CN108827903A - 太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器及制备和用途 - Google Patents
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Abstract
前本发明涉及一种太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器及制备和用途，属于生物技术领域。包括如下结构，柔性基底聚酰亚胺，柔性基底聚酰亚胺的上层设有金属层，金属层为位于下层的20nm厚的钛金属层和位于上层的200nm厚的金金属层，钛金属层在柔性基底聚酰亚胺上，金属层为一种双开口金属谐振环。本发明的优点在于，设计有非对称双开口金属谐振环实现电磁诱导透明共振峰，通过细胞培养在超构材料表面接种细胞，最后利用背透射式方法检测器件共振频率偏移，理论灵敏度高达455GHz/RIU，能快速无标记地初步探测癌细胞浓度并且得到口腔癌细胞HSC3在抗癌药物作用不同时间下的凋亡趋势。
Description
技术领域
本发明涉及一种太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器及制备和用途，属于生物技术领域。
背景技术
太赫兹技术目前在公共安全、通讯、以及生物医疗等方面的应用备受瞩目。而太赫兹超构材料可通过设计相应的单元几何结构实现可控的电磁响应,即人们只需要通过设计谐振结构就可以灵活地控制其电磁特性，这种特性在太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器等功能器件方面展现了巨大的应用前景，尤其是在生物样品的高灵敏传感识别方面。传统流式细胞技术能够对细胞浓度进行标记检测，但是测试时间长，成本高。
发明内容
本发明提供一种太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器、制备方法和测试癌细胞浓度及凋亡趋势方法，解决传统流式细胞标记检测技术存在的测试时间长，成本高问题和不足，实现检测过程时间短，检测成本低。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是，
太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器，结构如下，包括柔性基底聚酰亚胺，柔性基底聚酰亚胺设有处于上表面的金属层，柔性基底聚酰亚胺厚度为25um, 金属层在柔性基底聚酰亚胺设有处于上表面横向及竖向等距排列，金属层包括20nm厚的钛金属层和200nm厚的金金属层，金金属层处于钛金属层至之上，钛金属层接触柔性基底聚酰亚胺的上表面，金属层为非对称双开口金属谐振环, 双开口金属谐振环横竖向均布设置在柔性基底聚酰亚胺的上表面；
双开口金属谐振环的俯视形状为两相对的“弓”字形金属环结构，两“弓”字形金属环组成镂空的带有两缺口的“工”字形，缺口位于“工”字形的顶部边和底部边，两处缺口不在同一条纵向直线上，“弓”字形金属环线宽为3 µm。
作为优选，相邻双开口金属谐振环相距12um，双开口金属谐振环的长宽皆为44 µm，双开口金属谐振环结构中部的狭缝d距离为6um，双开口金属谐振环结构中部距离g 为4um，两缺口中心线的横向距离为28um。
太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的制备方法，包括以下制备步骤，
（1）在清洗后的Si基片上旋涂25 μm聚酰亚胺薄膜；
（2）将光刻胶AZ5214涂覆在所述聚酰亚胺膜上后烘干；
（3）利用光刻机对光刻胶进行曝光；
（4）对曝光后的光刻胶进行显影和烘干；
（5）在显影后的聚酰亚胺图形表面上利用磁控溅射沉积厚度为20nm钛和200nm金；
（6）将沉积有金属的Si基片在丙酮溶液浸泡10分钟，剥离剩下的光刻胶；
（7）去除基片：将沉积有金属的Si基片在氢氟酸中浸泡10分钟将基片和聚酰亚胺膜剥离。
作为优选，包括如下步骤，
1）首先清洗Si基片，Si基片的大小为 10mm ×10mm, 厚度为 500μm，分别用丙酮、酒精、超声清洗，时间各为15分钟，最后用去离子水冲洗3-5次，以去除表面的有机污染物使得基片抛光面洁净。
2）然后在清洗干净的硅片上旋涂粘度为3600（厘泊）聚酰亚胺溶液，把旋涂好的聚酰亚胺溶液放在真空干燥箱里面进行固化，固化过程是分别在温度为120℃、200℃和230℃时各烘烤1小时，然后在温度为250℃时再烘烤2小时，最后自然冷却至室温取出；
3）在聚酰亚胺薄膜上，旋涂1μm厚的反转光刻胶AZ5214，在95°C下前烘90秒；
4）在光刻机上放置涂好光刻胶的基片和制备好的掩模板并对准，将Si基片与掩模板贴紧，用光刻机上的显微镜观察，并调整好曝光时间，曝光时间为9.8秒，曝光4次，曝光完以后接着进行反转烘烤，在110°C下烘烤1分钟，然后反曝光45秒，最后利用显影液显影，时间为45秒，显影后进行后烘，烘烤温度为90℃，时间为10分钟；
