CN108779426A - 用于罕见细胞和无细胞分子的质量标签分析 - Google Patents

Abstract

本发明大体上涉及用于罕见细胞和无细胞分子的质量标签分析。在某些实施例中，本发明提供了一种设备，其包含具有至少一个孔隙的基本上无吸收性的膜、可操作地与该基本上无吸收性的膜缔合的微孔和电场发生器。该设备能够被配置成使得由该电场发生器产生的电场可操作地与该微孔中的样品相互作用并且通过该基本上无吸收性的膜中的该至少一个孔隙排出该样品的小滴。在某些实施例中，本发明的设备用于检测并且任选地定量来自非均质样品的目标分析物，例如来自生物样品的罕见目标分析物(例如罕见细胞)。

Description

用于罕见细胞和无细胞分子的质量标签分析

相关申请

本申请要求2015年9月24日提出的美国临时申请第62/222,940号的权益和优先权，该临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体上涉及用于罕见细胞和无细胞分子的质量标签分析。

背景技术

细胞分析在例如诊断许多疾病等医疗应用中具有重要意义。同样希望检测细胞所结合或细胞中所包含的罕见分子。细胞分析的医疗应用需要分离所关注的某些细胞，这些细胞通常仅仅代表进行分析的样品的一小部分。举例来说，循环肿瘤细胞(circulatingtumor cell，“CTC”)在诊断转移性癌症中尤其受关注。在常规方法中，通过首先通过溶解来去除红细胞(red blood cell，RBC)，从而将CTC从全血中分离。在10mL血液样品中，几百个CTC将与约800,000,000个白血细胞(white blood cell，“WBC”)分离。因此，需要具有高分离效率和细胞回收率的方法。

然而，现有的技术检测来自样品的罕见分子的效率低。举例来说，罕见分子的检测无法通过常规亲和力测定来实现，常规亲和力测定需要大量分子拷贝，远远超过发现的罕见分子数目。罕见分子的检测能够通过常规核酸测定来实现。然而，目标核酸必须经历一个或多个冗长的纯化步骤和扩增，分析时间可能耗费若干天。

使用多孔基质分离罕见细胞的细胞过滤是一种适用于通过大小来分选细胞的方法，并且在大多数情况下，这类过滤方法允许在分离后提取细胞。然而，现有的过滤方法受某些因素限制，这些因素包含例如体外细胞具有直径范围，而非单个直径。另外，细胞过滤技术只产生少数的罕见细胞。在以下情况下罕见分子的拷贝数目可能是显著的：对于蛋白质来说，每个细胞仅数万个拷贝；或对于基因突变来说，每个细胞有几个拷贝。

可以通过常规扫描显微法，降到单细胞水平来分析罕见细胞。然而，即使扫描和分析自动化，显微法可能要耗费24小时或更长时间对每个样品进行扫描。另外，所有具有多个影像的罕见细胞都必须由病理学家目测检查，以确定所测量的蛋白质量的显著性。

质谱分析(MS)具有若干问题，使得MS无法与常规亲和力反应系统竞争。所提到的问题如下：不能将所关注的标记物与样品干扰(重叠峰上的基质)分离，由于临床样品中的背景而丧失灵敏度(皮摩尔(pM)降低到纳摩尔(nM))，因为捕捉小于1微升(μl)的样品用于电离的效率低并且与例如血液等复杂样品中干扰峰分离的效率低，所以不能用于小纳升数的样品体积。另外，MS常常由于与电离的具有相同质量的其它分子竞争而无法检测某些质量。这些问题通常引起问题并提供虚假结果。

发明内容

本发明认识到，当质谱分析用于进行罕见目标的检测时，重要的是避免检测液体的稀释，因为稀释大幅地降低检测的灵敏度。应该个别地对检测液体中的细胞或捕捉粒子检测，因为各具有独特的性质。因此，本发明提供了从膜释放精确少量的检测液体和递送液滴到质谱仪中同时避免稀释检测液体的方法和设备。

本发明的方面是用如下设备实现，该设备包含包括至少一个孔隙的基本上无吸收性的膜(无吸水性的膜)、可操作地与该膜缔合的微孔和可操作地与该膜缔合的电场发生器。将非均质样品(例如血液样品)引入到至少设备的微孔、膜或两者中。将多种亲和剂引入到样品中。多种亲和剂中的每一者都包含第一分子。多种亲和剂特异性地结合样品中的目标分析物。去除(例如通过洗涤)未结合的亲和剂。将一种或多种额外分子引入到样品中。该一种或多种额外分子与第一分子相互作用，以形成质谱分析标记。经由电场发生器提供电压到样品，以释放小滴穿过至少一个孔隙。小滴包含样品的一部分和质谱分析标记。例如通过对电离的质谱分析标记进行质谱分析来分析小滴中质谱分析标记的存在。质谱分析标记的存在指示样品中目标分析物的存在。在某些实施例中，本发明的方法可以另外包括通过定量所分析的质谱分析标记的量来定量样品中的目标分析物。

一般来说，至少一个孔隙包含近端开口、远端开口和壁。孔隙的许多不同取向包括在本发明的范围内。举例来说，至少一个孔隙的壁可以相对于近端开口和远端开口取向为90度。在另一实施例中，至少一个孔隙的壁从近端开口到远端开口逐渐变细。在另一实施例中，至少一个孔隙的壁从远端开口到近端开口逐渐变细。

在某些实施例中，基本上无吸收性的膜包含多个孔隙。多个孔隙可以具有相同的尺寸。可替代地，多个孔隙可以具有不同的尺寸。在这类实施例中，设备被配置用于从电场发生器产生电场，该电场仅从多个孔隙中的一个产生小滴。

设备可以进一步包含质谱仪。质谱仪可以是台式质谱仪或微型质谱仪，例如以下中所述：Gao等人(《德国分析化学杂志15(Z.Anal.15Chem)》.2006,78,5994-6002)、Gao等人(《分析化学(Anal.Chem.)》,80:7198-7205,2008)、Hou等人(《分析化学(Anal.Chem.)》,83:1857-1861,2011)、Sokol等人(《国际质谱学杂志(Int.J.Mass Spectrom.)》,2011,306,187-195)、Xu等人(《实验室自动化杂志(JALA)》,2010,15,433-439)；Ouyang等人(《分析化学(Anal.Chem.)》,2009,81,2421-2425)；Ouyang等人(《分析化学年评(Ann.Rev.Anal.Chem.)》,2009,2,187-25214)；Sanders等人(《欧洲质谱学杂志(Euro.J.Mass Spectrom.)》,2009,16,11-20)；Gao等人(《分析化学(Anal.Chem.)》,2006,78(17),5994-6002)；Mulligan等人(化学通讯《Chem.Com.》,2006,1709-1711)；以及Fico等人(《分析化学(Anal.Chem.)》,2007,79,8076-8082)，每一者的内容都以全文引用的方式并入本文中。

在某些实施例中，设备被配置成使得电场发生器以感应方式传递电场到微孔中的样品，例如美国专利第9,184,036号中所述，该专利的内容以全文引用的方式并入本文中。

在某些实施例中，第一分子是质谱分析标记前体。在这类实施例中，一种或多种额外分子是改变剂，其与质谱分析标记前体相互作用以形成质谱分析标记。

在其它实施例中，第一分子是改变剂。在这类实施例中，一种或多种额外分子是与改变剂相互作用从而形成质谱分析标记的质谱分析前体标记。

在某些实施例中，第一分子是质谱分析标记前体，并且一种或多种额外分子是与质谱分析标记前体相互作用从而形成质谱分析标记的第一和第二改变剂。

亲和剂可以是微粒或非微粒。目标分析物可以是罕见细胞并且非均质样品可以是非均质生物样品。

本发明的一些示例性方法是关于从包含至少一个孔隙的基本上无吸收性的膜释放液体的方法。基本上无吸收性的膜可以与能够容纳液体的微孔缔合。基本上无吸收性的膜的至少一个孔隙与至少一个表面的相交呈约30°到约150°的角度。该方法可以包括将基本上无吸收性的膜上的液体暴露于电场以通过基本上无吸收性的膜的至少一个孔隙释放液体的一个或多个小滴。

