机碱加成盐的实例包括胺盐，例如三甲胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺及乙二胺的盐。

化合物中碱性含氮基的四级盐可通过例如使所述化合物与烷基卤化物(如甲基、乙基、丙基及丁基氯化物、溴化物及碘化物)、硫酸二烷基酯(例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯及硫酸二戊酯)等反应而制备。

本文中所述的化合物可所为与各种不同溶剂的溶剂合物而形成或存在。若溶剂为水，则所述溶剂合物可被称为水合物，例如单水合物、二水合物或三水合物。本文中所述化合物的所有溶剂化形式及非溶剂化形式均在本发明的范围内。

本文中各式中所用一般化学术语具有其常用含义。

术语“脂族基(aliphatic)”意欲包括饱和的及不饱和的、非芳族、直链、支链、无环及环状烃。所属领域的技术人员将理解，脂族基包括，举例而言，烷基、烯基、炔基、环烷基及环烯基，以及其混杂体，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基及(环烷基)烯基。在多个不同实施例中，脂族基包含1至12个、1至8个、1至6个或1至4个碳原子。在一些实施例中，脂族基包含5至21个、9至21个或11至21个碳原子，例如11、13、15、17或19个碳原子。在一些实施例中，脂族基为饱和的。

术语“杂脂族基(heteroaliphatic)”意欲包括其中一或多个链及/或环碳原子独立地被杂原子(较佳地选自氧、氮及硫的杂原子)替代的脂族基。在一些实施例中，杂脂族基为饱和的。杂脂族基包括直链或支链杂烷基、杂烯基及杂炔基。

术语“烷基(alkyl)”意欲包括饱和直链及支链烃基。在一些实施例中，烷基具有1至12个、1至10个、1至8个、1至6个或1至4个碳原子。在一些实施例中，烷基具有5至21个、9至21个或11至21个碳原子，例如11、13、15、17或19个碳原子。直链烷基的实例包括但并不仅限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基及正辛基。支链烷基的实例包括但并不仅限于异丙基、异丁基、第二丁基、第三丁基、新戊基、异戊基及2,2-二甲基丙基。

术语“烯基(alkenyl)”意欲包括在两个碳原子之间具有至少一个双键的直链及支链烷基。在一些实施例中，烯基具有2至12个、2至10个、2至8个、2至6个或2至4个碳原子。在一些实施例中，烯基具有5至21个、9至21个或11至21个碳原子，例如11、13、15、17或19个碳原子。在一些实施例中，烯基具有一、二或三个碳碳双键。烯基的实例包括但并不仅限于乙烯基、烯丙基、–CH＝CH(CH₃)、–CH＝C(CH₃)₂、–C(CH₃)＝CH₂及–C(CH₃)＝CH(CH₃)。

术语“炔基(alkynyl)”意欲包括在两个碳原子之间具有至少一个三键的直链及支链烷基。在一些实施例中，炔基具有2至12个、2至10个、2至8个、2至6个或2至4个碳原子。在一些实施例中，炔基具有一、二或三个碳碳三键。实例包括但并不仅限于–C≡CH、–C≡CH₃、CH₂C≡CH₃及–C≡CH₂CH(CH₂CH₃)₂。

术语“杂烷基(heteroalkyl)”意欲包括其中一或多个链碳原子被较佳为选自由氧、氮及硫组成的群组的杂原子的杂原子替代的烷基。在一些实施例中杂烷基为饱和的。杂烷基包括，举例而言，聚乙二醇基及聚乙二醇醚基等。

术语“环烷基(cycloalkyl)”意欲包括单-、二-或三环烷基。在一些实施例中，环烷基在所述(等)环中具有3至12个、3至10个、3至8个、3至6个、3至5个碳原子。在一些实施例中，环烷基具有5或6个环碳原子。单环环烷基的实例包括但并不仅限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基及环辛基。在一些实施例中，环烷基具有3至8个、3至7个、3至6个、4至6个、3至5个或4至5个环碳原子。二-及三环环系统包括桥联、螺及稠环烷基环系统。二-及三环环环烷基系统包括但并不仅限于二环[2.1.1]己基、二环[2.2.1]庚基、金刚烷基(adamantyl)及癸基(decalinyl)。

术语“环烯基(cycloalkenyl)”意欲包括在两个碳原子之间具有至少一个双键的非芳族环烷基。在一些实施例中，环烯基具有一、二或三个双键。在一些实施例中，环烯基在所述(等)环中具有4至14个、5至14个、5至10个、5至8个或5至6个碳原子。在一些实施例中，环烯基具有5、6、7或8个环碳原子。环烯基的实例包括环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、丁二烯基、戊二烯基及己二烯基。

术语“芳基(aryl)”意欲包括不含任何环杂原子的环芳族烃基。芳基包括单环、二环及三环系统。芳基的实例包括但并不仅限于苯基、薁基、并环庚三烯基、联苯基、茀基、菲基、蒽基、茚基、二氢茚基、并环戊二烯基及萘基。在一些实施例中，芳基在所述(等)环中具有6至14个、6至12个或6至10个碳原子。在一些实施例中，芳基为苯基或萘基。芳基包括芳族-脂族稠环系统。实例包括但并不仅限于二氢茚基及四氢萘基。

术语“杂环基(heterocyclyl)”意欲包括含有3或更多个其中一或多个为杂原子的环原子的非芳族环系统。在一些实施例中，杂原子为氮、氧或硫。在一些实施例中，杂环基含有一、二、三或四个杂原子。在一些实施例中，杂环基包括具有3至16个、3至14个、3至12个、3至10个、3至8个或3至6个环原子的单-、二-及三环环。杂环基包括部分不饱和及饱和的环系统，例如咪唑啉基及咪唑啶基。杂环基包括含有杂原子的稠环及桥联环系统，例如奎宁环基(quinuclidyl)。杂环基包括但并不仅限于氮杂丙啶基、氮杂啶基(azetidinyl)、氮杂环庚烷基(azepanyl)、二氮杂环庚烷基(diazepanyl)、1,3-二噁烷基(1,3-dioxanyl)、1,3-二氧环戊烷基(1,3-dioxolanyl)、异噁唑啉基(isoxazolidinyl)、吗啉基、哌嗪基(piperazinyl)、哌啶基(piperidinyl)、哌喃基、吡唑啶基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、噻二唑啶基(thiadiazolidinyl)及三噻烷基(trithianyl)。

术语“杂芳基(heteroaryl)”意欲包括含有5或更多个其中一或多个为杂原子的环原子的芳族环系统。在一些实施例中，杂原子为氮、氧或硫。在一些实施例中，杂芳基包括具有5至16个、5至14个、5至12个、5至10个、5至8个或5至6个环原子的单-、二-及三环环系统。杂芳基包括但并不仅限于吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、吡啶基、哒嗪基(pyridazinyl)、嘧啶基、吡嗪基(pyrazinyl)、苯硫基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基、氮杂吲哚基(azaindolyl)(吡咯吡啶基(pyrrolopyridinyl)、吲唑基、苯并咪唑基、吡唑吡啶基(pyrazolopyridinyl)、三唑吡啶基(triazolopyridinyl)、苯并三唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、咪唑吡啶基、异噁唑吡啶黄嘌呤基(isoxazolopyridinylxanthinyl)、胍基(guaninyl)、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、喹噁啉基(quinoxalinyl)及喹唑啉基。杂芳基包括其中所有环均为芳族的稠环系统，例如吲哚基，以及其中所述环中仅一个环为芳族的稠环系统，例如2,3-二氢吲哚基。

术语“卤代(halo)”或“卤素(halogen)”意欲包括F、Cl、Br及I。

术语“杂原子(heteroatom)”意欲包括氧、氮、硫或磷。在一些实施例中，杂原子选自由氧、氮及硫组成的群组。

本文中所用术语“经取代(substituted)”意指所指基团中的一或多个氢原子经一或多个独立选择的适宜取代基替代，其限制条件为不超过连接所述(等)取代基的每一原子的常价，以及取代产生稳定的化合物。在多个不同实施例中，本文中所述化合物中的可选取代基包括但并不仅限于卤代、CN、NO₂、OH、NH₂、NHR¹⁰、NR10R²⁰、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C(O)NH₂、C(O)NHR¹⁰、C(O)NR¹⁰R²⁰、SO₂R¹⁰、OR¹⁰、SR¹⁰、S(O)R¹⁰、C(O)R¹⁰及C1-6脂族基；其中R¹⁰及R²⁰分别独立地为C1-6脂族基，例如C1-6烷基。

本文中所用术语“羧基保护基(carboxyl protecting group)”意指能够轻易地移除以提供羧基的OH基并且在合成程序期间保护羧基免于发生不期望的反应的基团。此类保护基在由T.W.Greene等人编辑的《有机合成(Organic Synthesis)》(John Wiley&Sons,1999)中的保护基(Protective Groups)中以及Fernando Albericio(与Albert Isidro-Llobet及Mercedes Alvarez一起)的“氨基酸保护基(Amino Acid-Protecting Groups)”化学评论(Chemical Reviews)2009(109)2455-2504中予以描述。实例包括但并不仅限于烷基及硅烷基，例如甲基、乙基、第三丁基、甲氧基甲基、2,2,2-三氯乙基、苄基、二苯基甲基、三甲基硅烷基及第三丁基二甲基硅烷基等。

本文中所用术语“胺保护基(amine protecting group)”意指能够轻易地移除以提供氨基的NH₂基并且在合成程序期间保护氨基免于发生不期望的反应的基团。此类保护基在由T.W.Greene等人编辑的《有机合成(Organic Synthesis)》(John Wiley&Sons,1999)中的保护基(Protective Groups)中以及Fernando Albericio(与Albert Isidro-Llobet及Mercedes Alvarez一起)的“氨基酸保护基(Amino Acid-Protecting Groups)”化学评论(Chemical Reviews)2009(109)2455-2504中予以描述。实例包括但并不仅限于酰基及酰氧基，例如乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯基乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、三氟乙酰基、乙酰乙酰基、4-氯丁酰基、异丁酰基、皮考啉基(picolinoyl)、氨基己酰基、苯甲酰基、甲氧基-羰基、9-茀基甲氧基羰基、2,2,2-三氟乙氧基羰基、2-三甲基硅烷基乙氧基-羰基、第三丁氧基羰基、苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、2,4-二氯-苄氧羰基等。其他实例包括Cbz(羧基苄基)、Nosyl(邻-或对-硝基苯基磺酰基)、Bpoc(2-(4-联苯基)异丙氧基羰基)及Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚己基)乙基)。

本文中所用术语“羧酰胺保护基(carboxamide protecting group)”意指能够轻易地移除以提供羧酰氨基的NH₂基并且在合成程序期间保护羧酰氨基免于发生不期望的反应的基团。此类保护基在由T.W.Greene等人编辑的《有机合成(Organic Synthesis)》(JohnWiley&Sons,1999)中的保护基(Protective Groups)中以及Fernando Albericio(与Albert Isidro-Llobet及Mercedes Alvarez一起)的“氨基酸保护基(Amino Acid-Protecting Groups)”化学评论(Chemical Reviews)2009(109)2455-2504中予以描述。实例包括但并不仅限于9-呫吨基(9-xanthenyl，Xan)、三苯甲基(Trt)、甲基三苯甲基(Mtt)、环丙基二甲基甲醇基(cyclopropyldimethylcarbinyl，Cpd)及二甲基环丙基甲基(Dmcp)。

本文中所用术语“及/或(and/or)”意指“及(and)”或者“或(or)”或者二者。

名词后的术语“(等)((s))”意欲涵盖单数及复数形式或同时涵盖二者。

本说明书中所用术语“包含(comprising)”意指“至少部分由……组成(consisting at least in part of)”。当解释本说明书中包括术语“包含(comprising)”的每一陈述时，也可能存在除由所述术语修饰的那个或那些特征之外的特征。例如“包含(comprise及comprises)”等相关术语应以相同的方式理解。“含有(containing)”也以相同的方式理解。

本发明也可以说是总体上是在于本申请案的说明书中单独提及或指示的部件、要素及特征，或者以所述部件、要素或特征的二或更多者的任何或所有组合共同地提及或指示的部件、要素及特征，且当本文中提及具有与本发明所涉及的技术中已知的等效值的整数时，此类已知的等效值被视为如同个别列出一样纳入本文中。

提及本文中所揭露数值的范围(例如1至10)也纳入提及在所述范围内的所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9及10)以及也提及在所述范围内的任何有理数范围(例如2至8、1.5至5.5以及3.1至4.7)，且因此本文中所明确公开的所有范围的所有子范围均特此明确地被公开。所述仅具体意欲涵盖者的实例，且在所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合均被认为以类似方式明确地在这件申请案中阐明。

尽管上文对本发明进行了大致界定，但所属领域的技术人员将明了，本发明并不仅限于此，且本发明也包括以下说明内容给出实例的实施例。

附图说明

将参照附图对本发明进行描述，其中：

图1为在365奈米下辐照由AcCSKKKKNLVPC(tBu)VATV 1、棕榈酸乙烯酯(70当量)以及DMPA组成的溶液后反应混合物的HPLC色谱图。峰a(11.05分钟)：残余起始肽1；b(18.58分钟)：单棕榈酰化肽2；c(26.66分钟)：双棕榈酰化肽3；e、f：2及3的亚砜；*：DMPA光引发剂的副产物。柱：Phenomenex Gemini C18(3μ,110埃,4.6x 150毫米)；溶析液A，水/0.1％TFA；溶析液B：MeCN/0.1％TFA；梯度：5-95％B，经30分钟@1毫升/分钟。

图2为来自图1的峰b的低分辨率质谱：m/z(ESI)999.9[M+2H⁺]。

图3为来自图1的峰c的低分辨率质谱：m/z(ESI)1141.3[M+2H⁺]。

图4A至4C为显示如本文中实例中所述的使用肽共轭物及HekBlue^TM的TLR激动分析的结果的图。A：由激动剂520、550、530、540、510或PBS在HEK-Blue^TM-mTLR2细胞(左)及HEK-Blue^TM-hTLR2细胞(右)中引发的SEAP产生情况。B：由激动剂520(灰色条)及530(黑色条)在HEK-Blue^TM-mTLR2细胞(左)及HEK-Blue^TM-hTLR2细胞(右)中引发的SEAP产生情况。C：由激动剂550(灰色条)及530(黑色条)在HEK-Blue^TM-mTLR2细胞(左)及HEK-Blue^TM-hTLR2细胞(右)中引发的SEAP产生情况。

图4D及4E为显示响应于D：激动剂521(黑色条)、551(交叉影线条)及511(灰色条)；E：激动剂552(交叉影线条)、512(黑色条)及500(灰色条)的T细胞克隆活化的图。

图5为双棕榈酰化肽3的¹H NMR谱。

图6A及6B为显示使用如实例8中所述在表4中列出的Pam1Cys-SKKKK-NH₂以及(R)-及(S)-Pam2Cys-SKKKK、Pam3Cys-SKKKK、及homoPam2Cys-SKKKK构建体在多种不同浓度下在HEK-Blue^TM-mTLR2(图6A)及HEK-Blue^TM-hTLR2(图6B)细胞中的TLF激动分析的结果：10^-6摩尔/升(黑色条)、10^-7摩尔/升(深灰色条)、10^-8摩尔/升(中灰色条)、10^-9摩尔/升(斜交叉影线条)、10^-10摩尔/升(淡灰色条)、及10^-11摩尔/升(方影线条)。

主要元件标记说明

无

具体实施方式

本发明提供本文中所定义的式(I)的氨基酸及肽共轭化合物。发明者有利地发现此类共轭物具有令人惊讶的免疫原活性。

式(I)的氨基酸及肽共轭化合物可使用本文中所述方法及程序制备。

所述方法中使用的起始材料及/或中间物可使用熟知合成化学技术(例如大致描述于Louis F Fieser and Mary F,Reagents for Organic Synthesis v.1-19,Wiley,NewYork(1967-1999ed.)或Beilsteins Handbuch der organischen Chemie,4,Aufl.Ed.Springer-Verlag Berlin(包括附录(也可经由Beilstein在线数据库获得)中的方法)制备，或者在一些实施例中可商购。

所述化合物的制备可涉及多种不同化学基的保护及去保护。对保护及去保护的需要以及适宜保护基的选择可容易地由所属领域的技术人员确定。用于进行保护及去保护的保护基及方法在业内为人熟知(参见例如T.W.Greene and P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis,3^rd Ed.,Wiley&Sons,Inc.,New York(1999))。

如示意图A1中所示以及下文所述，式(IF)的化合物为其中w为1、v为0且m为2至6、较佳2的式(I)的化合物，其可经由涉及将环氧化物共轭至含氨基酸共轭配偶体的方法制备。

示意图A1：经由共轭至环氧化物制备式(IF)的化合物。

本发明提供一种制备式(XV)的方法，包含使式(XVI)的环氧化物与式(III)的包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体在通过硫醇与环氧化物共轭而有效地提供所述式(XV)的化合物的条件下反应。

与环氧化物反应的所述含氨基酸共轭配偶体可由例如Nα-胺经保护及/或C端经保护的半胱氨酸等氨基酸组成。或者，含氨基酸共轭配偶体可包含肽，例如短肽。在此类实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体可包含约15个氨基酸残基或更少，例如5、4或3个氨基酸残基。所述含氨基酸共轭配偶体的Nα-氨基较佳经保护或者经取代(即，不呈自由胺–NH₂基形式)以防止在共轭反应期间发生反应。所述含氨基酸共轭配偶体的C端也可经保护。

所述式(XVI)的化合物中的X¹⁰可为经保护的羟基、硫醇、胺或氨基甲酸酯基(分别为P¹⁰–O–、P¹¹–S–、P¹²–NR–或P¹²-NRC(O)O-)，随后可由其形成L¹–Z¹–及L²–Z²–。当X¹⁰为经保护基时，所述保护基可在共轭反应中移除以提供式(XV)的化合物，其中X¹¹为对应的去保护基。举例而言，当X¹⁰为P¹⁰–O–基时，共轭可在式(XV)的化合物中提供相应的羟基作为X¹¹。

式(XVI)的环氧化物在联接R³的碳原子处包含立体源中心。因而，在反应中可使用环氧化物的单一立体异构体或环氧化物的富立体异构混合物来控制式(XV)的化合物以及随后形成的产物(包括式(IF)的化合物)中的联接R³的碳原子的立体化学结构(stereochemistry)。本领域熟知多种用以提供环氧化物的对映纯或富对映异构的混合物的方法。在多个不同实施例中，提供式(XVI)的环氧化物的单一立体异构体或富立体异构混合物包含对环氧化物的外消旋混合物进行解析。举例而言，通过动力水解对外消旋环氧化物混合物进行解析，如Jacobsen et al,Science,1997,277,936-938所述。

所述式(XVI)的环氧化物可通过使式(XVII)的烯烃与氧化剂在有效地环氧化所述烯烃的条件下反应而提供。本领域熟知数种用于环氧化烯烃的方法。在某些实施例中，环氧化通过使烯烃与作为氧化剂的过氧化物或有机N-氧化物反应而进行。适宜过氧化物的实例包括有机过氧化物，例如间-氯过氧苯甲酸。N-氧化物的实例包括，举例而言，吡啶N-氧化物等。所属领域的技术人员将明了其他适宜的氧化剂。反应可在包含例如二氯甲烷等适宜溶剂的液体反应介质中进行。式(XVII)的烯烃可商购或使用标准合成化学技术自商购前驱体制备。

所属领域的技术人员将了解，某些X¹⁰基团可能易于在环氧化反应中氧化，例如当X¹⁰包含氨基(其可形成N-氧化物)或硫醚基(其可形成例如亚砜或砜)时。可在反应期间对此类基团进行保护，以防止氧化，或可在合成顺序中已进行环氧化反应后的适宜点上将其还原回为期望的基团。

或者，式(XVI)的环氧化物可通过用在适宜溶剂中的碱处理式(XVII-A)的化合物(其中LG为适宜的离去基，例如卤素)以置换所述离去基，如示意图A2中所示。

示意图A2.经由离去基置换进行环氧化。

式(XVII-A)的化合物可商购或可自商购前驱体制备。有利地，在一些实施例中，式(XVII-A)的化合物可自对映纯α-氨基酸制备。环氧化反应以立体特异性方式进行，联接R³的碳处的立体化学结构发生反转。

例如，如图A2-1中所示，式(XVII-A1)的化合物可自L-天冬氨酸制备，式(XVII-A1)的化合物对应于其中m为2且每一R¹及R²以及R³、R⁴及R⁵为氢、X¹⁰为-OH且LG为溴代的式(XVII-A)的化合物(参见Volkmann,R.A.et al.J.Org.Chem.,1992,57,4352-4361)。

可在-10℃至0℃的温度下在溴化钠的存在下通过例如用亚硝酸钠及例如硫酸等强酸处理(以原位产生硝酸)而将L-天冬氨酸转化为溴代琥珀酸(AA-1)。所述反应以立体特异性方式进行，立体化学结构整体保留。

将溴代琥珀酸(AA-1)还原为溴二醇(XVII-A1)可使用适宜还原剂进行，例如通过在-78℃用在THF中的硼烷或硼烷-二甲基硫醚络合物处理，允许反应混合物升温至室温。用以提供式(XVI-1a)的化合物的环氧化可通过使溴二醇(XVII-A1)与例如碳酸铯等碱在二氯甲烷中在室温下反应而进行。如上所述，所述反应以立体特异性方式进行，立体化学结构整体反转。

环氧化物(XVI-1a)的相反对映异构体可通过相同程序自D-天冬氨酸制备。

示意图A2-1.自L-天冬氨酸制备对映纯环氧化物。

再次参照示意图A1，式(XV)的化合物可随后通过一或多个合成步骤转化为式(IF)的氨基酸或肽共轭物。在所述一或多个步骤中，与联接R³的碳结合的羟基被转化为L²-Z²-基。

若X¹¹不为L¹-Z¹-，那么所述一或多个步骤也包含将X¹¹转化为L¹-Z¹-。L¹-Z¹-及L²-Z²-基可同时或以任何顺序依序引入。

在某些实施例中，所述一或多个步骤包含酰化所述式(XV)的化合物以使L²-C(O)-替代与联接R³的碳结合的羟基的氢原子。

在例示性实施例中，X¹⁰为P¹⁰–O–或OH；且X¹¹为P¹⁰–O–或OH。

在多个不同实施例中，X¹¹为P¹⁰–O–或OH；且所述一或多个合成步骤包含酰化所述式(XV)的化合物以用L¹–C(O)–替代P¹⁰或X¹¹的羟基的氢原子；及/或用L²–C(O)–替代与联接R³的碳结合的羟基的氢原子。

在某些实施例中，如下文在示意图A3中所示以及所述实例中所述，所述方法包含使具有经保护羟基的式(XVI-1)的环氧化物与式(III)的含氨基酸共轭配偶体反应以提供式(XV-1a)的化合物。

示意图A3：经由环氧化物共轭制备双酯共轭物。

共轭反应可在酸性条件下通过使所述环氧化物与硫醇在例如氢氯酸、硫酸或其混合物等酸的存在下反应而进行。所述反应可在包含例如二氯甲烷等适宜溶剂的液体反应介质中在约-10℃至约50℃、例如0℃至40℃的温度下进行。

羟基保护基P¹⁰经选择以使其可在有效共轭的条件移除且因此在共轭反应期间移除而提供期望的式(XV-1a)的二醇。适宜的保护基对所属领域的技术人员而言将是显而易见的且可包括，举例而言，对酸不稳定的硅烷基保护基。

或者，共轭反应可使用其中X¹⁰为羟基的式(XVI)的环氧化物进行，例如式(XVI-1a)的环氧化物。

式(XV-1a)的二醇可通过与其中X为OH或适宜离去基(例如卤化物基，例如氯代或溴代)的式(VI-1)及(VI)的化合物在对于酯化有效的条件下反应而转化为式(IF-1)的化合物。

对酯化有效的条件根据式(IV)及/或(VI-1)的化合物的性质而定。举例而言，在X为OH时，所述反应可在例如DMAP等碱以及例如N,N’-二异丙基碳化二亚胺(DIC)等活化剂的存在下在包含例如THF等适宜溶剂的液体介质中进行。

在多个不同实施例中，式(VI)的化合物与式(VI-1)的化合物完全相同。例如，式(VI)的化合物及式(VI-1)的化合物可分别为棕榈酸。在此类实施例中，式(XV-1a)的二醇至式(IF-1)的化合物的转化可在一个步骤中完成。

在某些实施例中，可通过下列引入不同的L¹及L²基：使所述二醇与化学计量的量的式(VI-1)或(VI)的化合物反应以酯化所述两种醇中反应性更强的醇，且然后使所得酯与式(VI)或(VI-1)中的另一者反应以酯化所述二醇的第二醇。

在有的实施例中，所述方法包含使式(XVI-1)的环氧化物与式(III)的含氨基酸共轭配偶体反应以提供式(XV-1b)的化合物，如下面的示意图A4中所示。在此类实施例中，羟基保护基P¹⁰是稳定的且在共轭反应条件下不会被移除。

式(XV-1b)的经保护醇容易得到式(IF-1)的化合物，其中L¹与L²不同。使用式(XV-1b)的化合物而非式(XV-1a)的二醇来获得此类化合物在某些实施例中可能更方便，例如在其中式(XV-1a)的二醇的各醇之间选择性差的情形中。

示意图A4：经由式(XV-1b)的化合物制备双酯共轭物。

式(XV-1b)的β-氢硫基羟基(β-sulfanylhydroxyl)可在有效酯化的条件下用式(VI)的化合物酰化以提供经保护的酯(XVIII)，然后移除保护基P¹⁰以提供式(XIX)的醇。移除保护基的条件根据所用保护基而定。举例而言，可使用稀氟化氢移除硅烷基保护基，例如第三丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、第三丁基二苯基硅烷基(TBDPS)等。然后可用式(VI-1)的化合物在有效酯化的条件下酰化式(XIX)的醇，以提供期望的式(IF-1)的化合物。

所属领域的技术人员将明了，羟基，例如式(XV-1a)、(XV-1b)及(XIX)的化合物中的羟基，可转化为多种其他功能基，例如硫醇及胺，以提供除酯外的具有L¹-Z¹-及L²-Z²-基的化合物。

举例而言，可使用式(XV-1b)的化合物制备式(IF-1)的化合物的硫酯及酰胺类似物，如下面示意图A5中所示。要制备酰胺类似物(IF-3)，式(XV-1b)的化合物中的羟基可首先转化为迭氮化物，然后还原为相应的胺。所述反应可于经修改的光延(Mitsunobu)条件(例如L.Rokhum et al,J.Chem.Sci,2012,124,687-691)下使用PPh₃、I₂、咪唑及NaN₃进行，以提供所述迭氮化物，然后使用PPh₃将迭氮化物还原为胺。或者，所述迭氮化物可通过首先将羟基转化为例如甲苯磺酰基或甲磺酰基等适宜离去基且然后用NaN₃处理而获得。

用式(VI)的化合物对胺进行酰化提供式(XVIII-2)的酰胺。酰化反应可在例如DMAP等碱以及例如DIC等活化剂的存在下在例如THF等适宜溶剂中通过使式(VI)的羧酸反应而进行。保护基P¹⁰的去保护及所得醇(XIX-2)的酯化提供式(IF-3)的化合物。

示意图A5.经由式(XV-1b)的化合物制备硫酯及酰胺。

硫酯类似物(IF-2)可通过下列制备：首先使式(XV-1b)的化合物于光延条件(例如PPh₃、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD))下反应并用例如硫代棕榈酸等期望的式(VI-2)的硫代酸捕捉以提供式(XVIII-1)的化合物(参见，例如O.Schulze et al,Carbohydrate Res.,2004,339,1787-1802)。保护基P¹⁰的去保护以及所得醇(XIX-1)的酯化提供式(IF-2)的化合物。

双酯(IF-1)的硫酯及酰胺类似物也可自式(XIX)的化合物制备，如示意图A6中所示。可通过类似于上文针对将式(XV-1b)转化为式(XVIII-1)的化合物所述方法的方法将式(XIX)的化合物转化为式(IF-4)的化合物。

