CN108866174B

CN108866174B - 一种循环肿瘤dna低频突变的检测方法

Info

Publication number: CN108866174B
Application number: CN201711421739.XA
Authority: CN
Inventors: 刘青青; 谢文龙; 曾缘欢; 陈荣山; 李宇; 温恒斌; 肖辛野; 姚迅; 李奇渊; 李晓哲
Original assignee: Xiamen Genokon Medical Technology Co ltd
Current assignee: Xiamen Jiyuan Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2023-05-19
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: CN108866174A

Abstract

本发明公开了一种循环肿瘤DNA（以下简称ctDNA）低频突变的检测方法。该方法包括以下步骤：S1，从血浆中提取cfDNA；S2，对所提取的cfDNA进行末端修复和3’端加“A”；S3，对末端修复产物进行接头连接，该接头含有随机分子标签序列，同时含有用于区分不同样本的index序列；S4，对接头连接产物进行PCR扩增；S5，探针捕获目的文库；S6，通过illumina Miseq、illumina Nextseq、illumina Hiseq平台进行测序，并对下机数据进行分析。该方法适用于探针靶向捕获测序，能够降低下机数据重复率，去除PCR及测序过程中产生的错误，提高ctDNA检测灵敏度和特异性，降低假阳性率。

Description

一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法。

背景技术

cfDNA是指以单链或双链DNA或DNA蛋白复合物形式存在于血液、脑脊液中的一种胞外DNA。1948年，Mandel和Metais首次发现人体血液中存在游离DNA。在肿瘤患者体内，由肿瘤细胞坏死、凋亡后释放入血液中的游离DNA片段称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。ctDNA片段大小一般为160-180bp左右，半衰期为16min-2h不等。

由于ctDNA携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞DNA中出现，因此，ctDNA相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点，具有广泛前景。

虽然ctDNA检测技术具有很大潜力，但要将其广泛应用于临床还需克服诸多障碍。首先，血液中游离DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA，而ctDNA占总游离DNA比例较低，一般只有0.1%-10%。所以，低频突变位点检测是目前ctDNA检测技术遇到的一个瓶颈。其次，在高通量测序文库构建和探针捕获过程中要进行PCR反应，而PCR过程不可避免地会引入错配碱基，即使是高保真酶，其碱基错配率仍在10^-6左右，并且扩增循环数越多，错误率越高。此外，目前最常用的测序仪Hiseq和Nextseq在测序过程中产生的单碱基错误率在0.01%-1%之间。因此，PCR和测序过程中产生的错误会对低频ctDNA突变检测产生强烈的背景噪音，当模板突变频率低于0.1%时，很难区分模板突变和PCR或测序过程产生的错误，导致检测特异性降低。为了提高检测灵敏度和特异性，目前最常见的做法则是提高测序深度，但由于起始cfDNA模板量量少，在后续实验过程中需要增加扩增循环数，导致下机数据重复率过高，不仅浪费了数据量，增加了成本，检测限也并没有相应地成比例提高。

为了解决这一问题，学者们发明了一种cSMART检测技术，在每一条起始cfDNA模板3’端加上带有分子标签的测序接头，再针对特异性检测位点设计PCR下游引物，上游引物则为与测序接头相同的序列，通过多重PCR方法直接获得目的文库，在后续下机数据分析时可通过聚类分析除去PCR和测序过程中产生的错误，节约了数据量，并且使检测灵敏度达到0.03%。但该方法最大不足则在于其原理为多重PCR建库，因此只能对少量区域或位点进行检测，检测范围远远少于探针捕获测序技术。此外，目前通用的分子标签是由ATCG四种碱基随机组合而成，长度一般8-12bp，理论上四种碱基完全随机分布，但实际在引物合成过程中，由于四种碱基合成所需能量和合成效率不同，导致每个位置出现ATCG的频率并不完全一样。可能会出现连续多个相同碱基的情况，例如8个A或C，从而使实际得到的分子标签数量少于理论值。并且，连续多个相同的碱基还会增加测序错误的可能性，增加优势分子序列的比例。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法，旨在提高现有探针捕获测序法检测ctDNA低频突变的灵敏度和特异性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