其它示例性方法包括检测疑似含有罕见分子和非罕见分子的一个或多个不同群体的样品中目标罕见分子的一个或多个不同群体。样品(通常呈液体形式)可以接触包括微孔和具有至少一个孔隙的基本上无吸收性的膜的设备。基本上无吸收性的膜的至少一个孔隙与至少一个表面的相交呈约30°到约150°的角度。针对目标罕见分子的每个不同群体，样品可以与包含对目标罕见分子的一种群体的目标罕见分子具有特异性且与其结合的结合搭配物的亲和剂一起培育。亲和剂包含质谱分析标记前体或第一改变剂。亲和剂可以非微粒或微粒。第一改变剂促进质谱分析标记从质谱分析标记前体形成，或从亲和剂释放包含质谱分析标记前体的实体。如果第一改变剂不促进质谱分析标记从质谱分析标记前体形成，那么样品经受第二改变剂，该第二改变剂促进质谱分析标记从质谱分析标记前体形成。质谱分析标记与目标罕见分子的一种群体相对应。使基本上无吸收性的膜上的样品暴露于电场，以释放样品的一个或多个小滴穿过基本上无吸收性的膜的至少一个孔隙。小滴经受质谱分析，以确定每个不同质谱分析标记的存在和/或量。每个不同质谱分析标记的存在和/或量可能与每个微孔的样品中目标罕见分子的每个不同群体的存在和/或量相关。

在其它方面中，本发明提供了样品分析方法，其包括将疑似包括目标分析物的样品引入到包含孔隙的膜(例如基本上无吸收性的膜，但任选地吸收性膜)中。将一种或多种试剂引入到膜上的样品中，以在目标分析物存在于样品中的情况下产生与样品中的目标分析物缔合的质谱分析标记。将电场施加于膜，由此产生样品的一个或多个小滴，该一个或多个液滴从膜的孔隙中排出并引入到质谱仪中。经由质谱仪，通过检测质谱分析标记的存在来检测目标分析物的存在。接着如果基于来自检测步骤的结果，存在目标分析物，那么从膜中提取与膜的孔隙缔合的样品的一部分，并分析样品的提取部分。本发明的方法可以进一步包括通过定量所分析的质谱分析标记的量来定量样品中的目标分析物。

一种或多种试剂引入到膜上的样品中可以包括将各包含第一分子的多种亲和剂引入到样品中，其中该多种亲和剂特异性地结合样品中的目标分析物；去除未结合的亲和剂；以及将一种或多种额外分子引入到样品中，其中一种或多种额外分子与第一分子相互作用，形成质谱分析标记。

在某些实施例中，第一分子是质谱分析标记前体。在这类实施例中，一种或多种额外分子是改变剂，其与质谱分析标记前体相互作用以形成质谱分析标记。

在其它实施例中，第一分子是改变剂。在这类实施例中，一种或多种额外分子是与改变剂相互作用从而形成质谱分析标记的质谱分析前体标记。

在其它实施例中，第一分子是质谱分析标记前体，并且一种或多种额外分子是与质谱分析标记前体相互作用从而形成质谱分析标记的第一和第二改变剂。

在所有这些实施例中，亲和剂可以是微粒或非微粒。在示例性实施例中，目标分析物是罕见细胞并且样品是非均质生物样品。

附图说明

图1A-C是描绘具有不同孔隙取向的本发明的设备的实例的示意图。

图2是描绘根据本发明的设备的另一实例的示意图。

图3是描绘用于从图1中示出的设备释放液滴的本发明的设备和方法的一实例的示意图，该小滴进入质谱仪的入口。

图4是描绘具有超过一个孔隙的本发明的设备和方法的一实例的示意图。从一个孔隙释放的小滴进入质谱仪的入口。

图5描绘图4的设备的基本上无吸收性的膜，其中鉴别基本上无吸收性的膜上的区域以供进一步分析。

图6是描绘微孔阵列的一实例的示意图。

图7是描绘包含阵列和电场发生器的设备的一实例的示意图。

图8A-C是一组质谱，展示直接从本发明的设备喷洒的FC-2肽。该组质谱是由多种浓度的肽FC-2产生的m/z 412的MS/MS谱。

图9A-C是一组质谱，展示直接从本发明的设备喷洒的FC-2肽。该组质谱是由多种浓度的肽FC-2产生的m/z 412的MS/MS谱。

图10是来自本发明的设备的引导到MS入口的喷雾羽流的相片。

图11展示示出用于产生和引导DESI活性喷雾的喷雾装置的示意图。

图12展示示出低温等离子体(low temperature plasma，LTP)探针的一实施例的示意图。

图13展示用于产生馈入到一张纸的离子以产生离子束的液体的示意图。

具体实施方式

本发明大体上涉及用于从膜，尤其具有含有很少分子(飞摩尔(fM)规模或更少)的少量(微升(μL)规模或更少)液体的分析区域中释放液体的方法和设备。在一些方面中，本发明涉及用于检测疑似含有罕见分子和非罕见分子的一种或多种不同群体的生物样品(例如血液样品)中罕见分子的一种或多种不同群体的方法、设备和试剂盒。在一些方面中，本发明涉及用于检测在生物样品(例如血液)中自由循环的罕见分子的一种或多种不同群体的方法和试剂盒。在其它方面中，本发明涉及用于检测疑似含有罕见分子和非罕见分子的一种或多种不同群体的生物样品(例如血液样品)中罕见分子的一种或多种不同群体的方法和试剂盒。

用于检测样品中目标罕见分子的一种或多种不同群体的本发明的方法可以包括增强目标罕见分子的一种或多种不同群体的浓度，超过非罕见分子的浓度。形成浓缩的样品，并且针对目标罕见分子的每个不同群体，与包括对目标罕见分子的一种群体的目标罕见分子具有特异性且与其结合的结合搭配物的亲和剂一起培育。亲和剂可以是非微粒或微粒。亲和剂包括质谱分析(MS)标记前体或第一改变剂，该第一改变剂促进MS标记从MS标记前体形成或从亲和剂释放包括MS标记前体的实体。MS标记与目标罕见分子的一种群体相对应。通过所培育的样品与多孔基质接触，形成保留物和滤液。如果第一改变剂未促进MS标记从MS标记前体形成，那么保留物和滤液中的一或两者经受第二改变剂，该第二改变剂促进MS标记从MS标记前体，从亲和剂形成。保留物和滤液中的一或两者经受MS分析以确定每个不同MS标记的存在和/或量。每个不同MS标记的存在和/或量与样品中目标罕见分子的每个不同群体的存在和/或量有关。

在另一实例中，疑似含有罕见细胞和非罕见细胞的血液样品中的罕见细胞与非罕见细胞的比率增加。通过组合提供血液样品、血小板失活剂、阻止纤维蛋白形成剂和足以引起预定水平的罕见细胞凝集的量的纤维蛋白来制备处理过的血液样品。接着处理过的血液样品与多孔基质接触，使得凝集的罕见细胞优先保留在多孔基质上。