类似地，可通过类似于上文针对将式(XV-1b)转化为式(XVIII-2)的化合物所述方法的方法将式(XIX)的化合物转化为式(IF-5)的化合物。

示意图A6.经由式(XIX)的化合物制备硫酯及酰胺。

双酯(IF-1)的更多其他类似物可通过用式(XIX-1)或(XIX-2)的化合物替代示意图A6中的式(XIX)的化合物且然后遵照所述合成顺序而制备。

所属领域的技术人员将明了，可通过类似方法制备无数其他式(IF)的化合物。

式(VI)、(VI-1)、(VI-2)及(VI-3)的化合物可商购或使用标准合成化学技术自商购前驱体制备。

式(I)的化合物也可通过包含共轭含氨基酸共轭配偶体与缩醛的方法制备，如示意图B1中所示。

示意图B1.经由缩醛(XXI)制备式(I)的化合物。

本发明提供一种制备式(XX)的化合物的方法，所述方法包含使式(III)的含氨基酸共轭配偶体与其中LG为适宜离去基的式(XXI)的缩醛在有效地提供式(I)的化合物的条件下反应。在所述反应中，式(III)的化合物的硫醇替代式(XXI)的缩醛中的离去基(LG)。适宜的离去基包括但并不仅限于卤代(例如氯代、溴代或碘代)或磺酸酯基(例如甲苯磺酸酯基或甲磺酸酯基)。其他适宜的离去基对所属领域的技术人员而言将是显而易见的。

式(XXI)的化合物中的缩醛环的大小可有所变化。缩醛环可包含5至7个环原子(即可为5至7元环缩醛)。在某些实施例中，环缩醛为6元的。将理解，当环缩醛为5元环缩醛时，为了提供式(I)的化合物，w至少为2(因而m、v及w的和至少为3)。

与缩醛反应的含氨基酸共轭配偶体可由例如Nα-胺经保护及/或C端经保护的半胱氨酸等氨基酸组成。或者，所述含氨基酸共轭配偶体可包含肽，例如短肽。在此类实施例中，所述含氨基酸共轭配偶体可包含约15个氨基酸残基或更少，例如5、4或3个氨基酸残基。所述含氨基酸共轭配偶体的Nα-氨基较佳经保护或者经取代(即，不呈自由胺–NH₂基形式)以防止在共轭反应期间发生反应。所述含氨基酸共轭配偶体的C端也可经保护。

共轭反应可在碱的存在下进行。举例而言，所述反应可在有机胺的存在下在例如DMF等适宜溶剂中在约50℃的温度下进行。适宜的有机胺包括但并仅限于三乙胺、N-甲基吗啉、柯林碱等。

式(XXI)的化合物可通过使立体异构纯的式(XXII)的化合物或所述化合物的富立体异构的混合物反应而以立体异构纯的形式或富立体异构混合物而提供。有利地，式(XXII)的立体异构纯化合物容易商购，例如(4R)-或(4S)-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-4-基)-甲醇。

其他式(XXII)的化合物可通过本领域熟知的常规方法制备。如示意图B1-1中所示，其中P^g为适宜羟基保护基的式(XXII-B)的化合物可与式(XXII-C1)的化合物反应以提供式(XXII-D)的缩醛，所述缩醛然后可通过移除保护基P^g而转化为式(XXII)的化合物。或者，所述式(XXII-B)的化合物可与其中R^o及R^p分别独立地为C1-4烷基的式(XXII-C2)的无环缩醛反应。乙酰化反应可使用例如樟脑磺酸等酸在例如二氯甲烷等适宜溶剂中进行。

移除保护基P^g的条件根据所用保护基而定。举例而言，可通过在例如THF等适宜溶剂中使用例如四丁基氟化铵(TBAF)等氟源进行处理来移除硅烷基醚保护基，例如TBDMS。参见，例如C.R.Reddy et al,(Tetrahedron Letters,2010,51(44)5840-5842)；及Sauret-Cladière et al(Tetrahedron Asymmetry,1997,8(3),417-423)。

示意图B1-1.式(XXII)的化合物的制备。

再次参照示意图B1，式(XXI)的化合物可自式(XXII)的化合物通过与离去基的适宜前驱体反应而制备。举例而言，甲苯磺酸酯或甲磺酸酯离去基可通过在碱及适宜溶剂的存在下与对甲苯磺酰氯或甲烷磺酰氯反应而制备，且碘代离去基可通过与PPh₃及I₂反应而制备。

随后可通过一或多个合成步骤将式(XX)的化合物转化为式(I)的化合物，例如式(IA)的化合物。

所述一或多个合成步骤可包含移除所述缩醛以提供式(XXIII-1)的二醇。式(XXIII-1)的化合物中与联接R¹及R²的碳结合的羟基可转化为L¹-Z¹-，及/或与联接R^x及R^y的碳结合的羟基可转化为L²-Z²-。

举例而言，如示意图B2中所示，式(XX)的化合物中的缩醛可通过在例如二氯甲烷等溶剂中用例如对甲苯磺酸等酸处理而移除以提供式(XXIII-1)的二醇。以与针对将式(XV-1a)的化合物转化为式(IF-1)的化合物所述类似的方式，可经由一或多个酰化步骤将式(XXIII-1)的二醇转化为式(IA)的双酯化合物。

示意图B2.式(IA)的双酯共轭物的制备。

或者，在其中R^m为例如苯基或经甲氧基取代的苯基等视需要经取代的芳基的多个不同实施例中，所述一或多个合成步骤可包含移除缩醛以提供式(XXIII-2)或(XXIII-3)的化合物。所述一或多个合成步骤可包含将式(XXIII-2)的化合物中与联接R^x及R^y的碳结合的羟基转化为L²-Z²-，移除R^mRⁿCH-基以提供羟基，及将羟基转化为L¹-Z¹；或将式(XXIII-2)的化合物中与联接R^x及R^y的碳结合的羟基转化为L¹-Z¹-，移除R^mRⁿCH-基以提供羟基，及将羟基转化为L²-Z²-。此类方法有利地允许引入不同的L¹-Z¹基及L²-Z²-基。

如示意图B3中所示，式(XX)的化合物中的缩醛可通过例如用如二异丁基氢化铝(DIBAL)等适宜还原剂处理而移除。然后可用式(VI)的化合物酰化所得的式(XXIII-2)的化合物，以引入期望的L²-C(O)O-基。移除R^mRⁿCH-基以提供式(XXV-2)的化合物可通过氢解(例如针对苄基或对甲氧基苄基)或任何其他适于R^mRⁿCH-基的性质的方法进行。然后可通过用式(IV-1)的化合物酰化而将式(XXV-2)的化合物转化为式(IA)的化合物。酰化步骤可如本文中针对式(IF-1)的化合物的制备所述进行。

示意图B3.经由式(XXIII-2)的化合物的双酯共轭物。

对于所属领域的技术人员将显而易见的是，式(IA)的化合物可自式(XXIII-3)的化合物通过分别用式(XXIII-3)、(VI-1)及(VI)的化合物替代示意图B3中式(XXIII-2)、(VI)及(VI-1)的化合物、且然后遵照所述合成顺序而制备。

移除缩醛或R^mRⁿCH-基而产生的羟基，例如式(XXIII-1)、(XXIII-2)、(XXIII-3)及(XXV-2)的化合物中的羟基，可转化为多种其他功能基，例如硫醇及胺，以提供具有其他Z¹及Z²基的式(I)的化合物。

将理解，式(IA)的双酯化合物的酰胺及硫酯类似物可通过类似于上文针对式(IF-1)的双酯化合物的酰胺及硫酯类似物所述方法的方法而制备。

本发明也提供一种经由硫醇-烯反应(thiol-ene reaction)制备式(I)的化合物的方法。所述方法包含使包含碳碳双键的第一含脂质共轭配偶体、包含碳碳双键的第二含脂质共轭配偶体以及包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体在有效地使所述第一及第二含脂质共轭配偶体共轭至所述含氨基酸共轭配偶体的条件下反应。每一含脂质共轭配偶体均包含脂质部分并且因此在反应中向所述式(I)的化合物提供脂质部分，一个脂质部分包含L¹，另一脂质部分包含L²。

所述硫醇-烯反应涉及在非芳族碳碳双键上加成硫醇(即碳碳双键的氢硫醇化)。所述反应经由自由基机制进行。反应中有三个明显的阶段：引发、偶合及终止。

通常，自由基产生得到亲电子性含硫自由基(thiyl radical)，其在烯烃的烯基间扩展，形成以碳为中心的自由基且自另一硫醇分子的链转移将所述自由基淬灭在碳上而得到最终产物。

虽然不希望受理论的限制，但发明者相信在本发明的方法中，硫醇共轭至所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子而形成以碳为中心的自由基，然后这个以碳为中心的自由基不是被淬灭，而是与所述第二含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子共轭而提供式(I)的化合物。

因此所述方法提供式(I)的氨基酸及肽共轭物，其中来自所述硫醇的硫原子共轭至来自所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子，而来自所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子共轭至来自所述第二含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子。

所述第一及第二含脂质共轭配偶体可相同或不同。所属领域的技术人员将了解，使不同的含脂质共轭配偶体同时反应可提供(可能多达四种不同的)式(I)的化合物的混合物。因此，在某些例示性实施例中，所述第一及第二含脂质共轭配偶体相同。

硫醇烯反应对于所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的哪一碳原子共轭至硫醇并且也对于所述第二含脂质共轭配偶体的碳碳双键的哪一碳原子共轭至所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的哪一碳原子而言具有位置选择性。所属领域的技术人员将了解，在反应中可能形成多种位置异构体。

在某些实施例中，所述方法包含使式(IIA)的第一含脂质共轭配偶体及式(IIB)的第二含脂质共轭配偶体与含硫醇的含氨基酸共轭配偶体(III)在有效地提供式(IB)的化合物的条件下反应(示意图C1)。

示意图C1.经由硫醇烯反应制备(式IB)的化合物。

有效地形成式(IB)的化合物的条件可变化。在多个不同实施例中，有效地形成式(IB)的化合物的条件可包含用对于硫醇化学计量过量的含脂质共轭配偶体进行反应，例如含脂质共轭配偶体(IIA)及(IIB)(组合)对含氨基酸共轭配偶体的化学计量比为至少7:1，例如8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1或70:1。

所述含氨基酸共轭配偶体至所述式(IB)的产物化合物的转化程度可变化。较佳地，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％或70％的所述含氨基酸共轭配偶体转化为所述式(IB)的化合物。转化可通过HPLC确定。

如上所述，虽然不希望受理论的限制，但发明者相信，在此类条件下，式(IA)的烯烃与式(III)的硫醇的反应导致式(X)的以碳为中心的自由基的形成，所述自由基用所述式(IIB)的第二烯烃捕捉而非通过自所述式(III)的另一分子的硫醇提取质子而淬灭，以提供期望的氨基酸或肽共轭物。

所述反应可导致产生立体异构体的混合物，因为可能由于反应过程中产生的自由基中间体而无法控制或影响结合R³的碳原子与结合R^b及R^c的碳原子之间的键形成的立体化学结构。所述反应通常产生针对结合R³的碳原子的差向异构体的混合物。

在某些实施例中，含脂质共轭配偶体中的Z¹及Z²分别为–C(O)O–，且所述硫醇烯方法中形成的式(I)的化合物为本文中所定义的式(IC)的化合物。

在例示性实施例中，本发明的硫醇烯方法包含使包含式(III)的结构的含氨基酸共轭配偶体与为乙烯基酯的式(IIA)及(IIB)的含脂质共轭配偶体反应而提供式(ID)的化合物。所述反应可例如按下面的实例中所述通过辐照包含所述含氨基酸共轭配偶体；含脂质共轭配偶体；例如DMPA等光化学引发剂的反应混合物而进行。可包含一或多种添加剂来减少副产物的形成，例如位阻硫醇(例如第三丁基硫醇)、酸(例如TFA)或有机硅烷(例如三异丙基硅烷)或其任何二或更多者的组合。所述反应可在例如NMP等适宜溶剂中在环境温度下进行适宜的时间，例如30分钟。

所述反应通常通过在反应混合物中产生一或多种自由基而引发。在所述方法中可通过任何本领域熟知方法产生一或多种自由基。自由基可以热及/或光化学方式产生。可使用一或多种自由基引发剂来引发自由基的产生。适宜自由基引发剂包括热引发剂及光引发剂。

自由基通过加热自热引发剂产生。热引发剂的降解率及所产生的自由基的形成根据引发剂以及加热引发剂的温度而定。较高的温度通常造成更快的分解。所属领域的技术人员不经过度实验便将能够选择适合加热引发剂的温度。

多种热引发剂市面有售。热引发剂的实例包括但并不仅限于过氧苯甲酸第三戊酯、1,1'-偶氮双(环己烷腈),2,2'-偶氮双异丁腈(AIBN)、过氧化苯甲酰、第三丁基过氧化氢、过氧乙酸第三丁酯、过氧化第三丁酰、过氧苯甲酸第三丁酯、过氧化异丙基碳酸第三丁酯、过氧化月桂酰、过乙酸及过硫酸钾。

自由基可通过用光辐照自光引发剂产生。所需用以引发光引发剂降解及自由基形成的光的频率根据引发剂而定。许多光引发剂可用紫外光引发。

可使用特定波长或波长范围的光来选择性辐照引发剂，其中所述含脂质共轭配偶体或例如含肽共轭配偶体等含氨基酸共轭配偶体包含光敏基团。在某些实施例中，使用约365奈米的频率。这一频率的光一般与自然存在的氨基酸的侧链兼容。

许多不同的光引发剂市面有售。光引发剂的实例包括但并不仅限于苯乙酮、大茴香偶姻、蒽醌、蒽醌-2-磺酸、苯偶酰、苯偶姻、苯偶姻乙基醚、苯偶姻异丁基醚、苯偶姻甲基醚、二苯甲酮、3,3',4,4'-二苯甲酮四甲酸二酐、4-联苯基苯甲酮、2-苄基-2-(二甲基氨基)-4'-吗啉并苯丁酮、4'-双(二乙基氨基)二苯甲酮、4,4'-双(二甲基氨基)二苯甲酮、樟脑醌、2-氯硫杂蒽-9-酮、二苯并环庚烯酮、2,2-二乙氧基苯乙酮、4,4'-二羟基二苯甲酮、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、4-(二甲基氨基)二苯甲酮、4,4'-二甲基苯偶酰、2,5-二甲基二苯甲酮、3,4-二甲基二苯甲酮、4'-乙氧基苯乙酮、2-乙基蒽醌、3'-羟基苯乙酮、4'-羟基苯乙酮、3-羟基二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮、1-羟基环己基苯基酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、2-甲基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、苯甲酰基甲酸甲酯、2-甲基-4'-(甲基硫代)-2-吗啉并苯丙酮、菲醌、4'-苯氧基苯乙酮及硫杂蒽-9-酮。

所属领域的技术人员将能够考虑例如所述含脂质共轭配偶体、例如含肽共轭配偶体等含氨基酸共轭配偶体以及反应混合物中存在的任何其他组分而选择适用于所述方法的自由基引发剂。在一些实施例中，引发剂以相对于包含硫醇的起始材料自约20:1至约0.05:1、约10:1至约0.05:1、约5:1至约0.05:1、约3:1至约0.5:1的化学计量比存在于反应中。

所述含脂质共轭配偶体以及例如含肽共轭配偶体等含氨基酸共轭配偶体可使用熟知合成化学技术(例如大致描述于Louis F Fieser and Mary F,Reagents for OrganicSynthesis v.1-19,Wiley,New York(1967-1999ed.)或Beilsteins Handbuch derorganischen Chemie,4,Aufl.Ed.Springer-Verlag Berlin(包括附录(也可经由Beilstein在线数据库获得))中的方法)制备，或在一些实施例中，可商购。

举例而言，式(IIA-1)的含脂质共轭配偶体化合物可通过使其中X为OH或适宜离去基的式(VI)的化合物与其中Y为H、金属或类金属或酰基(例如烷基羰基)的式(VII)的化合物在有效地酯化(或在Y为酰基的情形下转酯化)的条件下反应而制备(示意图C2)。

示意图C2.式(IIA-1)的化合物的制备。

本领域熟知用于酯化(或转酯化)的方法。举例而言，当X为氯代且Y为H时，反应可在例如吡啶或三乙胺等碱的存在下在适宜溶剂中进行。所述酰基氯可原位转化为更具反应性的物质(例如使用碘化钠转化为对应的碘化物)。反应进行的温度根据所述酸物质及所用溶剂的反应性而定。

举例而言，可通过使用酸或金属催化剂用乙酸乙烯酯(其本身通过乙酸与乙炔或乙酸与乙烯经适宜催化剂反应而以工业方式生产)转酯化生成式(IIA-1)的乙烯基酯。参见，例如EP0376075A2及S.K.Karmee,J.Oil Palm Res.,2012,1518-1523。

式(IIA-1)的乙烯基酯也可通过在催化剂(通常为钯或钌络合物)的存在下向末端炔烃加入羧酸而制备。参见，例如V.Cadierno,J.Francos,J.Gimeno Organometallics,2011,30,852-862；S.Wei,J.Pedroni,A.Meissner,A.Lumbroso,H.-J.Drexler,D.Heller,B.Breit,Chem.Eur.J.,2013,19,12067-12076。也可使非末端炔烃反应。参见，例如N.Tsukada,A.Takahashi,Y.Inoue,Tetrahedron Lett.,2011,52,248-250以及M.Rotem,Y.Shvo,J.Organometallic Chem.1993,448,159-204。

用于制备式(IIA-1)的乙烯基酯的其他实例包括：使二乙烯汞与芳族及脂族酸反应[参见，例如D.J.Foster,E.Tobler,J.Am.Chem.Soc.1961,83,851]；在AgF的存在下使芳烃羧酸与三甲氧基(乙烯基)硅烷进行Cu(II)催化的酯化[参见，例如F.Luo,C.Pan,P.Qian,J.Cheng,Synthesis 2010,2005]；使用由2摩尔-％的[AuCl(PPh₃)]及2摩尔-％的AgOAc组成的催化剂系统自乙酸酯至一级及二级醇并且也至羧酸的乙烯基转移反应[参见，例如A.Nakamura,M.Tokunaga,Tetrahedron Lett.2008,49,3729]；以及Ir络合物([Ir(cod)Cl]₂/P(OMe)₃)催化的反乙烯化[参见，例如H.Nakagawa,Y.Okimoto,S.Sakaguchi,Y.Ishii,Tetrahedron Lett.2003,44,103]。

其他用于制备式(II-A)的化合物的适宜方法对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。

当式(IIA-1)的化合物与(IIB-1)的化合物不同时，式(IIB-1)的含脂质共轭配偶体化合物可通过类似方式制备。

多种式(VI)的化合物市面有售。其他的可使用标准合成化学技术自市售前驱体制备。举例而言，其中X为氯代的式(VI)的化合物可在适宜溶剂或溶剂的混合物中用亚硫酰氯处理相应的羧酸而制备。

类似地，式(VII)的化合物也市面有售或可使用标准合成化学技术自市售前驱体制备。

所述含脂质共轭配偶体及例如含肽共轭配偶体等含氨基酸共轭配偶体以及反应混合物中存在的任何其他组分引入反应釜中的顺序可变化。反应可以一锅程序(one-potprocedure)形式进行。

所述反应中所述含脂质共轭配偶体与例如含肽共轭配偶体等含氨基酸共轭配偶体的比率可变化。在一些实施例中，合并的第一含脂质共轭配偶体及第二含脂质共轭配偶体(即总和)与含氨基酸共轭配偶体的摩尔比为至少7:1，例如8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1或70:1。

所述反应可在任何适宜温度下进行。在一些实施例中，所述反应在约-25℃至约200℃、约-10℃至约150℃、约0℃至约125℃、约环境温度至约100℃的温度下进行。在一些实施例中，反应在小于约200℃、小于约175℃、小于约150℃、小于约125℃或小于约100℃的温度下进行。

在一些实施例中，反应在高于环境温度的温度下进行。在一个实施例中，反应在40至200℃、50至150℃、60至100℃、65至90℃或70至80℃的温度下进行。在一些实施例中，反应在大于40℃、大于50℃、大于75℃、大于100℃或大于150℃的温度下进行。

进行反应的温度可根据反应中如何产生自由基而定。所用温度可经选择以控制反应速率。温度在反应过程期间可调整以控制反应的速率。

若自由基以热方式(例如使用热引发剂)产生，则反应一般将在高于环境温度的温度下进行。温度将根据自其产生自由基的物质的反应性而定。

若自由基以光化学方式产生，则反应将有利地在环境温度下进行。在某些实施例中，可能期望冷却反应混合物以减缓反应速率或相反地加热反应混合物以增加反应速率。

所属领域的技术人员将能够根据起始材料以及其他存在的反应物的反应性选择适于进行所述方法的温度。

反应进行的温度可通过用本领域熟知的适宜方法加热或冷却反应混合物而加以控制。举例而言，可通过使用在反应釜内的换热器、环绕反应釜的加热套或通过将反应釜浸入热液体(例如油或沙浴)中向反应混合物施加热。在某些例示性实施例中，通过微波辐照加热反应混合物。

可通过任何适宜方式监测反应的进程，例如通过薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)。可允许反应进行至实质结束，按起始材料其中的至少一者的消耗监测。在一些实施例中，允许反应进行1分钟至7天、5分钟至72小时、10分钟至48小时、10分钟至24小时的时间。在有的实施例中，允许反应进行小于72小时、小于48小时、小于24小时、小于12小时、小于6小时、小于4小时、小于2小时或小于1小时的时间。

在一些实施例中，反应进行至直至至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％的所述含氨基酸共轭配偶体已被消耗。起始材料的消耗可通过例如HPLC等任何适宜方法监测。

反应混合物可通过例如使用磁性或机械搅拌器等任何本领域熟知适宜方法混合。所用方法可根据反应进行的规模而定。

反应一般在液体反应介质中进行。液体反应介质可包含溶剂。适宜溶剂的实例可包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、三氟乙酸、乙酸、乙腈及其混合物。

溶剂可根据起始材料以及例如自由基引发剂等其他存在的反应物的溶解性进行选择。在一些实施例中，所述含脂质共轭配偶体为疏水性的。含氨基酸共轭配偶体的疏水性或亲水性可根据例如含肽共轭配偶体的肽的氨基酸序列而变化。含肽共轭配偶体中存在增溶基可增加在例如水等极性溶剂中的溶解度。所属领域的技术人员将不进行过度实验便能够选择适宜的溶剂。

反应可在实质无氧的条件下进行。氧可能淬灭在反应中形成的自由基。反应混合物可用实质上无氧的惰性气体(例如氮或氩)进行脱气，以在产生自由基前移除任何溶解的氧。或者，反应混合物的各个组分可于在反应釜中合并之前用实质上无氧的惰性气体进行脱气。反应可在实质上无氧的惰性气体气氛下进行。

本发明的方法可在环境压力下进行。

在本发明的硫醇烯方法中，可在反应混合物中包含抑制不期望的副产物的形成及/或改善期望产物的产率或至期望产物的转化的添加剂。一或多种添加剂可为外源硫醇、酸、有机硅烷或其任何二或更多者的组合。

发明者已发现，在一些实施例中，在反应混合物中包含外源或外生硫醇作为添加剂会降低不期望的副产物的形成。在一些实施例中，外源硫醇可增加期望的硫醇烯反应的效率或转化率。适宜外源硫醇的实例包括但并不仅限于还原型麸胱甘肽、DODT、DTT、蛋白质、位阻硫醇等。

在一些实施例中，外源硫醇为DTT。

在有的实施例中，外源硫醇为位阻硫醇。适宜位阻外源硫醇的非限制性实例包括第三丁基硫醇及1-甲基丙基硫醇。

虽然不希望受理论限制，但发明者相信，在某些实施例中，例如第三丁基硫醇等外源硫醇可提供质子来淬灭在式(X)的化合物与式(IIB)的烯烃的扩展中产生的自由基中间体，以提供期望的式(IB)的化合物且所得含硫自由基能通过自式(III)的含氨基酸共轭配偶体产生另一摩尔的含硫自由基而使反应扩大。

将显而易见的是，外源硫醇在某些实施例中也能够通过提供式(X)的质子自由基而过早淬灭反应。在此类实施例中，可选择外源硫醇及其用量，以便最优化式(IB)的化合物的产率或至式(IB)的化合物的转化(通过HPLC确定)。

在多个不同实施例中，外源硫醇以相对于含氨基酸共轭配偶体为约200:1至约0.05:1、100:1至0.05:1、80:1至0.05:1、60:1至0.05:1、40:1至0.05:1、20:1至约0.05:1、10:1至约0.5:1、5:1至约1:1或3:1至约1:1的化学计量比存在于反应中。在某些实施例中，例如t-BuSH等位阻硫醇以相对于含氨基酸共轭配偶体为约100:1至0.05:1、例如约80:1、约40:1或约3:1的化学计量比存在于反应中。

在一些实施例中包含酸也可减少不期望的副产物的形成。酸可为强无机酸，例如HCl，或有机酸，例如TFA。在某些实施例中，添加剂为TFA。虽然不希望受理论限制，但发明者相信，降低反应混合物的pH可产生例如赖氨酸等原本可能参与单个电子转移并在反应中形成自由基物质的残基的富电子侧链的质子化。在多个不同实施例中，反应混合物包含约0.01至25、0.01至15、0.01至10或1至10％v/v的酸添加剂。在某些实施例中，反应混合物包含1-10％v/v的TFA，例如5％v/v的TFA。

发明者已发现，在一些实施例中在反应混合物中同时包含第三丁基硫醇及TFA作为添加剂可减少不期望的副产物的形成并增加起始材料向期望的产物的转化。因此，在某些例示性实施例中，反应混合物包含酸与外源硫醇的组合，例如强有机酸与位阻硫醇的组合，例如TFA与第三丁基硫醇的组合。

硫醇烯反应中也可包含有机硅烷作为添加剂。有机硅烷为基于自由基的还原剂，其活性可通过改变硅原子上的取代基而进行调整。在多个不同实施例中，有机硅烷为式(R^q)₃SiH的化合物，其中R^q在每一情形下均独立地为氢或有机基团，例如烷基或芳基，其限制条件为至少一个R^q不为氢。有机硅烷的实例包括但并不仅限于三乙基硅烷(TES)、三苯基硅烷、二苯基硅烷、三异丙基硅烷(TIPS)等。在多个不同实施例中，有机硅烷为三烷基硅烷，例如三异丙基硅烷或三乙基硅烷。

虽然不希望受理论限制，但发明者相信，如同外源硫醇一样，在某些实施例中，例如三异丙基硅烷等有机硅烷可用作氢供体以提供期望的式(IB)的化合物并促进反应的扩大。

在多个不同实施例中，有机硅烷以相对于含氨基酸共轭配偶体为约200:1至约0.05:1、100:1至0.05:1、80:1至0.05:1、60:1至0.05:1、40:1至0.05:1、20:1至0.05:1、10:1至0.5:1、5:1至约1:1或3:1至约1:1的化学计量比存在于反应中。在某些实施例中，例如三异丙基硅烷等三烷基硅烷以相对于含氨基酸共轭配偶体为约100:1至0.05:1、例如约80:1或约40:1的化学计量比存在于反应中。

有机硅烷可以与外源硫醇组合的形式用作添加剂。或者，可使用有机硅烷代替外源硫醇。也可存在酸，例如三氟乙酸。发明者已发现，在某些实施例中，在反应中使用三异丙基硅烷以及三氟乙酸但不使用任何外源硫醇与当使用三异丙基硅烷、t-BuSH及三氟乙酸的组合时相比可提供更高的向期望的式(IB)的化合物的转化。

添加剂的用量一般足以使不期望副产物的形成最小化，同时不会对所述方法中的反应或任何可选后续步骤造成不利影响。

在反应中形成的产物以及向期望产物的转化可通过例如HPLC确定。

所述含脂质共轭配偶体及例如含肽共轭配偶体等含氨基酸共轭配偶体在反应混合物中的浓度也可分别影响反应。所属领域的技术人员将不经过度实验便能够改变反应混合物中所述含脂质共轭配偶体及含肽共轭配偶体的浓度以例如最优化产率及纯度。

