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CN108823261A - 一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用 - Google Patents

一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用 Download PDF

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CN108823261A CN201810743725.8A CN201810743725A CN108823261A CN 108823261 A CN108823261 A CN 108823261A CN 201810743725 A CN201810743725 A CN 201810743725A CN 108823261 A CN108823261 A CN 108823261A
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Abstract

本发明属于石斛多糖制备的技术领域，公开了一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用。方法：(1)将活化后的塔宾曲霉菌菌种接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；(2)取种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中，调节发酵罐内料液pH为4.0～7.0，在25～35℃下发酵，获得发酵液；所述发酵培养基包含有破碎的铁皮石斛；(3)将发酵液灭活处理；(4)将灭活处理的发酵液纯化，浓缩，加入赋形剂，高压均质，干燥，得到铁皮石斛多糖。本发明的方法简单，安全，无污染，且多糖的得率高，纯度高；所获得石斛多糖中重均分子量小于10kDa的多糖占总多糖的98％以上，因此本发明所获的石斛多糖属于超低分子量的石斛多糖。

Description

一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用
技术领域
本发明属于石斛多糖制备的技术领域，具体涉及一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备方法与应用。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale kimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生型草本植物，富含石斛多糖、石斛碱、多酚、菲类、联节类、荀酮化合物、氨基酸以及微量元素等多种生物活性物，是我国传统的名贵中草药。根据植物化学及植物药理学研究发明，铁皮石斛主要的活性成分为石斛多糖，具有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、抗敏消炎、抗氧化、抗衰老以及补水保湿等功效。基于铁皮石斛多糖卓越的生物活性，目前已将石斛多糖作为化妆品原料使用。现在市面上多提供分子量(Mw)为700kDa～1000kDa的大分子石斛多糖，以及分子量(Mw)为100kDa～300kDa的小分子石斛多糖，而对于分子量小于10kDa的超低分子石斛多糖却尚未可见。大分子的石斛多糖不仅溶解度较低，不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体，且生物活性不明显。降低石斛多糖的分子量，可以改善石斛多糖的溶解度，降低粘度，有利于多糖分子在皮肤的渗透、吸收，还能增加其生物活性。
铁皮石斛中含有大量的果胶、纤维素等植物细胞壁结构，水提法对石斛多糖的提取率低，且多糖为大分子结构、提取液粘度大，存在提取液容易堵塞滤膜的问题，难以实现高效的工业化过滤操作。酶提法是近年来应用比较广泛的技术，它主要利用酶水解细胞壁，从而达到高效提取细胞壁内活性成分的目的，同时酶可以降解大分子多糖。常见的多糖降解酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶以及β-葡聚糖酶等，但这些酶均难以将2000kDa分子量的石斛多糖降解至10kDa的超低分子量多糖。