在另一实例中，采用将包括罕见细胞和非罕见细胞的样品中罕见细胞与来自非罕见细胞的完整核酸分离的方法。将样品与水性介质组合，并且组合保持在一定温度下一段时间，以选择性地从非罕见细胞而非从罕见细胞释放核酸。样品进行过滤以将罕见细胞与非罕见细胞分离。

一般论述

本文所述的设备允许从保留在基本上无吸收性的膜上的少量液体形成电离的小滴并且进一步允许随后从基本上无吸收性的膜释放液滴穿过基本上无吸收性的膜(无吸水性的膜)的至少一个孔隙。

图1中描绘了本发明的设备的一个实例。设备10包括具有微孔14的圆形壁12和具有至少一个孔隙18的基本上无吸收性的膜16。孔隙18与基本上无吸收性的膜16在点20以90°的角度相交。孔隙用以促进小滴(例如液滴)从设备10产生和释放。

图2中描绘了本发明的一个设备的另一实例。设备30包括具有微孔34的圆形壁32和具有至少一个孔隙38的基本上无吸收性的膜36。膜36的上表面36a与孔隙38的内表面38a在点40以90°的角度相交，并且膜36的下表面36b与孔隙38的内表面38a在点42以90°的角度相交。孔隙用以促进小滴(例如液滴)从设备30产生和释放。

图3描绘从如图1中所述的设备释放小滴(例如液滴)的一个实例。液体24含于微孔14中，且体积不足以穿过基本上无吸收性的膜16的孔隙18。电场发生器20由电线20a启动以产生强度足以从基本上无吸收性的膜16释放小滴24a穿过孔隙18的电场。小滴24a被收集在质谱仪28的入口26中。

质谱仪28可以是所属领域中已知的任何类型的质谱仪，例如台式质谱仪或微型质谱仪。一示例性微型质谱仪描述于例如Gao等人(《德国分析化学杂志(Z.Anal.Chem.)》2006,78,5994-6002)中，其内容以全文引用的方式并入本文中。与具有数千瓦功率的用于实验室规模仪器的泵送系统相比，微型质谱仪一般具有较小泵送系统，如用于Gao等人所描述的系统中的仅具有5L/min(0.3m3/hr)隔膜泵和11L/s涡轮泵的18W泵送系统。其它示例性微型质谱仪描述于例如Gao等人(《分析化学(Anal.Chem.)》,80:7198-7205,2008)、Hou等人(《分析化学》,83:1857-1861,2011)以及Sokol等人(《国际质谱学杂志》,2011,306,187-195)中，其中每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。微型质谱仪还描述于例如以下中：Xu等人(《实验室自动化杂志》,2010,15,433-439)；Ouyang等人(《分析化学》,2009,81,2421-2425)；Ouyang等人(《分析化学年评》,2009,2,187-214)；Sanders等人(《欧洲质谱学杂志》,2009,16,11-20)；Gao等人(《分析化学》,2006,78(17),5994-6002)；Mulligan等人(《化学通讯》,2006,1709-1711)；以及Fico等人(《分析化学》,2007,79,8076-8082)，其中每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。

图4描绘包含孔隙阵列的本发明的设备的另一实例。液体64含于设备50的微孔54中且体积不足以穿过基本上无吸收性的膜56的孔隙58a-58d。微孔54具有圆形壁56。将电场发生器60启动以产生强度足以从基本上无吸收性的膜56释放小滴64a仅仅穿过个别孔隙58b的电场。小滴64a被收集在质谱仪68的入口66中。在此实例中，电场发生器的尺寸被选择用来将电场准确地施加于单个孔隙或孔隙亚群。因此，电场发生器被相应地设计成使得电场发生器包含允许这类施加的至少一部分(如例如尖端、电线、针、圆锥形、矩形或球形)。在此实例中，在电场施加点电场发生器的尺寸应该是大约希望电场选择性施加的孔隙或孔隙亚群的大小。因此，在电场施加点电场发生器的尺寸应该是不超过孔隙或孔隙亚群的大小的约200％并且不低于约50％，或不超过约150％并且不低于约25％，或不超过约100％并且不低于约50％，或不超过约50％并且不低于约25％。此外，质谱仪的入口应该与电场发生器对齐。在一些实例中，质谱仪的入口的尺寸与电场施加点处的电场发生器的尺寸相对应。

参考图4和5，根据MS分析的结果鉴别小滴64a中的MS标记，并且选择基本上无吸收性的膜56上的对应区域59用于进一步分析。通过例如抽吸、冲压、切开或提取或者两种或超过两种上述方法的组合将液体或粒子(包含细胞)从区域59中移出。

在上述设备中，基本上无吸收性的膜可以是基本上或完全不可透过液体的平坦表面。基本上无吸收性的膜包含至少一个孔隙，并且在某些实施例中，超过一个孔隙(例如孔隙阵列)。至少一个孔隙在基本上无吸收性的膜内具有固定取向。固定取向可能相对于孔隙的壁与基本上无吸收性的膜的表面相交的方式描述。举例来说，孔隙可以具有竖直壁，使得孔隙的壁以90度与基本上无吸收性的膜的表面(面对微孔(近端表面)的顶表面和面对质谱仪(远端表面)的底表面)相交。图1A中示出孔隙的这类取向。

其它取向是可能的，并且熟练技术人员应了解本发明不限于孔隙的特定取向。举例来说，孔隙的壁可以在两个表面的相交处以约30°到约150°的角度与基本上无吸收性的膜的表面相交。这允许孔隙从近端表面朝向远端表面逐渐变细，如图1B中所示(即，孔隙尺寸被设定成变得更狭窄)。可替代地，孔隙可以从远端表面到近端表面逐渐变细，图1C(即，孔隙尺寸被设定成变得更宽)。在基本上无吸收性的膜包括超过一个孔隙的一些实例中，从一个孔隙到另一孔隙，相交处的角度具有高精确度数(变化小于1度)，即，孔隙都具有相同尺寸。因此，在此实例中，基本上无吸收性的膜的孔隙与表面的角度与另一孔隙的角度相差不超过1°。在其它实施例中，孔隙中的一些或全部具有彼此不同的尺寸。

术语“相交”意指两个表面彼此接触的点或一系列点。在基本上无吸收性的膜包括超过一个孔隙的一些实例中，基本上无吸收性的膜的一个孔隙与表面的角度与另一孔隙的角度相差例如不超过1°，或不超过0.5°，或不超过0.2°，或不超过0.1°，或不超过0.05°，或不超过0.01°，或不超过0.005°，或不超过0.001°。

在一些实例中，使基本上无吸收性的膜上的液体暴露于电场，以从基本上无吸收性的膜释放一个或多个液滴。电场还会引起小滴内的分子电离。基本上无吸收性的膜也与电场发生器缔合。电场发生器的启动产生电场，该电场引起液体更多地穿过孔隙并形成液滴，液滴从膜释放，穿过至少一个孔隙，到达例如质谱仪的入口中。

如上文所提及，基本上无吸收性的膜与能够容纳液体的微孔缔合。短语“缔合”意指基本上无吸收性的膜与微孔可以形成其中基本上无吸收性的膜可能在微孔底部或微孔顶部上的单个单元。

