CN108795935B

CN108795935B - 日本血吸虫SjELAV-like 1基因的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN108795935B
Application number: CN201810498888.4A
Authority: CN
Inventors: 金亚美; 许蓉; 张媛媛; 李肖纯; 程桂凤; 何川川; 李�浩; 刘金明; 古少鹏
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN108795935A

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫SjELAV‑like 1基因的siRNA，所述siRNA为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本发明还公开了日本血吸虫SjELAV‑like 1基因的siRNA的应用。本发明日本血吸虫SjELAV‑like 1基因的siRNA，可明显抑制SjELAV‑like 1基因的转录，并能显著降低血吸虫感染小鼠的肝脏荷卵数和虫卵孵化率，对血吸虫体被结构造成了一定的损伤，并造成生殖细胞的形态异常，适用于制备治疗血吸虫病的药物。

Description

日本血吸虫SjELAV-like 1基因的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫SjELAV- like 1基因的 siRNA 及其应用。

背景技术

血吸虫病(Schistosomiasis)是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病，呈地方性流行；血吸虫性成熟雌虫产生的大量虫卵在动物肝脏中形成的肉芽肿是导致宿主损伤的根本原因，而大量虫卵排出体外又造成血吸虫病的传播和流行。目前，主要采用药物，例如吡喹酮，对已经感染血吸虫病的人或动物进行治疗，但是这些药物不能够防治血吸虫病的再次感染，因此，有必要寻找新的治疗血吸虫病的药物。此外，抗原伪装和抗原模拟是血吸虫免疫逃避的重要机制，这也是没有一种安全性高、特异性强的疫苗可以广泛应用于控制血吸虫病的原因，故研究有效的抗原靶点对血吸虫疫苗、药物靶标和诊断工具的开发方面具有潜在应用价值。

ELAV (embryonic lethal abnormal vision) -like 是一类家族基因，该家族成员最早在果蝇体内发现，因其有胚胎期致死及视觉异常表型而得名。该家族基因编码的RNA结合蛋白在基因的转录后调节中通过影响mRNA转运、定位和翻译，控制蛋白的时空表达，并调控RNA与蛋白质的结合及其相互作用，决定基因表达最终产物的类型和表达量，从而发挥不同的生物学功能。ELAV-like 1是该家族成员之一，在果蝇神经元中特异性表达，它通过转录后调控限制神经突触的生长发育，对神经系统的发育和维持有重要作用。在人类中与ELAV-like 1同源的基因HuR在各种细胞中广泛表达，通过与ARE(AU-rich element) 元件的结合调节mRNA的稳定性，它的异常表达会导致生长发育异常、自身免疫和肿瘤等疾病的发生。HuR对胚盘的形态学发生和血管形成以及胎儿的维持有重要作用，它的缺失导致胚胎致死型或胚胎发育异常。果蝇中与ELAV-like同源的RBP9不仅对神经元成熟有重要作用，还与卵母细胞的分化有关，RBP9突变导致卵子缺陷，引起雌性不孕。但是尚没有针对日本血吸虫中ELAV-like 1基因的深入研究。

RNA干扰（RNAi）是发生在mRNA水平上的一种基因沉寂现象，即将外源性双链RNA（dsRNA）引入细胞后可以引起细胞内与其同源的mRNA特异性降解，使该基因在RNA水平上被关闭而致其不表达，即转录后基因沉寂，从而产生相应的功能表型缺失。该技术目前已经在功能基因组学、基因治疗、微生物学研究和药物研发等领域里取得了令人瞩目的进展。小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs），是一种短片段双链RNA分子，通常由20个左右核苷酸组成，能够以同源互补序列mRNA为靶标并将其降解，从而介导特异性RNA干扰途径的进行，使转录后基因沉默。siRNA已经广泛应用于基因表达调控机制研究等领域。