另外，铁皮石斛提取物中除了含有大量多糖外，还有较高含量的蛋白质，因此，对提取液的脱蛋白处理是提高多糖含量的又一关键步骤。目前现有技术中常用的提取物脱蛋白方法是Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法、盐酸法、氢氧化钠法等。但是酸碱法容易使多糖分子的部分糖苷键断裂，严重影响多糖的结构及活性。Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等方法使用大量有毒化学试剂，这些方法不可避免的存在有机溶剂残留的问题，不仅有害于人体健康，且具有安全隐患。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法。本发明利用塔宾曲霉及其次级代谢产物-生物酶对石斛多糖进行了生物转化，所获得产物纯度高，总糖含量高，超低分子量铁皮石斛多糖含量达到98％以上，即通过本发明的方法，石斛多糖的提取率高(蛋白及其它成分含量少)，超低分子量(重均分子量小于10kDa)的石斛多糖含量高。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的超低分子量铁皮石斛多糖。
本发明的再一目的在于提供上述超低分子量铁皮石斛多糖的应用。所述超低分子量石斛多糖在化妆品领域中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将活化后的塔宾曲霉菌菌种接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
(2)取步骤(1)的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中，调节发酵罐内料液pH为4.0～7.0，在25～35℃下发酵，获得发酵液；所述发酵培养基包含有破碎的铁皮石斛，即包含铁皮石斛破碎后的汁液和渣；
(3)将发酵液进行灭活处理；
(4)将灭活处理的发酵液进行纯化，浓缩，加入赋形剂进行高压均质，干燥，得到铁皮石斛多糖。
步骤(2)中所述调节发酵罐内料液pH是指利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液进行调节；步骤(2)中发酵时的转速为100～300r/min，发酵的时间为3～5d。
步骤(1)中所述塔宾曲霉菌为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)GYC 501。
步骤(1)中所述活化是指将塔宾曲霉菌菌种配成悬浮液，然后接种于固体培养基，活化培养，得到活化的塔宾曲霉菌菌种；所述固体培养基为PDA固体培养基(马铃薯培养基)或DRBC琼脂固体培养基；
所述PDA固体培养基的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200～300g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸30min)，利用100～500目滤布过滤残渣。在滤液中添加琼脂20～40g，葡萄糖20～40g，再补足水分至1L，120～130℃灭菌20～30min后贮存备用。
所述DRBC琼脂固体培养基的制备步骤为：3号月示胨5.0～10.0g、葡萄糖10.0～30.0g、KH2PO41.0～3.0g、氯硝胺0.002～0.01g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、虎红0.01～0.1g、琼脂15～30g，再补足水分至1L，120～130℃灭菌20～30min后贮存备用。
所述活化培养的条件为：于25～35℃下，培养36～72h。
活化的塔宾曲霉菌菌种的浓度为1×103～1×106CFU/mL。
步骤(1)中所述液体种子培养基为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基(DG18)、孟加拉红培养基(RB)或YES培养基。
所述沙氏液体培养基的配置方法是：将40.0～50.0g葡萄糖，10.0～30.0g蛋白胨溶解在人工海水中，并定容至1L，然后灭菌，备用。人工海水的配方为：NaCl 20～30g、MgSO4·7H2O 1.0～8.0g、CaCl2·2H2O 1.0～3.0g、KCl 0.5～1.0g、NaHCO3 0.2～1.0g、KBr0.1～0.5g、H3BO3 0.01～0.05mg，蒸馏水加至1L。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述高盐察氏培养基的配置方法是：NaCl 50～80g、AgNO3 1.0～5.0g、KH2PO41.0～3.0g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、KCl 0.5～1.0g、FeSO4 