本发明提供了一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法，该方法包括以下步骤：1）从血浆中提取cfDNA；2）对所提取的cfDNA进行末端修复和3’端加“A”；3）对末端修复产物进行接头连接，该接头含有随机分子标签序列，同时含有用于区分不同样本的index序列；4）对接头连接产物进行PCR扩增；5）探针捕获目的文库；6）通过illumina Miseq、illuminaNextseq、illumina Hiseq平台进行测序，并对下机数据进行分析。

上述接头序列包括下表1中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条序列。SEQ IDNO.1中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，位于Index2位置上，每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开，共14bp，由此可得到的随机分子标签总共有4¹⁰即1048576种，每一条原始游离DNA都将连接上带有不同随机分子标签的接头。SEQ ID NO.2中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，6个N代表由6bp碱基组成的index序列。

表1

名称	序列
		SEQ ID NO.1	CCACCGAGATCTACACNNANNTNNCNNGNNTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
SEQ ID NO.2	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCC

上述PCR扩增引物为下表2中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两条序列。

表2

名称	序列
		SEQ ID NO.3	AATGATACGGCGACCACCGAGATCT
SEQ ID NO.4	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT

上述文库构建步骤还需用到末端修复酶及其buffer，接头连接酶及其buffer，PCR高保真聚合酶和纯化磁珠。

上述探针为大于1kb的任意商业化探针或定制探针。

上述探针捕获试剂为NimbleGen或IDT探针捕获试剂。

上述探针捕获过程中使用的blocking oligo包括下表3中SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的两条序列，SEQ ID NO.6中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，与所用接头中index序列相同，合成SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列时，纯化方式均采用HPLA，且3’端均用Inverted dT修饰。

表3

名称	序列
		SEQ ID NO.5	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
SEQ ID NO.6	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

完成上述文库构建和探针捕获实验后，还应进行文库质检和qPCR文库定量，根据每个样本数据量要求，按比例进行混样，再用Illumina Miseq/Nextseq/Hiseq测序仪上机测序，测序仪参数设置时，Index2设置14bp，Index1设置6bp。

数据下机后，根据随机分子标签序列进行聚类分析，去除PCR及测序过程产生的错误数据，剩余的数据进行质控，再将质控合格的数据进行后续变异分析及注释。

上述聚类分析后的标签序列进行计数时，遵循以下原则：在同一标签中80%以上reads突变则计数，一个位点在所有标签中出现2次及其以上算作阳性位点。

与现有技术相比，本发明有以下进步和优势。

1、本发明采用携带随机分子标签的接头，通过后续对下机数据进行特殊分析，能够排除PCR及测序过程中产生的错误，提高真阳性率。同时，在无需增加测序深度的情况下，还能降低数据重复率，提高检测灵敏度和特异性。

2、本发明采用的分子标签接头，每隔两个随机碱基由A或T或C或G隔开，共14bp，总共有4¹⁰种标签，不会降低分子标签种类，又避免了连续碱基的出现。

3、目前现有的分子标签多设计在接头3’端，即与目的序列相连接位置，因此，在合成接头的两条序列3’端均需要添加分子标签，导致测序时浪费较多数据量。本发明采用的随机分子标签设计在Index2位置，相对而言，节约了数据量。

4、本发明适用于目前肿瘤基因检测中最常见的探针捕获测序，可针对目的区域设计不同大小的探针，适用范围广。

附图说明

图1示出了本发明所提供的携带随机分子标签的接头结构。

图2示出了本发明具体实施例中5例样本探针捕获后文库经Qsep生物分析仪检测的结果。

具体实施方式

下面将结合实例进一步说明本专利的有益效果。

实施例1

1、采集5例肺癌患者全血各10ml，采集管使用Streck Cell-Free DNA BCT®Blood Collection Tubes (10ml)，常温保存和运输，时间不超过72h。采用两步法分离血浆，先将全血1600g室温离心10min，取出约4.5ml上清于15ml离心管中，再16000g 4℃离心10min，取出约4ml上清，分装于1.5ml离心管中，冻存于-80℃。采用QIAamp @ ciculiatiqNucleic Acid KIT提取血浆cfDNA，最终用50ul EB buffer洗脱，样本名称及提取cfDNA浓度、质量信息如下表4。