液体可以是样品或含有MS标记的液体。液体还可以是引入到样品中的MS标记。在一些实例中，液体包括溶剂，例如电喷雾质谱分析中采用的喷雾溶剂。在一些实例中，用于电喷射电离的溶剂包含(但不限于)例如极性有机化合物，如例如醇(例如甲醇、乙醇和丙醇)、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和硝基甲烷；非极性有机化合物，如例如己烷、甲苯、环己烷；以及水，或上述两种或更多种的组合。任选地，溶剂可以含有一种或多种酸或碱作为改性剂(例如挥发性盐和缓冲液，例如乙酸铵、碳酸氢铵；挥发性酸，例如甲酸、乙酸或三氟乙酸、七氟丁酸、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；和非挥发性盐或缓冲液，如例如钠和钾的氯化物和磷酸盐。

膜基本上无吸收性，这意味着膜基本上不能吸收液体(无吸水性)。在一些实例中，基本上无吸收性的膜吸收的液体的量小于约2％(按体积计)，或小于约1％，或小于约0.5％，或小于约0.1％，或小于约0.01％或0％。基本上无吸收性的膜可以无纤维，这意味着膜至少95％不含纤维，或至少99％不含纤维，或至少99.5％或至少99.9％不含纤维，或100％不含纤维。

基本上无吸收性的膜可以是坚硬的无柔性材料，其不可透过液体(除了穿过膜的一个或多个孔隙)。基本上无吸收性的膜可以由有机或无机材料或水不溶性材料构成。基本上无吸收性的膜的形状取决于例如以下一个或多个：基本上无吸收性的膜的固定器或保持器的性质、孔隙的性质和形状、孔隙与基本上无吸收性的膜的角度、微孔的性质、电荷产生的性质和质量标记的性质。在一些实例中，基本上无吸收性的膜的形状是例如圆形、椭圆形、矩形、正方形、六角形、平面或平坦表面(例如条带、圆盘、薄膜、膜和板)。在一些实例中，基本上无吸收性的膜是刚性的或无柔性，这意味着基本上无吸收性的膜可以从基本上无吸收性的膜的平面弯曲至多约1°，或至多约0.5°，或至多约0.1°。

基本上无吸收性的膜可以由各种材料构造，这些材料可以是天然存在的，或合成、聚合或非聚合的。这类用于制造基本上无吸收性的膜的实例包含(借助于说明而非限制)塑料，例如聚碳酸酯、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚-(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚(氯三氟乙烯)、聚(丁酸乙烯酯)、聚酰亚胺、聚氨酯和聚对二甲苯；硅烷；硅；氮化硅；石墨；陶瓷材料(如例如氧化铝、氧化锆、PZT、碳化硅、氮化铝)；金属材料(如例如金、钽、钨、铂和铝)；玻璃(如例如硼硅酸盐、钠钙玻璃和PYREX(低热膨胀硼硅酸盐玻璃，康宁公司(CorningIncorporated))；以及生物可吸收的聚合物(如例如聚乳酸、聚己内酯和聚乙醇酸)；例如本身使用或彼此结合和/或结合其它材料使用。用于制造基本上无吸收性的膜的材料不包含纤维材料，例如纤维素(包含纸)、硝化纤维、乙酸纤维素、人造丝、二乙酸盐、木质素、矿物纤维、纤维状蛋白、胶原蛋白、合成纤维(例如尼龙、涤纶、烯烃、丙烯酸类、聚酯纤维)或吸水性和/或可渗透并且因此不符合本文所述的原理的其它纤维材料(玻璃纤维、金属纤维)。

每个微孔的基本上无吸收性的膜包括至少一个孔隙。基本上无吸收性的膜可以包含超过一个孔隙，例如约2,000,000个孔隙/平方厘米(cm²)。在一些实例中，每平方厘米基本上无吸收性的膜的孔隙数目是例如1到约2,000,000，或1到约1,000,000，或1到约500,000，或1到约200,000，或1到约100,000，或1到约50,000，或1到约25,000，或1到约10,000，或1到约5,000，或1到约1,000，或1到约500，或1到约200，或1到约100，或1到约50，或1到约20，或1到约10，或2到约500,000，或2到约200,000，或2到约100,000，或2到约50,000，或2到约25,000，或2到约10,000，或2到约5,000，或2到约1,000，或2到约500，或2到约200，或2到约100，或2到约50，或2到约20，或2到约10，或5到约200,000，或5到约100,000，或5到约50,000，或5到约25,000，或5到约10,000，或5到约5,000，或5到约1,000，或5到约500，或5到约200，或5到约100，或5到约50，或5到约20，或5到约10。基本上无吸收性的膜中的孔隙密度是例如基本上无吸收性的膜的表面积的约1％到约20％，或约1％到约10％，或约1％到约5％，或约5％到约20％，或约5％到约10％。在一些实例中，基本上无吸收性的膜的孔隙大小足以优先保留液体，同时允许如本文所述形成的液滴通过。基本上无吸收性的膜的孔隙大小取决于例如液体的性质、细胞的大小、捕捉粒子的大小、质量标记的大小、分析物的大小、标记粒子的大小、非罕见分子的大小和非罕见细胞的大小。在一些实例中，基本上无吸收性的膜的孔隙的平均大小是例如约0.1到约20微米，或约0.1到约5微米，或约0.1到约1微米，或约1到约20微米，或约1到约5微米，或约1到约2微米，或约5到约20微米，或约5到约10微米。

如上文所提及，基本上无吸收性的膜的顶表面和/或底表面与孔隙的内壁的相交角度是例如约30°到约150°，或约30°到约125°，或约30°到约110°，或约30°到约100°，或约30°到约95°，或约30°到约90°，或约45°到约150°，或约60°到约150°，或约75°到约150°，或约80°到约150°，或约85°到约150°，或约90°到约150°，或约45°到约125°，或约60°到约110°，或约70°到约100°，或约80°到约100°，或约85°到约95°，或约90°。表面的相交取决于例如孔隙等每个表面的形状，并且可以是例如线状、圆形、椭圆形、六角形、正方形或矩形或其组合。

膜的以上特征允许高精确水平的量的液体作为小滴从膜释放。小滴中液体量的变异(CV)可以是例如至多约1％(体积/体积)或至多约0.5％或至多约0.1％。此外，从溶剂进行质量解吸附的时间(解吸附时间)变化较小，即变化至多约500毫秒(msec)，或至多约400msec，或至多约300msec，或至多约200msec，或至多约100毫秒，或至多约50msec，或至多约10msec，由此使得在短时间内捕获离子更便捷得多，因此与已知方法相比允许更小的喷雾体积。对于刚性的基本上无吸收性的膜，解吸附时间进一步减少。另外，可以实现约50msec的更短的解吸附时间，其中基本上无吸收性的膜包括超过一个孔隙并且在基本上无吸收性的膜的表面上的一个孔隙的角度与另一孔隙的角度相差不超过0.5°。本文所述的设备所实现的精确度允许高定量结果。短语“质量解吸附”是指质量标记离子从溶剂分子分离。

微孔和具有孔隙的膜可以通过例如微机电(MEMS)技术、金属氧化物半导体(CMOS)技术、用于产生微筛的微制造方法、激光技术、辐照、模制和微机械加工或其组合来制造。

如上文所提及，含有带电小滴和分析物离子的分析物(或质量标签)从基本上无吸收性的膜(无吸水性的膜)的孔隙的放出是通过在膜附近产生电场来实现。电场通过向距离基本上无吸收性的膜0.05mm到20mm的导电元件(下文称为电场发生器)提供约1千伏(kV)到约10千伏(kV)或约1kV到约5kV或约2kV到约10kV或约5kV到约10kV或约6.0到6.5kV的电势来建立。设备通常位于距离质谱仪的入口毛细管0.01mm到5mm处，质谱仪可以保持在-300V到+300V的电势下。