在一些实施例中，包含硫醇的起始材料以约0.05mM至约1M、约0.5mM至约1M、约1mM至约1M的浓度存在。在一些实施例中，浓度为至少约0.05mM、0.5mM或1mM。

在一些实施例中，包含烯烃的起始材料的浓度为至少约0.05mM、0.5mM或1mM。

在一些实施例中，所述氨基酸共轭物或肽共轭物在反应后自反应介质分离并视需要经纯化。可使用本领域熟知的任何适宜方法、例如通过沉淀将共轭物自反应介质分离。

在一些实施例中，氨基酸或肽共轭物在将其自反应介质中分离后进行纯化。举例而言，可通过HPLC使用一或多种适宜溶剂对共轭物进行纯化。

本发明也提供一种制备肽共轭物的方法，所述方法包含

提供本发明的式(I)的氨基酸或肽共轭物或者其盐或溶剂合物，以及

通过本发明的方法所产生的肽共轭物及/或所述含肽共轭配偶体及/或在本发明的方法中偶合的肽可包含合成肽。合成肽可使用固相肽合成(SPPS)制备。

固相肽合成(SPPS)的基本原理为向经由连接分子锚固至通常为树脂颗粒的固相载体的生长中的多肽链逐步添加氨基酸，其允许一旦多肽链完成便进行裂解及纯化。简言之，固相树脂载体与起始氨基酸经由连接分子彼此联接。此类树脂-连接体-酸基质市面有售。

偶合至树脂的氨基酸在其Nα-端被化学保护基保护。

所述氨基酸也可具有侧链保护基。此类保护基于在待偶合的氨基酸的羧基与联接树脂的肽链的未保护的Nα-氨基之间形成新肽键的过程期间防止发生不期望或有害的反应。

待偶合的氨基酸与肽链的N端氨基酸的未经保护的Nα-氨基反应，使肽链的链长度增加一个氨基酸的长度。待偶合的氨基酸的羧基可用适宜的化学活化剂活化以促进与肽链的Nα-氨基的反应。然后移除肽链的N端氨基酸的Nα-保护基，为与下一氨基酸残基偶合做准备。这个技术由许多重复步骤组成，使得有可能实现自动化，这很具有吸引力。所属领域的技术人员将理解，肽可偶合至固相结合的氨基酸或肽而非单独的氨基酸的Nα-氨基，例如在需要会聚肽合成(convergent peptide synthesis)时。

当达成期望的氨基酸序列时，在连接分子处将肽自固相载体裂解。

固相肽合成可使用连续流方法或间歇流方法进行。连续流允许经由分光亮度计实时监测反应进程，但具有两个明显劣势——与树脂上的肽接触的反应物被稀释，且规模由于固相树脂的物理尺寸限制而更受限。间歇流在过滤反应釜中发生，且因为反应物易得到且可手动或自动添加而非常有用。

通常使用两类保护基来保护Nα-氨基末端：“Boc”(第三丁氧羰基)及“Fmoc”(9-茀甲氧羰基)。用于Boc法的试剂相对廉价，但它们腐蚀性高且需要昂贵的设备以及采取更严格的预防措施。使用虽然更贵但腐蚀性更低的试剂的Fmoc法通常较佳。

对于固相肽合成，有许多种固体载体相可用。用于合成的固相载体可为合成树脂、合成聚合物膜或适用于合成目的的硅或硅酸盐表面(例如可控孔度玻璃)。一般使用树脂，通常为聚苯乙烯悬浮液、或聚苯乙烯-聚乙二醇、或例如聚酰胺等聚合物载体。用适合于Boc化学结构的连接体功能化的树脂的实例包括PAM树脂、肟树脂SS、苯酚树脂、溴化王氏树脂(Wang resin)及溴化PPOA树脂。适于Fmoc化学结构的树脂的实例包括氨基-甲基聚苯乙烯树脂、AMPB-BHA树脂、西贝尔酰胺(Sieber amide)树脂、林克酸(Rink acid)树脂、TentagelS AC树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、2-氯三苯甲基醇树脂、TentaGel S Trt-OH树脂、Knorr-2-氯三苯甲基树脂、肼-2-氯三苯甲基树脂、ANP树脂、Fmoc光敏(photolable；photolabile)树脂、HMBA-MBHA树脂、TentaGel S HMB树脂、Aromatic Safety Catch树脂、BAl树脂及Fmoc-羟胺2氯三苯甲基树脂。其他树脂包括PL Cl-Trt树脂、PL-肟树脂及PL-HMBA树脂。树脂一般可互换。

对于每一树脂，文献中已知用于联接起始单体或亚单元的适宜偶合条件。

固相载体的制备包括将载体溶解在适宜溶剂(例如二甲基甲酰胺)中。固相在溶解期间通常增加，这又增加可用于进行肽合成的表面积。

然后将连接分子联接到载体，以将肽链连接到固相载体。连接分子一般经设计，以使最终的裂解在C端提供自由酸或酰胺。连接体一般不具有树脂特异性。连接体的实例包括肽酸，例如4-羟基甲基苯氧基乙酰基-4'-甲基二苯甲基胺(HMP)，或肽酰胺，例如二苯甲基胺衍生物。

所述肽序列的第一氨基酸可在所述连接体联接到固相载体后联接到所述连接体或使用包含所述肽序列的第一氨基酸的连接体联接到所述固相载体。包含氨基酸的连接体市面有售。

下一步是将所述第一氨基酸的Nα-氨基去保护。对于Fmoc SPPS，Nα-氨基的去保护可用弱碱处理(例如哌嗪或哌啶)进行。侧链保护基可通过适度酸解(例如三氟乙酸(TFA))移除。对于Boc SPPS，Nα-氨基的去保护可使用例如三氟乙酸进行。

在去保护后，通过肽键的形成进行氨基酸扩链或偶合。这个过程需要活化待偶合的氨基酸的C-α-羧基。这可使用例如原位试剂、预形成对称酸酐、活性酯、酰基卤或经氨基甲酸乙酯保护的N-羧基酸酐等完成。原位法允许同时活化及偶合。偶合剂包括碳二亚胺衍生物，例如N,N'-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基碳二亚胺。偶合剂也包括苯并三唑的脲鎓(uronium)或鏻盐衍生物。此类脲鎓及鏻盐的实例包括HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷并鏻六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)、TOTU(O-[氰基(乙氧基羰基l)亚甲基氨基]-N,N,N′,N″-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)及HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧双-(吡咯烷)-脲鎓六氟磷酸盐)。在一些实施例中，偶合剂为HBTU、HATU、BOP或PyBOP。

在已合成期望的氨基酸序列后，将肽自树脂裂解。这个过程中使用的条件根据肽的氨基酸组成及侧链保护基的敏感度而定。一般而言，裂解在含有多种清除剂的环境中进行，以淬灭从保护基及连接体产生的反应性阳碳离子。常用裂解剂包括，举例而言，三氟乙酸及氟化氢(HF)。在一些实施例中，当肽经由连接体结合至固相载体时，通过自连接体裂解肽将肽链自固相载体裂解。

用于将肽自树脂裂解的条件可伴随移除一或多个侧链保护基。

在SPPS中使用保护基相沿成习。常用保护基的实例包括但并不仅限于乙酰氨基甲基(Acm)、乙酰基(Ac)、金刚烷氧基(AdaO)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bzl)、2-溴苄基、苄氧基(BzlO)、苄氧基羰基(Z)、苄氧基甲基(Bom)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、第三丁氧基(tBuO)、第三丁氧基羰基(Boc)、第三丁氧基甲基(Bum)、第三丁基(tBu)、第三丁硫基(tButhio)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、环己氧基(cHxO)、2,6-二氯苄基(2,6-DiCl-Bzl)、4,4'-di甲氧基二苯甲基(Mbh)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧-亚环己基)3-甲基-丁基(ivDde)、4-{N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧-亚环己基)3-甲基丁基]-氨基)苄氧基(ODmab)、2,4-二硝基苯基(Dnp)、茀基甲氧基羰基(Fmoc)、甲酰基(For)、伸三甲苯基-2-磺酰基(mesitylene-2-sulfonyl，Mts)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、3-硝基-2-吡啶氧硫基(Npys)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、2,2,5,7,8-五甲基-色烷-6-磺酰基(Pmc)、甲苯磺酰基(Tos)、三氟乙酰基(Tfa)、三甲基乙酰氨基甲基(Tacm)、三苯甲基(Trt)及呫吨基(Xan)。

当所述肽的一或多个氨基酸侧链含有例如额外的羧基、氨基、羟基或硫醇基等功能基时，可能需要额外的保护基。举例而言，如果使用Fmoc策略，则可使用Mtr、Pmc、Pbf来保护Arg；可使用Trt、Tmob来保护Asn及Gln；可使用Boc来保护Trp及Lys；可使用tBu来保护Asp、Glu、Ser、Thr及Tyr；以及可使用Acm、tBu、tButhio、Trt及Mmt来保护Cys。所属领域的技术人员将理解，有许多其他适宜的组合。

本领域熟知上文所概述的用于SPPS的方法。参见，例如Atherton and Sheppard,“Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,”New York:IRL Press,1989；Stewart and Young:“Solid-Phase Peptide Synthesis 2nd Ed.,”Rockford,Illinois:Pierce Chemical Co.,1984；Jones,“The Chemical Synthesis of Peptides,”Oxford:Clarendon Press,1994；Merrifield,J.Am.Soc.85:2146-2149(1963)；Marglin,A.andMerrifield,R.B.Annu.Rev.Biochem.39:841-66(1970)；及Merrifield R.B.JAMA.210(7):1247-54(1969)；以及“Solid Phase Peptide Synthesis–A Practical Approach”(W.C.Chan and P.D.White,eds.Oxford University Press,2000)。用于肽或多肽的自动合成的设备容易自例如Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City,CA)等供货商购得且可根据制造商的指示进行操作。

自树脂裂解后，可例如通过离心或过滤等将肽自反应介质分离。然后随后可例如通过HPLC使用一或多种适宜溶剂对肽进行纯化。

有利地，发明者已发现，在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体在所述肽自树脂裂解后不经纯化便可用于本发明的方法中。

发明者也有利地发现，在一些实施例中，本发明的硫醇烯方法可使用含肽共轭配偶体进行，其中所述肽不含有Nα-氨基保护基或任何侧链保护基。所述反应一般对于硫醇与非芳族碳碳双键的反应具有选择性。

在本发明的方法中可能必须要用保护基保护所述含肽共轭配偶体中(例如在肽的半胱氨酸残基中)存在的硫醇基，以防止不期望的竞争反应。硫醇基可用保护基保护，所述保护基在用于移除肽中存在的一或多个其他保护基的条件下或用于在将肽自树脂裂解的条件下不会被移除。

通常，所述肽将使用具有适宜保护基的氨基酸合成。所属领域的技术人员将能够不经过度实验便可选择合适的保护基。

除含脂质共轭配偶体的待反应的碳碳双键外，所述含氨基酸共轭配偶体及/或含脂质共轭配偶体可包含一或多个不饱和碳碳键。所属领域的技术人员将理解，在此类实施例中硫醇对于待反应的碳碳双键的选择性可举例而言根据所述碳碳双键相对于所述一或多个额外不饱和碳碳键的空间位阻(steric)及/或电子环境而定。在某些实施例中，所述待反应的碳碳双键相对于所述含氨基酸共轭配偶体及含脂质共轭配偶体中的任何其他不饱和碳碳键被活化。在某些实施例中，所述待反应的碳碳双键相对于所述含肽共轭配偶体及含脂质共轭配偶体中的任何其他不饱和碳碳键被活化。

在一些实施例中，所述包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体的氨基酸的Nα-氨基被酰化，例如乙酰化。在一些实施例中，本发明的方法可包含酰化、例如乙酰化所述包含待反应的碳碳双键或硫醇的含氨基酸共轭配偶体的氨基酸的Nα-氨基。

在已通过SPPS合成所述含肽共轭配偶体时，酰化可在自树脂裂解之前或之后进行。在一些实施例中，具有待反应的硫醇的含肽共轭配偶体的氨基酸残基为N端氨基酸残基，例如半胱氨酸，且所述方法包含在裂解肽之前酰化所述N端氨基。

在一些实施例中，所述方法还包含酰化、例如乙酰化所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸残基的与脂质部分偶合的Nα-氨基。

氨基酸的Nα-氨基的酰化可通过使氨基酸或肽与酰化剂在碱的存在下在例如DMF等适宜溶剂中进行。酰化剂的非限制实例包括酰基卤，例如酰基氯，如乙酰氯，以及包括酸酐，例如乙酸酐。此类试剂可购得或可通过本领域熟知的方法制备。适宜碱的非限制实例包括三乙胺、二异丙基乙胺、4-甲基吗啉等。

在有的实施例中，合成所述含肽共轭配偶体的肽包括将在Nα-氨基处酰化、例如乙酰化且包含待反应的硫醇的氨基酸或含氨基酸的肽偶合至一或多个氨基酸及/或一或多个肽。

在一些实施例中，所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽以提供肽共轭物。在一些实施例中，所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸偶合至通过固相肽合成与固相树脂载体结合的氨基酸或肽。在一些实施例中，所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸偶合至通过固相肽合成与固相树脂载体结合的肽。所述方法可包含通过固相肽合成而合成与固相树脂载体结合的肽。

在一些实施例中，所述方法还包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽以提供包含肽表位的肽共轭物。在一些实施例中，待偶合的肽包含肽表位。在有的实施例中，在偶合时形成肽表位。偶合可如本文中所述通过固相肽合成进行。

在一些实施例中，所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸偶合至通过固相肽合成与固相树脂载体结合的肽，以提供包含肽表位的肽共轭物。

在一个实施例中，所述待偶合的肽共轭物的肽结合至固相树脂载体，且所述方法包含将待偶合的肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽，以提供包含肽表位的肽共轭物。

在另外供选择的实施例中，所述方法包含将所述肽共轭物的氨基酸偶合至通过固相肽合成与固相树脂载体结合的氨基酸或肽，以提供包含肽表位的肽共轭物。

在一些实施例中，所述方法还包含将例如肽表位等表位偶合至所述氨基酸共轭物或肽共轭物。当所述方法包含偶合肽表位时，偶合可如本文中所述通过固相肽合成进行。

在某些实施例中，例如肽表位等表位经由连接基偶合或结合。在某些实施例中，所述连接基为氨基序列，例如具有二或更多个、三或更多个或者四或更多个连续氨基酸的序列。在某些实施例中，连接体包含约2至20个、2至18个、2至16个、2至14个、2至12个、2至10个、4至20个、4至18个、4至16个、4至14个、4至12个或4至10个氨基酸。

所属领域的技术人员将理解本文中所述的将氨基酸或肽偶合至另一氨基酸或肽可包含在一个偶合配偶体的所述氨基酸或所述肽的氨基酸的Nα端与另一偶合配偶体的所述氨基酸或所述肽的氨基酸的C端之间形成肽键。

在一些实施例中，本发明的方法包含通过SPPS合成所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸序列；且使所述含肽共轭配偶体反应。

在一些实施例中，本发明的方法包含通过SPPS合成所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸序列；且使所述含脂质共轭配偶体与所述含肽共轭配偶体反应。

在一些实施例中，通过SPPS合成的所述含肽共轭配偶体的肽的氨基酸序列包含将氨基酸或肽偶合至与固相树脂载体结合的氨基酸或肽，以提供所述肽的氨基酸序列或其一部分。在某些实施例中，所述含肽共轭配偶体的整个肽的氨基酸序列是通过SPPS合成。

举例而言，所述含肽共轭配偶体可在与固相树脂载体结合的情形下在所述硫醇烯方法中与所述含脂质共轭配偶体反应。或者，所述肽可在例如与所述含脂质共轭配偶体反应之前自固相树脂载体裂解，并视需要进行纯化。

所述肽共轭物及/或例如含肽共轭配偶体等含氨基酸共轭配偶体可包含一或多个增溶基。所述一或多个增溶基增加例如所述含肽共轭配偶体在例如水等极性溶剂中的溶解度。在例示性实施例中，所述增溶基不会对所述肽共轭物的生物活性产生不利影响。

增溶基的存在可有利于作为医药组合物的所述肽共轭物的配制及/或给药。

在一些实施例中，所述增溶基结合至所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽。在一些实施例中，所述增溶基结合至所述含肽共轭配偶体的肽。在一些实施例中，所述肽共轭物的肽及/或所述含肽配偶体的肽包含增溶基。在一些实施例中，所述含肽配偶体的肽包含增溶基。

在一些实施例中，增溶基结合至肽链中氨基酸的侧链。在一些实施例中，增溶基结合至肽链的C端或N端。在一些实施例中，增溶基结合于肽链中两个氨基酸残基之间。在一些实施例中，增溶基结合至肽链中一个氨基酸残基的Nα-a氨基以及肽链中另一氨基酸残基的羧基。

适宜增溶基的实例包括但并不仅限于亲水性氨基酸序列或聚乙二醇(PEG)。

在一个实施例中，所述增溶基为在肽链中包含二或更多个亲水性氨基酸残基的亲水性氨基酸序列。在一些实施例中，所述增溶基为在肽链中包含二或更多个连续亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。此类增溶基可是通过SPPS向肽链中添加所述增溶基的每一氨基酸而形成。

在另一实施例中，所述增溶基为聚乙二醇。在一些实施例中，所述聚乙二醇结合至肽链中一个氨基酸残基的Nα-氨基以及肽链中另一氨基酸残基的羧基。

在一些实施例中，所述聚乙二醇包含约1至约100个、约1至约50个、约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约15个、约1至约10个、约2至约10个或约2至约4个乙二醇单体单元。用于将聚乙二醇偶合至肽的方法为人熟知。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体包含抗原，例如抗原肽。在一个实施例中，所述肽共轭物或含肽共轭配偶体的肽为抗原或者包含抗原；或者抗原视需要经由连接体结合至肽。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含抗原，例如抗原肽。在一个实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽为抗原或者包含抗原；或者抗原视需要经由连接体结合至肽。

在一个实施例中,所述抗原包含含有表位的肽。在一个实施例中，所述含表位的肽为含表位的糖肽。在一个实施例中，所述抗原包含含有表位的糖肽。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体包含表位。在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽包含表位。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含表位。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽包含表位。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体包含二或更多个表位，举例而言，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽包含二或更多个表位。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体为或包含含有表位的糖肽。在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽为糖肽。在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体包含含有表位的糖肽，所述表位结合至所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体为或者包含含有表位的糖肽。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽为糖肽。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含含有表位的糖肽，所述表位结合至所述含肽共轭配偶体的肽。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体包含溶蛋白性裂解位点。在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽包含溶蛋白性裂解位点。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含溶蛋白性裂解位点。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽包含溶蛋白性裂解位点。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽包含一或多个连接基。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体的肽包含一或多个连接基。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体包含连接基。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含连接基。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体包含表位，所述表位经由连接基结合至所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽。在一些实施例中，所述含肽共轭配偶体包含表位，所述表位经由连接基结合至所述含肽共轭配偶体的肽。

连接基的实例包括但并不仅限于氨基酸序列(例如，肽)、聚乙二醇、烷基氨基酸等。在一些实施例中，连接体为或包含溶蛋白性裂解位点。在一些实施例中，连接体为或包含增溶基。

在一些实施例中，连接体结合于肽链中两个氨基酸残基之间。

在一些实施例中，连接基结合至所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体中一个氨基酸残基的Nα-氨基以及所述含肽共轭配偶体中另一氨基酸残基的羧基。在一些实施例中，连接基结合至所述含肽共轭配偶体中一个氨基酸残基的Nα-氨基以及所述含肽共轭配偶体中另一氨基酸残基的羧基。

在某些实施例中，连接基可在活体内自其所结合的氨基酸裂解。在某些实施例中，连接基可在活体内通过水解裂解。在某些实施例中，连接基可在活体内通过酶促水解裂解。连接基可通过任何本领域熟知方法引入。

所述方法还可包含将表位偶合至所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的肽。所述表位可如上所述经由连接基结合。在一些实施例中，所述表位为肽表位。在一些实施例中，所述方法包含偶合含有表位的糖肽。

将理解，在某些合意的实施例中，本发明的肽共轭物通过抗原递呈细胞来维持合适的吸收、处理及递呈。合意地，所述含脂质共轭物不干扰抗原递呈细胞对共轭物内存在的任何抗原肽的递呈。本文中呈现的实例确定，本发明的共轭物通过与非共轭的相关肽相容的抗原递呈细胞递呈。

合成肽的身份的确认可方便地通过例如氨基酸分析、质谱分析、埃德曼降解(Edman degradation)等实现。

本发明的方法还可包含将所述氨基酸共轭物自液体反应介质分离。或者，本发明的方法还可包含将所述肽共轭物自液体反应介质分离。可使用本领域熟知的任何适宜分离方法，例如沉淀及过滤。共轭物可随后通过HPLC使用一或多种溶剂进行纯化。

本发明也涉及通过本发明的方法制备的氨基酸共轭物及肽共轭物。

本发明也涉及一种式(I)的化合物，其为氨基酸共轭物。

本发明也涉及一种式(I)的化合物，其为肽共轭物。

所述肽共轭物可为纯的或经纯化的、或实质纯的。

本文中所述“经纯化的(purified)”不需要绝对纯度；而是，其意欲作为相对术语，其中相关材料比其之前所在环境中更纯。实际上，材料已通常例如经分馏以移除各种其他组分，且所得材料已实质上保留其所需的一或多种生物活性。术语“实质上经纯化的(substantially purified)”是指材料至少约60％无、较佳至少约75％无、以及最佳至少约90％无、至少约95％无、至少约98％无、或更多无其他它们在制造期间可能与之相关的组分。

术语“α-氨基酸(α-amino acid)”或“氨基酸(amino acid)”是指同时含有与命名为“α-碳”的碳结合的氨基及羧基的分子。适宜氨基酸包括但并不限于天然存在的氨基酸的D-异构体与L-异构体二者，以及通过有机合成或其他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。除非上下文另有具体规定，否则本文中所用术语氨基酸意欲包含氨基酸类似物。

在某些实施例中，所述含肽共轭配偶体仅包含天然氨基酸。术语“天然存在的氨基酸(naturally occurring amino acid)”是指自然界中合成的肽中常见的二十种氨基酸其中的任一者，所述二十种氨基酸按一个字母缩写熟知为A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及V。

术语“氨基酸类似物(amino acid analog)”或“非天然存在的氨基酸(non-naturally occurring amino acid)”是指在结构上类似于氨基酸且可替代氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于在结构上完全类似于如本文中所定义的氨基酸的化合物，除外情形为在氨基与羧基之间包含一或多个额外的亚甲基(例如a-氨基β-羧酸)，或者用类似的反应性基团取代氨基或羧基(例如用二级或三级胺取代一级胺，或用酯或羧酰胺取代羧基)。

除非另外指出，否则在实践本文中所述方法时可采用在本领域技艺内的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术。此类技术在文献中有全面阐释，例如分子克隆：实验室手册，第二版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,secondedition)(Sambrook等人，1989)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编辑，1984)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编辑，1987)；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir及C.C.Blackwell编辑)；哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller及M.P.Calos编辑，1987)；当代分子生物学实验室操作指南(Current Protocols CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；PCR：聚合醚链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)(Mullis等人编辑，1994)；当代免疫学实验室操作指南(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等人编辑，1991)；免疫分析手册(The Immunoassay Handbook)(David Wild编辑，斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约，1994)；抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)(Harlow等人，1987)；以及免疫分析方法(Methods of Immunological Analysis)(R.Masseyeff、W.H.Albert及N.A.Staines编辑，Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH,1993)。

本文中所用术语“肽(peptide)”等是指任何长度的氨基酸残基的任何聚合物。所述聚合物可为线性的或非线性的(例如具支链的)，其可包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物。所述术语也涵盖天然地或通过干预经修饰的氨基酸聚合物，例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酰化、或任何其他修饰或操控进行修饰，例如与标记或生物活性组分共轭。

发明者已发现，本发明的肽共轭物具有免疫活性。

细胞介导的免疫性主要由T-淋巴细胞介导。病原性抗原在抗原递呈细胞(例如巨噬细胞、B-淋巴细胞及树突细胞)的表面上表达，结合至主要的组织兼容性MHC I类或MHCII类分子。偶合至MCH II类的病原性抗原的递呈活化辅助细胞(CD4+)T细胞反应。当T细胞结合至抗原-MHC II络合物时，CD4+T细胞释放细胞因子并增殖。

结合至MHC I类分子的病原性抗原的递呈活化细胞毒性(CD8+)T细胞反应。当T细胞结合至所述抗原-MHC I复合物时，CD8+细胞分泌穿孔素及其他传递质(mediator)，导致靶细胞死亡。虽然不希望受任何理论限制，但是申请者相信，在某些实施例中，当存在一或多个被CD4+细胞识别的表位时，CD8+细胞的反应增强。

本领域熟知用于评估及监测细胞介导的反应的起始或进展的方法。方便的例示性方法包括对一或多个与细胞介导的反应相关的细胞因子(例如本文中所识别的细胞因子)的存在或水平进行评估的方法。类似地，用于评估或监测细胞介导的反应的起始或进展的基于细胞的方法可以在本发明中使用，且可包括细胞增殖或活化分析，包括目标在于确定一或多个例如T淋巴细胞等免疫细胞群的活化或扩增的分析。

在某些实施例中，本发明的方法同时引起细胞介导的免疫反应及体液反应。

体液免疫反应通过B细胞产生的分泌抗体介导。分泌抗体结合至入侵病原体的表面上递呈的抗原，标记它们以进行破坏。

同样，本领域熟知用以评估及监测体液反应的起始及进展的方法。所述方法包括抗体结合分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、皮肤点刺试验等。

虽然不希望受理论限制，但发明者相信，所述肽共轭物在一些实施例中刺激T样受体(Toll like receptor，TLR)。

T样受体(TLR)为高度保守的样式识别受体(PRR)，识别病原相关分子样式并向细胞传递危险信号(Kawai,T.,Akira,S.,Immunity 2011,34,637-650)。TLR2为在包括树突细胞、巨噬细胞及淋巴细胞在内的多种不同细胞类型上表达的细胞表面受体(Coffman,R.L.,Sher,A.,Seder,R.A.,Immunity 2010,33,492-503)。

TLR2识别许多种微生物组分，包括脂多糖、肽聚糖及脂磷壁酸。其在各TLR中是独特的，因为其与TLR1或TLR6形成异二聚体；与其他PRR形成复合物的能力可以解释为什么TLR2的激动剂范围广泛(Feldmann,M.,Steinman,L.,Nature 2005,435,612-619)。当配体结合及异二聚体化时，经由MyD88途径发生信号传导，导致NFκB活化及随后炎症及效应细胞因子的生成。

衍生自细菌细胞壁组分的二-及三酰化脂肽已作为TLR2激动剂得到深入研究(Eriksson,E.M.Y.,Jackson,D.C.,Curr.Prot.and Pept.Sci.2007,8,412-417)。已报导脂肽促进树突细胞成熟，引起细胞表面上共刺激分子的上调以及抗原递呈增强。也已报导脂肽刺激巨噬细胞释放细胞因子并促进包括B细胞及CD8+T细胞在内的淋巴细胞的活化。

在一些实施例中，所述肽共轭物具有TLR2激动剂活性。在一些实施例中，所述肽共轭物具有与Pam3CSK4相当的TLR2激动剂活性。在一些实施例中，所述肽共轭物的TLR2激动剂活性为Pam3CSK4的至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％。在一些实施例中，例如在其中调节后免疫反应较为合意的实施例中，所述肽共轭物的TLR2激动剂活性小于Pam3CSK4。举例而言，所述肽共轭物的TLR2激动剂活性比Pam3CSK4的小约50％、小约40％、小约30％、小约20％或小约10％。

在一些实施例中，所述肽共轭物及/或含肽共轭配偶体的肽包含丝氨酸氨基酸残基，所述残基毗邻脂质部分经由其共轭至肽的氨基酸。在一些实施例中，所述丝氨酸结合至所述氨基酸的C端。在这个位置存在丝氨酸氨基酸残基可增强TLR2结合。