5）在露出的聚酰亚胺膜上面磁控溅射方法沉积20nm厚的钛和200nm厚的金；
6）将上述蒸镀了金属层的Si基片放入丙酮溶液中进行剥离去除剩下的光刻胶AZ5214与所述光刻胶上的第一层金属，浸泡时间20分钟左右，然后用异丙醇及去离子水清洗；
7）把Si基片的聚酰亚胺薄膜浸泡在1:10的氢氟酸溶液中, 时间大约为10分钟，然后取出，把聚酰亚胺膜从硅基底剥离掉，在90℃的温度下固化10分钟左右。
根据权利要求5所述的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的制备方法，其特征是，步骤（2）中采用两次旋转涂聚酰亚胺溶液，得到厚度为25μm的聚酰亚胺膜，第一次涂完聚酰亚胺先在120℃和200℃时条件下分别烘烤1小时，然后接着第二次涂聚酰亚胺固化。
利用太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试癌细胞浓度及凋亡趋势方法，包括以下步骤，
1）首先将癌细胞接种在太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器中，用胰蛋白酶将癌细胞从培养皿消化下来；再用培养基吹匀细胞，形成单细胞悬液；将太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器灭菌后，置于培养板底部并把单细胞悬液接种至培养板中，放入37°C、5%浓度的二氧化碳细胞培养箱中培养；
2）将上述接种有癌细胞的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器放入太赫兹时域光谱测试仪中检测，太赫兹波束设置为从聚酰亚胺层入射，再从金属层射出的光路设置进行探测，得到透射波电磁响应特性；
3）在太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器上接种不同浓度的HSC3口腔癌细胞，并检测太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器共振频率相比于无细胞浓度下的共振频率偏移量，得到浓度检测曲线；
4）在培养有一定浓度的HSC3口腔癌细胞的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器中加入1 μM浓度的抗癌药物顺铂，在作用不同时间下检测太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器共振频率相比于无细胞浓度下的共振频率偏移量，得到口腔癌细胞凋亡曲线。
步骤3）中培养浓度为1×105cell/ml、4×105cell/ml及7×105cell/ml浓度的HSC3口腔癌细胞，培养24小时后从培养基中取出并用滤纸去除表面水分，待干燥充分后利用太赫兹时域光谱仪测试共振频率偏移量。
步骤4）中加入1 μM浓度的抗癌药物顺铂的HSC3口腔癌细胞的细胞浓度为2×106cell/ml，分别作用24，48以及72小时，后待作用时间完成后，从培养基中取出并用滤纸去除表面水分，待干燥充分后利用太赫兹时域光谱仪中测试共振频率偏移量。
本发明的优点在于，该结构的太赫兹癌细胞传感器相比以往结构，设计有非对称双开口金属谐振环实现电磁诱导透明共振峰，共振响应频率处损耗只与材料本身有关，通过细胞培养在超构材料表面接种细胞，最后利用背透射式方法检测器件共振频率偏移，理论灵敏度高达455GHz/RIU，能快速无标记地初步探测癌细胞浓度并且得到口腔癌细胞HSC3在抗癌药物作用不同时间下的凋亡趋势。
附图说明
图1为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的俯视结构示意图；
图2为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的立体结构示意图；
图3为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的显微镜照片，
图4为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的实物图；
图5为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的利用背透射式方法检测器件共振频率偏移的图示；
图6为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试的不同HSC3癌细胞浓度下的透射共振曲线；
图7是为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试的不同癌细胞浓度下的共振频率偏移量；