电场的性质和强度取决于以下中的一个或多个∶液体的性质、孔径、喷雾液体的量、膜与电场发生器之间的距离、膜与质谱仪入口之间的距离以及施加到电场发生器和质谱仪入口的电势。在一些情况下，电势经由高压源连续供应以便从膜产生连续喷雾。在其它情况下，电势通过压缩或解压缩连接到电场发生器的压电装置(例如防静电枪)来供应。此外，带电小滴和分析物从膜的不连续放出可以通过向电场发生器提供在1kV到约15kV范围内的一个或一系列电脉冲达每个个别脉冲少到0.5ms到每个个别脉冲多到2分钟的持续时间来实现。

穿过孔隙或孔隙亚群排出的液体体积取决于例如样品的体积、孔径、分析性质、孔的大小、孔中的孔隙数目、所产生的电场中的孔的数目、所产生的电场中的孔隙的数目、孔径、孔隙角度和膜的刚性。在一些实例中，排出的液体体积是例如约1fL到约1μL，或约1nL到约1μL。

在一些实例中，电场发生器与基本上无吸收性的膜缔合并且启动以产生电场。在一些实例中，电场发生器是与基本上无吸收性的膜的支撑物成一体的电网线。在一些实例中，电场发生器是与基本上无吸收性的膜分开的电网并且被安置成移动到基本上无吸收性的膜和从基本上无吸收性的膜移动。在一些实例中，电场发生器和基本上无吸收性的膜中的一个或两个附接到机械臂上，该机械臂能够移动以使电场发生器相对于基本上无吸收性的膜安置，从而允许启动电场发生器以选择性地诱发基本上无吸收性的膜的区域上或具体的基本上无吸收性的膜或其中基本上无吸收性的膜可能是如下文所论述的基本上无吸收性的膜的阵列的一部分的一组基本上无吸收性的膜上形成小滴。

在一些实例中，电场发生器是线、板、离子流或其组合。例如电势施加于电场发生器使电场发生器启动。离子流可以通过不同方式来产生，包含(但不限于)通过电介质阻挡放电产生等离子体、交流电势施加到合适的导电元件、静态电势施加到合适的导电元件或连接到合适的导电元件的压电材料压缩。在每种情况下，合适的导电元件由合适几何形状的导电材料构成，使得电场强度(在施加电势时)量值足以造成周围介质的电击穿。在一些情况下，此合适的导电元件可以是电线、突起或一系列突起、板、网格或网孔、尖棒或粗糙化表面。离子流还可以通过电喷雾合适液体来产生。产生的离子流被引导在无吸水性的膜的一侧，同时膜的相对侧位于如先前所描述的质谱仪的入口附近。离子流可以通过但不限于以下来引导：离子流发生器以适当方式定位，使得离子流行进到无吸水性的膜并对其进行撞击；向一系列导电电极提供合适的电势以静电引导离子到膜；或通过使用气动力，例如流动气体，传送离子流到膜。还可以使用样品的感应充电和感应电离，并且在下文和例如美国专利第9,184,036号中进一步描述，该专利的内容以全文引用的方式并入本文中。

基本上无吸收性的膜可以与外壳缔合，外壳可以是微孔，其中基本上无吸收性的膜可以位于例如外壳的顶部或底部。外壳可以由与基本上无吸收性的膜的材料相容的任何合适材料构成。这类材料的实例包含(作为实例而非限制)上文关于基本上无吸收性的膜所列的任一材料。外壳和基本上无吸收性的膜的材料可以相同或可以不同。在一些实例中，基本上无吸收性的膜是微孔的一部分。

如上文所提及，在一些实例中，基本上无吸收性的膜是微孔或微孔阵列的一部分。至少两个微孔的基本上无吸收性的膜可以包括可以相同或不同的液体样品，并且可以启动电场以从该至少两个微孔的基本上无吸收性的膜中的每一个选择性地释放液滴。微孔的顶部或底部可以包括基本上无吸收性的膜。微孔体积取决于例如液体样品的性质、孔隙的性质、基本上无吸水性的膜的性质和大小、喷雾溶剂、捕捉粒子或细胞、分析物浓度、质量标记浓度。在一些实例中，微孔体积是约1飞升(fL)到约100微升(μL)，或约1μL到约100纳升(nL)，或约1μL到约50nL，或约1μL到约10nL，或约1μL到约5nL，或约1μL到约1nL，或约1nL到约2nL。在一些实例中，在微孔是圆形的情况下，微孔的直径是约5微米(μm)到约40毫米(mm)，或约5μm到约500μm，或约500μm到约2mm，或约2mm到约40mm。环绕单个孔隙的微孔可以容纳所界定体积的液体，这允许界定的喷雾液体体积并且因此允许固定高浓度的分析物和液体在孔隙内的解吸附时间短。

阵列可以包括例如2到约100,000个微孔，或2到约50,000个微孔，或2到约10,000个微孔，或2到约5,000个微孔，或2到约2,500个微孔，或2到约1,000个微孔，或2到约500个微孔，或2到约100个微孔，或2到约50个微孔，或约10到约100,000个微孔，或约10到约50,000个微孔，或约10到约10,000个微孔，或约10到约5,000个微孔，或约10到约2,500个微孔，或约10到约1,000个微孔，或约100到约10,000个微孔，或约100到约5,000个微孔，或约100到约2,500个微孔，或约5,000到约10,000个微孔，或约2,500到约7,500个微孔。

在一实例中根据本文所述的原理的设备10阵列描绘于图5中。显示阵列70，其包括设备10的24×32网格(768)，各包括微孔14。

如上文所提及，微孔阵列和电场发生器可以彼此安置成使得一个或两个能够以针对一个或多个微孔选择性地启动电场的方式移动。借助于说明而非限制，一个实例展示于图6-7中。设备80包括阵列70和电场发生器74。机械臂72控制阵列70的移动，并且任选地，机械臂76控制电场发生器74的移动。设备80也包括外壳(未显示)，该外壳提供机械臂72和76中的一个或两个的支撑。机械臂72和机械臂76中的每一个能够使用合适的电子装置和控制器(未显示)分开控制，使得阵列70和电场发生器74中的一个或两个可以相对于彼此移动。质谱仪入口与电场发生器的移动对齐。以此方式，电场可以选择性地施加于一个或多个包括阵列70的设备80，由此允许询问阵列70的微孔的基本上无吸收性的膜的特定区域。可以从基本上无吸收性的膜的不同区域，通过将电势仅仅施加于该区域，或通过使用包含纳米结构在内的外部结构促进从选定区域电离，来实现小滴的电离。此外，阵列70可以相对于质谱仪的入口安置，从而使得选择性地从膜释放的液滴可以进行质谱分析(看见图4)。

应注意，在图6-7中所示的实例中，显示控制电场发生器74的机械臂在阵列70上方。这仅仅是举例说明；在一些实例中，机械臂76可以是例如在阵列70下方或与阵列70相邻(在侧面上)。

本发明的设备应用于其中期望精确的小体积液体释放在膜上的任何情况。这类应用的实例包含(借助于说明而非限制)例如检测目标罕见分子、非罕见分子、非罕见细胞和罕见细胞。在一些实例中，基本上无吸收性的膜包括超过一个孔隙，并且启动电场以选择性地从个别孔隙或孔隙亚群释放小滴。释放的小滴进行质谱分析，以确定与具体MS标记所定位的个别孔隙或孔隙亚群相邻的区域。移出与该区域相对应的膜上的液体，以通过以下更充分论述的方法进行分析。与个别孔隙相邻的液体可以通过例如抽吸、冲压膜的区域、提起、切开或提取或其两者或多者的组合来移出。