发明内容

本发明人在分析日本血吸虫由单性感染而来的发育阻遏雌虫与由混合感染而来的正常发育雌虫转录组差异时发现，SjELAV-like 1在25d发育阻遏雌虫体内高表达，这可能预示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的影响，因而促使发明人进行进一步的研发，尤其是抑制日本血吸虫的ELAV-like 1基因是否能够有效的控制血吸虫病。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现: 在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫SjELAV-like 1基因的 siRNA，所述 dsRNA 为：

SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种治疗血吸虫病的药物，所述药物的活性成分为：通过 RNA 干扰抑制日本血吸虫SjELAV-like 1基因表达的 dsRNA。

所述 dsRNA 为：

SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫SjELAV-like 1基因的dsRNA 在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫SjELAV-like 1基因的dsRNA 在制备预防血吸虫病的疫苗中的应用。

本发明日本血吸虫SjELAV-like 1基因的 siRNA，可用于干扰日本血吸虫SjELAV- like 1基因转录、表达及血吸虫的生长发育，小鼠的体内 RNA 干扰实验表明，该 siRNA 能显著降低感染小鼠肝脏荷卵数和虫卵孵化率，适于制备治疗血吸虫病的药物。

附图说明

图 1 是本发明实施例 1 实时定量 PCR 分析各处理组SjELAV-like 1基因的转录结果图；

图 2 是本发明实施例 2 实时定量 PCR 分析各处理组SjELAV-like 1基因的转录结果图；

图 3 是本发明实施例2扫描电镜观察各处理组SjELAV-like 1基因干扰的结果图，a-d： S2 siRNA干扰组；e-f: 阴性对照组。a，e：抱雌沟起始部腹侧体壁；b，f：雄虫中段背侧体壁；c，g：雄虫后段体壁；d，h：雌虫中段体壁；

图 4 是本发明实施例2透射电镜观察各处理组SjELAV-like 1基因干扰的结果图，a-c： S2 siRNA干扰组；d-f: 阴性对照组。a，b，d，e：雄虫睾丸内精母细胞；c，f：雌虫卵黄腺内卵黄细胞；s：精母细胞；is：细胞间隙；vc：卵黄细胞；vg：卵黄球；vd：卵黄滴；n：细胞核；l：脂滴；cg：皮质颗粒；er：内质网。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译. 第 3 版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。

实施例 1 siRNA筛选

1.方法步骤

1.1 siRNA 分子和SjELAV-like 1基因实时定量 PCR 引物的准备

根据已提交至 NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的SjELAV-like 1（MG515727）基因序列，通过分析比较，设计并合成两对 dsRNA。同时，合成一对无关对照dsRNA（NC dsRNA）为：

sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’（SEQ ID NO.5），

Anti-sense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’（SEQ ID NO.6）；

两对日本血吸虫ELAV-like 1基因的 dsRNA 小分子为：

S1dsRNA：sense：5’- GCUAUACCUGUACGUAUUATT -3’（SEQ ID NO.1），

Anti-sense：5’- UAAUACGUACAGGUAUAGCTT -3’（SEQ ID NO.2），该第一对 siRNA针对的靶点序列是 648-664bp (UAUACCUGUACGUAUUA)；

S2dsRNA：sense：5’- GCGACAGUGAAUUUACCUUTT -3’（SEQ ID NO.3），

Anti-sense：5’- AAGGUAAAUUCACUGUCGCTT -3’（SEQ ID NO.4），该第二对 siRNA针对的靶点序列是1101-1117bp (GACAGUGAAUUUACCUU)。

1.2 体内筛选siRNA

9只BALB/c小鼠，分为3组，每组3只，40±5条尾蚴以腹部贴片法感染小鼠，于感染后22 d，分别于小鼠尾静脉注射1OD siRNA，阴性对照组注射1OD 无关siRNA，空白对照组注射等体积的PBS。体内干扰48h后，剖杀小鼠，肝门静脉灌注法冲虫并收集虫体。