0.01～0.5g、蔗糖30～50g，蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述氯硝胺18％甘油培养基的配置方法是：蛋白胨5.0～10.0g、无水葡萄糖10.0～30.0g、KH2PO41.0～3.0g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、氯硝胺0.002～0.01g、氯霉素0.1～0.5g、甘油200～250g、蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述孟加拉红培养基的配置方法是：蛋白胨5.0～10.0g、葡萄糖10.0～20.0g、KH2PO41.0～3.0g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、氯霉素0.1～0.5g、1/3000孟加拉红溶液100～200ml，蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述YES培养基的配置方法是：酵母提取物1.0～5.0g、葡萄糖10～30g、NaCl 50～80g、CuSO4·5H2O 0.001～0.01g、ZnSO4 0.01～0.05g、氯硝胺0.002～0.02g、氯霉素0.1～0.5g，蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
步骤(1)中所述培养的条件为培养温度为25～35℃，转速为100～300r/min，培养时间为36～72h。
步骤(1)中所述种子液的浓度为1×106～1×1012CFU/mL。
对步骤(1)中得到的塔宾曲霉菌种子液进行分析，采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离塔宾曲霉菌的次级代谢产物-生物酶，利用凝胶色谱及液相质谱联用仪分析生物酶，发现生物酶主要为α-L-鼠李糖苷酶、α-淀粉酶、纤维素酶以及酸性蛋白酶。
步骤(2)中所述发酵培养基包含有破碎的铁皮石斛和液体培养基；铁皮石斛为发酵培养基质量的2％～5％；所述液体培养基为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基(DG18)、孟加拉红培养基(RB)或YES培养基。
步骤(2)中种子液的接种量为发酵培养基中液体培养基体积的1％～5％。
步骤(3)中所述灭活处理是指高温处理，灭活处理的温度为120～130℃，灭活处理的时间为20～30min；完成对微生物及酶的灭活处理。
步骤(4)中所述纯化是指将发酵液脱色处理，过滤去渣，过微滤膜，获得石斛多糖液；所述脱色处理是指采用硅藻土助滤剂、羧甲基可聚糖和/或脱色活性炭对发酵液进行脱色；硅藻土助滤剂的用量为发酵液质量的0.5～2％，羧甲基可聚糖的用量为发酵液质量的0.5～2％，脱色活性炭为发酵液质量0.5～2％；所述脱色处理的时间为2～3h；所述过滤去渣是指利用板框压滤机过滤去渣；所述过微滤膜是指将滤液依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去细小杂质。
步骤(4)中所述浓缩为减压浓缩；减压浓缩的条件为压强为-0.01～-0.15MPa，温度为40～60℃，浓缩时间为0.5～5h。
步骤(4)中所述赋形剂为麦芽糊精、淀粉和/或淀粉衍生物；淀粉包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、豌豆淀粉等。
步骤(4)中赋形剂与浓缩液的质量比为(1～3):100，浓缩液是指浓缩后的溶液。
步骤(4)中所述高压均质的条件为：压力为20～50MPa，温度为20～30℃，均质循环次数为5～10次。此条件能有效减少喷雾过程中石斛多糖的粘壁现象，提高喷雾干燥粉得率。
步骤(4)中所述干燥为喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风温度为130～180℃，进风压力为30～40Mpa，出风温度为60～80℃。
所述超低分子量铁皮石斛多糖通过上述制备方法得到。上述方法的多糖产物中总多糖含量高于98％。
所述超低分子量铁皮石斛多糖在食品、药品、保健品和/或化妆品的应用。所述超低分子量铁皮石斛多糖用于制备食品、药品、保健品和/或化妆品。
本发明的超低分子量铁皮石斛多糖，具有优异的透皮吸收、深层保湿及抗敏修复活性。
本发明制备的超低分子量石斛多糖，滤液中蛋白含量极少，简化了石斛多糖提取物的脱蛋白处理，满足安全无毒、绿色环保且条件温和的提取要求。
本发明相对于现有的植物提取技术具有如下的优点及功效：
(1)本发明利用微生物发酵技术，采用塔宾曲霉及其次生代谢产物实现了对高分子铁皮石斛多糖的降解，制备了一种纯度高的石斛多糖，且石斛多糖中重均分子量小于10kDa的多糖占总多糖的98％以上，因此本发明所获的石斛多糖属于超低分子量的石斛多糖；
(2)本发明提供的塔宾曲霉发酵方法制备的石斛多糖中含极微量蛋白质和粗脂肪，不需要再次进行脱脂、脱蛋白处理，简化实验工艺；
(3)本发明的超低分子量铁皮石斛多糖在化妆品中具有较好的应用效果：具有优异的透皮吸收效果以及深层保湿性能；
(4)本发明的多糖在制备过程不使用任何有机溶剂，卫生安全，无污染，且多糖的得率明显高于水热浸提法、超声提取及酶解法等提取方法。
附图说明
图1为实施例1～3和对比例1～3制备的铁皮石斛多糖的凝胶渗透色谱图；