电感充电

在感应电喷射电离中，如例如内容以全文引用的方式并入本文中的美国专利第9,184,036号中所描述，电势可以施加于靠近含有样品的基本上无吸收性的膜放置的一个或多个电极(例如电场发生器)。其以正离子或负离子模式在10-2000Hz范围内的频率下重复脉冲。在基本上无吸收性的膜中产生强动态电磁场，并在基本上无吸收性的膜的特别靶向的孔隙中产生电场焦点，导致带电液滴从孔隙迸发。

在电感充电中，高压源(例如电场发生器)与样品或含有样品的基本上无吸收性的膜不接触。以此方式，离子由电感充电产生，即，感应方法用于对初级微滴充电。这允许控制和集中小滴产生。产生的小滴被引导到质谱仪中。

带电小滴从基本上无吸收性的膜上的特定位置产生可以通过将电极(例如电场发生器)靠近基本上无吸收性的膜的所需孔隙(通常距离2-5mm)放置并重复脉冲到高正电势(5-7kV、50-3,000Hz，脉冲约0.2-2ms)来实现。电磁感应在基本上无吸收性的膜的特定孔隙附近产生高电场，这些电场引起带电小滴仅仅从基本上无吸收性膜的该孔隙迸发。

在一些实例中，含有如本文所论述的MS标记的液体可以在施加质量标签释放剂后直接从负载质量标记的罕见细胞或粒子的基本上无吸收性的膜排出。因此，实现放出的带电微滴/溶剂化离子向例如质谱仪入口的更小区域的周围静电聚焦。在一些实例中，利用通过在基本上无吸收性的膜上方或下方的点阵列提供的纳米特征，在基本上无吸收性的膜的表面附近提供高电场来实现电场辅助的带电小滴放出。

在一些实例中，基本上无吸收性的膜的内在纳米特征可以用于通过带电小滴的场发射从润湿的基本上无吸收性的膜产生负载分析物的离子的喷雾。气动力与静电力的组合可以用于收集离子以供随后用质谱仪分析。此包含通过从质谱仪入口(例如通过真空)抽吸或通过独立于质谱仪提供的气体流动提供气动力的情况。

解吸附电喷射电离

用于产生待引导在基本上无吸收性的膜上的样品上的一个实施例采用解吸附电喷射电离(DESI)，其例如描述于Takats等人(美国专利第7,335,897号)，其内容以全文引用的方式并入本文中。DESI允许材料(分析物)在大气压或减压下在环境条件下电离和解吸附。DESI系统一般包含通过递送液滴到雾化气体中来产生DESI活性喷雾的装置。该系统还包含用于引导DESI活性喷雾到表面上的构件。应了解，DESI活性喷雾可以在与表面接触的点包含带电和不带电液滴两者或任一者、气态离子、雾化气体分子和附近气氛分子。将气动辅助的喷雾引导到容纳样品的基本上无吸收性的膜上，其中其与一种或多种分析物(如果样品中存在的话)相互作用，并产生穿过基本上无吸收性的膜的孔隙弹出的分析物的解吸附离子。解吸附离子可以被引导到用于质量分析的质量分析器、用于通过大小和所得到的电压变化的测量值分离的IMS装置、用于频谱分析的火焰光谱仪等等。

图11示意性地示出DESI系统100的一实施例。在此系统中，喷雾110由常规电喷雾装置120产生。装置120包含馈入液体溶剂140所通过的喷雾毛细管130。周围雾化器毛细管150形成环形空间，例如氮气(N₂)等雾化气体以高速度穿过该环形空间馈入。在一个实例中，液体是水/甲醇混合物并且气体是氮气。经由金属连接元件，通过电源170将高压施加于液体溶剂。与离开毛细管130的液体相互作用的快速流动的雾化气体的结果是形成包括液滴的DESI活性喷雾110。DESI活性喷雾110还可以包含中性气氛分子、雾化气体和气态离子。虽然已经描述电喷雾装置120，但能够产生由雾化气体射流传送的液滴流的任何装置可以用于形成DESI活性喷雾11。

将喷雾110引导到容纳样品的基本上无吸收性的膜上。收集穿过基本上无吸收性的膜的孔隙离开样品的解吸附离子，并将其引入到质谱仪的大气入口或界面以供分析。基本上无吸收性的膜可以是能够移动的平台，或可以安装在能够移动的平台上，该能够移动的平台可以在x、y或z方向上通过众所周知的驱动构件移动以解吸和电离不同区域的样品。平台的电势和温度还可以通过已知方式来控制。通常在质谱仪中发现的任何大气界面将适合用于本发明中。已经使用典型的加热毛细管大气界面获得良好的结果。也已经使用经由由金属或绝缘体制成的延长的柔性离子输送管取样的大气界面获得良好的结果。

低温等离子体

一个用于产生待引导在基本上无吸收性的膜上的样品上的离子束的实施例采用低温等离子体(low temperature plasma，LTP)探针，其描述于Ouyang等人(美国专利第8,519,354号)，该专利的内容以全文引用的方式并入本文中。不同于基于电喷雾或激光的周围电离源，等离子体源无需电喷雾溶剂、辅助气体和激光。LTP的特征可以为具有高能量电子的非平衡等离子体，具有相对较低的动能但具反应性的离子和中性物；结果是可以用于从表面解吸附和电离分析物并产生分析物的分子态离子或碎片离子的低温周围等离子体。与高温(平衡)等离子相比，LTP的区别特征是，LTP不将分子分解成原子或小分子片段，因此分子信息保留在所产生的离子中。LTP电离源具有尺寸小、消耗低功率和气体(或仅仅使用周围空气)的潜能，并且这些优点可以降低操作成本。除节省成本之外，基于LTP的电离法能够用于便携式质谱仪以进行所属领域中的实时分析型分析(Gao,L.；Song,Q.；Patterson,G.E.；Cooks,D.Ouyang,Z.,《分析化学(Anal.Chem.)》2006,78,5994-6002；Mulligan,C.C.；Talaty,N.；Cooks,R.G.,《化学通讯(Chemical Communications)》2006,1709-1711；和Mulligan,C.C.；Justes,D.R.；Noll,R.J.；Sanders,N.L.；Laughlin,B.C.；Cooks,R.G.,《分析家(The Analyst)》2006,131,556-567)。

一种示例性LTP探针展示于图12中。这类探针可以包含具有放电气体入口端的外壳、探针头、两个电极和电介质阻挡，其中两个电极由电介质阻挡分离，并且其中从电源施加电压产生电场和低温等离子体，其中电场或气体流动或两者驱动低温等离子体离开探针头。本文所述的探针的电离源是基于介质阻挡放电(DBD；Kogelschatz,U.,《等离子体化学和等离子体加工(Plasma Chemistry and Plasma Processing)》2003,23,1-46)。电介质阻挡放电通过在由电介质阻挡分离的两个电极之间施加高压信号，例如交流电来实现。在两个电极之间形成非热的低功率等离子体，其中电介质限制位移电流。此等离子体含有样品的周围环境中的反应性离子、电子、自由基、激发的中性物和亚稳定的物种，这些可以用于从坚硬的样品表面以及电离液体和气体解吸附/电离分子。可以从放电区中提取等离子体并用电场力或电场力与气体流动的组合力引导到样品表面。