如所属领域的技术人员在阅读本公开案时将理解，所述肽共轭物可包含表位，包括例如二或更多个表位。所述表位可经由连接基偶合或结合至所述肽。在一些实施例中，所述表位为肽表位。所属领域的技术人员将理解，在本发明中可采用许多种肽表位。

抗原

将理解，例如肿瘤抗原或来自多种致病生物的抗原等许多种抗原已被表征且适用于本发明中。本发明意欲涵盖所有能够引起免疫反应的抗原，不论其目前是否被表征。

因此，根据所选抗原而定，本发明的共轭物可应用在许多种免疫疗法中，包括但并不仅限于在免疫抑制期间或之后感染性疾病的治疗及预防、癌症的治疗及预防以及病毒再活化的治疗，例如在已进行骨髓移植或造血干细胞移植的患者中。

本发明也意欲涵盖包含一或多个氨基酸取代、例如一或多个保守氨基酸取代的抗原。

“保守氨基酸取代(conservative amino acid substitution)”是其中氨基酸残基用另一种具有化学上类似或经衍生的侧链的残基替代的取代。举例而言，业内已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。所述家族包括，举例而言，具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰氨酸、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。氨基酸类似物(例如，磷酰化或糖基化氨基酸)也涵盖在本发明中，经非天然存在的氨基酸取代的肽同样涵盖在本发明中，非天然存在的氨基酸包括但并不仅限于N-烷基化氨基酸(例如N-甲基氨基酸)、D-氨基酸、β-氨基酸及γ-氨基酸。

抗原的片段及变异体也特别意欲涵盖在内。

肽的“片段(fragment)”为肽的子序列，执行酶活性或结合活性所需的功能及/或提供肽的三维结构，例如多肽的三维结构。

本文中所用术语“变异体(variant)”指肽序列，例如包括不同于明确确定的序列的肽序列，其中缺失、取代或增加一或多个氨基酸残基。变异体为天然存在的变异体，或非天然存在的变异体。变异体来自同一物种或来自其他物种，且可涵盖同系物、旁系同源物(paralogue)及直系同源物(orthologue)。在某些实施例中，包括肽在内的肽的变异体具有与野生型肽相同或类似的生物活性。关于肽的术语“变异体”涵盖本文中所定义的肽的所有形式。

所属领域的技术人员将理解，本发明的共轭物在某些实施例中特别适于刺激T细胞反应，例如在包括癌症在内的肿瘤病的治疗中。包含一或多个肿瘤抗原的本发明的共轭物特别意欲涵盖在内。将理解，预期用于制备本发明的肽共轭物的肿瘤抗原一般将包含一或多个肽。在本发明的某些实施例中，包括例如本发明的医药组合物在内，可存在一或多种额外肿瘤抗原，其中所述一或多种肿瘤抗原不包含肽。肿瘤抗原通常分类为独特抗原或共享抗原，后一类包括分化抗原、癌症特异性抗原及过表达抗原。每一类抗原的实例均可以用于本发明中。下文讨论在例如免疫治疗或者抗包括癌症在内的肿瘤病的预防接种等治疗中使用的代表性肿瘤抗原。特别意欲涵盖包含使用这些免疫方法制备的一或多种抗原的化合物、疫苗及组合物。

在某些实施例中，肿瘤抗原为含肽肿瘤抗原，例如多肽肿瘤抗原或糖肽肿瘤抗原。在某些实施例中，肿瘤抗原为含糖肿瘤抗原，例如糖脂肿瘤抗原或神经节苷脂肿瘤抗原。在某些实施例中，肿瘤抗原为表达含多肽肿瘤抗原的含多核苷酸肿瘤抗原，例如RNA载体构建体或DNA载体构建体，如质粒DNA。

适用于本发明的肿瘤抗原涵盖许多种分子，例如(a)含肽肿瘤抗原，包括肽表位(其长度可介于例如8至20个氨基酸，但是超出这个范围的长度也常见)、脂多肽及糖肽，(b)含糖肿瘤抗原，包括多糖、粘蛋白、神经节苷脂、糖脂及糖肽，包括以及(c)表达抗原多肽的多核苷酸。同样，所属领域的技术人员将认识到，在本发明的共轭物或组合物中存在的肿瘤抗原通常将包含肽。然而，本发明意欲涵盖其中一或多种共轭物包含本身不含肽但例如结合至含氨基酸或含肽共轭配偶体的肿瘤抗原的本发明的实施例。类似地，本发明意欲涵盖其中存在一或多种本身不含肽的肿瘤抗原的本发明的组合物。

在某些实施例中，肿瘤抗原为，举例而言(a)与肿瘤细胞相关的全长分子，(b)其同系物及修饰形式，包括具有缺失、增加及/或经取代部分的分子，以及(c)其片段，其限制条件为所述片段保留抗原性或免疫原性。在某些实施例中，肿瘤抗原以重组形式提供。在某些实施例中，肿瘤抗原包括例如被CD8+淋巴细胞识别的I类限制性抗原或被CD4+淋巴细胞识别的II类限制性抗原。在某些实施例中，肿瘤抗原包括包含被CD8+淋巴细胞识别的I类限制性抗原或被CD4+淋巴细胞识别的II类限制性抗原的合成肽。

共享肿瘤抗原一般被视作由于允许在发育上被抑制的基因的脱抑制而被肿瘤表达的内源未突变序列。因此，共享抗原由于在正常组织中无表达而通常被视为优于过度表达或与分化相关的抗原。并且，所述抗原可在许多癌症患者中被靶向。举例而言，癌症睾丸抗原NY-ESO-1存在于大部分患有许多肿瘤的患者以及少数患有其他肿瘤的患者中。在另一实例中，乳腺分化肿瘤抗原NYBR-1及NYBR-1.1见于一部分乳腺癌患者中。因而共享肿瘤抗原代表有吸引力的开发靶。

本文特别意欲涵盖在本发明的共轭物中使用共享肿瘤抗原，例如癌症睾丸抗原，包括NY-ESO-1、CTSP-1、CTSP-2、CTSP-3、CTSP-4、SSX2,及SCP1，以及乳腺癌抗原NYBR-1及NYBR-1.1。

在一个例示性实施例中，所述含肽共轭配偶体或所述肽共轭物的肽包含一或多个衍生自NY-ESO-1的表位。在一个实施例中，所述肽包含一或多个衍生自NY-ESO-1残基79至116的表位。在一个实施例中，所述肽包含一或多个衍生自NY-ESO-1残基118至143的表位。在一个实施例中，所述肽包含一或多个衍生自NY-ESO-1残基153至180的表位。

在一个特别意欲涵盖的实施例中，所述含肽共轭配偶体或所述肽共轭物的肽包含选自由来自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20其中的任一者的8或更多个连续的、10或更多个连续的、12或更多个连续的、15或更多个连续的、20或更多个连续或25或更多个连续的氨基酸组成的群组的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在多个不同实施例中，所述肽包含一个以上选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20其中的任一者组成的群组的氨基酸序列。在一个实施例中，所述肽包含一或多个选自由SEQID NO:4至7、12、13及18至20组成的群组的氨基酸序列。

类似地，95％的前列腺癌细胞中存在前列腺癌疫苗Sipuleucel-T(APC8015,ProvengeTM)，其包含抗原前列腺酸性磷酸酶(PAP)。至少部分因为这种在相当大比例的前列腺癌患者中的疗效潜力，美国食品及药物管理局(FDA)于2010年批准Sipuleucel-T用于治疗无症状的激素难治性前列腺癌。本发明特别意欲涵盖前列腺酸性磷酸酶抗原在本发明的共轭物中的使用。

独特抗原被视为个人所特有或被小部分癌症患者所共有且通常源于导致独特蛋白质序列的突变的那些抗原。独特肿瘤抗原的代表性实例包括突变Ras抗原及突变p53抗原。已阅读本说明书的所属领域的技术人员将理解，本发明的方法使得能够容易地制备包含一或多个独特肿瘤抗原的共轭物，举例而言以引起对一或多个独特肿瘤抗原的特异性T细胞反应，例如在患者特异性疗法的准备中。

因此，代表性肿瘤抗原包括但并不仅限于，(a)抗原，例如RAGE、BAGE、GAGE及MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6及MAGE-12(其可用于例如处理黑素瘤、肺部肿瘤、头颈肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃肠及膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤相关，例如结肠直肠癌、肺癌、头颈癌)、p21/Ras(例如与黑素瘤、胰腺癌及结肠直肠癌相关)、CDK4(例如与黑素瘤相关)、MUM1(例如与黑素瘤相关)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8，例如与头颈癌相关)、CIA0205(例如与膀胱癌相关)、HLA-A2-R1701、β连环蛋白(例如与黑素瘤相关)、TCR(例如与T-细胞非霍奇金淋巴瘤相关)、BCR-abl(例如与慢性骨髓性白血病相关)、磷酸丙糖异构酶、MA 0205、CDC-27及LDLR-FUT，(c)过度表达抗原，例如半乳凝素4(例如与结肠直肠癌相关)、半乳凝素9(例如与霍奇金氏病相关)、蛋白酶3(例如与慢性骨髓性白血病相关)、维尔姆氏肿瘤抗原-1(WT 1，例如与各种白血病相关)、碳酸酐酶(例如与肾癌相关)、醛缩酶A(例如与肺癌相关)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME，例如与黑素瘤相关)、HER-2/neu(例如与乳腺、结肠、肺及卵巢癌相关)、α-甲胎蛋白(例如与肝细胞瘤相关)、KSA(例如与结肠直肠癌相关)、胃泌素(例如与胰腺及胃癌相关)、端粒酶催化蛋白MUC-1(例如与乳腺及卵巢癌相关)、G-250(例如与肾细胞癌相关)、p53(例如与乳腺、结肠癌相关)、及癌胚抗原(例如与乳腺癌、肺癌、及如结肠直肠癌等胃肠道癌相关)，(d)共享抗原，例如黑素瘤-黑色素细胞分化抗原例如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑色素细胞-刺激激素受体、络氨酸酶、络氨酸酶相关蛋白-1/TRP1及络氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(例如与黑素瘤相关)，(e)前列腺相关抗原例如PAP、前列腺血清抗原(PSA)、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，例如与前列腺癌相关，(f)免疫球蛋白个体基因型(例如与骨髓瘤及B细胞淋巴瘤相关)，及(g)其他肿瘤抗原，例如多肽抗原及含糖抗原，包括(i)糖肽，例如sialyl Tn及sialyl Le.sup.x(例如与乳腺癌及结肠直肠癌相关)，以及各种粘蛋白；糖肽偶合至载体蛋白(例如MUC-1偶合至KLH)；(ii)脂多肽(例如MUC-1连接到脂质部分)；(iii)多糖(例如Globo H合成六糖)，偶合至载体蛋白(例如至KLH)，(iv)神经节苷脂，例如GM2、GM12、GD2、GD3(例如与脑肿瘤、肺癌、黑素瘤相关)，也偶合至载体蛋白(例如KLH)。

其他可以用于本发明中的代表性肿瘤抗原包括TAG-72(参见例如美国专利第5,892,020号)；人肿瘤抗原(参见例如美国专利第5,808,005号)；来自骨癌细胞的TP1及TP3抗原(参见例如美国专利第5,855,866号)；来自腺癌的汤姆森-佛里奇(Thomsen-Friedenreich，TF)抗原(参见例如美国专利第5,110,911号)；来自人前列腺癌的KC-4抗原(参见例如美国专利第4,743,543号)；人结肠直肠癌抗原(参见例如美国专利第4,921,789号)；来自囊腺癌的CA125抗原(参见例如美国专利第4,921,790号)；来自人乳腺癌的DF3抗原(参见例如美国专利第4,963,484号及5,053,489号)；人乳腺肿瘤抗原(参见例如美国专利第4,939,240号)；人黑素瘤的p97抗原(参见例如美国专利第4,918,164号)；癌或血清类粘蛋白相关抗原(CORA)(参见例如美国专利第4,914,021号)；人乳腺癌的糖肽MSA乳腺癌糖肽中的T及Tn半抗原；MFGM乳腺癌抗原；DU-PAN-2胰腺癌抗原；CA125卵巢癌抗原；YH206肺癌抗原、α甲胎蛋白(AFP)肝细胞癌抗原；癌胚抗原(CEA)肠癌抗原；上皮肿瘤抗原(ETA)乳腺癌抗原；络氨酸酶；raf癌基因产物；gp75；gp100；EBV-LMP 1&2；EBV-EBNA 1,2&3C；HPV-E4、6、7；CO17-1A；GA733；gp72；p53；蛋白酶3；端粒酶；及黑素瘤神经节苷脂。所述及其他肿瘤抗原不管目前是否表征均意欲涵盖用于本发明中。

在某些实施例中，肿瘤抗原衍生自突变或改变的细胞组分。改变的细胞组分的代表性实例包括但并不仅限于ras、p53、Rb、由维尔姆氏肿瘤基因(Wilms'tumour gene)编码的改变的蛋白质、泛素、粘蛋白、由DCC、APC及MCC基因编码的蛋白质、以及受体或受体样结构例如neu、甲状腺激素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、胰岛素受体、表皮生长因子(EGF)受体、及群落刺激因子(CSF)受体。

本发明中使用的含多核苷酸抗原包括编码例如上文所列者的多肽肿瘤抗原的多核苷酸。在某些实施例中，含多核苷酸抗原包括但并不仅限于DNA或RNA载体构建体，例如质粒载体(例如pCMV)，其能够活体内表达多肽肿瘤抗原。

本发明也意欲涵盖包含病毒抗原的共轭物的制备，所述病毒抗原能够在正或已经被免疫抑制的患者，例如已进行骨髓移植、造血干细胞移植或者在其他方面经受免疫抑制的患者中引起有效的抗病毒免疫性。

类似地，衍生自例如人乳头瘤病毒、甲型肝炎病毒及乙型肝炎病毒等与癌发生率增加相关或者被报告致癌的病毒的抗原意欲用于本发明中。

举例而言，在某些实施例中，肿瘤抗原包括但并不仅限于p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)抗原、包括E6及E7在内的人乳头瘤病(HPV)抗原、乙型及丙型肝炎病毒抗原、人T-细胞亲淋巴病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。

在某些实施例中，肿瘤抗原包括在肿瘤形成中涉及的病毒蛋白，例如来自爱泼斯坦-巴尔病毒、包括E6及E7在内的人乳头瘤病毒(HPV)及乙型肝炎和丙型肝炎、以及人T细胞亲淋巴病毒的抗原。

将理解，此类病毒蛋白以及各种其他病毒蛋白也可为T细胞活性的靶，例如在抗病毒疾病的治疗中。事实上，本发明可用于任何其中已知T细胞活性在免疫性中起作用的感染(实际上所有的病毒感染以及许多细菌感染，如肺结核)。本文中所述感染性疾病仅以举例说明的方式提供，绝不意欲限制本发明的范围。将理解，本发明可用于治疗各种其他疾病及状况。

下面讨论用于接种预防抵抗致病生物的代表性抗原。特别意欲涵盖包含一或多种使用这些免疫方法制备的抗原的化合物、疫苗及组合物。

肺结核抗原

将理解，许多种结核分枝杆菌(M.tuberculosis)抗原已被表征且适用于本发明中。意欲涵盖所有能够引起免疫反应的结核分枝杆菌抗原，无论目前是否被表征。

适用的例示性结核分枝杆菌抗原包括早分泌抗原靶(ESAT)-6、Ag85A、Ag85B(MPT59)、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT51、MPT59、MPT63、MPT64、MPT83、MPB5、MPB59、MPB64、MTC28、Mtb2、Mtb8.4、Mtb9.9、Mtb32A、Mtb39、Mtb41、TB10.4、TB10C、TB11B、TB12.5、TB13A、TB14、TB15、TB15A、TB16、TB16A、TB17、TB18、TB21、TB20.6、TB24、TB27B、TB32、TB32A、TB33、TB38、TB40.8、TB51、TB54、TB64、CFP6、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CFP9、CFP10、CFP11、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP28B、CFP29、CFP30A、CFP30B、CFP50、CWP32、hspX(α-结晶)、APA、结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)、ST-CF、PPE68、LppX、PstS-1、PstS-2、PstS-3、HBHA、GroEL、GroEL2、GrpES、LHP、19kDa脂蛋白、71kDa、RD1-ORF2、RD1-ORF3、RD1-ORF4、RD1-ORF5、RD1-ORF8、RD1-ORF9A、RD1-ORF9B、Rv1984c、Rv0577、Rv1827、BfrB、Tpx.Rv1352、Rv1810、PpiA、Cut2、FbpB、FbpA、FbpC、DnaK、FecB、Ssb、RplL、FixA、FixB、AhpC2、Rv2626c、Rv1211、Mdh、Rv1626、Adk、ClpP、SucD(Belisle等，2005；US 7,037,510；US 2004/0057963；US 2008/0199493；US 2008/0267990)、或上述抗原其中的任一抗原的至少一个抗原部分或T细胞表位。

肝炎抗原

许多肝炎抗原已被表征且适用于本发明。例示性丙型肝炎抗原包括C–p22、E1–gp35、E2-gp70、NS1–p7、NS2–p23、NS3–p70、NS4A–p8、NS4B–p27、NS5A–p56/58、及NS5B–p68，所述抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位(无论单独还是组合)均分别适合应用于本发明中。意欲涵盖所有能够引起免疫反应的肝炎抗原，无论目前是否被表征。

流感抗原

许多流感抗原已被表征且适用于本发明。适用于本发明的例示性流感抗原包括PB、PB2、PA、血凝素(HA)或神经氨糖酸苷酶(NA)蛋白中的任一者、NP、M及NS，所述抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位(无论单独还是组合)均分别适合应用于本发明中。意欲涵盖所有均能够引起免疫反应的流感抗原，无论目前是否被表征。

炭疽抗原

许多炭疽杆菌(B.anthracis)抗原已被认定为用于疫苗开发的潜在候选者且可用于本发明中。举例而言，PA83为这样的一种用于疫苗开发的抗原。目前，仅有一种FDA批准的针对炭疽的疫苗，称为“炭疽吸附疫苗(Anthrax Vaccine Adsorbed)”(AVA)或这种疫苗来自吸附至铝佐剂的炭疽杆菌的无包膜菌株的不含细胞的上清液。PA为AVA中的主要免疫原。适用于本发明的其他例示性炭疽抗原包括保护抗原(PA或PA63)、LF及EF(蛋白质)、聚-γ-(D-麸氨酸盐)荚膜、芽孢抗原(内芽孢特异性组分)、BclA(外孢壁特异性蛋白)、BxpB(芽孢相关蛋白)及分泌蛋白。所有能够引起免疫反应的炭疽抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位，无论目前是否被表征，均意欲涵盖在内。

土拉菌病抗原

许多土拉文氏杆菌(F.tularensis)抗原已被认定为用于疫苗开发的潜在候选者且可用于本发明中。举例而言，AcpA及IglC为适用于疫苗开发的抗原。其他适用于本发明的例示性土拉菌病抗原包括O-抗原、CPS、外膜蛋白(例如FopA)、脂蛋白(例如Tul4)、分泌蛋白及脂多糖。能够引起免疫反应的所有土拉菌病抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位，无论目前是否被表征，均意欲涵盖在内。

布氏杆菌病抗原

许多土布氏杆菌(B.abortusis)抗原已被认定为用于疫苗开发的潜在候选者且可用于本发明中。举例而言，Omp16为这样一种用于疫苗开发的抗原。适用于本发明的其他例示性布氏杆菌病抗原包括O-抗原、脂多糖、外膜蛋白(例如Omp16)、分泌蛋白、核糖体蛋白(例如L7及L12)、细菌铁蛋白、p39(推定周质结合蛋白)、groEL(热休克蛋白)、二氧四氢喋啶合成酶、BCSP31表面蛋白、PAL16.5OM脂蛋白、过氧化氢酶、26kDa周、3l kDa Omp31、28kDaOmp、25kDa Omp及10kDA Om脂蛋白。能够引起免疫反应的所有布氏杆菌病抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位，无论目前是否被表征，均意欲涵盖在内。

脑膜炎抗原

许多脑膜炎双球菌(N.meningitidis)抗原已被认定为用于疫苗开发的潜在候选者且可用于本发明中。举例而言，Cys6、PorA、PorB、FetA及ZnuD为适用于疫苗开发的抗原。其他适用于本发明的例示性脑膜炎抗原包括O-抗原、因子H结合蛋白(fHbp)、TbpB、NspA、NadA、外膜蛋白、B组CPS、分泌蛋白及脂多糖。能够引起免疫反应的所有脑膜炎抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位，无论目前是否被表征，均意欲涵盖在内。

登革热抗原

许多黄病毒抗原已被认定为用于疫苗开发以治疗登革热的潜在候选者且可用于本发明中。举例而言，登革热病毒包膜蛋白E1至E4及膜蛋白M1至M4为适用于疫苗开发的抗原。其他适用于本发明的例示性登革热抗原包括C、preM、1、2A、2B、3、4A、4B及5。能够引起免疫反应的所有登革热抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位，无论目前是否被表征，均意欲涵盖在内。

伊波拉病毒抗原

许多伊波拉病毒抗原已被认定为用于疫苗开发以治疗伊波拉病毒感染的潜在候选者且可用于本发明中。举例而言，丝状病毒科扎伊尔伊波拉病毒(Filoviridae Zaireebolavirus)及苏丹伊波拉病毒(Sudan ebolavirus)病毒体纤突糖肽前体抗原，分别为ZEBOV-GP及SEBOV-GP，适用于疫苗开发。其他适用于本发明的例示性伊波拉病毒抗原包括NP、vp35、vp40、GP、vp30、vp24及L。能够引起免疫反应的所有伊波拉病毒抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位，无论目前是否被表征，均意欲涵盖在内。

西尼罗河病毒抗原

许多西尼罗河病毒抗原已被认定为用于疫苗开发以治疗感染的潜在候选者且可用于本发明中。举例而言，来自西尼罗河病毒(WNV)的黄病毒包膜抗原(E)为在WNV病毒体上表达的非毒性蛋白(WNVE)且可适用于疫苗开发。其他适用于本发明的例示性WNV抗原包括Cp、Prm、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5。

能够引起免疫反应的所有西尼罗河病毒抗原连同自其衍生的一或多个抗原部分或表位，无论目前是否被表征，均意欲涵盖在内。

上文所列或提及的抗原为例示性的，而非限制本发明。

本发明也涉及一种医药组合物，所述医药组合物包含有效量的本发明的肽共轭物或者其医药上可接受的盐或溶剂合物以及医药上可接受的载剂。

所述医药组合物可包含有效量的二或更多种本发明的肽共轭物的组合。在一些实施例中，医药组合物可包含一或多种本发明的肽共轭物以及一或多种本文中所述的肽。

术语“医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)”是指可与本发明的肽共轭物或其医药上可接受盐或溶剂合物或医药上可接受的载剂一起施予受试者的载剂(佐剂或媒剂)。

可用于本发明中的医药上可接受的载剂包括但并不仅限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯等自乳化药物传递系统(SEDDS)、例如聚山梨醇酯(Tween)等以药物剂型或其他类似聚合物传递基质使用的表面活性剂、例如人血清蛋白等血清蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪油的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素系物质、聚乙二醇、羧基甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、石蜡、聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。有利地，也可使用环糊精来增强传递，例如使用α-、β-、及γ-环糊精或经化学修饰的衍生物，例如包括2-及3-羟基丙基-β-环糊精在内的羟基烷基环糊精。油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂、或羧基甲基纤维素或类似分散剂，所述试剂常用于调配医药上可接受的剂型，例如乳液或悬浮液。

调配所述组合物，以允许其通过任何选择途径施予受试者，包括但并不仅限于口服或胃肠外(包括局部、皮下、肌肉内及静脉内)给药。

举例而言，组合物可用根据预期给药途径及标准医药实践选择的医药上可接受的适宜载剂(包括赋形剂、稀释剂、辅助剂及其组合)调配。举例而言，组合物可作为粉末、液体、片剂或胶囊口服，或作为软膏、霜剂或洗剂局部用药。适宜的调配物可视需要含有另外的试剂，包括乳化剂、抗氧化剂、矫味剂或着色剂，且可适合于立即释放、延迟释放、缓释、持续释放、脉冲释放或控释。

可对组合物进行调配以优化生物可利用率、免疫原性，或将血浆、血液或组织浓度维持在具有免疫原性或治疗性的范围内，包括持续期长。举例而言，也可使用受控传递制剂来最优化作用位点的抗原浓度。

可对组合物进行调配以达成定期给药，例如提供连续曝露。本领域熟知用于引起有益免疫反应的策略，例如采用一或多种“加强”接种的策略，且可采用此类策略。

组合物可经由胃肠外途径给药。胃肠外剂型的实例包括活性剂的水溶液、等渗盐水或5％葡萄糖、或其他医药上可接受的熟知赋形剂。举例而言，可使用环糊精或所属领域的技术人员熟知的其他增溶剂作为递送治疗剂的医药赋形剂。

适用于口服的剂型的实例包括但并不仅限于片剂、胶囊、锭剂或类似剂型，或任何液体剂型，例如糖浆剂、水溶液、乳液等，所述剂型能够提供治疗有效量的组合物。胶囊可含有任何医药上可接受的标准材料，例如明胶或纤维素。片剂可根据常规程序通过压制活性成分与固体载剂及润滑剂的混合物而调配。固体载剂的实例包括淀粉及糖膨润土。活性成分也可以是以含有例如乳糖或甘露糖醇等结合剂、常规填充剂及压片剂的硬壳片剂或胶囊的形式给药。

适用于经皮给药的剂型的实例包括但并不仅限于经皮贴剂、经皮绷带等。

适用于组合物的局部给药剂型的实例包括任何洗剂、条形剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、凝胶等，无论是直接施用至皮肤抑或经由垫、贴剂等间接施用至皮肤。

适用于组合物的栓剂给药剂型的实例包括任何插入身体孔道中的固体剂型，特别是从直肠、阴道及尿道插入的固体剂型。

适用于组合物的注射剂型的实例包括经由推注递送，例如通过静脉注射、皮下、真皮下及肌内给药或口腔内给药单次或多次给药。

适用于组合物的储库(depot)给药剂型的实例包括肽共轭物的丸剂或其中肽共轭物被裹置在生物可降解聚合物、微乳液、脂质体的基质中或者被装入微胶囊的固体形式。

用于组合物的输液装置的实例包括用以提供所需数目的剂量或稳态给药的输液泵，且包括可植入药泵。

用于组合物的可植入输液装置的实例包括其中肽共轭物被囊封在或分散于例如硅酮、硅酮橡胶、硅橡胶或类似聚合物等生物可降解聚合物或合成聚合物内的任何固体形式。

适用于组合物的穿粘膜递送的剂型的实例包括灌肠剂储液、阴道栓、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、喷雾液、粉末及类似调配物，除活性成分外还含有本领域熟知的合适载剂。此类剂型包括适合吸入或吹入组合物的形式，所述组合物包括包含在医药上可接受的水性或有机溶剂、或其混合物中的溶液及/或悬浮液及/或粉末的组合物。组合物的穿粘膜给药可利用任何粘膜，但通常利用鼻、口、阴道及直肠组织。所述组合物的适用于经鼻用药的调配物可以例如喷鼻剂、滴鼻剂等液体形式给药，或用雾化器通过气溶胶给药，包括聚合物颗粒的水性或油性溶液在内。调配物可制备为例如在盐水中的水溶液，采用苄基醇或其他适宜防腐剂、用以增强生物可利用率的吸收促进剂、氟碳及/或其他本领域熟知的增溶剂或分散剂的溶液。

所述组合物适用于口腔或舌下给药的剂型的实例包括锭剂、片剂等。所述组合物适用于眼部给药的剂型的实例包括插入剂及/或在医药上可接受的水性或有机溶剂中的含组合物的溶液及/或悬浮液。