图2为实施例1的超低分子量铁皮石斛多糖、对比例1的大分子量铁皮石斛多糖、阳性对照10％甘油水溶液、空白对照的保湿性测试结果图；
图3为不同分子量葡聚糖的标准曲线，以保留时间(T)为横坐标，标准品的相对分子质量对数(logM)为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线及GPC软件计算样品分子量(石斛多糖)；标准曲线：logM＝11.888-0.275T，R＝0.9555。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。实施例中采用的塔宾曲霉菌为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)GYC 501，该塔宾曲霉菌为已公开的菌株，可通过各种途径获得，如：武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M2014425。
本发明在菌株活化时，在固体培养基上接种的步骤为：移取1～10μL塔宾曲霉菌菌悬液在PDA固体培养基或DRBC琼脂固体培养基表面划线，然后活化培养。
实施例中PDA固体培养基的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸30min)，利用300目滤布过滤残渣，在滤液中添加琼脂20g，葡萄糖20g，再补足水分至1L，120℃灭菌20min冷却后贮存备用。
沙氏液体培养基的配置方法是：将40.0g葡萄糖，10.0g蛋白胨溶解在人工海水(人工海水配方：NaCl 20g、MgSO4·7H2O 1g、CaCl2·2H2O 1g、KCl 0.5g、NaHCO3 0.2g、KBr0.1g、H3BO3 0.01mg，蒸馏水加至1L)中，并定容至1L，然后在120℃灭菌20min后贮存备用。
所述氯硝胺18％甘油培养基的配置方法是：蛋白胨5.0g、无水葡萄糖10.0g、KH2PO41.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、氯硝胺0.002g、氯霉素0.1g、甘油200g、蒸馏水加至1L，在120℃灭菌20min后贮存备用。
实施例1
(1)菌株活化与扩培：将塔宾曲霉菌种溶于无菌水制成菌悬液，移取3μL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间48h，获得活化后的塔宾曲霉菌种(活化后浓度为1×104CFU/mL)；将活化后的塔宾曲霉菌种以1％接种量接种至含有沙氏液体培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，转速150r/min，培养48h后，得到塔宾曲霉菌发酵种子液，菌种的浓度为1×107CFU/mL；
(2)铁皮石斛原料处理：称取4kg新鲜铁皮石斛，粉碎机打碎，汁液连同渣一起投入100L发酵罐中，注入96kg沙氏液体培养基，使铁皮石斛的质量分数为4.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温；
(3)发酵培养：将1％(体积分数)塔宾曲霉菌发酵种子液加入含有4％铁皮石斛的沙氏液体培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为5.4，在30℃，转速150r/min下发酵3d，得到发酵液，将发酵液升温至120℃，保持30min，完成对微生物及生物酶的灭活处理；
(4)多糖纯化：待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量1.0％脱色活性炭，静置吸附2h后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去细小杂质，得到滤液87.5kg；
(5)多糖干燥：将滤液经过减压蒸发浓缩，压强为-0.10MPa，温度为50℃，浓缩至原有体积的1/10，获得石斛多糖浸膏9kg；向石斛多糖浸膏中添加麦芽糊精赋形剂，麦芽糊精与石斛多糖浸膏的质量比为1:100，分散均匀，利用高压均质机循环均质，均质压力为35MPa，温度为25℃，均质循环次数为10次，将均质后的产物进行喷雾干燥，进风温度为140℃，进风压力为40Mpa，出风温度为70℃，得到铁皮石斛多糖淡黄色粉末1.20kg，其中石斛总多糖纯度为98％。
实施例2
(1)菌株活化与扩培：将塔宾曲霉菌种溶于无菌水制成菌悬液，移取4μL菌悬液在DRBC琼脂培养基进行活化，培养温度28℃，培养时间60h，获得活化后的塔宾曲霉菌种(浓度为1.5×105CFU/mL)；将活化后的塔宾曲霉菌种以1％接种量接种至含有沙氏液体培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为28℃，转速170r/min，培养60h后，得到塔宾曲霉菌发酵种子液，菌种的浓度为1.0×108CFU/mL；