在某些实施例中，探针进一步包含电源。电源可以提供直流电或交流电。在某些实施例中，电源提供交流电。在某些实施例中，放电气体穿过放电气体入口端供应到探针，并且电场和/或放电气体驱动低温等离子体离开探针头。放电气体可以是任何气体。示例性放电气体包含氦气、压缩或周围空气、氮气和氩气。在某些实施例中，电介质阻挡由电绝缘材料构成。示例性电绝缘材料包含玻璃、石英、陶瓷和聚合物。在其它实施例中，电介质阻挡是在每一端空心的玻璃管。在其它实施例中，变化电场调整能量和由样品中的分析物产生的离子的碎片化程度。

来自低温等离子体探针的等离子体放电被引导到容纳样品的基本上无吸收性的膜上。等离子体与样品相互作用并且引起样品液滴穿过基本上无吸收性的膜的孔隙弹出并引入到质谱仪的大气入口或界面中以供分析。

使用润湿多孔材料的电离

一个用于产生待引导在基本上无吸收性的膜上的样品上的离子束的实施例采用由被润湿以产生离子的多孔材料构成的探针，其描述于Ouyang等人(美国专利第8,859,956号)，该专利的内容以全文引用的方式并入本文中。一种示例性探针展示于图13中。例如纸(例如滤纸或色谱纸)或其它类似材料等多孔材料用于容纳和转移液体，当高压施加于材料时直接从材料边缘产生的离子束。多孔材料保持与溶剂流(例如连续溶剂流)分开(即，分离或断开)。实际上，液体点样到多孔材料上。接着点样的液体连接到高压源，以产生液体离子束，该液体离子束被引导到容纳该样品的基本上无吸收性的膜上。收集穿过基本上无吸收性的膜的孔隙离开样品的解吸附离子，并将其引入到质谱仪的大气入口或界面以供分析。在不需要独立溶剂流的情况下输送液体通过多孔材料。不需要气动辅助；实际上，电压仅仅施加于多孔材料。

在某些实施例中，多孔材料是任何纤维素类材料。在其它实施例中，多孔材料是非金属多孔材料，例如棉花、亚麻、羊毛、合成纺织物或植物组织。在其它实施例中，多孔材料是纸。纸的优点包含：成本(纸较便宜)；其是完全商品化的并且其物理和化学特性可以调整；其可以过滤来自液体样品的颗粒(细胞和灰尘)；其容易成形(例如，易于切割、撕开或折叠)；液体在毛细作用下在其中流动(例如，无外部泵送和/或电源)；以及其是一次性的。

在某些实施例中，多孔材料与具有针对喷雾优化的宏观角度的坚硬端部整合到一起。

在特定实施例中，多孔材料是滤纸。示例性滤纸包含纤维素滤纸、无灰滤纸、硝化纤维纸、玻璃微纤维滤纸和聚乙烯纸。可以使用具有任何孔径的滤纸。示例性孔径包含级别1(11μm)、级别2(8μm)、级别595(4-7μm)以及级别6(3μm)。孔径不仅将影响喷雾材料内部的液体输送，而且会影响端部处泰勒锥(Taylor cone)的形成。最优孔径将产生稳定的泰勒锥并减少液体蒸发。滤纸孔径也是过滤中的重要参数，即，纸充当在线预处理装置。孔径在低纳米范围内的市售再生纤维素超滤膜被设计成用于保留小到1000Da的粒子。可以购得分子量截止值在1000Da到100,000Da范围内的超滤膜。

简单地基于使用在多孔材料边缘处产生的高电场，本发明的探针很好地产生微米级小滴。在特定实施例中，将多孔材料成形为具有宏观上尖锐点(如三角形点)以便于离子产生。本发明的探针可以具有不同的端部宽度。在某些实施例中，探针端部宽度是至少约5μm或更宽、至少约10μm或更宽、至少约50μm或更宽、至少约150μm或更宽、至少约250μm或更宽、至少约350μm或更宽、至少约400μm或更宽、至少约450μm或更宽等。在特定实施例中，端部宽度是至少350μm或更宽。在其它实施例中，探针端部宽度是约400μm。在其它实施例中，本发明的探针具有三维形状，例如圆锥形状。

目标罕见分子的检测

在一些实例中，本发明的设备用于采用亲和剂和能够使用MS技术检测的不同标记检测目标罕见分子的不同群体。在一些实例中，一种或多种改变剂用于产生被选择用来区分目标罕见分子的不同群体的MS标记。该等方法也采用分离法，其中产生液滴并通过MS技术检查每个不同MS标记的存在和量中的一者或两者。MS标记的区分得到关于目标罕见分子的每个不同群体的存在和量中的一者或两者的信息。MS标记数目可以是每个目标罕见分子多达10⁶个或更多个，或每个目标罕见分子少至10个。每个目标罕见分子的MS标记数目可以是例如约10到约10¹²，或约10到约10¹⁰，或约10到约10⁸，或约10到约10⁶，或约10到约10⁴，或约10到约100，或约100到约10¹⁰，或约100到约10⁸，或约100到约10⁶，或约100到约10⁴。

在一些实例中，该等方法是用于检测疑似含有罕见分子和非罕见分子的一个或多个不同群体的样品中的目标罕见分子的一个或多个不同群体。呈液体形式的样品接触到包括基本上无吸收性的膜的微孔。任选地，通过采用合适的技术，例如过滤，将目标罕见分子的一种或多种不同群体的浓度增强到超过非罕见分子，以形成浓缩样品。针对目标罕见分子的每个不同群体，将样品与包括对目标罕见分子的一种群体的目标罕见分子具有特异性且与其结合的特异性结合搭配物的亲和剂一起培育。亲和剂包括质谱分析标记前体或第一改变剂。亲和剂可以是非微粒或微粒。第一改变剂促进质谱分析标记从质谱分析标记前体形成，或从亲和剂释放包括质谱分析标记前体的实体。如果第一改变剂不促进质谱分析标记从质谱分析标记前体形成，那么样品经受第二改变剂，该第二改变剂促进质谱分析标记从质谱分析标记前体形成。质谱分析标记与目标罕见分子的一种群体相对应或包括目标罕见分子的一种群体。使基本上无吸收性的膜上的样品暴露于电场，以释放样品的液滴穿过基本上无吸收性的膜的至少一个孔隙。小滴经受质谱分析，以确定每个不同质谱分析标记的存在和/或量。每个不同质谱分析标记的存在和/或量与每个微孔的样品中目标罕见分子的每个不同群体的存在和/或量相关。

在一个方法中，利用粒子扩增并且提供粒子聚集或群集以形成粒子聚集体。在一个实例中，较大粒子(载体粒子)可以被许多更小的粒子(标记粒子)涂布。为进一步实现扩增，载体粒子可以使用一种或多种连接基团与其它载体粒子链接。标记粒子在表面上含有MS标记，其可以是约10⁵，因为质量标记的尺寸相对较小。在此方法中，实现极低的背景水平。载体粒子和标记粒子应具有小于基本上无吸收性的膜中的孔隙的直径。

应注意，下文论述的一种或多种鉴别技术可以在样品与根据本文所述的原理的基本上无吸收性的膜接触之后应用于样品。因此，用于分析样品以鉴别一种或多种目标罕见分子的方法包含首先鉴别哪些微孔具有所关注的目标罕见分子。因此，技术可以用作筛选技术以鉴别具有含目标罕见分子的样品的微孔以供后续分析。