图8为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试的在一定细胞浓度条件下作用不同时间抗癌药物顺铂后的共振频率偏移量及生物CCK-8法测试的细胞存活率曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的使用范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器是一种非对称双开口金属谐振环，能够产生电磁诱导透明共振峰，通过细胞培养在其表面接种细胞，最后利用背透射式方法检测器件共振频率偏移来进行癌细胞的浓度测试。如图5所示。
本发明太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器具体来看是一种基于电磁诱导透明型Fano共振超构材料，利用其电磁响应的特性，电磁诱导透明峰位线型只与金属材料有关，因此任共振特性上的线型变化都可认为是外界物质造成的，传感器灵敏度较大。基于上述分析，我们设计了该基于柔性基底聚酰亚胺（PI）的太赫兹高灵敏癌细胞传感器，结构如图1所示，该传感器的整体结构包括2层，为上部的金属层和下部的介质层，聚酰亚胺作为柔性基底支撑上层金属结构。本专利申请要求保护的结构中，金属层结构是由两个弓字型双开口金属谐振环组合而成，如图1和图2所示。
双开口金属谐振环的俯视形状为两相对的“弓”字形金属环结构，两“弓”字形金属环组成镂空的带有两缺口的“工”字形，缺口位于“工”字形的顶部边和底部边，两处缺口不在同一条纵向直线上。
选择这种结构主要原因在于其形成的强辐射损耗（明模）与亚辐射损耗（暗模）能够发生相互干涉，反映在频谱上的共振响应会产生电磁诱导透明峰位，结构制作容易，灵敏度高。为确定该结构的具体参数，先用基于有限元时域差分算法的电磁场软件CST进行模拟仿真，x与y方向分别设置为电边界与磁边界，电磁场传输方向沿着z方向,最后根据传输特性确定具体参数。图1中聚酰亚胺的厚度10 µm，金属结构层包括厚度20nm的钛和厚度200nm的金。双开口金属谐振环中相关参数的分别为: p=50 μm，w=44 μm，t=25 μm，d=6 μm，g=4 μ m，s=28 μm。
太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的制备；
按照如图1和图2结构参数的太赫兹传感器结构参数进行实际制作，具体步骤过程如下：
（1）旋涂25μm厚聚酰亚胺膜
首先清洗硅衬底，硅片的大小为 10mm ×10mm, 厚度为 500μm，分别用丙酮、酒精、超声清洗，时间各为15分钟，最后用去离子水冲洗3-5次，以去除表面的有机污染物使得基片抛光面洁净。
（2）然后在清洗干净的硅片上旋涂粘度为3600（厘泊）聚酰亚胺溶液，为了得到厚度均匀的聚酰亚胺薄膜，把旋涂好的PI溶液放在真空干燥箱里面进行固化。固化过程是分别在温度为120℃，200℃和230℃时各烘烤1小时，然后在温度为250℃时再烘烤2小时，最后自然冷却至室温取出。采用多层重叠涂胶增加PI膜厚的办法，第一次涂完胶先在120℃和200℃时条件下分别烘烤1小时，然后接着涂胶固化，这样做的目的是避免膜厚之间有空气间隙。如果旋涂比较厚的PI薄膜，为了使溶液中水分全部挥发掉，可以烘烤时间响应长一些，这样固化好以后的薄膜性能比较稳定。
（3）旋涂反转光刻胶
在聚酰亚胺薄膜上，旋涂1μm厚的反转光刻胶AZ5214，在95°C下前烘90秒。
（4）紫外曝光与显影
在光刻机上放置涂好光刻胶的基片和制备好的掩模板（MASK）并对准，将基片与MASK贴紧，用光刻机上的显微镜观察，并调整好曝光时间，曝光时间为9.8秒，曝光4次。曝光完以后接着进行反转烘烤，在110°C下烘烤1分钟。然后反曝光45秒，最后利用显影液显影，时间为45秒，显影后进行后烘，烘烤温度为90℃，时间为10分钟。
（5）蒸一层金属与剥离
在露出的聚酰亚胺膜上面利用磁控溅射沉积20nm厚的钛和200nm厚的金。
（6）将蒸金属的样品浸泡在丙酮溶液中进行剥离去除剩下的光刻胶AZ5214与所述光刻胶上的第一层金属，浸泡时间20分钟左右即可。然后用异丙醇及去离子水清洗。
经过步骤（5）、（6），就可以得到一层金属结构。
（7）硅基底剥离
聚酰亚胺薄膜从硅基底上揭开的办法，把硅基底的聚酰亚胺薄膜浸泡在1:10的氢氟酸溶液中, 时间大约为10分钟，然后取出，小心把聚酰亚胺膜从硅基底剥离掉，在90℃的温度下固化10分钟左右。
经过以上程序，就可以得到如图3和图4所示的太赫兹超构材料无标记传感器，整个传感器大小为 10 mm×10 mm。该结构的太赫兹传感器相比以往结构，电磁响应信息单一，理论灵敏度高达455 GHz/RIU。
本发明设计的具有太赫兹超构材料无标记特性的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器最主要的应用方面是生物传感。利用本太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器进行癌细胞的浓度及凋亡趋势的测试，测试过程包括以下步骤。