(2)铁皮石斛原料处理：称取5kg新鲜铁皮石斛，粉碎机打碎，汁液连同渣一起投入发酵罐中，注入95kg沙氏液体培养基，使铁皮石斛的质量分数为5.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温；
(3)发酵培养：将1％(体积分数)塔宾曲霉菌发酵种子液加入含有5％铁皮石斛的沙氏液体培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为5.5，在28℃，转速150r/min下发酵5d，得到发酵液，将发酵液升温至120℃，保持30min，完成对微生物及生物酶的灭活处理；
(4)多糖纯化：待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量1.0％硅藻土进行脱色处理，静置吸附2h后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去细小杂质，得到滤液89kg；
(5)多糖干燥：将滤液经过减压蒸发浓缩，压强为-0.15MPa，温度为47℃，浓缩至原有体积的1/10，获得浓缩液(石斛多糖浸膏为8.9kg)；向浓缩液中添加玉米淀粉赋形剂，玉米淀粉与浓缩液的质量比为1:100，利用高压均质机循环均质，均质压力为40MPa，温度为25℃，均质循环次数为8次，将均质后的产物进行喷雾干燥，进风温度为145℃，进风压力为40Mpa，出风温度为65℃，得到铁皮石斛多糖淡黄色粉末1.54kg，其中石斛总多糖纯度为99％。
实施例3
(1)菌株活化与扩培：将塔宾曲霉菌种溶于无菌水制成菌悬液，移取8μL菌悬液在DRBC琼脂培养基进行活化，培养温度32℃，培养时间36h，获得活化后的塔宾曲霉菌种(活化后浓度为8.5×105CFU/mL)；将活化后的塔宾曲霉菌株以1％接种量接种至含有氯硝胺18％甘油培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为32℃，转速200r/min，培养36h后得到塔宾曲霉菌发酵种子液，菌种的浓度为1.1×109CFU/mL；
(2)铁皮石斛原料处理：称取3kg新鲜铁皮石斛，粉碎机打碎，汁液连同渣一起投入发酵罐中，注入97kg氯硝胺18％甘油培养基，使铁皮石斛的质量分数为3.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温；
(3)发酵培养：将1％(体积分数)塔宾曲霉菌发酵种子液加入含有3％铁皮石斛的氯硝胺18％甘油培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.4，在32℃，转速200r/min下发酵3d，得到发酵液，将发酵液升温至120℃，保持30min，完成对微生物及生物酶的灭活处理；
(4)多糖纯化：待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量0.5％羧甲基壳聚糖进行脱色处理，静置吸附2h后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去细小杂质，得到滤液90kg；
(5)多糖干燥：将滤液经过减压蒸发浓缩，压强为-0.10MPa，温度为45℃，浓缩至原有体积的1/10，获得浓缩液(石斛多糖浸膏为9.1kg)；向浓缩液中添加马铃薯淀粉，马铃薯淀粉与浓缩液的质量比为1:100，利用高压均质机循环均质，均质压力为50MPa，温度为25℃，均质循环6次，将均质后的产物进行喷雾干燥，进风温度为143℃，进风压力为35Mpa，出风温度为60℃，得到铁皮石斛多糖淡黄色粉末0.92kg，其中石斛总多糖纯度为98.5％。
本发明制备的超低分子石斛多糖的含量测试方法参照《中国药典》苯酚-硫酸法；石斛多糖的分子量的测定方法是通过凝胶渗透色谱法进行测定，多糖的组分分析是利用高效液相色谱仪对酸解后多糖进行测定(具体方法参照不同生长年限铁皮石斛多糖含量与特性分析[J],食品科学,2018,39(06):189-193)。结果表明，本发明制备的超低分子量石斛多糖的重均分子量在10kDa，其主链均由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖构成。石斛多糖提取物中蛋白质含量的测定方法参照文献“考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量[J],粮食与食品工业,2010,17(3):57-59”。石斛多糖提取物中粗脂肪含量的测定方法参照国标方法GB/T 15674-2009“食用菌中粗脂肪含量的测定”。石斛多糖总糖的提取率计算方法参照国标GB/T 15672-2009“食用菌中总糖含量的测定”。
对比例分子量的测定
实验组为实施例1～3分别制备的超低分子量铁皮石斛多糖；