包括疫苗在内的组合物的调配物的实例可见于例如Sweetman,S.C.(编辑).Martindale.药物参考大全，第33版，医药出版社，芝加哥，2002,2483页(Sweetman,S.C.(Ed.).Martindale.The Complete Drug Reference,33rd Edition,PharmaceuticalPress,Chicago,2002,2483pp.)；Aulton,M.E.(编辑)Pharmaceutics.剂型设计科学.丘姬儿利文斯通出版社，爱丁堡，2000,734页(Aulton,M.E.(Ed.)Pharmaceutics.The Scienceof Dosage Form Design.Churchill Livingstone,Edinburgh,2000,734pp.)；以及Ansel,H.C.,Allen,L.V.及Popovich,N.G.医药剂型及药物递送系统，第7版，立宾科特1999，676页(Ansel,H.C.,Allen,L.V.and Popovich,N.G.Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,7th Ed.,Lippincott 1999,676pp.)。制造药物递送系统中采用的赋形剂描述于所属领域的技术人员熟知的各种出版物中，包括，举例而言，Kibbe,E.H.医药赋形剂手册，第3版，美国制药协会，华盛顿，2000，665页(Kibbe,E.H.Handbook ofPharmaceutical Excipients,3rd Ed.,American Pharmaceutical Association,Washington,2000,665pp)。美国药典也提供缓释剂型的实例，包括调配为片剂或胶囊的缓释剂型。参见，举例而言，美国药典23/国家处方集18,美国药典委员会公司，马里兰州罗克维尔市，1995(The United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18,TheUnited States Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville MD,1995)(以下为“美国药典(the USP)”)，其也描述了用以确定缓释及延迟释放片剂及胶囊的药物释放能力的具体测试法。美国药典针对缓释及延迟释放对象的药物释放测试是基于在测试时间内药物自剂量单位的溶解。关于各种测试仪器及程序的描述可见于美国药典。有关缓释剂型的分析的进一步指导已由美国食品药品管理局提供(参见工业指导。缓释口服剂型：体外/活体内相关的开发、评价及应用。马里兰罗克维尔：药品评价及研究中心，食品及药品管理局，1997(Guidance for Industry.Extended release oral dosage forms:development,evaluation,and application of in vitro/in vivo correlations.Rockville,MD:Center for Drug Evaluation and Research,Food and Drug Administration,1997))。

虽然所述组合物可包含一或多种外来佐剂，但有利的是在一些实施例中并非必须如此。在一些实施例中，肽共轭物包含表位且是自佐的。

本发明提供一种在受试者中进行接种或引起免疫反应的方法，包含施予所述受试者有效量的本发明的肽共轭物。本发明也涉及本发明的肽共轭物在受试者中进行接种或引起免疫反应的用途，以及本发明的肽共轭物在制造用于在受试者中接种或引起免疫反应的药物中的用途。

本发明也提供一种在受试者中进行接种或引起免疫反应的方法，包含施予所述受试者有效量的本发明的医药组合物。本发明也涉及本发明的医药组合物在受试者中进行接种或引起免疫反应的用途，以及本发明的一或多种肽共轭物在制造用于在受试者中接种或引起免疫反应的药物中的用途。

本文中意欲涵盖在受试者中施与或使用一或多种本文中所述肽及/或一或多种本发明的肽共轭物、例如一或多种本文中所述的肽与一或多种肽共轭物一起进行接种或引起免疫反应。

当施与或使用二或更多种肽共轭物、或者一或多种肽与一或多种肽共轭物时，所述二或更多种肽共轭物、或者一或多种肽与一或多种肽共轭物可同时、依序或分开施与或使用。

“受试者(subject)”是指为哺乳动物的脊椎动物，例如人。哺乳动物包括但并不仅限于人、家畜、运动动物、宠物、灵长类、小鼠及大鼠。

“有效量(effective amount)”是足以达成有益或所需的包括临床结果在内的结果的量。有效量可通过多种给药途径以一或多次给药施与。

除其他因素外，有效量将根据所治疗的疾病、疾病严重程度、受试者的年龄及相对健康状况、所用化合物的药效、给药方式以及期望的治疗而变化。所属领域的技术人员将能够根据所述任何其他相关因素而确定适宜的剂量。

组合物的疗效可在体外也可在活体内进行评估。举例而言，可在体外或活体内测试组合物引起细胞介导的免疫反应的能力。对于活体内研究，可将组合物喂食或注射入动物(例如小鼠)体内，然后评估其在引起免疫反应上的效果。基于结果，可确定适宜的剂量范围及给药途径。

组合物可以单剂量或多剂量方案形式给药。多剂量可用于初级免疫方案及/或加强免疫方案中。

在某些实施例中，引起免疫反应包含提高或增强免疫反应。在例示性实施例中，引起免疫反应包含引起体液及细胞介导的反应。

在某些实施例中，引起免疫反应提供免疫性。

引起免疫反应是为了治疗疾病或状况。所属领域的技术人员将理解，本文中所述肽共轭物根据例如表位的性质而定而用于治疗多种疾病及状况。

在一些实施例中，所述疾病及状况选自与本文中所述各种抗原相关的疾病及状况。

在一些实施例中，感染性疾病、癌、或骨髓移植后病毒再活化或出于任何其他原因而随后引起的极深免疫抑制。

本文中所用术语““治疗(treatment)”及例如“治疗(treating)”及“治疗(treat)”等相关术语一般涉及人或非人受试者的治疗，其中达成某些期望的治疗效果。举例而言，治疗效果可为疾病或状况的抑制、缓解、转佳、终止或预防。

所述组合物可用于引起全身及/或粘膜免疫。全身及/或粘膜免疫力增强可反映为TH1及/或TH2免疫反应增强。免疫反应增强可包括IgG1及/或IgG2a及/或IgA的生成增加。

实例

1.实例1

这个实例描述经由硫醇烯反应制备本发明的肽共轭物3。

1.1一般详情及方法

经保护氨基酸及偶合剂购自GL-Biochem(上海)。固载合成中所用树脂为用连接体及来自Rapp Polymere GmbH(图宾根)的肽序列的第一(C端)残基衍生出的tentagel树脂，且其他溶剂及反应剂自Sigma(密苏里州圣刘易斯)及Novabiochem获得。

下文所述肽合成使用标准重复Fmoc固相肽合成技术在Tribute肽合成仪(ProteinTechnologies International,Tucson,AZ)上进行。

以0.1毫摩尔规模进行的典型去保护及偶合循环需要用在DMF中的20％哌啶处理两次(4毫升x5分钟)，然后用DMF洗涤树脂，以自与树脂结合的氨基酸移除Fmoc保护基。在单独的容器中，将Fmoc氨基酸(0.5毫摩尔)及偶合剂(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)(0.45毫摩尔)溶于DMF(1.5毫升)中并添加碱(4-甲基吗啉(NMM)，1毫摩尔)。混合1分钟后，将这一溶液转移至树脂，在室温(RT)下搅拌1小时，排干并洗涤。

通过下列达成肽的裂解(0.1毫摩尔规模)：将树脂悬浮于5毫升含有5％(v/v)乙二硫醇(EDT)的三氟乙酸(TFA)中，并于室温下摇动3小时。然后添加三异丙基硅烷(TIPS)至1％(v/v)并且在将TFA排入冷冻二乙醚(40毫升)之前再继续摇动5分钟。通过离心将沉淀的材料制成丸剂，弃掉醚，将丸剂用醚(25毫升)洗涤一次，并风干或冻干。

使用Dionex Ultimate 3000HPLC系统以210奈米或225奈米的紫外检测进行反相(RP)-HPLC。对于半制备纯化，将肽试样注入在由溶析液A(水/0.1％TFA)与溶析液B(MeCN/0.1％TFA)的适宜混合物中平衡的反相Phenomenex Gemini C18柱(5μ，110埃，10x250毫米)中，然后增大溶析液B的梯度，以洗提构成组分。类似地，使用Phenomenex Gemini C18柱(3μ，110埃；4.6x150毫米)进行分析性HPLC。

使用Agilent Technologies 6120四极质谱仪获得低分辨率质谱。

使用在400MHz下针对¹H NMR以及在100MHz下针对¹³C NMR运行的Bruker BRX400分光仪获得NMR谱。

1.2肽合成

如上文一般详情中所述及下文所绘示来合成肽1(序列在表1中给出)(示意图1)。

所述肽为熟知的CMV pp65肽(NLVPMVATV[SEQ ID No:122])的组合，其中甲硫氨酸残基用Cys(tBu)残基替代以避免在硫醇烯反应期间在这一位置发生不期望的副反应，并且在N端用聚赖氨酸增溶标记物及自由硫醇基进行衍生化。

示意图1

(i)重复Fmoc-SPPS；(ii)Fmoc-Cys(Trt)-OH、HATU、NMM、DMF；(iii)20％哌啶/DMF；(iv)Ac₂O/NMM、DMF；(v)TFA/EDT。

在使用重复Fmoc-SPPS将肽序列合成至倒数第二个氨基酸后，通过与在DMF中的Fmoc-Cys(Trt)-OH、HATU及4-甲基吗啉反应将Fmoc-半胱氨酸作为树脂上的肽的N端残基引入。使用在DMF中的20％哌啶移除Fmoc基。

通过用在DMF(2毫升)中的20％乙酸酐与4-甲基吗啉(1毫摩尔)的混合物处理而将所得氨基转化为乙酰胺。

用TFA/EDT将肽自树脂裂解并且在醚中沉淀后，将固体溶于1:1水/MeCN中并冻干。然后通过RP-HPLC对肽进行纯化，得到>95％的材料。

表1.肽1

1.3肽共轭物合成

如下文所述及所示经由硫醇烯反应自肽1合成肽共轭物3(示意图2)。

示意图2

(vi)棕榈酸乙烯酯、DMPA、tBuSH、NMP，365奈米，基于HPLC 83％的转化率(49％2；34％3)。

称取肽底物1(1.7毫克，1微摩尔)及棕榈酸乙烯酯(20毫克，70微摩尔，70当量)，放入装配有磁力搅拌器的小聚丙烯瓶中，加入100微升脱气NMP，随后加入0.5微摩尔DMPA及3微摩尔^tBuSH(通过添加10微升6.5毫克DMPA及17微升^tBuSH在0.5毫升脱气NMP中的溶液而加入)。用氮气冲洗容器并在365奈米下辐照30分钟，同时激烈搅拌混合物。

通过HPLC对反应混合物的试样进行的分析(参见图1)显示，存在一些残余起始材料(峰a)并且同时形成了单棕榈酰化肽2与双棕榈酰化肽3(分别为峰b及c)。

加入水及乙腈(分别为200微升)，冻干所得混合物并通过半制备RP-HPLC分离各组分。

1.4肽共轭物3的分析

来自图1的峰b及峰c的低分辨率质谱分别显示于图2及图3中。

峰c的质谱证实了肽底物中引入了第二个2-(棕榈酰氧基)乙基(M+282)。

虽然不希望受理论约束，但是认为在辐照含有硫醇化肽的反应混合物后，所产生的含硫自由基随后与棕榈酸乙烯酯的分子反应而提供自由基中间体4(示意图3)，所述自由基中间体随后或者(i)被淬灭而得到单棕榈酰化产物2，或者(ii)与棕榈酸乙烯酯的另一分子反应而得到更多非极性双棕榈酰化产物3。两个路径被认为具有竞争性，本实验中使用的棕榈酸乙烯酯的浓度(70当量)有利于短链聚合(telomerisation)而提供3。未观察到更高阶的扩展(即增加两个以上的棕榈酸乙烯酯分子并未再产生产物)。

示意图3

产物2及产物3的一些氧化很明显(图1的峰e及峰f，均为M+16)，推测在新形成的硫醚上发生。这可能由于难以从所用的小规模系统排除氧所致。所述氧化物能容易地还原至对应的硫醚。

2.实例2

这个实例研究：

1.本发明的鼠类及人TLR2激动作用，在两种变异中——homoPam2Cys(NH₂)-SKKKK及homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK——与熟知TLR2激动剂Pam1Cys-SKKK、Pam2Cys-SKKKK及Pam3Cys-SKKKK相比。在所有情形中，激动剂均内部制备并如针对实例1所述经由半制备HPLC分离，除了购自InvivoGen的Pam3Cys-SKKK之外。此外，相对于Pam3Cys-SKKKK，对与短肽表位共轭时TLR2激动作用的保留情况进行评估。在这个实例中，如针对本发明3所述生成homoPam2Cys(NHAc)-SKKK-‘NLV’(如实例1中所述通过半制备HPLC分离)，除了共轭物肽序列为NLVPMVATVK(Ac)之外。也制备匹配的Pam2Cys-SKKKK-NLVPMVATVK(Ac)。

2.共轭短合成肽及长合成肽至同源CD8+T细胞克隆的释放及递呈。在这个实例中，如针对本发明3所述生成homoPam2Cys(NHAc)-SKKK-‘NLV’(如实例1中所述通过半制备HPLC分离)，除了共轭肽序列为NLVPMVATVK(Ac)而非NLVP(Tbu)VATVK(Ac)之外，旨在保留肽的T细胞识别。释放及递呈与由肽匹配的Pam1Cys-SKKKK及Pam2Cys-SKKKK构建体引发的释放及递呈进行比较。

3.共轭长合成肽至同源CD8+T细胞克隆的加工及递呈。如针对本发明3所述生成homoPam2Cys(NHAc)-SKKK-‘VPG’(如实例1中所述通过半制备HPLC分离)，除了共轭肽序列为VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID No:113)之外。将来自这个较长序列内的HLA-A2-限制表位EFTVSGNIL(SEQ ID No:114)的加工及递呈与仅有长肽时观察到的由肽匹配Pam1Cys-SKKKK构建体引发的加工及递呈进行比较。

在研究TLR2激动作用及至CD8+T细胞的肽加工及递呈中利用的所有构建体均如下表2中命名：

表2.肽共轭物

示意图3A.表2中所提及的Pam1Cys、Pam2Cys、Pam3Cys、homoPam2Cys(NH₂)及homoPam2Cys(NHAc)的结构。

2.1使用HekBlue细胞的Toll样受体2(TLR2)激动作用

HEK-Blue^TM检测介质、HEK-Blue^TM-hTLR2及HEK-Blue^TM-mTLR2购自Invivogen。所述HEK-Blue细胞分别通过报告基因SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)与人TLR2或者鼠类TLR2二者的共转染产生。SEAP报告基因受并合至五个AP-1及五个NFkB结合位点的IFN-B最小启动子的控制。根据制造商的说明对细胞进行培养。

在进行分析之日，将TLR激动剂510、520、530、540、550或PBS(负性对照)以指定浓度添加入96孔板中20微升体积的不含内毒素的水中。将HEK-Blue^TM-hTLR2或HEK-Blue^TM-hTLR2细胞以约2.78x10⁵个细胞/毫升悬浮于HEK-Blue^TM检测介质中，并将180微升细胞悬浮液添加至每一孔(约5x10⁴个细胞)。将细胞在37℃下在5％CO₂中培养10至12小时。使用EnSpire酶标仪(plate reader)(PerkinElmer)在635奈米处定量SEAP表达。数据以背景减除后三个复孔的平均+/-SD ABS或mABS(635奈米)值表示。

2.2.1结果

在HEK-Blue^TM-mTLR2及HEK-Blue^TM-hTLR2二者中，homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK均在≥1nM下引发与所测试的最强效激动剂(Pam2Cys-SKKKK)相等的SEAP生成，且在亚nM浓度下生成情况相当(图4A)。在两个系统中，都证明homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK为比Pam3Cys-SKKKK或homoPam2Cys(NH₂)-SKKKK更强效的激动剂。homoPam2Cys(NH₂)-SKKKK在HEK-Blue^TM-mTLR2中引发的SEAP生成与Pam3Cys-SKKKK相等，在HEK-Blue^TM-hTLR2中生成情况相当(图4A)。已证明homoPam2Cys(NHAc/NH₂)-SKKKK二者均为比Pam1CYs-SKKKK更强效的TLR2激动剂。重要的是，Pam1Cys-SKKKK在亚nM浓度下在HEK-Blue^TM-mTLR2中无活性，不像Pam1Cys-SKKKK，homoPam2Cys(NHAc/NH₂)-SKKKK在至亚nM浓度时在HEK-Blue^TM-mTLR2及–hTLR2中均具有活性(图4A)，从而有可能在未来应用在转基因鼠类模型中。所述数据表明homoPam2Cys(NHAc/NH₂)-SKKKK展现出与已知强效TLR1/2及TLR2/6激动剂Pam3Cys及Pam2Cys相当的生物功能及活性。

在HEK-Blue^TM-mTLR2及–hTLR2二者中，与未共轭的Pam3Cys-SKKKK相比，肽NLVPMVATVK(Ac)与Pam2Cys-SKKKK的共轭均引发激动作用的相对损失(图4B)。尚未明确确定这是否是由构建体聚集引起。相比之下，肽NLVPMVATVK(Ac)与homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK的共轭并未造成激动作用的任何损失，且homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK-NLVPMVATVK(Ac)仍为比Pam3Cys-SKKKK更强效的激动剂，尤其是在nM浓度下(图4C)。所述数据表明，当偶合至疏水性肽负荷(cargo)时，homoPam2Cys比Pam2Cys更强地保留溶解性及生物活性，且可能与所述构建体的相对活体内生物可利用率有一定关联。

2.2肽加工及递呈至CD8+T细胞克隆

在所有肽加工及递呈分析中均使用经爱泼斯坦-巴尔病毒转化的TLR2+HLA-A2+类淋巴母细胞B细胞系(LCL)作为抗原递呈细胞。将LCL以所需浓度按指示在RF10+肽/构建体中培养16小时。未经处理的LCL仅在RF10中培养。根据分析的性质以及每一处理所需的LCL数目而定，LCL/构建体培养在96孔板(U形底，BD Biosciences)中或在48孔板(平底，BDBiosciences)中进行。培养后，用RPMI 1640彻底洗涤LCL，以移除未结合的构建体/肽。

为了能够进行流式细胞术检测，CD8+T细胞克隆在种到APC孔中之前按照制造商的规程用0.5μM CellTrace^TMViolet(“CTV”)(Life Technologies^TM)进行预染色。将所装入的经过洗涤的LCL及CTV-染色T细胞克隆一式二份以4:1(LCL:T细胞)的比率种在96孔板的孔(U形底)中(所用细胞的典型数目为1.25x10⁴个细胞/毫升T细胞及5x10⁴个细胞/毫升APC)。种入后，将板轻轻离心(＜300x g，3分钟)，以允许立即相互作用，并且在标准细胞培养箱(cell culture incubator)中培养26小时。

为了检测T细胞活化，用抗CD8:AlexaFluor700及抗CD137:PE抗体(二者均来自Biolegend)对试样进行染色。将试样在暗处在冰上培养30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，以移除未结合的抗体。在进行采集的前一刻立刻将DAPI(1微克/最终浓度)加至每一试样中，以允许活/死排除。

数据采集使用带有FACSDiva软件的BD FACSAria II进行，且数据分析使用FlowJo软件(Treestar)进行。数据以CD137表现阳性的活克隆(clonal)细胞的平均％+SD表示(图4D至图4E)。

2.2.1结果

在由LCL内化及肽递呈后，homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK-NLV(551)引发的T细胞克隆活化与具有NLV的Pam2Cys-SKKKK(521)相当，且引发优于具有NLV的Pam1Cys-SKKKK(511)的T细胞克隆活化(图4D)。图4D中的虚线及实线分别代表背景T细胞克隆活化及通过与负载有10nM自由NLV肽的LCL共培养引发的活化。由于肽NLVPMVATVK(Ac)代表整个T细胞表位，因而在这个系统中不需要肽加工，且T细胞活化通过构建体内化、肽释放以及运输(trafficking)入LCL的MHC I路径中而确定。

在通过LCL的内化及表位递呈后，homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK-VPG(552)引发的T细胞克隆活化优于具有VPG的Pam1Cys-SKKKK(512)，且两种构建体均优于单独的VPG肽(500)(图4E)。由于最小表位EFTVSGNIL经由例如肽酶活性自长肽VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR内释放对于T细胞活化而言是必须的，所述数据表明，长合成肽共轭至homoPam2Cys部分改善TLR2+抗原递呈细胞的表位加工及递呈，推断这是通过在表面TLR1/2或TLR2/6结合后将肽靶向内/溶酶体路径实现的，且所述数据表明，共轭可能改善同源T细胞对肽表位的活体内识别。图4E中的虚线代表背景T细胞克隆活化。

3.实例3

这个实例展示经由硫醇烯反应制备本发明的氨基酸共轭物6。

3.1方法

在365奈米下辐照总体积为1毫升的由Fmoc-Cys-OH(3.4毫克，10微摩尔)、棕榈酸乙烯酯(141毫克，500微摩尔)及DMPA(0.5毫克，2微摩尔)溶入CH₂Cl₂(约850微升)中构成的溶液60分钟，产生由作为主要组分的单棕榈酰化Fmoc-Cys 5及作为次要组分的Fmoc-Cys 6组成的产物混合物(m/z ESI,908.5[M+H])(示意图4)。溶剂蒸发后，每一组分可通过在硅土上柱色谱分离，首先用4:1己烷/乙酸乙酯洗提，然后换为2:1己烷/乙酸乙酯，最后用1:1己烷/乙酸乙酯洗提。这产生5(4.6毫克，75％)及6(0.9毫克，10％)。

示意图4

这种合成方法很有用，因为起始材料廉价，反应可大规模进行，且产物相对容易分离。

然而，向6的转化(通过HPLC)低，且反应机制决定了新形成的手性中心可能在新形成的手性中心处提供差向异构体的混合物。

4.实例4

这个实例展示本发明的氨基酸共轭物6的合成。

4.1方法

然后自容易获得的3-丁烯醇进行化学合成，如示意图5中所概示。

通过与具有期望保护基的受保护半胱氨酸反应，所产生的双棕榈酰化产物6可具有不同的N端保护基。

环氧化物可分解(例如通过动力水解：M.Tokunaga,J.F.Larrow,F.Kakiuchi,E.N.Jacobsen,Science,1997,277,936-938)而提供首选非对映异构体。

示意图5

步骤i

向第三丁基二甲基氯硅烷(10.60克，70毫摩尔)及咪唑(4.77克，40毫摩尔)在CH₂Cl₂(200毫升)中的室温搅拌溶液中，经10分钟滴加3-丁烯-1-醇100(5.98毫升，69毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌90分钟。然后用Et₂O(150毫升)稀释混合物并用水(3×100毫升)及盐水(50毫升)洗涤。将有机层经无水MgSO₄干燥并真空浓缩。通过经由硅胶过滤纯化粗制品，得到无色液体101(11.99克，91％)。

步骤ii

室温下搅拌烯烃101(2.00克，10.74毫摩尔)在CH₂Cl₂(10毫升)中的溶液。经30分钟向搅拌溶液中滴加经无水Na₂SO₄干燥的mCPBA(2.78克，16.12毫摩尔)在CH₂Cl₂(25毫升)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物用Et₂O(70毫升)稀释，经由垫过滤并用饱和Na₂S₂O₃30水溶液(30毫升)、2M NaOH水溶液(30毫升)及盐水(30毫升)洗涤。将有机层经无水MgSO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，3:1)纯化粗制品，得到无色油102(1.85克，85％)。

步骤iii

在0℃下将硫醇200(0.53克，1.34毫摩尔)在CH₂Cl₂(4毫升)中及新鲜制备的甲醇、浓氢氯酸及浓硫酸的混合物(100:7:1，2毫升)中的溶液搅拌30分钟。然后向混合物中加入环氧化物102，并将所得溶液在40℃下回流19小时。然后将混合物用CH₂Cl₂(30毫升)稀释，经由垫过滤并用盐水(30毫升)洗涤。将水层用CH₂Cl₂(3×30毫升)提取并将合并后的有机提取物经无水MgSO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，1:3)纯化粗制品，得到无色油103(0.50克，77％)。

步骤iv

向二醇103(0.327克，0.67毫摩尔)及棕榈酸(0.516克，2.01毫摩尔)在THF(9毫升)的室温搅拌溶液中加入二异丙基碳二亚胺(0.414毫升，2.68毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(0.01克，0.07毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌19小时。将混合物用EtOAc(30毫升)稀释，经由床过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(CH₂Cl₂)纯化粗制品，得到黄色油201(0.301克，47％)。

步骤v

在室温下将二酯201(0.35克，0.364毫摩尔)在三氟乙酸中的溶液搅拌1小时，之后真空浓缩混合物。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，9:1→0:1)纯化粗制品，得到无色油6(0.33克，定量产率)。

Fmoc-Cys-OH描述于以下文献中：H.-K.Cui,Y.Guo,Y.He,F.-L.Wang,H.-H.Chang,Y.J.Wang,F.-M.Wu,C.-L.Tian,L.Lu,Angew.Chem.Int.Eng.,2013,52(36),9558-9562。

4.2氨基酸共轭物6的分析

通过上文在4.1节中所述方法合成的氨基酸共轭物6具有与如实例3中所述通过辐照Fmoc-半胱氨酸及棕榈酸乙烯酯的溶液而获得的6相同的分析特性(质谱相同)。

双棕榈酰化Fmoc-Cys 6的¹H NMR谱显示于图3中。表征资料如下：¹H NMR(400Mhz,CDCl₃)δ7.75(2H,d,Fmoc Ar-H),7.60(2H,d,Fmoc Ar-H),7.39(2H,t,Fmoc Ar-H),7.31(2H,t,Fmoc Ar-H),5.75(1H,宽d,NH),5.06(1H,m,H-2’),4.66(1H,m,H-1),4.40(2H,d,CH₂(Fmoc)),4.26(1H,t,CH(Fmoc)),4.11(2H,m,H-4’),3.13(1H,2x dd,H-2),3.06(1H,2x dd,H-2),2.76(2H,m,H-1’),2.28(4H,m,H-1”),2.03,(1H,m,H-3’),1.94(1H,m,H-3’),1.59(4H,m,H-2”),1.24(48H,m,14xCH₂(棕榈酰基)),0.88(6H,t,2xCH₃(棕榈酰基)).MS(ESI-TOF):m/z[M+H]908.6065；C₅₄H₈₆NO₈S需要[M+H]908.6069。

4.3对映体纯环氧化物102A及102B的制备及用途

非对映异构纯氨基酸共轭物6可使用自对映异构纯的起始材料以立体特异性方式生成的对映纯环氧化物102A或对映纯环氧化物102B制备。所得对映纯环氧化物可与硫醇200以上文第4.1节步骤(iii)中所述类似的程序反应或与二硫化物804如下文所述反应，以提供对应的非对映异构纯二醇103A或103B，然后可如本文中所述将其转化为对应的非对映异构纯共轭物6A或6B。

对映纯环氧化物102A及对映纯环氧化物102B分别自L-天冬氨酸及D-天冬氨酸按照Volkmann,R.A.et al.J.Org.Chem.,1992,57,4352-4361中针对自L-天冬氨酸制备(R)-(2-羟乙基l)噁烷(102A)所述的程序制备。

(S)-2-溴代琥珀酸

向溴化钠(15.46克，150.24毫摩尔)在6N H₂SO₄(33毫升)中的0℃溶液中加入L-天冬氨酸(5.00克，37.56毫摩尔)。经90分钟向所得混合物中分批加入亚硝酸钠(3.11克，45.07毫摩尔)。再将反应混合物在0℃下搅拌2小时。然后用H₂O(17毫升)稀释混合物并用Et₂O(100毫升)提取。水层用盐水(20毫升)稀释并再用Et₂O(3×100毫升)提取。经无水Na₂SO₄干燥合并的有机提取物并真空浓缩，得到白色固体标题化合物(2.98克，41％)。粗制品不经进一步纯化便用于随后的合成步骤中。[α]_D ^19.7-71.5(c 0.46，在EtOAc中)(lit-73.5(c 6.0，在EtOAc中)；δ_H(400MHz；DMSO)12.8(2H,br s,2×CO₂H),4.54(1H,dd,J＝8.5,6.4Hz,H-1),3.10(1H,dd,J＝17.2,8.6Hz,H-2),2.90(1H,dd,J＝17.1,6.4Hz,H-2)；δ_C(100MHz；DMSO)171.0(C,CO₂H),170.1(C,CO₂H),40.5(CH,C-1),39.5(CH₂,C-2).光谱资料与文献中所报告一致。