1）首先将HSC3口腔癌细胞接种在太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器中，用胰蛋白酶将癌细胞从培养皿消化下来；再用培养基吹匀细胞，形成单细胞悬液；将太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器灭菌后，置于培养板底部并把单细胞悬液接种至培养板中，放入37°C、5%浓度的二氧化碳细胞培养箱中培养；
2）将上述接种有HSC3口腔癌细胞的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器放入太赫兹时域光谱测试仪中检测，太赫兹波束设置为从聚酰亚胺层入射，再从金属层射出的光路设置进行探测，得到透射波电磁响应特性，如图5所示。
3）在太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器上接种培养浓度为1×105cell/ml、4×105cell/ml及7×105cell/ml浓度的HSC3口腔癌细胞，培养24小时后从培养基中取出并用滤纸去除表面水分，待干燥充分后利用太赫兹时域光谱仪检测太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器共振频率相比于无细胞浓度下的共振频率偏移量，图7为在室温干燥（湿度小于4%）的氮气环境下，用太赫兹时域光谱仪器测量培养有HSC3口腔癌细胞的透射谱线。从图7可知，在3个不同浓度的癌细胞下，相比于无细胞的超构材料，其共振频率偏移量分别为50 GHz, 68 GHz, 90 GHz。图6为太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试的不同HSC3癌细胞浓度下的透射共振曲线。
4）在培养有细胞浓度为2×106cell/ml的HSC3口腔癌细胞的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器中加入1 μM浓度的抗癌药物顺铂，分别作用24，48以及72小时，待作用时间完成后，从培养基中取出并用滤纸去除表面水分，利用太赫兹时域光谱仪检测太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器共振频率相比于无细胞浓度下的共振频率偏移量和口腔癌细胞凋亡曲线。如图8为测试的共振频率偏移量及生物CCK-8法测试的细胞存活率曲线。作用不用抗癌药物浓度及作用不同时间所得的所得曲线的趋势与生物CCK-8试剂盒法所测的细胞存活率较为一致。
同时，我们还模拟了不同折射率参数的待测样品的测试结果，定义太赫兹传感器灵敏度为：Δf/Δn，这里，Δf为频率偏移量。通过计算，得到本发明的太赫兹传感器理论灵敏度达455 GHz/RIU。总之，我们在柔性聚酰亚胺基底上设计制作的具有太赫兹超构材料无标记特性的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器可以纯电场响应、灵敏度高、无标记检测。可以初步快速地对细胞浓度及在外加因素影响下细胞浓度发生的变化趋势进行无标记检测。因此，能够广泛应用于太赫兹生物传感及识别领域。
Claims (8)
1.一种太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器，其特征是，结构如下，包括柔性基底聚酰亚胺，柔性基底聚酰亚胺设有处于上表面的金属层，柔性基底聚酰亚胺厚度为25um,金属层在柔性基底聚酰亚胺上表面横向及竖向等距排列，金属层包括20nm厚的钛金属层和200nm厚的金金属层，金金属层处于钛金属层之上，钛金属层接触柔性基底聚酰亚胺的上表面，金属层为非对称双开口金属谐振环, 双开口金属谐振环横竖向均布设置在柔性基底聚酰亚胺的上表面；
双开口金属谐振环的俯视形状为两相对的“弓”字形金属环结构，两“弓”字形金属环组成镂空的带有两缺口的“工”字形，缺口位于“工”字形的顶部边和底部边，两处缺口不在同一条纵向直线上，“弓”字形金属环线宽为3 µm。
2.根据权利要求1中的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器，其特征是，相邻双开口金属谐振环相距12um，双开口金属谐振环的长宽w皆为44 µm，双开口金属谐振环结构中部的狭缝d距离为6um，双开口金属谐振环结构中部距离g 为4um，两缺口中心线的横向距离s为28um。
3.一种权利要求1所述的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的制备，其特征是，包括以下制备步骤，
（1）在清洗后的Si基片上旋涂25 μm聚酰亚胺薄膜；
（2）将光刻胶AZ5214涂覆在所述聚酰亚胺膜上后烘干；
（3）利用光刻机对光刻胶进行曝光；
（4）对曝光后的光刻胶进行显影和烘干；
（5）在显影后的聚酰亚胺图形表面上利用磁控溅射沉积厚度为20nm钛和200nm金；
（6）将沉积有金属的Si基片在丙酮溶液浸泡10分钟，剥离剩下的光刻胶；