表4

样本编号	浓度(ng/ul)	A260/280	总质量（ng）
				1	0.51	2.41	25.5
2	0.904	2.46	45.2
				3	2.1	2.45	105
4	0.86	2.08	43
				5	0.43	2.66	21.5

2、合成如上述表1所示的带有随机标签的接头，其中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开，共14bp。本实施例采用index序列均为6bp，5种带index序列接头如下表5中SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.11所示。合成的引物采用TE buffer溶解至浓度为100uM，再将SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.11分别按照等比例摩尔数混合，95℃加热5min，缓慢降温至室温完成退火。采用乙醇沉淀法将退火产物进行纯化，再用无酶水溶解至终浓度为30uM。

表5

名称	序列
		SEQ ID NO.1	CCACCGAGATCTACACNNANNTNNCNNGNNTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTT
SEQ ID NO.7	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTTCGATCTCGTATGCC
		SEQ ID NO.8	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGTACGATCTCGTATGCC
SEQ ID NO.9	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAGTGGATCTCGTATGCC
		SEQ ID NO.10	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTGATATCTCGTATGCC
SEQ ID NO.11	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTCCTATCTCGTATGCC

3、每个样本均按照下表6所示，在200ul低吸附管中配置末端修复反应液。

表6

End Repair Enzyme Mix	5ul
		End Repair Buffer (10X)	7ul
Water	8ul
		cfDNA	50ul

涡旋混匀，将管置于PCR仪上，20℃孵育30min。采用HighPrep™ PCR post PCRclean up system磁珠按照1.7X比例进行纯化。

4、每个样本均按照下表7所示，配置加A反应混合液。

表7

A-tailing Enzyme	3ul
		A-tailing Buffer (10X)	3ul
Water	42ul
		Beads with end-repaired DNA

涡旋混匀，将管置于PCR仪上，30℃孵育30min。加入90ul PEG/NaCl Solution，使磁珠比例为1.8X，进行纯化。

5、每个样本均按照下表8所示，配置接头连接反应液。

表8

DNA Ligase	5ul
		Ligation Buffer (5X)	10ul
Water	30ul
		Adaptor	5ul
Beads with A-tailedDNA

涡旋混匀，将管置于PCR仪上，20℃孵育15min。加入50ul PEG/NaCl Solution，使磁珠比例为1X，进行纯化。

6、再次加入50ul PEG/NaCl Solution，使磁珠比例为1X，进行第二次纯化，纯化完用20ul EB buffer进行洗脱。

7、每个样本按照表9所示，配置PCR反应液，其中，p5 Primer和p7 Primer分别是上述表2中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列。

表9

KAPA HiFi HotStart Ready Mix (2x)	25ul
		p5 Primer	2.5ul
p7 Primer	2.5ul
		Adapter-ligated library DNA	20ul

涡旋混匀，将管置于PCR仪上，设定如下反应程序。

加入50ul HighPrep™ PCR post PCR clean up system磁珠，按照1X比例进行纯化，最后用25ul无核酸酶水洗脱，采用nanodrop和Qubit检测文库浓度和纯度，每个样本文库信息如下表10所示。

表10

样本编号	浓度(ng/ul)	A260/280	A260/230	总质量（ng）
					1	22.3	1.90	1.56	446
2	18.4	1.87	1.62	368
					3	20.5	1.80	2.0	410
4	19.7	1.78	1.75	394
					5	25.3	1.83	1.69	506

8、将5个文库样本，每个取出200ng，共1000ng，混合于一低吸附1.5ml离心管中。向离心管中加入Cot-1 DNA 5μg，通用封闭引物10ul，其他各2ul，所用封闭引物序列如下表11所示，封闭引物合成后，用无核酸酶水稀释至终浓度100uM。