对照组1(即对比例1)的制备过程如下：利用粉碎机将1kg新鲜的铁皮石斛粉碎处理，分别加入样品重量50倍的纯水煎煮二次，每次提取2h，合并滤液；加入0.5％的活性炭，加热至80℃，搅拌1h，冷却至室温，600目滤布过滤，收集滤液；减压蒸发浓缩(真空度-0.10MPa，温度50℃，真空干燥5h)，将滤液浓缩至原有体积的1/10，喷雾干燥(进风温度140℃，进风压力40Mpa，出风温度70℃)得到石斛多糖样品0.38kg。
对照组2(即对比例2)的制备过程如下：利用粉碎机将1kg新鲜的铁皮石斛粉碎处理，加入重量比为1:20的pH 12.0的碱性电解水浸泡，85℃浸提4h，浸提两次后渣液分离，合并滤液；加入0.5％的活性炭，加热至80℃，搅拌1h，冷却至室温，600目滤布过滤，收集滤液，减压蒸发浓缩(真空度-0.10MPa，温度50℃，真空干燥5h)，将滤液浓缩至原有体积的1/10，喷雾干燥(进风温度140℃，进风压力40Mpa，出风温度70℃)，得到石斛多糖样品0.42kg。
对照组3(即对比例3)的制备过程如下：利用粉碎机将新鲜的铁皮石斛粉碎处理，加入重量30倍的纯水以及1％的复合酶(0.4％果胶酶+0.4％纤维素酶+0.2％漆酶),利用1mol/L的醋酸溶液调节pH值为6.0，保持温度为55℃酶解2h；加入0.5％的活性炭，加热至80℃，搅拌1h，冷却至室温，600目滤布过滤，收集滤液；减压蒸发浓缩(真空度-0.10MPa，温度50℃，真空干燥5h)，将滤液浓缩至原有体积的1/10，喷雾干燥(进风温度140℃，进风压力40Mpa，出风温度70℃)得到石斛多糖样品0.50kg。
石斛多糖的分子量测试结果如图1，分子量分布结果如表1所示。图1为实施例1～3和对比例1～3制备的铁皮石斛多糖的凝胶渗透色谱图。表1为实施例1～3和对比例1～3制备的铁皮石斛多糖分子量分布情况。
图3为不同分子量葡聚糖的标准曲线，以保留时间(T)为横坐标，标准品的相对分子质量对数(logM)为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线及GPC软件计算样品分子量(石斛多糖)；标准曲线：logM＝11.888-0.275T，R＝0.9555。
从图1和表1可知，实施例1、实施例2和实施例3得到的石斛多糖中重均分子量在10kDa以下的多糖均占99.0％以上；而对比例1得到的石斛多糖中重均分子量在10kDa以下的多糖仅占0.64％，其多糖分子量主要集中在1000kDa以上；对比例2得到的石斛多糖中重均分子量在10kDa以下的多糖仅占1.73％，其多糖分子量主要集中在500～1000kDa以上；对比例3得到的石斛多糖中重均分子量在10kDa以下的多糖仅占11.23％，其多糖分子量主要集中在100～500kDa以上。因此，利用本发明提供的微生物发酵法可以制备分子量小于10kDa的超低分子石斛多糖。
表1实施例1～3和对比例1～3制备的铁皮石斛多糖分子量的分布情况
粗脂肪含量、总糖含量和蛋白质含量的测定
实施例1～3制备的超低分子量石斛多糖粉末与对比例1～3制备的大分子量石斛多糖粉末中初脂肪含量、总糖含量和蛋白质含量进行测定。实验结果如表2所示。表2为实施例1～3和对比例1～3制备的铁皮石斛多糖中粗脂肪、蛋白质、总糖含量及其多糖提取率的情况。从表2可知，本发明使用的塔宾曲霉发酵方法制备的石斛多糖的含糖量高于对比例提取方法制备的石斛多糖；本发明的微生物发酵法对石斛多糖的提取率可以达到85％以上；此外，本发明方法制备的石斛多糖中含极微量蛋白质和粗脂肪，而对比例提取方法仍然含有少量的粗脂肪和蛋白质。因此，本发明方法对于提取超低分子量的铁皮石斛多糖具体显著的优势。
表2不同石斛多糖中粗脂肪、蛋白质、总糖含量及其多糖提取率
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
粗脂肪含量(％) 0.010 0.009 0.011 5.830 4.820 2.880
蛋白质含量(％) 0.020 0.030 0.030 2.10 2.30 1.93
总糖含量(％) 98.00 97.00 98.00 81.46 87.93 90.35
多糖提取率(％) 85.37 85.41 85.36 37.00 44.69 60.07
效果实施例
(1)保湿性
试验品如下：实施例1获得的超低分子量石斛多糖1.0％(w/w)水溶液，分子量低于10000；对比例1的大分子石斛多糖1.0％(w/w)水溶液，分子量为105万(占比百分比为90％)；以及阳性对照品，10％(w/w)的甘油水溶液；空白对照组。选择50名年龄在20～40岁的志愿者，男女各25名。分别在受试者左、右手内侧涂抹量为(2.0±0.1)mg/cm2的实施例1、对比例1、以及阳性对照品，时间间隔1h、2h、4h、6h进行皮肤水分含量的测试，使用德国CK公司生产的皮肤水份测量仪进行测试，实验结果如图2。图2为实施例1的超低分子量石斛多糖、对比例1的大分子量石斛多糖、阳性对照10％甘油水溶液、空白对照的保湿性测试结果图。