(R)-2-溴代琥珀酸

(R)-2-溴代琥珀酸按照上文针对(S)-2-溴代琥珀酸的制备所述的程序制备，但是使用D-天冬氨酸而非L-天冬氨酸。[α]_D ^20.2+66.5(c 0.2，在EtOAc中)。其余的光谱数据与所观察到的(S)-2-溴代琥珀酸的光谱数据完全相同。

(S)-2-溴代-1,4-丁二醇

经90分钟向(S)-2-溴代琥珀酸(2.98克，15.20毫摩尔)在THF(35毫升)中的-78℃溶液中滴加BH₃·DMS络合物(4.33毫升，45.61毫摩尔)。将反应在-78℃下搅拌2小时，然后升温至室温并再搅拌60小时。然后将反应冷却至0℃并缓慢添加MeOH(15毫升)。然后真空浓缩混合物并用MeOH(15毫升)稀释残余物。重复这一过程3次，得到黄色油标题化合物(2.55克，定量产率)。粗制品不经进一步纯化便用于后续合成步骤中。[α]_D ^19.6-36.8(c 0.5，在CHCl₃中)；δ_H(400MHz,CDCl₃)4.34(1H,dq,J＝7.7,5.3Hz,H-2),3.92-3.78(4H,m,H-1,H-4),2.40(2H,br s,2×OH),2.20-2.06(2H,m,H-3)；δ_C(100MHz；CDCl₃)67.1(CH₂,C-1),60.1(CH₂,C-4),55.2(CH,C-2),37.8(CH₂,C-3).光谱资料与文献中报告的一致。

(R)-2-溴代-1,4-丁二醇

(R)-2-溴代-1,4-丁二醇按照上文所述用于制备(S)-2-溴代-1,4-丁二醇的程序制备，但是使用(R)-2-溴代琥珀酸而非(S)-2-溴代琥珀酸。[α]_D ^21.3+20.0(c 0.17，在CHCl₃中)。其余的光谱数据与所观察到的(S)-2-溴代-1,4-丁二醇的光谱数据完全相同。

(R)-(2-羟乙基)噁烷(102A)

向(S)-2-溴代-1,4-丁二醇(2.31克，13.76毫摩尔)在CH₂Cl₂(46毫升)中的室温溶液中添加Cs₂CO₃(8.74克，24.77毫摩尔)。将所得混合物在室温下搅拌72小时。然后经由垫过滤反应并真空浓缩，得到定量转化的黄色油标题化合物。粗制材料不经进一步纯化便用于随后的合成步骤中。[α]_D ^22.9+35.0(c 0.61在CHCl₃中)；δ_H(400MHz；CDCl₃)3.83-3.79(2H,m,H-1),3.12-3.08(1H,m,H-3),2.81(1H,dd,J＝4.8,4.1Hz,H-4),2.60(1H,dd,J＝4.8,2.8Hz,H-4),2.03-1.95(1H,m,H-2),1.78(1H,t,J＝5.4Hz,OH),1.71(1H,dq,J＝14.6,5.9Hz,H-2)；δ_C(100MHz；CDCl₃)60.0(CH₂,C-1),50.5(CH,C-3),46.5(CH₂,C-4),34.6(CH₂,C-2).光谱资料与文献中所报告的一致。

(S)-(2-羟乙基)噁烷(102B)

(S)-(2-羟乙基)噁烷(102B)按照上文所述用于制备(R)-(2-羟乙基)噁烷(102A)的程序制备，但是使用(R)-2-溴代-1,4-丁二醇而非(S)-2-溴代-1,4-丁二醇.。[α]_D ^22.9-35.2((c 0.23，在CHCl₃中)。其余的光谱数据与所观察到的(S)-2-溴代-1,4-丁二醇的光谱数据完全相同。

非对映异构纯6A的制备

向二硫化物804(1.59克，2.06毫摩尔)在CH₂Cl₂(10毫升)中的0℃搅拌溶液中，添加锌粉末(0.94克，14.42毫摩尔)及新鲜制备的甲醇、浓氢氯酸与浓硫酸的混合物(100:7:1，5毫升)。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟，之后添加环氧化物102A(0.73克，8.24毫摩尔)。将反应混合物在55℃下搅拌17小时。然后将反应混合物用CH₂Cl₂(30毫升)稀释，经由垫过滤并用盐水(50毫升)洗涤。水层用CH₂Cl₂(3×50毫升)提取，并将合并的有机提取物经无水MgSO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，1:3)纯化粗制品，得到无色油103A(1.72克，88％)。

R_f 0.15(己烷-EtOAc 1:3)；[α]_D ^20.2-3.5(c 0.32，在CHCl₃中)；ν_max(纯净的)/cm^-13347,2976,1703,1518,1449,1413,1369,1335,1249,1151；δ_H(400MHz；CDCl₃)7.77(2H,d,J＝7.5,FmocH),7.61(2H,d,J＝7.2Hz,FmocH),7.40(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),7.32(2H,t,J＝7.5Hz,FmocH),5.81(1H,d,J＝8.0Hz,NH),4.53-4.50(1H,m,H-1),4.40(2H,d,J＝6.8Hz,FmocCH₂),4.23(1H,t,J＝7.0Hz,FmocCH),3.94-3.88(1H,m,H-4),3.85-3.81(2H,m,H-6),3.03(1H,dd,J＝14.0,4.2Hz,H-2),2.94(1H,dd,J＝14.3,6.1Hz,H-2),2.82(1H,dd,J＝14.0,2.9Hz,H-3),2.56(1H,dd,J＝14.0,9.0Hz,H-3),1.74-1.71(1H,m,H-5),1.50(9H,s,C(CH₃)₃)；δ_C(100MHz；CDCl₃)141.3(C,Fmoc),127.8(CH,Fmoc),127.1(CH,Fmoc),125.1(CH,Fmoc),120.0(CH,Fmoc),83.1(C,C(CH₃)₃),69.9(CH,C-4),67.2(CH₂,FmocCH₂),61.2(CH₂,C-6),54.7(CH,C-1),47.1(CH,FmocCH),41.2(CH₂,C-3),37.5 37.5(CH₂,C-5),35.7(CH₂,C-2),28.0(3×CH₃,C(CH₃)₃)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺510.1921C₂₆H₃₃NNaO₆S计算值510.1921.

然后按照与上文在第4.1节步骤iv及v中所述程序类似的程序将非对映异构纯二醇103A转化成非对映异构纯共轭物6A。

非对映异构纯6B的制备

向二硫化物804(2.01克，2.53毫摩尔)在CH₂Cl₂(14毫升)中的0℃搅拌溶液中，添加锌粉末(1.15克，17.51毫摩尔)及新鲜制备的甲醇、浓氢氯酸与浓硫酸的混合物(100:7:1，7毫升)。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟，之后添加环氧化物102B(0.89克，10.11毫摩尔)。将反应混合物在55℃下搅拌17小时。然后将反应混合物用CH₂Cl₂(30毫升)稀释，经由垫过滤并用盐水(50毫升)洗涤。水层用CH₂Cl₂(3×50毫升)提取，并将合并的有机提取物经无水MgSO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，3:1)纯化粗制品，得到无色油103B(2.17克，88％)。

R_f 0.15(己烷-EtOAc 1:3)；[α]_D ²²+8.5(c 0.3，在CHCl₃中)；ν_max(纯净的)/cm^-13347,2976,1703,1518,1449,1413,1369,1335,1249,1151；δ_H(400MHz；CDCl₃)7.77(2H,d,J＝7.5Hz,FmocH),7.61(2H,d,J＝7.4Hz,FmocH),7.40(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),7.32(2H,t,J＝7.5Hz,FmocH),5.74(1H,d,J＝7.0Hz,NH),4.51-4.47(1H,m,H-1),4.42-4.39(2H,m,FmocCH₂),4.24(1H,t,J＝7.0Hz,FmocCH),3.93(1H,br s,H-4),3.85-3.81(2H,m,H-6),3.31(1H,br s,OH-4),3.00-2.78(2H,m,H-2),2.80(1H,dd,J＝13.5,3.2Hz,H-3),2.55(1H,dd,J＝13.8,8.4,Hz,H-3),2.36(1H,br s,OH-6)1.73(2H,q,J＝5.3,H-5),1.50(9H,s,C(CH₃)₃)；δ_C(100MHz；CDCl₃)141.3(C,Fmoc),127.8(CH,Fmoc),127.1(CH,Fmoc),125.1(CH,Fmoc),120.0(CH,Fmoc),83.1(C,C(CH₃)₃),69.9(CH,C-4),67.2(CH₂,FmocCH₂),61.2(CH₂,C-6),54.7(CH,C-1),47.1(CH,FmocCH),41.2(CH₂,C-3),37.5 37.5(CH₂,C-5),35.7(CH₂,C-2),28.0(3×CH₃,C(CH₃)₃)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺510.1921C₂₆H₃₃NNaO₆S计算值510.1921.

然后按照与上文在第4.1节步骤iv及v中所述程序类似的程序将非对映异构纯二醇103B转化至非对映异构纯共轭物6B。

5.实例

如下面所述及所绘示使用6制备包含肽序列SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR[SEQ ID No:112]的本发明的肽共轭物10A及10B(示意图6)。

示意图6

(i)重复Fmoc-SPPS；(ii)双棕榈酰化Fmoc-Cys-OH 6，PyBOP，柯林碱，DMF；(iii)20％哌啶/DMF；(iv)Ac₂O/NMM,DMF；(v)TFA/EDT.

所期望的肽序列使用如先前所述的标准重复Fmoc SPPS技术合成。

偶合倒数第二个氨基酸残基后，然后使用在DMF中的PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷并鏻六氟磷酸盐)及柯林碱用氨基酸共轭物6衍生化结合树脂的肽链。用于氨基酸共轭物的偶合的条件降低所述氨基酸的α-碳在活化时差向异构的倾向。氨基酸共轭物(0.075毫摩尔)与PyBOP(0.1毫摩尔)合并且溶于DMF(0.3毫升)中。添加纯净的2,4,6-三甲基吡啶(0.1毫摩尔)。混合30秒后，将溶液转移到0.025毫摩尔的树脂中，然后摇动90分钟，排干并洗涤(DMF)。

然后使用在DMF中的20％哌啶移除Fmoc基团以提供8。

然后通过用在DMF(2毫升)中的20％乙酸酐与4-甲基吗啉(1毫摩尔)的混合物将肽8转化为对应的乙酰胺9。

或者，将肽8自树脂裂解，以提供对应的肽共轭物10A。在室温下将在含有5％(v/v)乙二硫醇的1毫升三氟乙酸中的树脂(0.015毫摩尔)摇动3小时。然后将上清液经由烧结矿排入冷冻二乙醚(10毫升)中。然后再用1毫升TFA洗涤树脂，也将其添加至醚中。通过离心将沉淀的材料丸粒化并用醚(5毫升)洗涤丸粒一次，然后溶于1:1MeCN/水(+0.1％tfa)中并冻干。

使用相同程序将肽9自树脂裂解。

使用Phenomenex Gemini C18(5μ，110埃)10x250毫米柱用溶析液A及溶析液B通过半制备HPLC进行10A及10B的纯化，溶析液A为水(+0.1％tfa)，溶析液B为MeCN(+0.1％tfa)。将粗制肽试样注入柱后，产生经30分钟5％B至95％B的梯度，流速为4毫升/分钟，并且将期望的产物材料在自柱洗提出时收集并冷冻干燥。

10A:m/z(ESI)1363.8[M+3H⁺].HPLC分析：柱：Phenomenex Proteo C12(4μ，90埃，4.6x 250毫米)；溶析液A，水/0.1％TFA；溶析液B：MeCN/0.1％TFA；梯度：5-95％B，经30分钟@1毫升/分钟。保留时间：23.4分钟。

10B:m/z(ESI)1377.7[M+3H⁺].HPLC分析：柱：Phenomenex Proteo C12(4μ，90埃，4.6x 250毫米)；溶析液A，水/0.1％TFA；溶析液B：MeCN/0.1％TFA；梯度：5-95％B，经30分钟@1毫升/分钟。保留时间：25.2分钟。

6.实例6

如下表2中所概述，在各种不同条件下按照以下一般程序进行肽1与棕榈酸乙烯酯的硫醇烯反应。

6.1肽1的合成

如下所述制备肽1。

使氨基甲基聚苯乙烯树脂(100毫克，0.1毫摩尔，负荷1.0毫摩尔/克)与Fmoc-Val-HMPP(HMPP＝羟甲基苯氧基乙酸)(105毫克，0.2毫摩尔)及DIC(31微升，0.2毫摩尔)在二氯甲烷与DMF的混合物(2毫升，1.9:0.1v/v)中在室温下反应1小时。偶合的结束使用卡瑟测试(Kaiser test)监测，并且在偶合不彻底时用新鲜制备的试剂重复偶合程序。肽序列其余部分的固相肽合成使用Tribute肽合成仪(Protein technologies Inc.)进行，对于每一偶合步骤使用HATU/DIPEA在室温下进行40分钟，且对于每一Fmoc去保护步骤使用在DMF中的20％哌啶溶液(v/v)在室温下以5分钟重复进行两次。

在合成肽序列后，使用在DMF(v/v)中的20％乙酸酐溶液及DIPEA(0.25毫升)在室温下15分钟完成N端乙酰化。

通过在室温下用TFA/TIPS/H₂O/DODT(10毫升，94:1:2.5:2.5v/v/v/v)处理2小时裂解树脂结合肽。用氮气流蒸发TFA后，在冷二乙醚中沉淀肽，通过离心分离，用冷二乙醚洗涤两次，溶于含有0.1％TFA的乙腈:水(1:1,v/v)中，并冻干以提供粗制肽。

通过RP-HPLC使用半制备Gemini C-18柱(phenomenex,5μ10.0x250毫米)进行纯化得到肽1(74毫克，43％，以0.1毫摩尔规模计)，[(M+2H)²⁺，计算值858.5，实测值858.6Da)]。

6.2硫醇烯反应的一般程序

储液1：在脱气N-甲基-2-吡咯烷酮(0.5毫升)中的DMPA(6.5毫克，25.3微摩尔)。

储液2：在脱气N-甲基-2-吡咯烷酮中的棕榈酸乙烯酯(需要的浓度)

将肽1(1.71毫克，1.0微摩尔)溶于储液1(10微升，0.5微摩尔)中，随后添加第三丁基硫醇及/或三异丙基硅烷、以及三氟乙酸(5％v/v)及储液2。在室温下使用紫外灯以365奈米的波长辐照反应混合物，之后以30分钟的间隔移取试样进行LC-MS分析。通过用Milli-Q水淬灭制备分析试样并使用Gemini C-18柱(Phenomenex，5μ4.6x 150毫米)进行分析。

表3：使用DMPA^b作为自由基引发剂在NMP^a中进行肽10与棕榈酸乙烯酯1的共轭

^a30分钟反应时间，5％TFA/最终反应体积；^b相对于肽1为0.5摩尔当量；^c相对于肽1的摩尔当量；^d二甲基亚砜作为溶剂；^eN,N’-二甲基甲酰胺作为溶剂；^f肽1、单加合物2及双加合物3的转化是基于在210奈米下对应的峰在RP-HPLC图形上的整合。2及3的相对量以百分比形式引述；^gRP-HPLC纯化后72％的分离产率。

7.实例7

这个实例展示了自各种起始材料合成本发明的氨基酸共轭物。

7.1自醇800合成氨基酸共轭物806

步骤i

向4-戊炔-1-醇800(5毫升，53.72毫摩尔)在CH₂Cl₂(150毫升)中的室温搅拌溶液中，添加咪唑(3.66克，53.72毫摩尔)及第三丁基二甲基氯硅烷(8.10克，53.72毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。然后用Et₂O(200毫升)稀释混合物并用水(3×100毫升)及盐水(100毫升)洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过经由硅胶过滤纯化粗制品，得到无色液体标题化合物801(10.64克，定量产率)。炔烃801不经表征便用于随后合成步骤中。

步骤ii

向炔烃801(14.08克，70.00毫摩尔)在己烷(150毫升)中的室温搅拌溶液中添加喹啉(11.75毫升，100.00毫摩尔)及林德拉催化剂(Lindlar’s catalyst)(1.408克)。将反应混合物连接到充满H₂的球形大烧瓶(1大气压)并且在室温下搅拌5小时。然后将混合物经由垫过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到无色液体标题化合物802(14.09克，99％)。

R_f 0.88(石油醚-EtOAc 9:1)；δ_H(400MHz；CDCl₃)5.82(1H,ddt,J＝17.0,10.2,6.7Hz,H-4),5.02(1H,d,J＝17.1Hz,H_a-5),4.95(1H,d,J＝10.4Hz,H_b-5),3.62(2H,t,J＝6.5Hz,H-1),2.10(2H,q,J＝7.2Hz,H-3),1.61(2H,p,J＝7.0Hz,H-2),0.90(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.05(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)138.6(CH,C-4),114.5(CH₂,C-5),62.6(CH₂,C-1),32.0(CH₂,C-2),30.5(CH₂,C-3),26.0(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),18.4(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告的一致。

步骤iii

向烯烃802(8.646克，43.16毫摩尔)在CH₂Cl₂(100毫升)中的室温搅拌溶液中添加mCPBA(8.191克，47.47毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌15小时。然后将混合物经由过滤，用Et₂O(100毫升)稀释并用饱和NaHCO₃水溶液(3×100毫升)及盐水(100毫升)洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到无色液体标题化合物803(8.09克，87％)。

R_f 0.51(石油醚-EtOAc 9:1)；δ_H(400MHz；CDCl₃)3.70-3.60(2H,m,H-1),2.96-2.92(1H,m,H-4),2.75(1H,dd,J＝5.0,4.0Hz,H-5),2.47(1H,dd,J＝5.0,2.8Hz,H-5),1.73-1.53(4H,m,H-2,H-3),0.89(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.04(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)62.7(CH₂,C-1),52.2(CH,C-4),47.1(CH₂,C-5),29.1(CH₂,C-2),29.0(CH₂,C-3),25.9(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),18.3(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告的一致。

步骤iv

向外消旋环氧化物803(8.272克，38.24毫摩尔)、(R,R)-(+)-N,N’-双(3,5-二-第三丁基亚水杨基)-1,2-环己烷二氨基钴(II)(0.121克，0.19毫摩尔)及冰乙酸(0.04毫升，0.76毫摩尔)在THF(0.35毫升)中的0℃搅拌溶液中滴加水(0.38毫升)。将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后将混合物真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到黄色油标题化合物803a(4.12克，49％)。

R_f 0.51(石油醚-EtOAc 9:1)；[α]_D ^21.4+4.65(c 1.15，在CHCl₃中)；δ_H(400MHz；CDCl₃)3.70-3.60(2H,m,H-1),2.96-2.92(1H,m,H-4),2.75(1H,dd,J＝5.0,4.0Hz,H-5),2.47(1H,dd,J＝5.0,2.8Hz,H-5),1.73-1.53(4H,m,H-2,H-3),0.89(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.04(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)62.7(CH₂,C-1),52.2(CH,C-4),47.1(CH₂,C-5),29.1(CH₂,C-2),29.0(CH₂,C-3),25.9(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),18.3(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告一致。

步骤v

向商购二硫化物804(0.751克，0.94毫摩尔)在CH₂Cl₂(5毫升)中的0℃搅拌溶液中添加锌粉(0.508克，7.78毫摩尔)及新鲜制备的甲醇、浓氢氯酸与浓硫酸的混合物(100:7:1，2毫升)。将所得反应混合物在0℃下搅拌30分钟。然后将混合物在65℃下搅拌5分钟，之后添加环化合物803a(0.839克，3.88毫摩尔)。将反应混合物在65℃下搅拌19小时。然后将混合物用EtOAc(50毫升)稀释，经由垫过滤并用盐水(50毫升)洗涤。用EtOAc(3×50毫升)提取水层，并将合并的有机提取物经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，1:3)纯化粗制品，得到无色油标题化合物805(0.568克，60％)。

R_f 0.34(己烷-EtOAc 1:3)；[α]_D ^21.0-26.7(c 0.03，在CHCl₃中)；ν_max(纯净的)/cm^-13321,2931,1706,1532,1450,1369,1248,1152,1050；δ_H(400MHz；CHCl₃)7.76(2H,d,J＝7.5Hz,FmocH),7.61(2H,d,J＝7.2Hz,FmocH),7.40(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),7.31(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),5.90(1H,d,J＝7.8Hz,NH),4.51(1H,dd,J＝12.3,5.2Hz,H-1),4.39(2H,d,J＝7.1Hz,FmocCH₂),4.23(1H,t,J＝7.1Hz,FmocCH),3.73-3.58(3H,m,H-4,H-7),3.03(1H,dd,J＝13.9,4.4Hz,H-2),2.95(1H,dd,J＝13.9,5.7Hz,H-2),2.80(1H,dd,J＝13.6,2.9Hz,H-3),2.53(1H,dd,J＝13.6,8.9Hz,H-3),1.72-1.61(4H,m,H-5,H-6),1.49(9H,s,C(CH₃)₃))；δ_C(100MHz；CHCl₃)169.8(C,CO₂tBu),156.1(C,FmocCO),143.9(C,Fmoc),141.1(C,Fmoc),127.9(CH,Fmoc),127.2(CH,Fmoc),125.3(CH,Fmoc),120.1(CH,Fmoc),83.2(C,C(CH₃)₃),70.1(CH,C-4),67.3(CH₂,FmocCH₂),62.8(CH₂,C-7),54.7(CH,C-1),47.2(CH,FmocCH),41.2(CH₂,C-3),35.5(CH₂,C-2),33.4(CH₂,C-5),29.2(CH₂,C-6),28.1(3×CH₃,C(CH₃)₃)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺524.2077C₂₇H₃₅NNaO₆S的计算值524.2075.

步骤vi

向二醇805(0.114克，0.243毫摩尔)及棕榈酸(0.18克，0.702毫摩尔)在THF(3毫升)中的室温搅拌溶液中添加N,N’-二异丙基碳化二亚胺(0.145克，0.936毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(0.011克，0.094毫摩尔)。将所得反应混合物在室温下搅拌17小时。然后将混合物经由垫过滤、用EtOAc(30毫升)稀释、用1M柠檬酸(30毫升)及盐水(30毫升)洗涤并真空浓缩。然后将残余物再次溶解于TFA(3毫升)中并于室温下搅拌45分钟。再次真空浓缩反应混合物。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，9:1→0:1)纯化粗制品，得到无色油标题化合物806(0.220克，98％)。

R_f 0.15(石油醚-EtOAc 1:1)；[α]_D ^21.3+10.0(c 0.08，在CHCl₃中)；ν_max(纯净的)/cm^-1 2919,2851,1723,1521,1521,1221,1108,1054；δ_H(400MHz；CHCl₃)7.76(2H,d,J＝7.5Hz,FmocH),7.62(2H,d,J＝7.4Hz,FmocH),7.39(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),7.30(2H,td,J＝11.2,0.9Hz,FmocH),5.78(1H,d,J＝7.6Hz,NH),5.04-4.95(1H,m,H-4),4.60(1H,dd,J＝12.2,5.2Hz,H-1),4.38(2H,d,J＝7.2Hz,FmocCH₂),4.24(2H,t,J＝7.1Hz,FmocCH),4.13-3.99(2H,m,H-7),3.16(1H,dd,J＝13.9,4.5Hz,H-2),3.04(1H,dd,J＝14.0,5.3Hz,H-2),2.78-2.70(2H,m,H-3),2.34-2.25(4H,m,2×PamCH_2α烷基),1.74-1.56(8H,m,2×PamCH_2β烷基,H-5,H-6),1.32-1.22(48H,m,24×PamCH₂烷基),0.88(6H,t,J＝6.9Hz,2×PamCH₃烷基)；δ_C(100MHz；CHCl₃)174.3(C,CO₂H),174.0(C,PamCO₂),173.5(C,PamCO₂₎,156.0(C,FmocCO),143.7(C,Fmoc),141.3(C,Fmoc),127.8(CH,Fmoc),127.1(CH,Fmoc),121.2(CH,Fmoc),120.0(CH,Fmoc),72.1(CH,C-4),67.5(CH₂,FmocCH₂),63.8(CH₂,C-7),53.6(CH,C-1),47.1(CH,FmocCH),36.5(CH₂,C-3),34.6(CH₂,PamCH_2α烷基),34.5(CH₂,PamCH_2α烷基),34.3(CH₂,C-2),31.9(2×CH₂,PamCH₂烷基),29.7-29.2(21×CH₂,PamCH₂烷基,C-5),25.0(2×CH₂,PamCH_2β烷基),24.6(CH₂,C-6),22.7(2×CH₂,PamCH₂烷基),14.1(2×CH₃,PamCH₃烷基)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺944.6045C₅₅H₈₇NNaO₈S的计算值944.6028.

7.1.2自醇807合成氨基酸共轭物811

步骤i

向5-己烯-1-醇807(5.00毫升，41.64毫摩尔)在CH₂Cl₂(150毫升)中的室温搅拌溶液中，添加咪唑(2.86克，43.06毫摩尔)及第三丁基二甲基氯硅烷(6.34克，42.06毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌19小时。然后用EtOAc(400毫升)稀释混合物，用水(200毫升)及盐水(200毫升)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚)纯化粗制品，得到无色油标题化合物808(8.846克，定量产率)。

R_f 0.90(石油醚-EtOAc 9:1)；δ_H(400MHz；CDCl₃)5.81(1H,ddt,J＝17.1,10.1,6.7Hz,H-5),5.00(1H,dq,J＝17.2,1.7Hz,H_a-6),4.94(1H,d,J＝10.5Hz,H_b-6),3.61(2H,t,J＝6.2Hz,H-1),2.06(2H,q,J＝7.1Hz,H-4),1.59-1.50(2H,m,H-2),1.47-1.39(2H,m,H-3),0.89(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.05(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)139.0(CH,C-5),114.3(CH₂,C-6),63.1(CH₂,C-1),33.5(CH₂,C-4),32.3(CH₂,C-2),26.0(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),25.2(CH₂,C-3),18.4(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告一致。

步骤ii

向烯烃808(7.58克，35.35毫摩尔)在CH₂Cl₂(150毫升)中的室温搅拌溶液中分批添加mCPBA(9.15克，53.05毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。然后用Et₂O(200毫升)稀释混合物，经由过滤，用2M NaOH水溶液(200毫升)及盐水(200毫升)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到无色油标题化合物809(6.91克，85％)。

R_f 0.60(石油醚-EtOAc 9:1)；δ_H(400MHz；CDCl₃)3.61(2H,t,J＝6.0Hz,H-1),2.93-2.88(2H,m,H-5),2.74(1H,dd,J＝5.0,4.0Hz,H-6),2.46(1H,dd,J＝5.0,3.0Hz,H-6),1.63-1.46(6H,m,H-2,H-3,H-4),0.89(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.04(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)63.0(CH₂,C-1),52.3(CH,C-5),47.1(CH₂,C-6),32.6(CH₂,C-4),32.3(CH₂,C-2),26.0(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),22.3(CH₂,C-3),18.4(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告一致。

步骤iii

向外消旋环氧化物809(5.887克，25.56毫摩尔)、(R,R)-(+)-N,N’-双(3,5-二-第三丁基亚水杨基)-1,2-环己烷二氨基钴(II)(0.083克，0.13毫摩尔)及冰乙酸(0.03毫升，0.51毫摩尔)在THF(0.3毫升)中的0℃搅拌溶液中滴加水(0.253毫升)。将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后真空浓缩混合物。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到黄色油标题化合物809a(2.913克，49％)。

R_f 0.60(石油醚-EtOAc 9:1)；[α]_D ^20.4+5.0(c 0.02，在CHCl₃中)；δ_H(400MHz；CDCl₃)3.61(2H,t,J＝6.0Hz,H-1),2.93-2.88(2H,m,H-5),2.74(1H,dd,J＝5.0,4.0Hz,H-6),2.46(1H,dd,J＝5.0,3.0Hz,H-6),1.63-1.46(6H,m,H-2,H-3,H-4),0.89(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.04(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)63.0(CH₂,C-1),52.3(CH,C-5),47.1(CH₂,C-6),32.6(CH₂,C-4),32.3(CH₂,C-2),26.0(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),22.3(CH₂,C-3),18.4(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告一致。

步骤iv

向二硫化物804(0.500克，0.649毫摩尔)在CH₂Cl₂(5毫升)中的0℃搅拌溶液中添加锌粉(0.300克，4.54毫摩尔)及新鲜制备的甲醇、浓氢氯酸与浓硫酸的混合物(100:7:1，2毫升)。将所得反应混合物在0℃下搅拌30分钟。然后将混合物在65℃下搅拌5分钟，之后添加环氧化物809a(0.600克，2.60毫摩尔)。将反应混合物在65℃下搅拌19小时。然后将混合物用EtOAc(50毫升)稀释，经由垫过滤并用盐水(50毫升)洗涤。用EtOAc(3×50毫升)提取水层，并将合并的有机提取物经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，4:1→1:3)纯化粗制品，得到无色油标题化合物810(0.553克，83％)。

R_f 0.39(己烷-EtOAc 1:3)；[α]_D ^21.2-25.0(c 0.07在CHCl₃中)；ν_max(纯净的)/cm^-13343,2934,2862,1705,1513,1450,1369,1344,1248,1152；δ_H(400MHz；CHCl₃)7.76(2H,d,J＝7.5Hz,FmocH),7.61(2H,d,J＝7.0Hz,FmocH),7.40(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),7.30(2H,td,J＝11.2,1.1Hz,FmocH),5.88(1H,d,J＝7.8Hz,NH),4.52(1H,dd,J＝12.5,5.2Hz,H-1),4.39(2H,d,J＝8.1Hz,FmocCH₂),4.23(1H,t,J＝7.1Hz,FmocCH),3.70-3.59(3H,m,H-4,H-8),3.03(1H,dd,J＝13.7,4.7Hz,H-2),2.94(1H,dd,J＝13.7,5.4Hz,H-2),2.80(1H,dd,J＝13.6,3.4Hz,H-3),2.51(1H,dd,J＝13.4,8.7Hz,H-3),1.60-1.38(15H,m,H-5,H-6,H-7,C(CH₃)₃))；δ_C(100MHz；CHCl₃)169.7(C,CO₂tBu),156.0(C,FmocCO),143.8(C,Fmoc),141.3(C,Fmoc),127.8(CH,Fmoc),127.1(CH,Fmoc),125.2(CH,Fmoc),120.0(CH,Fmoc),83.1(C,C(CH₃)₃),69.8(CH,C-4),67.2(CH₂,FmocCH₂),62.5(CH₂,C-8),54.6(CH,C-1),47.1(CH,FmocCH),41.1(CH₂,C-3),35.8(CH₂,C-5),35.4(CH₂,C-2),32.4(CH₂,C-7),28.0(3×CH₃,C(CH₃)₃),21.9(CH₂,C-6)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺538.2226C₂₈H₃₇NNaO₆S计算值538.2234.