表11

名称	序列
		SEQ ID NO.5	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
SEQ ID NO.12	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTTCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
		SEQ ID NO.13	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGTACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
SEQ ID NO.14	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAGTGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
		SEQ ID NO.15	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
SEQ ID NO.16	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTCCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

将离心管置于浓缩仪中浓缩干燥，直至管内液体蒸干，60℃约30min。

9、向浓缩干燥完的离心管中加入下表12所示试剂。

表12

2X Hybridization Buffer	8.5ul
		Hybridization Buffer Enhancer	2.7ul
Nuclease-Free Water	1.8ul

室温孵育5-10min，将所有液体转移至一0.2ml低吸附离心管中，置于PCR仪上95℃孵育10min。将离心管从PCR上取出，立即加入4μl Probe pool，涡旋混匀，置于PCR仪上65℃过夜（12h），热盖温度75℃。其中，探针捕获肺癌靶向用药相关11基因外显子，由IDT公司合成。

10、用链霉亲和素磁珠纯化杂交产物，纯化步骤参照Dynabeads® M-270Streptavidin说明书进行。

11、按照下表13配置PCR反应体系。

表13

2X Hybridization Buffer	25ul
		p5 Primer	2.5ul
p7 Primer	2.5ul
		Beads with captured DNA	20ul

涡旋，短暂离心PCR管，保证beads在溶液中。将PCR管置于PCR仪上，设定以下程序，热盖温度105℃。

12、加入75ul HighPrep™ PCR post PCR clean up system磁珠，按照1.5X比例进行纯化，最后用25ul无核酸酶水洗脱。

13、文库定量和质检：采用nanodrop测定文库纯度，采用Qubit测定文库浓度，采用Qsep测定文库大小，文库片段分布如图2所示。

14、采用qPCR进行文库定量，采用Illumina Nextseq500测序仪进行测序，参数设置时，Index2设置14bp，Index1设置6bp，下机数据质控结果如下表14所示。

表14

样本编号	数据量	测序深度	覆盖度	捕获效率
					1	2804510450	10676	0.998970606	60%
2	2993484836	10811	0.998455909	62%
					3	2886476166	11286	0.998906269	62%
4	3239602652	12805	0.998656962	66%
					5	3145400156	11297	0.998978648	64%

15、将质控合格数据进行变异分析，在同一标签中80%以上reads突变则计数，一个位点在所有标签中出现2次及其以上算作阳性位点。将检出的突变位点用annovar进行注释，再比对数据库找到靶向用药相关位点，本实施例中5例样本检测结果如下表15所示。

表15

样本编号

变异基因

碱基改变

氨基酸改变

变异类型

变异丰度

COSMIC-ID

1

KRAS

NM_033360:exon2:c.G38A

p.G13D

错义突变

4.31%

COSM1140132

2

EGFR

NM_005228:exon21:c.T2573G

p.L858R

错义突变

19.68%

COSM6224

3

EGFR

NM_001346898:exon21:c.T2573G

p.L858R

错义突变

30%

COSM6224

4

NRAS

NM_002524:exon3:c.A183T

p.Q61H

错义突变

0.23%

COSM585

5

KRAS

NM_004985:exon2:c.G35A

p.G12D

错义突变

2.04%

COSM521

Claims

1.一种循环肿瘤DNA低频突变非诊断目的的检测方法，其特征在于：

所使用的接头由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条脱氧核苷酸序列退火而成；SEQ IDNO.1含有随机分子标签序列，该随机分子标签序列长14bp，序列为NNANNTNNCNNGNN，位于Index2位置上，其中，N表示ATCG四种碱基中任意一种，每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开；SEQ ID NO.2序列含有用于区分不同样本的index序列，该index序列长6bp，由ATCG四种碱基组成；

文库构建所用PCR扩增引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4两条脱氧核苷酸序列；

探针捕获过程中使用的blocking oligo为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6两条脱氧核苷酸序列，其中SEQ ID NO.6含有与接头序列相同的index序列，两条序列的3’端均用Inverted dT修饰。