（7）去除基片，将沉积有金属的Si基片在氢氟酸中浸泡10分钟将基片和聚酰亚胺膜剥离。
4.根据权利要求3所述的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的制备方法，其特征是，
1）首先清洗Si基片，Si基片的大小为 10mm ×10mm, 厚度为 500μm，分别用丙酮、酒精、超声清洗，时间各为15分钟，最后用去离子水冲洗3-5次，以去除表面的有机污染物使得基片抛光面洁净；
2）然后在清洗干净的硅片上旋涂粘度为3600（厘泊）聚酰亚胺溶液，把旋涂好的聚酰亚胺溶液放在真空干燥箱里面进行固化，固化过程是分别在温度为120℃、200℃和230℃时各烘烤1小时，然后在温度为250℃时再烘烤2小时，最后自然冷却至室温取出；
3）在聚酰亚胺薄膜上，旋涂1μm厚的反转光刻胶AZ5214，在95°C下前烘90秒；
4）在光刻机上放置涂好光刻胶的基片和制备好的掩模板并对准，将Si基片与掩模板贴紧，用光刻机上的显微镜观察，并调整好曝光时间，曝光时间为9.8秒，曝光4次，曝光完以后接着进行反转烘烤，在110°C下烘烤1分钟，然后反曝光45秒，最后利用显影液显影，时间为45秒，显影后进行后烘，烘烤温度为90℃，时间为10分钟；
5）在露出的聚酰亚胺膜上面磁控溅射方法沉积20nm厚的钛和200nm厚的金；
6）将上述蒸镀了金属层的Si基片放入丙酮溶液中进行剥离去除剩下的光刻胶AZ5214与所述光刻胶上的第一层金属，浸泡时间20分钟左右，然后用异丙醇及去离子水清洗；
7）把Si基片的聚酰亚胺薄膜浸泡在1:10的氢氟酸溶液中, 时间大约为10分钟，然后取出，把聚酰亚胺膜从硅基底剥离掉，在90℃的温度下固化10分钟左右。
5.根据权利要求4所述的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器的制备方法，其特征是，步骤（2）中采用两次旋转涂聚酰亚胺溶液，得到厚度为25μm的聚酰亚胺膜，第一次涂完聚酰亚胺先在120℃和200℃时条件下分别烘烤1小时，然后接着第二次涂聚酰亚胺固化。
6.一种利用权利要求1中的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试癌细胞浓度及凋亡趋势方法，其特征是，包括以下步骤，
1）首先将HSC3口腔癌细胞接种在太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器中，用胰蛋白酶将癌细胞从培养皿消化下来；再用培养基吹匀细胞，形成单细胞悬液；将太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器灭菌后，置于培养板底部并把单细胞悬液接种至培养板中，放入37°C、5%浓度的二氧化碳细胞培养箱中培养；
2）将上述接种有HSC3口腔癌细胞的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器放入太赫兹时域光谱测试仪中检测，太赫兹波束设置为从聚酰亚胺层入射，再从金属层射出的光路设置进行探测，得到透射波电磁响应特性；
3）在太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器上接种不同浓度的HSC3口腔癌细胞，并检测太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器共振频率相比于无细胞浓度下的共振频率偏移量，得到浓度检测曲线；
4）在培养有一定浓度的HSC3口腔癌细胞的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器中加入1 μM浓度的抗癌药物顺铂，在作用不同时间下检测太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器共振频率相比于无细胞浓度下的共振频率偏移量，得到口腔癌细胞凋亡曲线。
7.根据权利要求6所述的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试癌细胞浓度及凋亡趋势方法，其特征是，步骤3）中培养浓度为1×105cell/ml、4×105cell/ml及7×105cell/ml浓度的HSC3口腔癌细胞，培养24小时后从培养基中取出并用滤纸去除表面水分，待干燥充分后利用太赫兹时域光谱仪测试共振频率偏移量。
8.根据权利要求6所述的太赫兹非双各向异性超构材料无标记传感器测试癌细胞浓度及凋亡趋势方法，其特征是，步骤4）中加入1 μM浓度的抗癌药物顺铂的HSC3口腔癌细胞的细胞浓度为2×106cell/ml，分别作用24，48以及72小时，后待作用时间完成后，从培养基中取出并用滤纸去除表面水分，待干燥充分后利用太赫兹时域光谱仪中测试共振频率偏移量。
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