步骤v

向二醇810(0.190克，0.370毫摩尔)及棕榈酸(0.284克，1.10毫摩尔)在THF(3毫升)中的室温搅拌溶液中添加N,N’-二异丙基碳化二亚胺(0.226克，1.47毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(0.018克，0.147毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌17小时。然后将混合物经由垫过滤，用EtOAc(50毫升)稀释，用1M柠檬酸(30毫升)及盐水(30毫升)洗涤并真空浓缩。然后将残余物再溶解于TFA(3毫升)中并于室温下搅拌45分钟。再次真空浓缩反应混合物。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，9:1→0:1)纯化粗制品，得到无色油标题化合物811(0.301克，定量产率)。

R_f 0.20(石油醚-EtOAc 1:1)；[α]_D ^21.2+10.0(c 0.07在CHCl₃中)；ν_max(纯净的)/cm^-1 3331,2917,2850,1728,1692,1532,1467,1451,1244,1221,1198,1175；δ_H(400MHz；CHCl₃)7.76(2H,d,J＝7.5Hz,FmocH),7.62(2H,d,J＝7.2Hz,FmocH),7.40(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),7.30(2H,td,J＝11.2,1.0Hz,FmocH),5.82(1H,d,J＝7.9NH),5.03-4.92(1H,m,H-4),4.71-4.60(1H,m,H-1),4.40(2H,d,J＝7.0Hz,FmocCH₂),4.24(1H,t,J＝7.1Hz,FmocCH),4.11-4.00(2H,m,H-8),3.15(1H,dd,J＝13.9,4.4Hz,H-2),3.04(1H,dd,J＝13.8,5.8Hz,H-2),2.78-2.65(2H,m,H-3),2.31(2H,t,J＝7.6Hz,PamCH_2α烷基),2.28(2H,t,J＝7.6Hz,PamCH_2α烷基),1.74-1.55(8H,m,2×PamCH_2β烷基,H-5,H-7),1.45-1.17(50H,m,24×PamCH₂烷基,H-6),0.88(6H,t,J＝6.8Hz,2×PamCH₃烷基)；δ_C(100MHz；CHCl₃)174.3(C,CO₂H),174.0(C,PamCO₂),173.9(C,PamCO₂),156.1(C,FmocCO),143.7(C,Fmoc),141.3(C,Fmoc),127.8(CH,Fmoc),127.1(CH,Fmoc),125.2(CH,Fmoc),120.0(CH,Fmoc),72.4(CH,C-4),67.4(CH₂,FmocCH₂),64.0(CH₂,C-8),53.6(CH,C-1),47.1(CH,FmocCH),36.6(CH₂,C-3),34.6(CH₂,PamCH_2α烷基),34.5(CH₂,PamCH_2α烷基),34.4(CH₂,C-2),32.7(CH₂,C-5),32.0(2×CH₂,PamCH₂烷基),29.7-29.3(20×CH₂,PamCH₂烷基),28.3(CH₂,C-7),25.0(2×CH₂,PamCH_2β烷基),25.0(2×CH₂,PamCH_2β烷基),22.7(2×CH₂,PamCH₂烷基),21.7(CH₂,C-6),14.4(2×CH₃,PamCH₃烷基)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺958.6239C₅₆H₈₉NNaO₈S计算值958.6238.

7.1.3自烯烃814合成氨基酸共轭物820

A)自醇812合成烯烃814

步骤i

向6-庚炔-1-醇812(3.33毫升，26.75毫摩尔)在CH₂Cl₂(80毫升)中的室温搅拌溶液中，添加咪唑(1.76克，27.01毫摩尔)及第三丁基二甲基氯硅烷(4.07克，27.01毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。然后用Et₂O(100毫升)稀释混合物并用水(3×100毫升)及盐水(100毫升)洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过经由硅胶过滤纯化粗制品，得到无色液体炔烃813(5.68克，定量产率)。炔烃813不经表征便用于随后的合成步骤中。

步骤ii

向炔烃813(5.34克，25.18毫摩尔)在己烷(140毫升)中的室温搅拌溶液中添加喹啉(4.18毫升，35.26毫摩尔)及林德拉催化剂(0.53克)。将反应混合物连接到充满H₂的球形大烧瓶(1大气压)并且在室温下搅拌2小时。然后将混合物经由垫过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到无色液体标题化合物814(5.34克，定量产率)。

R_f 0.91(石油醚-EtOAc 9:1)；δ_H(400MHz；CDCl₃)5.81(1H,ddt,J＝17.0,10.3,6.7Hz,H-6),4.99(1H,dd,J＝17.0Hz,H_a-7)4.93(1H,dd,J＝10.1Hz,H_b-7),3.60(2H,t,J＝6.6Hz,H-1),2.05(2H,q,J＝7.0Hz,H-5),1.56-1.31(6H,m,H-2,H-3,H-4),0.89(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.05(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)139.1(CH,C-6),114.2(CH₂,C-7),63.2(CH₂,C-1),33.8(CH₂,C-5),33.7(CH₂,C-4),28.7(CH₂,C-3),26.0(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),25.3(CH₂,C-2),18.4(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告一致。

B)自醇815合成烯烃814

步骤i

向1,6-己二醇(815)(16.00克，135.39毫摩尔)在CH₂Cl₂(150毫升)中的室温搅拌溶液中，添加咪唑(9.22克，135.39毫摩尔)及第三丁基二甲基氯硅烷(20.41克，135.39毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌19小时。然后将混合物过滤，用H₂O(100毫升)及盐水(100毫升)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，4:1)纯化粗制品，得到无色液体标题化合物816(25.13克，80％)。醇816不经表征便用于随后的合成步骤中。

步骤ii

向醇816(4.90克，21.10毫摩尔)在CH₂Cl₂(11毫升)中的0℃搅拌溶液中添加二甲基亚砜(11.08毫升，154.05毫摩尔)、Et₃N(14.71毫升，105.52毫摩尔)及三氧化硫吡啶络合物(9.89克，63.31毫摩尔)。将反应混合物搅拌30分钟。然后将混合物用水(20毫升)淬灭并用EtOAc(2×50毫升)提取。将合并的有机提取物用水(50毫升)及盐水(50毫升)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到无色油标题化合物817(4.71克，97％)。醛817不经表征便用于随后合成步骤中。

步骤iii

向甲基三苯基溴化鏻(4.60克，12.89毫摩尔)在THF(30毫升)中的-78℃搅拌溶液中滴加正丁基锂(7.16毫升，1.8M，12.89毫摩尔)。将所得反应物升温至室温并且搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至-78℃并滴加在THF(6毫升)中的醛817(2.56克，11.21毫摩尔)。将反应混合物在-78℃下搅拌3小时且然后升温至室温，并再搅拌15小时。接着将混合物用饱和NH₄Cl水溶液(10毫升)淬灭并用EtOAc(3×70毫升)提取。将合并的有机提取物用水(2×50毫升)及盐水(50毫升)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，99:1)纯化粗制品，得到无色液体标题化合物814(2.50克，98％)。

C)自烯烃814合成氨基酸共轭物820

步骤i

向烯烃814(4.30克，18.40毫摩尔)在CH₂Cl₂(40毫升)中的室温搅拌溶液中添加mCPBA(4.46克，25.84毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌7小时。然后将混合物经由过滤，用Et₂O(60毫升)稀释，并用饱和NaHCO₃水溶液(3×100毫升)及盐水(100毫升)洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到无色液体标题化合物818(4.30克，96％)。

R_f 0.63(石油醚-EtOAc 9:1)；δ_H(400MHz；CDCl₃)3.60(2H,t,J＝6.5Hz,H-1),2.92-2.88(1H,m,H-6),2.74(1H,t,J＝4.5Hz,H-7),2.46(1H,dd,J＝5.0,2.8Hz,H-7),1.56-1.36(8H,m,H-2,H-3,H-4,H-5),(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.04(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)63.1(CH₂,C-1),52.3(CH,C-6),47.1(CH₂,C-7),32.8(CH₂,C-5),32.5(CH₂,C-2),26.0(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),25.8(CH₂,C-4),25.7(CH₂,C-3),18.4(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告一致。

Step ii

向外消旋环氧化物818(2.23克，9.13毫摩尔)、(R,R)-(+)-N,N’-双(3,5-二-第三丁基亚水杨基)-1,2-环己烷二氨基钴(II)(0.03克，0.05毫摩尔)及冰乙酸(0.01毫升，0.18毫摩尔)在THF(0.1毫升)中的0℃搅拌溶液中滴加水(0.09毫升)。将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后真空浓缩混合物。通过快速柱色谱(石油醚-EtOAc，9:1)纯化粗制品，得到黄色油标题化合物818a(1.09克，49％)。

R_f 0.63(石油醚-EtOAc 9:1)；[α]_D ^21.3+4.2(c 0.90，在CHCl₃中)；δ_H(400MHz；CDCl₃)3.60(2H,t,J＝6.5Hz,H-1),2.92-2.88(1H,m,H-6),2.74(1H,t,J＝4.5Hz,H-7),2.46(1H,dd,J＝5.0,2.8Hz,H-7),1.56-1.36(8H,m,H-2,H-3,H-4,H-5),(9H,s,SiC(CH₃)₃),0.04(6H,s,Si(CH₃)₂)；δ_C(100MHz；CDCl₃)63.1(CH₂,C-1),52.3(CH,C-6),47.1(CH₂,C-7),32.8(CH₂,C-5),32.5(CH₂,C-2),26.0(3×CH₃,SiC(CH₃)₃),25.8(CH₂,C-4),25.7(CH₂,C-3),18.4(C,SiC(CH₃)₃),-5.3(2×CH₃,Si(CH₃)₂).光谱资料与文献中所报告一致。

步骤iii

向二硫化物804(0.30克，0.375毫摩尔)在CH₂Cl₂(1毫升)中的0℃搅拌溶液中添加锌粉(0.20克，3.01毫摩尔)及新鲜制备的甲醇、浓氢氯酸与浓硫酸的混合物(100:7:1，1毫升)。将所得反应混合物在0℃下搅拌30分钟之后添加环氧化物818a(0.344克，1.13毫摩尔)。将反应混合物在70℃下搅拌17小时。然后将混合物用EtOAc(30毫升)稀释，经由垫过滤并用盐水(30毫升)洗涤。用EtOAc(3×30毫升)提取水层，并将合并的有机提取物经无水MgSO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，1:3)纯化粗制品，得到无色油标题化合物819(0.350克，88％)。

R_f 0.4(己烷-EtOAc 1:3)；[α]_D ^20.8-20.0(c 0.03在EtOAc中)；ν_max(纯净的)/cm^-13365,3933,1703,1514,1450,1369,1343,1248,1151,1046；δ_H(400MHz；MeOD)7.79(2H,d,J＝7.5Hz,FmocH),7.68(2H,d,J＝7.4Hz,FmocH),7.39(2H,t,J＝7.4Hz,FmocH),7.31(2H,t,J＝4.7Hz,FmocH),4.34(2H,d,J＝7.1Hz,FmocCH),4.28(1H,dd,J＝8.2,5.1Hz,H-1),4.23(1H,t,J＝7.0Hz,FmocCH₂),3.72-3.61(1H,m,H-4),3.57-3.79(2H,m,H-9),3.01(1H,dd,J＝13.8,5.0Hz,H-2),2.86(1H,dd,J＝13.7,8.3Hz,H-2),2.69(1H,dd,J＝13.4,4.9Hz,H-3),2.60(1H,dd,J＝13.4,7.0Hz,H-3),1.57-1.34(17H,m,H-5,H-6,H-7,H-8,C(CH₃)₃)；δ_C(100MHz；MeOD)171.8(C,CO₂tBu),158.1(C,FmocCO),145.3(C,Fmoc),142.6(C,Fmoc),128.8(CH,Fmoc),128.2(CH,Fmoc),126.4(CH,Fmoc),121.0(CH,Fmoc),83.3(C,C(CH₃)₃),71.9(CH,C-4),68.2(CH₂,FmocCH₂),62.9(CH₂,C-9),56.5(CH,C-1),50.2(CH,FmocCH),40.8(CH₂,C-3),37.3(CH₂,C-5),35.5(CH₂,C-2),33.6(CH₂,C-8),28.3(3×CH₃,C(CH₃)₃),26.9(CH₂,C-7),26.6(CH₂,C-6)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺552.2390C₂₉H₃₉NNaO₆S计算值552.2393.

步骤iv

向二醇819(0.168克，0.317毫摩尔)及棕榈酸(0.244克，0.951毫摩尔)在THF(4.6毫升)中的室温搅拌溶液中添加N,N’-二异丙基碳化二亚胺(0.191克毫升，1.269毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(0.016克，0.127毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌17小时。然后将混合物经由垫过滤，用EtOAc(30毫升)稀释，用1M柠檬酸(30毫升)及盐水(30毫升)洗涤并真空浓缩。然后将残余物再溶解于TFA(3毫升)中并于室温下搅拌45分钟。再次真空浓缩反应混合物。通过快速柱色谱(己烷-EtOAc，9:1→0:1)纯化粗制品，得到无色油标题化合物820(0.301克，定量产率)。

R_f 0.21(石油醚-EtOAc 1:1)；[α]_D ^20.8+7.5(c 0.24，在CHCl₃中)；ν_max(纯净的)/cm^-1 3319,2919,2851,1722,1521,1471,1450,1221,1055；δ_H(400MHz；CDCl₃)7.76(2H,d,J＝7.6Hz,FmocH),7.61(2H,d,J＝7.3Hz,FmocH),7.40(2H,t,J＝7.7Hz,FmocH),7.30(2H,td,J＝11.2,1.1Hz,FmocH),5.82,(1H,d,J＝7.7Hz,NH),5.00-4.94(1H,m,H-4),4.64(1H,dd,J＝12.3,5.6Hz,H-1),4.40(2H,d,J＝7.1Hz,FmocCH),4.24(1H,t,J＝7.1Hz,FmocCH₂),4.10-4.00(2H,m,H-9),3.14(1H,dd,J＝13.8,4.3Hz,H-2),3.04(1H,dd,J＝13.8,5.6Hz,H-2),2.76-2.67(2H,m H-3),2.31(2H,t,J＝7.6Hz,PamCH_2α烷基),2.28(2H,t,J＝7.6Hz,PamCH_2α烷基),1.65-1.56(8H,m,2×PamCH_2β烷基,H-8,H-5),1.39-1.18(52H,m,24×PamCH₂烷基,H-6,H-7),0.88(6H,t,J＝6.9Hz,2×PamCH₃烷基)；δ_C(100MHz；CDCl₃)174.4(C,CO₂H),156.1(C,FmocCO),143.7(C,Fmoc),141.3(C,Fmoc),127.8(CH,Fmoc),127.1(CH,Fmoc),125.2(CH,Fmoc),120.0(CH,Fmoc),72.4(CH,C-4),67.5(CH₂,FmocCH₂),64.2(CH₂,C-9),53.6(CH,C-1),47.1(CH,FmocCH),36.5(CH₂,C-3),34.6(CH₂,C-2),34.3(2×CH₂,PamCH_2α烷基),33.0(CH₂,C-5),31.9(2×CH₂,PamCH₂烷基)29.7-28.4(21×CH₂,PamCH₂烷基,C-8),25.5(CH₂,C-7),25.0(2×CH₂,PamCH_2β烷基),24.8(CH₂,C-6),22.7(2×CH₂,PamCH₂烷基),14.1(2×CH₃,PamCH₃烷基)；HRMS(ESI+)[M+Na]⁺972.6358C₅₇H₉₁NNaO₈S计算值972.6392.

8.实例8

这个实例展示Pam2Cys-SKKKK、homoPam2Cys-SKKKK及Pam3Cys-SKKKK的(R)-及(S)-构建体的TLR激动作用。

8.1方法

使用与本文实例(实例4及5)中所述方法类似的方法内部生产Pam2Cys-SKKKK、homoPam2Cys-SKKKK及Pam3Cys-SKKKK的对映纯差向异构(R)-及(S)-变体。此外，制备配对的SKKKK_-NH₂与SKKKK_-NAc激动剂组，旨在评估C端修饰对h-Pam-2-Cys及Pam-2-Cys的TLR激动作用的影响。制备的激动剂列于表4中。

通过按照与实例2的第2.1节中所述程序类似的程序经6-log₁₀稀释系列(10^-6M至10^-11M)在HEK-Blue^TM-mTLR2(图6A)及HEK-Blue^TM-hTLR2(图6B)细胞中研究表4中激动剂的TLR2激动作用。仅在10^-6及10^-9M下测试(R/S)-Pam-1-Cys-NH₂。数据以背景减除后三个复孔的+/-SD平均吸光度(635奈米)值表示，其中虚线代表仅用介质处理的孔中的吸光度。

表4.对映纯TLR激动剂

示意图7.表4中所提及Pam1Cys-、(R)-及(S)-Pam2Cys-、(R)-及(S)-Pam3Cys-以及(R)-及(S)-homoPam2Cys-的结构。

8.2结果

8.2.1 mTLR2 and hTLR2的构建体生物活性

Pam1Cys-SKKKK-NH₂在10^-6M下展现出对hTLR2的激动作用，但在10^-9M下无激动作用，并且在任何浓度下对mTLR2均无激动作用。相比之下，所有测试的Pam2Cys、homoPam2Cys及Pam3Cys构建体均对mTLR2及hTLR2二者表现出激动作用。通常，差向异构体及C端匹配的homoPam2Cys及Pam2Cys构建体在各稀释系列中表现出相当的激动作用强度及模式，且对于mTLR2及hTLR2二者而言为比差向异构体匹配的Pam3Cys显著更强效的激动剂(在比Pam3Cys低≥10-倍的浓度下引起NF_KB生成)。

8.2.2(R)-与(S)-立体化学结构的效果对比

在所有测试的构建体组中，对于mTLR2及hTLR2二者，配对的(R)-变体均表现出比(S)-变体更强效的激动作用。对于mTLR2及hTLR2二者，(R)-Pam3Cys均在比(S)-Pam3Cys低大约≥10-倍的浓度下维持NF_KB生成。对于mTLR2及hTLR2二者，(R)-homoPam2Cysz均在比(S)-homoPam2Cys低大约≥10-倍的浓度下维持NF_KB生成，不管是否进行了C端修饰。对于mTLR2及hTLR2二者，(R)-Pam2Cys均在比(S)-Pam2Cys低大约≥100-倍的浓度下维持NF_KB生产，不管是否进行了C端修饰。有趣的是，虽然(R)-homoPam2Cys与(R)-Pam2Cys在mTLR2及hTLR2二者中在log₁₀稀释系列中是相当的激动剂，但是在mTLR2及hTLR2中，(S)-homoPam2Cys均为比(S)-Pam2Cys强效的激动剂，在低大约≥10-100-倍的浓度下引起NF_KB的生成。(S)-Pam2Cys表现出与(S)-Pam3Cys类似的激动作用强度及模式。

8.2.3 C端–NH₂及-NAc的效果

当比较差向异构体匹配的具有C端–NH₂与C端–NAc的homoPam2Cys-SKKKK时，对于mTLR2或HTLR2均未观察到差异激动作用。当比较差向异构体匹配的具有C端–NH₂与C端–NAc的Pam2Cys-SKKKK时，对于hTLR2未观察到差异激动作用。当比较具有C端–NH₂与C端–NAc的(S)-Pam2Cys-SKKKK时，对于mTLR2未观察到差异激动作用。当针对mTLR2对(R)-Pam2Cys-SKKKK-NH₂与(R)-Pam2Cys-SKKKK-NAc进行比较时，仅在10^-10及10^-11M下观察到NK_KB生成。

9.实例9

如下面所述及所绘示使用6制备包含肽序列SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT[SEQ ID No:127]的本发明的共轭物821及822(示意图8)。

肽序列SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT(SEQ ID No:127)包含两个免疫原性肽表位(加下线的)，通过单个E联接，衍生自卵清蛋白(OVA)蛋白质(鸡蛋蛋白的主要构成成分)。OVA在小鼠等中用作模式抗原，因为肿瘤细胞能够被加工/转染而表达OVA。

表位的详细情况如下：

SIINFEKL:H-K2^b限制的(鼠类MHC I类)，被CD8⁺T细胞识别。OVA氨基酸257-264。

ISQAVHAAHAEINEAGR:I-Ad限制的(小鼠MHC II类)，被CD4⁺T细胞识别。OVA氨基酸323-339。

示意图8.(i)重复Fmoc-SPPS；(ii)(R)-或(S)-双棕榈酰化Fmoc-Cys-OH 6，PyBOP，柯林碱，DMF；(iii)20％哌啶/DMF；(iv)TFA/EDT/水

使用如前所述的标准重复Fmoc SPPS技术合成期望的肽序列。

偶合倒数第二个氨基酸残基后，然后使用在DMF中的PyBOP(苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷并鏻六氟磷酸盐)及柯林碱用氨基酸共轭物6的期望非对映异构体对所述结合树脂的肽链进行衍生化。氨基酸共轭物的偶合条件降低氨基酸的α-碳在活化时发生差向异构的趋势。将氨基酸共轭物(0.032毫摩尔)与PyBOP(0.033毫摩尔)合并，并且溶于DMF(0.25毫升)中。添加纯净的2,4,6-三甲基吡啶(0.05毫摩尔)。混合30秒后，将溶液转移到0.016毫摩尔的树脂，然后摇动90分钟，排干并洗涤(DMF)，得到823。

然后使用在DMF中的20％哌啶移除Fmoc基，得到824。

将肽824自树脂裂解，得到在指定位置具有R构型的肽共轭物821(示意图8)或者在指定位置具有S构型的肽共轭物822。在室温下将在1.5毫升含有2.5％(v/v)乙二醇及2.5％v/v水的三氟乙酸中的树脂(0.016毫摩尔)摇动2小时。然后将上清液经由烧结矿排入冷冻二乙醚(10毫升)中。然后再用1毫升TFA洗涤树脂，也将其添加至醚中。通过离心将沉淀的材料丸粒化并用醚(5毫升)洗涤丸粒一次，然后溶于1:1MeCN/水(+0.1％tfa)中并冻干。

使用Phenomenex Gemini C18(5μ，110埃)10x250毫米柱用溶析液A及溶析液B通过半制备HPLC来纯化821及822，溶析液A为水(+0.1％tfa)，溶析液B为MeCN(+0.1％tfa)。将粗制肽试样注入柱上后，产生以下梯度：经3分钟5％B至45％B，随后经16分钟45％B至65％B，流速为4毫升/分钟。收集自柱洗提出的期望的产物材料并冷冻干燥。

821:m/z(ESI)1191.5[M+4H⁺].HPLC分析：柱：Phenomenex Gemini C18(3μ,110埃,4.6x 150毫米)；溶析液A，水/0.1％TFA；溶析液B：MeCN/0.1％TFA；梯度：5-95％B，经30分钟@1毫升/分钟。保留时间：20.9分钟。

822:m/z(ESI)1191.5[M+4H⁺].HPLC分析：柱：Phenomenex Gemini C18(3μ,110埃,4.6x 150毫米)；溶析液A，水/0.1％TFA；溶析液B：MeCN/0.1％TFA；梯度：5-95％B，经30分钟@1毫升/分钟。保留时间：20.8分钟。

本发明的范围并不意欲仅限于上述实例。如所属领域的技术人员所理解，在不背离本发明的情形下可进行许多变动。

序列表

<110> 奥克兰联合服务有限公司

玛格丽特·安妮·布林布尔

彼得·罗德里克·邓巴

杰弗里·马丁·威廉斯

<120> 氨基酸及肽共轭物及共轭过程

<130> 849864

<150> AU 2016900701

<151> 2016-02-26

<160> 130

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4不存在或为一或多个亲水性氨基酸

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln

1 5 10 15

Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或来自1至10个亲水性氨基酸

<400> 2

Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp

1 5 10 15

Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25 30

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或来自1至4个亲水性氨基酸

<400> 3

Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln

1 5 10 15

Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25 30

<210> 4

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 4

Ser Lys Lys Lys Lys Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr

1 5 10 15

Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly

20 25 30

Leu

<210> 5

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 5

Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25

<210> 6

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4不存在或为一或多个亲水性氨基酸

<400> 6

Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp

1 5 10 15

Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His

20 25 30

Ile Tyr Glu Glu Ala

35

<210> 7

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或来自1至10个亲水性氨基酸

<400> 7

Xaa Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly

1 5 10 15

Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile

20 25 30

Tyr Glu Glu Ala

35

<210> 8

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或来自1至4个亲水性氨基酸

<400> 8

Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

20 25 30

Glu Glu Ala

35

<210> 9

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 9

Ser Lys Lys Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn

1 5 10 15

Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln

20 25 30

His Ile Tyr Glu Glu Ala

35

<210> 10

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 10

Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro

1 5 10 15

Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu

20 25 30

Ala

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4不存在或为一或多个亲水性氨基酸

<400> 11

Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser

1 5 10 15

Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25

<210> 12

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或来自1至10个亲水性氨基酸

<400> 12

Xaa Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25

<210> 13

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S或亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或来自1至4个亲水性氨基酸