1.3 体内siRNA 干扰效果的实时定量 PCR 验证。

以Trizol试剂盒提取各组虫体总RNA，消化基因组，反转录为cDNA，以之为模板，进行实时定量 PCR分析。

2. 结果

如图1所示，S2dsRNA分子显著地降低了SjELAV-like 1基因的转录水平，选取S1dsRNA 组小分子作为体内 RNA 干扰用小分子。NC 组和空白组相差不多。

实施例 2 小鼠体内干扰

1.方法步骤

1.1 siRNA体内长期干扰试验

1.1.1 siRNA长期干扰

8只BALB/c小鼠，分为2组，每组4只，按上述方法感染小鼠，于感染后14 d，选择最佳干扰效果的siRNA，以同样方法对小鼠进行干扰，每4 d干扰一次，共干扰7次，至41 d时收集虫体。

1.1.2 体内 RNA 干扰效果的实时定量 PCR 验证

以 Trizol 试剂盒提取各组虫体总 RNA，消化基因组，反转录为 cDNA，以之为模板，进行实时定量 PCR分析。

1.1.3 肝组织虫卵计数

收集肝脏并称重，肝组织中加入20mL PBS，用匀浆机混匀后，加入等体积10% NaOH（W/V），56℃水浴锅中消化2h，消化完全后混匀取5份50μL 样品，镜检计数虫卵，计算减卵率。

1.1.4 毛蚴计数

取4mL 肝脏匀浆液于平底烧瓶中，加入去氯水并用一薄层棉花覆盖，28℃孵化4h后收集棉花上层清液，转移至15mL 离心管中，加入1-2滴碘酊染液固定毛蚴，4000g离心5min，吸去上清，定容至2mL，混匀取5份100μL 样品，镜检计数尾蚴，计算减孵化率。

1.2 电镜试验

1.2.1 扫描电镜

将干扰试验中收集的雌、雄虫体用PBS洗涤后，4℃置于4%戊二醛中固定24h。固定好的标本经0.1 mol/L PBS漂洗3次（15min/次），1%锇酸固定染色2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次（15 min/次），30%、50%、70%、80%、90%系列浓度乙醇脱水分别20 min，100%乙醇脱水2次（20 min/次），真空干燥，用离子溅射仪喷金后，用JEOL JSM-6380LV电镜对虫体体壁作扫描电镜观察并拍照。

1.2.2 透射电镜

取上述固定后的雌、雄虫体，同样经PBS洗涤后，1%锇酸固定2h，依次在50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+90%丙酮（1：1）、90%丙酮、100%丙酮中脱水20 min，纯丙酮：包埋液按3：1、1：1和1：3，室温分别浸泡2h、4 h和37℃过夜；挑取虫体置入含包埋液的模具中，放入60℃烘箱内24h；包埋块于超薄切片机切片后，置于铜网上，用0.1 mol/L PBS清洗铜网6次，每次5 min，再用ddH₂O冲洗3次，每次5 min；在铜网上加入醋酸铀溶液，染色3 min，再加入混合铅溶液，染色1 min；同样方法清洗铜网，置于烘箱中干燥；在电镜下找出铜网上切片的位置，观察并拍照。

2．结果与分析

2.1 体内 RNA 干扰效果的实时定量PCR分析

如图 2 所示，对照组和处理组小鼠虫体实时定量PCR分析表明处理组SjELAV- like 1基因的转录水平显著降低，而注射无关 dsRNA 分子的对照组未见影响。

2.2 RNA 干扰后对肝脏荷卵数和卵孵化率的影响

BALB/c 小鼠于感染日本血吸虫尾蚴14d尾静脉注射 dsRNA，41d剖杀小鼠，收集小鼠肝脏，称重，虫卵计数，26-27 ℃孵化2 h，计数毛蚴数。计算 RNA 干扰后的减卵率和减孵化率，结果表明 RNA 干扰后处理组的减卵率和卵孵化率较对照组明显降低，减卵率达58.27%，每条雌虫减卵率达40.59%，减孵化率达74.58%，说明 RNA 干扰对日本血吸虫的产卵和卵的孵化有较大的影响（见下表 1）。