测试结果显示，相同浓度下(1.0％)，实施例1的超低分子量石斛多糖的保湿效果明显强于对比例1高分子量的铁皮石斛多糖；且1.0％超低分子量石斛多糖水溶液与阳性对照组(10％的甘油水溶液)在1～6h内保湿效果相当。
(2)经皮吸收测试
试验样品如下：实施例1～3制备的超低分子量石斛多糖1.0％(w/w)水溶液；对比例1制备的大分子石斛多糖1.0％水溶液，分子量为105万(百分比为90％)。根据国标GB/T27818～2011《化学品皮肤吸收体外试验方法》，检测在相同添加量下1～4h，通过1cm2小鼠皮肤模型的铁皮石斛多糖含量的百分比，实验结果如表3所示。
表3不同提取方法制备铁皮石斛多糖的经皮吸收测试结果
从表3的测试结果表明，实施例1～3的超低分子量石斛多糖与对比例1高分子石斛多糖相比，超低分子石斛多糖的皮肤渗透率远远高于大分子石斛多糖，在4h的经皮吸收后，通过皮肤的超低分子石斛多糖可以达到90％以上；而大分子量的石斛多糖难以经皮吸收，89％大分子石斛多糖仍保留在皮肤的表面。经皮吸收的实验说明，超低分子量的石斛多糖(分子量低于10000Da)更容易透过皮肤直到皮肤的真皮层，达到深层补水的效果。

Claims (10)

1.一种超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将活化后的塔宾曲霉菌菌种接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
(2)取步骤(1)的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中，调节发酵罐内料液pH为4.0～7.0，在25～35℃下发酵，获得发酵液；所述发酵培养基包含有破碎的铁皮石斛，即包含铁皮石斛破碎后的汁液和渣；
(3)将发酵液进行灭活处理；
(4)将灭活处理的发酵液进行纯化，浓缩，加入赋形剂进行高压均质，干燥，得到铁皮石斛多糖。
2.根据权利要求1所述超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述塔宾曲霉菌为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)GYC 501。
3.根据权利要求1所述超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述调节发酵罐内料液pH是指利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液进行调节；步骤(2)中发酵时的转速为100～300r/min，发酵的时间为3～5d。
4.根据权利要求1所述超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述培养的条件为培养温度为25～35℃，转速为100～300r/min，培养时间为36～72h；
步骤(2)中所述发酵培养基包含有破碎的铁皮石斛和液体培养基；铁皮石斛为发酵培养基质量的2％～5％。
5.根据权利要求4所述超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：所述液体培养基为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基。
6.根据权利要求1所述超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述活化是指将塔宾曲霉菌菌种配成悬浮液，然后接种于固体培养基，活化培养，得到活化的塔宾曲霉菌菌种；
步骤(4)中所述高压均质的条件为：压力为20～50MPa，温度为20～30℃，均质循环次数为5～10次。
7.根据权利要求6所述超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：所述固体培养基为PDA固体培养基或DRBC琼脂固体培养基；
所述活化培养的条件为：于25～35℃下，培养36～72h。
8.根据权利要求1所述超低分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述液体种子培养基为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基；
步骤(2)中种子液的接种量为发酵培养基中液体培养基体积的1％～5％；
步骤(3)中所述灭活处理是指高温处理；
步骤(4)中所述纯化是指将发酵液脱色处理，过滤去渣，过微滤膜，获得石斛多糖液；
步骤(4)中所述干燥为喷雾干燥。
9.一种由权利要求1～8任一项所述制备方法得到的超低分子量铁皮石斛多糖。
10.根据权利要求9所述超低分子量铁皮石斛多糖的应用，其特征在于：所述超低分子量铁皮石斛多糖用于制备食品、药品、保健品和/或化妆品。
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