<400> 13

Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 14

Ser Lys Lys Lys Lys Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln

1 5 10 15

Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25 30

<210> 15

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 15

Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly

1 5 10 15

Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25

<210> 16

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 16

Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln

1 5 10 15

Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

20 25 30

Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

35 40 45

Glu Glu Ala

50

<210> 17

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 17

Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp

1 5 10 15

Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro

20 25 30

Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu

35 40 45

Glu Ala

50

<210> 18

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 18

Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln

1 5 10 15

Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro

20 25 30

Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu

35 40 45

Ala

<210> 19

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 19

Ser Lys Lys Lys Lys Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr

1 5 10 15

Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly

20 25 30

Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile

35 40 45

Tyr Glu Glu Ala

50

<210> 20

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 20

Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala

35 40 45

<210> 21

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 21

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser

1 5 10 15

Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe

20 25 30

Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

35 40

<210> 22

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 22

Xaa Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser

1 5 10 15

Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu

20 25 30

Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

35

<210> 23

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 23

Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr

20 25 30

Ala Leu Ala Leu Leu Leu

35

<210> 24

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 24

Ser Lys Lys Lys Lys Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys

1 5 10 15

Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu

20 25 30

Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

35 40

<210> 25

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 25

Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser

1 5 10 15

Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu

20 25 30

Ala Leu Leu Leu

35

<210> 26

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 26

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg

20 25 30

Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

35 40

<210> 27

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 27

Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys

1 5 10 15

Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu

20 25 30

Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

35 40

<210> 28

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 28

Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser

1 5 10 15

Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe

20 25 30

Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

35 40

<210> 29

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 29

Ser Lys Lys Lys Lys Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu

1 5 10 15

Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala

20 25 30

Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

35 40 45

<210> 30

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 30

Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr

20 25 30

Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

35 40

<210> 31

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 31

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

20 25 30

<210> 32

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 32

Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys

1 5 10 15

Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

20 25

<210> 33

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 33

Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser

1 5 10 15

Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

20 25

<210> 34

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 34

Ser Lys Lys Lys Lys Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu

1 5 10 15

Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

20 25 30

<210> 35

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 35

Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

20 25

<210> 36

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 36

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu

1 5 10 15

Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu

20 25 30

Leu Leu Ala

35

<210> 37

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 37

Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser

1 5 10 15

Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Ala

<210> 38

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 38

Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys

1 5 10 15

Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Ala

<210> 39

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 39

Ser Lys Lys Lys Lys Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro

1 5 10 15

Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu

20 25 30

Leu Leu Leu Ala

35

<210> 40

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 40

Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu

1 5 10 15

Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

20 25 30

<210> 41

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 41

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu

1 5 10 15

Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro

20 25 30

Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu

35 40 45

Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile

50 55 60

<210> 42

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 42

Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp

1 5 10 15

Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu

20 25 30

Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu

35 40 45

Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile

50 55 60

<210> 43

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 43

Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr

1 5 10 15

Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser

20 25 30

Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

35 40 45

Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile

50 55

<210> 44

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 44

Ser Lys Lys Lys Lys Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu

1 5 10 15

Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys

20 25 30

Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala

35 40 45

Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile

50 55 60

<210> 45

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 45

Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val

1 5 10 15

Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile

20 25 30

Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

35 40 45

Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile

50 55

<210> 46

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 46

Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu

1 5 10 15

Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

20 25 30

Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

35 40 45

<210> 47

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 47

Xaa Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu

1 5 10 15

Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala

20 25 30

Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

35 40 45

<210> 48

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 48

Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg

20 25 30

Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

35 40 45

<210> 49

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 49

Ser Lys Lys Lys Lys Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val

1 5 10 15

Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu

20 25 30

Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser

35 40 45

Ala

<210> 50

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 50

Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser

1 5 10 15

Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe

20 25 30

Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

35 40

<210> 51

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 51

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu

1 5 10 15

Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly

20 25 30

Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val

35 40 45

Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu

50 55

<210> 52

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 52

Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly

20 25 30

Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu

35 40 45

Gln Leu Ser Pro Leu Leu

50

<210> 53

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 53

Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile

20 25 30

Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln

35 40 45

Leu Ser Pro Leu Leu

50

<210> 54

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 54

Ser Lys Lys Lys Lys Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys

20 25 30

Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala

35 40 45

Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu

50 55

<210> 55

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 55

Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala

1 5 10 15

Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe

20 25 30

Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser

35 40 45

Pro Leu Leu

50

<210> 56

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 56

Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys

1 5 10 15

Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr

20 25 30

Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe

35 40 45

Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala

50 55

<210> 57

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 57

Xaa Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser

1 5 10 15

Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val

20 25 30

Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu

35 40 45

Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala

50 55

<210> 58

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 58

Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser Leu

1 5 10 15

Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met

20 25 30

Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile

35 40 45

Phe Leu Ile Gly Phe Ala

50

<210> 59

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 59

Ser Lys Lys Lys Lys Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met

1 5 10 15

Cys Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu

20 25 30

Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly

35 40 45

Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala

50 55

<210> 60

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 60

Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser Leu Gly Gly

1 5 10 15

Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn

20 25 30

Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu

35 40 45

Ile Gly Phe Ala

50

<210> 61

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 61

Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro

1 5 10 15

Tyr Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr

20 25 30

Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly

35 40 45

Leu Pro Pro

50

<210> 62

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 62

Xaa Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr

1 5 10 15

Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln

20 25 30

Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

35 40 45

Pro Pro

50

<210> 63

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 63

Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr Trp

1 5 10 15

Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp

20 25 30

Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro

35 40 45

Pro

<210> 64

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 64

Ser Lys Lys Lys Lys Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp

1 5 10 15

Pro Tyr Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly

20 25 30

Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp

35 40 45

Gly Leu Pro Pro

50

<210> 65

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 65

Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr Trp Gly Asn

1 5 10 15

Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser

20 25 30

Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro

35 40 45

<210> 66

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 66

Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro

1 5 10 15

Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser

20 25 30

Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp

35 40 45

Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser

50 55

<210> 67

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 67

Xaa Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg

1 5 10 15

Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met

20 25 30

Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu

35 40 45

Ala Ala Ile Ala Ala Ser

50

<210> 68

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 68

Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp

1 5 10 15

Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn

20 25 30

Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala

35 40 45

Ala Ile Ala Ala Ser

50

<210> 69

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 69

Ser Lys Lys Lys Lys Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser

1 5 10 15

Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly

20 25 30

Ser Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe

35 40 45

Trp Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser

50 55

<210> 70

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 70

Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser

1 5 10 15

Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val

20 25 30

Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile

35 40 45

Ala Ala Ser

50

<210> 71

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 71

Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val

1 5 10 15

Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr

35 40 45

Pro Val Thr Val Leu Thr

50

<210> 72

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 72

Xaa Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser

1 5 10 15

Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala

20 25 30

Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro

35 40 45

Val Thr Val Leu Thr

50

<210> 73

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸

<400> 73

Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr

1 5 10 15

Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala

20 25 30

Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro Val

35 40 45

Thr Val Leu Thr

50

<210> 74

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 74

Ser Lys Lys Lys Lys Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser

1 5 10 15

Val Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu

35 40 45

Thr Pro Val Thr Val Leu Thr

50 55

<210> 75

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 75

Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr Val Val

1 5 10 15

Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala

20 25 30

Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val

35 40 45

Leu Thr

50

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 76

Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr

1 5 10

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 77

Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr

1 5

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 78

His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr

1 5

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 79

Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu

1 5

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 80

Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr

1 5 10

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 81

Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 82

Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu

1 5

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 83

Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu

1 5

<210> 84

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 84

Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly

1 5 10

<210> 85

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 85

Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 86

Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp

1 5

<210> 87

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 87

Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

1 5 10

<210> 88

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 88

Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr

1 5 10

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 89

Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro

1 5

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 90

Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg

1 5 10

<210> 91

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 91

Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

1 5 10

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 92

Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 93

His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly

1 5

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 94

Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr

1 5

<210> 95

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 95

Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile

1 5 10

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 96

Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 97

Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 98

Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val

1 5

<210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 99

Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu

1 5

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 100

Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu

1 5

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 101

Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu

1 5

<210> 102

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4不存在或为一或多个亲水性氨基酸

<400> 102

Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe

1 5 10 15

Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu

35 40

<210> 103

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或来自1至10个亲水性氨基酸

<400> 103

Xaa Xaa Xaa Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr

1 5 10 15

Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg

20 25 30

Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu

35 40

<210> 104

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或来自1至4个亲水性氨基酸

<400> 104

Xaa Xaa Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu

1 5 10 15

Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser

20 25 30

Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu

35 40

<210> 105

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 105

Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu

1 5 10 15

Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala

20 25 30

Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu

35 40

<210> 106

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 106

Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met

1 5 10 15

Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala

20 25 30

Gln Asp Ala Pro Pro Leu

35

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 107

Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met

1 5

<210> 108

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 108

Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu

1 5

<210> 109

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4不存在或为一或多个亲水性氨基酸

<400> 109

Xaa Xaa Xaa Xaa Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser

1 5 10 15

Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg

20 25 30

<210> 110

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或来自1至10个亲水性氨基酸

<400> 110

Xaa Xaa Xaa Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly

1 5 10 15

Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg

20 25

<210> 111

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或来自1至4个亲水性氨基酸

<400> 111

Xaa Xaa Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn

1 5 10 15

Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg

20 25

<210> 112

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 112

Ser Lys Lys Lys Lys Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val

1 5 10 15

Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg

20 25 30

<210> 113

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 113

Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg

20 25

<210> 114

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 114

Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu

1 5

<210> 115

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4不存在或为一或多个亲水性氨基酸

<400> 115

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln

1 5 10 15

Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg

20 25 30

<210> 116

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或来自1至10个亲水性氨基酸

<400> 116

Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys

1 5 10 15

Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg

20 25 30

<210> 117

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或来自1至4个亲水性氨基酸

<400> 117

Xaa Xaa Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe

1 5 10 15

Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg

20 25 30

<210> 118

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 118

Ser Lys Lys Lys Lys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr

1 5 10 15

Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg

20 25 30

Arg

<210> 119

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 119

Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro

1 5 10 15

Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg

20 25

<210> 120

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 120

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe

1 5 10

<210> 121

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 121

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys

1 5

<210> 122

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 122

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1 5

<210> 123

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 123

Cys Ser Lys Lys Lys Lys Asn Leu Val Pro Cys Val Ala Thr Val

1 5 10 15

<210> 124

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4不存在或为一或多个亲水性氨基酸

<400> 124

Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu

1 5 10 15

Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr

20 25 30

Glu Trp Thr

35

<210> 125

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或为亲水性氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3不存在或来自1至10个亲水性氨基酸

<400> 125

Xaa Xaa Xaa Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile

1 5 10 15

Asn Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu

20 25 30

Trp Thr

<210> 126

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1不存在或为S

<220>

<221> MISC_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2不存在或来自1至4个亲水性氨基酸

<400> 126

Xaa Xaa Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn

1 5 10 15

Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp

20 25 30

Thr

<210> 127

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 127

Ser Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala

1 5 10 15

Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

20 25 30

Thr Glu Trp Thr

35

<210> 128

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 128

Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala

1 5 10 15

Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr

20 25 30

<210> 129

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 129

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 130

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 130

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

Arg

Claims

1.一种式(I)的化合物，

其中

m及w分别独立地为0至7的整数且v为0至5的整数，

其限制条件为：

m、v与w的和至少为3；以及

m与w的和为0至7；

n为1或2；

R、R³及R⁸分别独立地为氢或C1-6脂族基；

R⁹为氢、C1-6脂族基、氨基保护基、L³–C(O)–或A²；

L¹及L²分别独立地选自C5-21脂族基或C4-20杂脂族基；

L³为C1-21脂族基或C2-20杂脂族基；

A²为氨基酸或肽；

或其医药上可接受的盐或溶剂合物。

2.如权利要求1所述的化合物，其中

R、R³及R⁸分别独立地为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基；

R⁹为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、氨基保护基、L³–C(O)或A²；

L¹及L²分别独立地选自C5-21烷基、C5-21烯基或C4-20杂烷基；

L³为C1-21烷基、C2-21烯基、C3-6环烷基或C2-20杂烷基；

A²为氨基酸或肽；

3.如权利要求1或2所述的化合物，其中Z¹及Z²分别独立地选自由–C(O)O–、–C(O)NR–及–C(O)S–组成的群组。

4.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述化合物为式(IA)的化合物：

5.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中v为0至3。

6.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中v为0。

7.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m及w分别独立地为0至5。

8.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m及w分别独立地为1至4。

9.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m与w的和为2至7。

10.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m与w的和为2至5。

11.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m与w的和为3。

12.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m为1至3。

13.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m为2。

14.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中w为1或2。

15.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中w为1。

16.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中n为1。

17.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中L¹及L²分别独立地为C5-21烷基。

18.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中L¹及L²分别独立地为C15直链烷基。

19.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中L³为甲基或C15直链烷基。

20.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中L³为甲基。

21.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述氨基保护基为第三丁氧羰基(Boc)或9-茀甲氧羰基(Fmoc)。

22.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R¹及R²在m的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢，较佳为氢。

23.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R³为C1-6烷基或氢，较佳为氢。

24.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R⁴及R⁵在w的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢，较佳为氢。

25.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R^x及R^y在v的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢，较佳为氢。

26.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R⁶及R⁷在n的每一情形下均分别独立地为C1-6烷基或氢，较佳为氢。

27.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R⁸独立地为C1-6烷基或氢，较佳为氢。

28.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R⁹为C1-6烷基、氢、氨基保护基、L³–C(O)或A²，较佳为氢、氨基保护基、L³–C(O)或A²。

29.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述化合物为式(IF)的化合物：

其中m为2至6的整数且其余变量为如前述权利要求中任一权利要求中所定义。

30.如权利要求29所述的化合物，其中所述化合物为式(IF-1)的化合物：

31.如权利要求1至28中任一权利要求所述的化合物，其中所述化合物为式(IB)的化合物：

其中

k为0至4的整数；且

R^a、R^b及R^c分别独立地为氢或C1-6脂族基。

32.如权利要求31所述的化合物，其中所述式(IB)的化合物为式(IC)的化合物：

33.如权利要求31或32所述的化合物，其中k为0至3。

34.如权利要求31至33中任一权利要求所述的化合物，其中k为0。

35.如权利要求31至34中任一权利要求所述的化合物，其中R^a、R^b及R^c分别独立地为氢、C1-6烷基或C3-6环烷基，较佳为氢。

36.如权利要求31至35中任一权利要求所述的化合物，其中R^a、R^b及R^c分别独立地选自氢或C1-6烷基，较佳为氢。

37.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述化合物为式(ID)的化合物：

38.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述式(I)的化合物具有式(IEE-3)：

39.如权利要求1至37中任一权利要求所述的化合物，其中所述式(I)的化合物具有式(IEE-4)：

40.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述式(I)的化合物具有式(IE)：

41.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中A¹为OH、OP¹、NH₂或NHP²且R⁹为氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、氨基保护基或L³–C(O)。

42.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中A¹为OH或OP¹，且R⁹为氢、氨基保护基、或L³–C(O)。

43.如权利要求1至40中任一权利要求所述的化合物，其中A¹及/或A²为氨基酸或肽。

44.如权利要求1至40及43中任一权利要求所述的化合物，其中所述肽包含表位。

45.如权利要求44所述的化合物，其中所述表位为肽表位。

46.如权利要求44或45所述的化合物，其中所述表位经由连接基偶合或结合。

47.如权利要求1至40及43至46中任一权利要求所述的化合物，其中与脂质部分共轭的所述肽共轭物的氨基酸为N端氨基酸残基。

48.如权利要求1至40及43至47中任一权利要求所述的化合物，其中A¹为丝氨酸或包含丝氨酸作为第一N端氨基酸残基的肽。

49.如权利要求1至40及43至48中任一权利要求所述的化合物，其中A¹及/或A²为包含增溶基的肽。

50.如权利要求49所述的化合物，其中所述增溶基包含在肽链中含有二或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。

51.如权利要求50所述的化合物，其中所述二或更多个亲水性氨基酸残基与所述丝氨酸残基相毗邻。

52.如权利要求1至40及43至51中任一权利要求所述的化合物，其中所述肽包含氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由8或更多个来自SEQ ID NO 1至121其中的任一者的氨基酸序列的连续氨基酸组成的群组。

53.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述可选取代基选自由卤素、CN、NO₂、OH、NH₂、NHR¹⁰、NR¹⁰R²⁰、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C(O)NH₂、C(O)NHR¹⁰、C(O)NR¹⁰R²⁰、SO₂R¹⁰、OR¹⁰、SR¹⁰、S(O)R¹⁰、C(O)R¹⁰及C1-6脂族基组成的群组；其中R¹⁰及R²⁰分别独立地为C1-6脂族基，例如C1-6烷基。

54.一种制备如前述权利要求中任一权利要求所述的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物的方法，所述方法包含使

包含碳碳双键的第一含脂质共轭配偶体，

包含碳碳双键的第二含脂质共轭配偶体，以及

包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体

55.如权利要求54所述的方法，其中所述第一含脂质共轭配偶体及所述第二含脂质共轭配偶体具有相同的结构。

56.如权利要求54或55所述的方法，其中所述方法包含使所述硫醇的硫原子共轭至所述第一含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子且然后使来自与所述硫醇共轭的碳碳双键的碳原子共轭至所述第二含脂质共轭配偶体的碳碳双键的碳原子。

57.如权利要求54至56中任一权利要求所述的方法，其中：

所述第一含脂质共轭配偶体为式(IIA)的化合物：

所述第二含脂质共轭配偶体为式(IIB)的化合物：

所述含氨基酸共轭配偶体包含式(III)的结构：

其中R^a、R^b、R^c、L¹、L²、Z¹、Z²、R¹、R²、R^x、R^y、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、A¹、k、v及n为如前述权利要求中任一权利要求中所定义。

58.如权利要求54至57中任一权利要求所述的方法，其中所述氨基酸或肽共轭物为式(IB)的化合物：

59.如权利要求54至58中任一权利要求所述的方法，所述含脂质共轭配偶体对于所述含氨基酸共轭配偶体为化学计量过量的。

60.如权利要求54至59中任一权利要求所述的方法，其中所述有效地使所述含脂质共轭配偶体共轭至所述含氨基酸共轭配偶体的条件包含通过热引发剂的热降解或光化学引发剂的光化学降解引发而产生一或多个自由基。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述热引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)或所述光引发剂为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)。

62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述自由基引发剂的光化学降解包含用紫外光辐照，所述紫外光较佳具有与天然存在的氨基酸的侧链兼容的频率，较佳约365奈米。

63.如权利要求54至62中任一权利要求所述的方法，其中所述反应在包含溶剂的液体介质中进行，其中所述溶剂包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)或其混合物。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述溶剂包括N-甲基吡咯烷酮。

65.如权利要求54至64中任一权利要求所述的方法，其中所述反应在一或多种添加剂的存在下进行，所述一或多种添加剂抑制副产物的形成及/或改善所述式(I)化合物的产率或向所述式(I)化合物的转化。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述一或多种添加剂为外源硫醇、酸、有机硅烷或其二或更多者的组合。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述外源硫醇为位阻硫醇，例如第三丁基硫醇。

68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述酸为强有机酸，例如三氟乙酸(TFA)。

69.如权利要求66至68中任一权利要求所述的方法，其中所述有机硅烷为三烷基硅烷，例如三异丙基硅烷(TIPS)。

70.如权利要求66至69中任一权利要求所述的方法，其中所述氨基酸共轭物或肽共轭物在所述反应后自所述反应介质中分离并视需要经纯化。

71.一种制备式(XV)的化合物的方法，所述方法包含使

式(XVI)的环氧化物：

式(III)的包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体：

其中

P¹⁰、P¹¹及P¹²分别独立地为保护基；

m为2至6的整数；以及

n、L¹、Z¹、R、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹及A¹为如前述权利要求中任一权利要求所述的式(I)的化合物中所定义；或其盐或溶剂合物。

72.如权利要求71所述的方法，其中X¹⁰为L¹–C(O)O–、OH或P¹⁰–O–；且X¹¹为L¹–C(O)O–、P¹⁰–O–或OH。

73.如权利要求71或72所述的方法，其中所述方法包含使所述环氧化物与含氨基酸共轭配偶体在酸的存在下反应。

74.如权利要求71至73中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含通过使式(XVII)的烯烃：

与氧化剂在有效地环氧化所述烯烃的条件下反应而提供所述环氧化物。

75.如权利要求71至73中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含通过使式(XVII-A)的化合物：

与碱在有效地进行环氧化的条件下反应而提供所述环氧化物，其中LG为离去基。

76.如权利要求71至75中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含通过一或多个额外合成步骤将所述式(XV)的化合物转化为根据前述权利要求中任一权利要求所述的式(IF)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物：

77.如权利要求76所述的方法，其中X¹¹为P¹⁰–O–或OH；且所述一或多个合成步骤包含酰化所述式(XV)的化合物以用L¹–C(O)–替代P¹⁰或X¹¹的羟基的氢原子；及/或酰化所述式(XV)的化合物以用L²–C(O)–替代与联接R³的碳结合的羟基的氢原子。

78.一种制备式(XX)的化合物的方法，所述方法包含使

式(XXI)的化合物：

式(III)的包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体：

在有效地使所述式(XXI)的化合物与所述含氨基酸共轭配偶体共轭并提供所述式(XX)的化合物的条件下反应：

其中

R^m及Rⁿ分别独立地为氢、C1-6烷基、芳基或杂芳基；

LG为离去基；

m及w分别独立地为0至7的整数且v为0至5的整数，

其限制条件为：

m、v及w的和至少为3；以及

m与w的和为0至7；以及

n、R^x、R^y、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹及A¹为如前述权利要求中任一权利要求所述的式(I)的化合物中所定义；或其盐或溶剂合物。

79.如权利要求78所述的方法，其中R^m及Rⁿ分别独立地选自氢、C1-6烷基或芳基。

80.如权利要求78或79所述的方法，其中R^m为氢、C1-6烷基或芳基；以及Rⁿ为C1-6烷基或芳基。

81.如权利要求78至80中任一权利要求所述的方法，其中m及v使得所述化合物包含5至7元环状缩醛。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述环状缩醛为6元环状缩醛。

83.如权利要求78至82中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含使所述式(XXI)的化合物与所述式(III)的含氨基酸共轭配偶体在碱的存在下反应。

84.如权利要求78至83中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含通过一或多个额外合成步骤将所述式(XX)的化合物转化为根据前述权利要求中任一权利要求所述的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其医药上可接受的盐或溶剂合物：

85.如权利要求84所述的方法，其中所述一或多个合成步骤包含移除所述式(XX)的化合物中的所述缩醛以提供式(XXIII-1)的化合物：

86.如权利要求84所述的方法，其中R^m为视需要经取代的芳基，例如苯基或经烷氧基取代的苯基，且所述方法包含移除所述式(XX)的化合物中的所述缩醛以提供式(XXIII-2)或(XXIII-3)的化合物：

87.如权利要求85所述的方法，其中所述一或多个合成步骤包含将所述式(XXIII-1)的化合物中与联接R¹及R²的碳结合的羟基转化为L¹-Z¹-，及/或将与联接R^x及R^y的碳结合的羟基转化为L²-Z²。

88.如权利要求86所述的方法，其中所述一或多个合成步骤包含

将所述式(XXIII-2)的化合物中与联接R^x及R^y的碳原子结合的羟基转化为L²-Z²-，移除所述R^mRⁿCH-基以提供羟基，并将所述羟基转化为L¹-Z¹；或

将所述式(XXIII-2)的化合物中与联接R^x及R^y的碳原子结合的羟基转化为L¹-Z¹-，移除所述R^mRⁿCH-基以提供羟基，并将所述羟基转化为L²-Z²-。

89.如权利要求87或88所述的方法，其中将所述羟基转化为L¹-Z¹-或L²-Z²-包含酰化以使L¹–C(O)–或L²–C(O)–替代所述羟基的氢原子。

90.如权利要求54至89中任一权利要求所述的方法，其中所述含氨基酸共轭配偶体为含肽共轭配偶体。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述含肽共轭配偶体包含表位。

92.如权利要求54至91中任一权利要求所述的方法，其中所述含氨基酸共轭配偶体由肽组成。

93.如权利要求54至92中任一权利要求所述的方法，其中所述含氨基酸共轭配偶体为包含15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少或者3个或更少的氨基酸残基的含肽共轭配偶体。

94.如权利要求54至89中任一权利要求所述的方法，其中所述含氨基酸共轭配偶体由氨基酸组成。

95.如权利要求54至94中任一权利要求所述的方法，所述含氨基酸共轭配偶体的C端由保护基保护及/或所述含氨基酸共轭配偶体的Nα-氨基由保护基保护。

96.如权利要求54至93及95中任一权利要求所述的方法，其中所述包含硫醇的氨基酸残基为N端氨基酸残基。

97.如权利要求54至96中任一权利要求所述的方法，其中所述硫醇为半胱氨酸残基的硫醇。

98.如权利要求54至97中任一权利要求所述的方法，其中所述包含硫醇的含氨基酸共轭配偶体中的R⁹为L³-C(O)-。

99.如权利要求54至70、76、77及84至98中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含使所述式(I)的氨基酸共轭物的氨基酸或所述式(I)的肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽的氨基酸以提供肽共轭物。

100.一种制备肽共轭物的方法，所述方法包含

提供如权利要求1至53中任一权利要求所述的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其盐或溶剂合物，以及

101.如权利要求99或100所述的方法，其中所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽的氨基酸以提供肽共轭物。

102.如权利要求99至101中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含将所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸偶合至氨基酸或肽以提供包含肽表位的肽共轭物。

103.如权利要求99至102中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含将表位偶合至所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸。

104.如权利要求100或101所述的方法，其中所述肽包含表位。

105.如权利要求91、103及104中任一权利要求所述的方法，其中所述表位为肽表位。

106.如权利要求105所述的方法，其中所述表位经由连接基偶合或结合。

107.如权利要求99至106中任一权利要求所述的方法，其中与所述脂质部分共轭的所述肽共轭物的氨基酸为N端氨基酸残基。

108.如权利要求54至70、76、77及84至107中任一权利要求所述的方法，其中所述方法还包含酰化与所述脂质部分共轭的所述氨基酸共轭物的氨基酸或所述肽共轭物的氨基酸残基的Nα-氨基。

109.如权利要求108所述的方法，其中所述氨基用例如乙酰等C2-20脂肪酸酰化。

110.如权利要求54至109中任一权利要求所述的方法，其中所述肽共轭物或含氨基酸共轭配偶体包含一或多个增溶基。

111.如权利要求110所述的方法，其中所述增溶基为在肽链中含有由二或更多个连续亲水性氨基酸残基组成的序列的氨基酸序列。

112.如权利要求54至110中任一权利要求所述的方法，其中所述肽共轭物或含氨基酸共轭配偶体包含毗邻与所述脂质部分共轭的氨基酸残基的丝氨酸残基。

113.一种通过如权利要求54至112中任一权利要求所述的方法制备的如权利要求1至53中任一权利要求所述的式(I)的氨基酸或肽共轭物或其盐或溶剂合物。

114.一种医药组合物，包含有效量的如权利要求1至53及113中任一权利要求所述的肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物以及医药上可接受的载剂。

115.如权利要求114所述的医药组合物，包含有效量的二或更多种如权利要求1至53及113中任一权利要求所述的肽共轭化合物。

116.一种在受试者中接种或引起免疫反应的方法，包含施予所述受试者有效量的一或多种如权利要求1至53及113中任一权利要求所述的肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物、或有效量的如权利要求114或115所述的医药组合物。

117.一种如权利要求1至53及113中任一权利要求所述的一或多种肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物或如权利要求114或115所述的医药组合物在制造用于在受试者中接种或引起免疫反应的药物中的用途。

118.一种如权利要求1至53及113中任一权利要求所述的一或多种肽共轭化合物或其医药上可接受的盐或溶剂合物或如权利要求114或115所述的医药组合物用于在受试者中进行接种或引起免疫反应的用途。

119.一种式(XV)的化合物：

其中

P¹⁰、P¹¹及P¹²分别独立地为保护基；

m为2至6的整数；且

n、L¹、Z¹、R、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹及A¹为如前述权利要求中任一权利要求所述的式(I)化合物中所定义；或其盐或溶剂合物。

120.一种式(XX)的化合物：

其中：

R^m及Rⁿ分别独立地为氢、C1-6烷基、芳基或杂芳基；m及w分别独立地为0至7的整数且v为0至5的整数，

其限制条件为：

m、v及w的和至少为3；以及

m与w的和为0至7；以及