表1 siRNA干扰效果评估

显著性差异：*为P＜0.05，**为P＜0.01。

Significant difference：*（P＜0.05），**（P＜0.01）。

2.3 RNA干扰对虫体体被和生殖细胞的影响

2.3.1 SEM观察结果

小鼠体内干扰后，收集各组虫体，利用扫描电镜观察干扰对虫体形态学的影响，结果发现，S2干扰组（图3 a-d）与NC对照组（图3 e-h）相比，虫体结构发生了明显的变化。正常血吸虫雄虫的抱雌沟起始部腹侧由突起的褶脊和凹陷组成，其上分布有许多小的泡状物，呈细颗粒状，而干扰后，血吸虫突起的褶脊塌陷，稍有萎缩，凹陷不明显，失去立体结构，呈现扁平状，表面失去小颗粒泡状物（图3 a，e）；正常雄虫的抱雌沟中段背侧体壁表面平整无褶嵴，条索状皮嵴紧密联结，排列整齐，其中有半圆形感觉乳突存在，而干扰后，血吸虫条索状皮嵴间隙增大，表面呈不规律的凹凸状（图3 b，f）；正常雄虫的后段体壁表面无褶嵴，布满凹陷，其中分布有蒂乳突，排列成网格状，而干扰后，虫体体壁突起肿胀变平，排列不规则，有部分融合，大部分网格状结构消失（图3 c，g）；正常血吸虫雌虫中段体壁表面几乎无褶脊，其中分布有小而短的体棘，而干扰组雌虫表皮间隙稍有增大，表面体棘变少变钝（图3d，h）。

2.3.2 TEM观察结果

将干扰后收集的一部分虫体用于观察雌、雄虫体的生殖细胞，透射电镜下观察发现，S2干扰组（图4 a-c）与NC对照组（图4 d-f）相比，雌、雄虫体的生殖细胞明显发生了改变。正常雄虫睾丸内有排列整齐紧密的精母细胞（s），呈规则的圆形或椭圆形，S2干扰后，其精母细胞数目减少，细胞间隙（is）增大（图4 a，d），且细胞肿大呈不规则的长椭圆形或梭形（图4 b，e）；正常雌虫卵黄腺内有卵黄细胞（vc），成熟卵黄细胞内含有卵黄滴（vd）、卵黄球（vg）和脂滴（l），卵黄滴包含于卵黄球内，数目较多，呈大小均一的卵圆形，内质网（er）结构清晰，有规律的分布于细胞间质，皮质颗粒（cg）排列整齐，而干扰后的卵黄腺细胞，卵黄球数目减少，其包含的卵黄滴较少，且大小不一，形状不规则，内质网明显肿胀，界限模糊，且皮质颗粒在细胞内分布不规律（图4 c，f）。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 日本血吸虫 SjELAV-like 1 基因的 siRNA 及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<400> 1

GCUAUACCUGUACGUAUUATT 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<400> 2

UAAUACGUACAGGUAUAGCTT 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<400> 3

GCGACAGUGAAUUUACCUUTT 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<400> 4

AAGGUAAAUUCACUGUCGCTT 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<400> 5

UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<400> 6

ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21

Claims

1.一种治疗日本血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为：日本血吸虫SjELAV-like 1基因的siRNA或用于抑制日本血吸虫SjELAV-like 1基因的 dsRNA，其中，所述siRNA针对下述的靶点：

靶点序列是1101-1117bp，即GACAGUGAAUUUACCUU；

所述dsRNA的有义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

2.如权利要求1所述的治疗日本血吸虫病的药物，其特征在于，所述siRNA的序列为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

3.日本血吸虫SjELAV-like 1基因的siRNA在制备治疗日本血吸虫病的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA针对下述的靶点：

靶点序列是1101-1117bp，即GACAGUGAAUUUACCUU。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

5.用于抑制日本血吸虫SjELAV-like 1基因的 dsRNA制备治疗日本血吸虫病的药物中的应用，其特征在于，所述dsRNA的有义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。