待分析的样品是疑似含有目标罕见分子、非罕见细胞和罕见细胞的样品。样品可以是生物样品或非生物样品。生物样品可以来自哺乳动物受试者或非哺乳动物受试者。哺乳动物可以是例如人类或其它动物物种。生物样品包含生物流体，例如全血、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊髓液、泪液和粘液。生物组织包含(以说明方式)例如头发、皮肤、来自器官或其它身体部位的切片或切除组织。在许多情况下，样品是全血、血浆或血清。罕见细胞可以来自例如肺癌、支气管癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胆管癌、膀胱癌、卵巢癌、脑癌、中枢神经系统癌、肾癌、骨盆癌、子宫体癌、口腔癌或咽癌或黑色素瘤癌症。罕见细胞可以是(但不限于)例如病原体，例如细菌、病毒、真菌和原生动物；恶性细胞，例如恶性赘瘤或癌细胞；循环内皮细胞；循环肿瘤细胞；循环癌症干细胞；循环癌症间充质细胞；循环上皮细胞；胎细胞；免疫细胞(B细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞)；以及干细胞。在一些实例中，待测试的样品是来自例如(但不限于)人类受试者的哺乳动物的血液样品。血液样品是含有例如非罕见细胞和罕见细胞的细胞的样品。在一些实例中，血液样品是全血或血浆。

短语“目标罕见分子”是指包含可以在样品中检测到的生物标记物的分子，其中分子或生物标记物指示特定细胞群体。目标罕见分子包含(但不限于)抗原(例如蛋白质、肽、激素、维生素、过敏原、自身免疫抗原、碳水化合物、脂质、糖蛋白、辅因子、抗体和酶)和核酸。

短语“目标罕见分子群体”是指一群分子，其共享对该群分子具有特异性的共同抗原或核酸。短语“具有特异性”意指共同抗原或核酸区分该群分子与其它分子。

当与样品中的罕见分子的量相比较时非罕见分子以相对较大的量存在。

短语“细胞群体”是指一群在表面上或细胞内部具有抗原或核酸的细胞，其中抗原为该群细胞中所有细胞所共有的，并且抗原对该群细胞具有特异性。

罕见细胞是与样品中的非罕见细胞的量相比，以相对较小的量存在于样品中的那些细胞。在一些实例中，罕见细胞以疑似含有罕见细胞的样品中的总细胞群体的约10^-8重量％到约10^-2重量％的量存在。罕见细胞可以是但不限于恶性细胞，例如恶性赘瘤或癌细胞；循环内皮细胞；循环上皮细胞；间充质细胞；胎细胞；免疫细胞(B细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞)；干细胞；有核红血球(正成红细胞或成红血细胞)；以及不成熟粒细胞。

非罕见细胞是与样品中的罕见细胞的量相比以相对较大的量存在的那些细胞。在一些实例中，非罕见细胞比疑似含有非罕见细胞和罕见细胞的样品中的总细胞群体中的罕见细胞的量大至少约10倍，或至少约10²倍，或至少约10³倍，或至少约10⁴倍，或至少约10⁵倍，或至少约10⁶倍，或至少约10⁷倍，或至少约10⁸。非罕见细胞可以是(但不限于)例如白血细胞、血小板和红细胞。

罕见细胞的目标罕见分子包含(但不限于)例如癌细胞型生物标记物、致癌蛋白和致癌基因、化学抗性生物标记物、转移潜能生物标记物和细胞分型标记物。癌细胞型生物标记物包含(借助于说明而非限制)例如细胞角蛋白(CK)(CK1、CK2、CK3、CK4、CKS、CK6、CK7、CK8和CK9、CK10、CK12、CK 13、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19和CK2)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、N-钙粘素、E-钙粘素和波形蛋白。由于突变而可能治疗相关的致癌蛋白和致癌基因包含(但不限于)例如WAF、BAX-1、PDGF、JAGGED 1、NOTCH、VEGF、VEGHR、CA1X、MIB1、MDM、PR、ER、SELS、SEM1、PI3K、AKT2、TWIST1、EML-4、DRAFF、C-MET、ABL1、EGFR、GNAS、MLH1、RET、MEK1、AKT1、ERBB2、HER2、HNF1A、MPL、SMAD4、ALK、ERBB4、HRAS、NOTCH1、SMARCB1、APC、FBXW7、IDH1、NPM1、SMO、ATM、FGFR1、JAK2、NRAS、SRC、BRAF、FGFR2、JAK3、RA、STK11、CDH1、FGFR3、KDR、PIK3CA、TP53、CDKN2A、FLT3、KIT、PTEN、VHL、CSF1R、GNA11、KRAS、PTPN11、DDR2、CTNNB1、GNAQ、MET、RB1、AKT1、BRAF、DDR2、MEK1、NRAS、FGFR1和ROS1。

内皮细胞分型标记物包含(借助于说明而非限制)例如CD136、CD105/内皮因子、CD144/VE-钙粘素、CD145、CD34、Cd41CD136、CD34、CD90、CD31/PECAM-1、ESAM、VEGFR2/Fik-1、Tie-2、CD202b/TEK、CD56/NCAM、CD73/VAP-2、紧密连接蛋白5、Z0-1和波形蛋白。

转移潜能生物标记物包含但限于尿激酶纤溶酶原激活物(urokinaseplasminogen activator，uPA)、纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)、CD95、丝氨酸蛋白酶(例如纤溶酶和ADAM)；丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如Bikunin)；基质金属蛋白酶(例如MMP9)；基质金属蛋白酶抑制因子(例如TIMP-1)。化学抗性生物标记物包含(借助于说明而非限制)PL2Lpiwi样、5T4、ADLH、β-整合素、α6整合素、c-kit、c-met、LIF-R、CXCR4、ESA、CD 20、CD44、CD133、CKS、TRAF2和ABC转运蛋白；缺乏CD45或CD31但含有CD34的癌细胞指示癌症干细胞；以及含有CD44但缺乏CD24的癌细胞。

在本文中的方法中，白细胞可以作为非罕见细胞排除掉。举例来说，例如(但不限于)CD45、CTLA-4、CD4、CD6S和CDS等存在于白细胞上的标记物可以用于指示细胞不是所关注的罕见细胞。在一特定非限制性实例中，CD45抗原(又称为蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型C或PTPRC并且最初称为白细胞共同抗原)适用于检测所有白细胞。

另外，CD45可以用于分化可能被视为罕见细胞的不同类型的白血细胞。举例来说，粒细胞由CD45+、CD15+指示；单核细胞由CD45+、CD14+指示；T淋巴细胞由CD45+、CD3+指示；T辅助细胞由CD45+、CD3+、CD4+指示；细胞毒性T细胞由CD45+、CD3+、CDS+指示；β-淋巴细胞由CD45+、CD19+或CD45+、CD20+指示；凝血细胞由CD45+、CD61+指示；并且自然杀伤细胞由CD16+、CD56+和CD3-指示。此外，两种常用的CD分子，即CD4和CD8，一般分别用作T辅助细胞和细胞毒性T细胞的标记物。这些分子与CD3+组合界定，因为一些其它白细胞也表达这些CD分子(一些巨噬细胞表达低水平的CD4；树突状细胞表达高水平的CDS)。

在其它情况下，罕见细胞是病原体，包含(但不限于)革兰氏阳性细菌(例如肠球菌属B群链球菌(Group B streptococcus)、凝固酶阴性葡萄球菌属草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和腐生葡萄球菌(saprophyicus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和其抗性菌株)；酵母，包含(但不限于)白色念珠菌(Candida albicans)；革兰氏阴性细菌，例如(但不限于)大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和类白喉菌(Diphtheroids)(gnb)和其抗性菌株；病毒，例如(但不限于)HIV、HPV、Flu和MERSA；以及性传播疾病。在检测罕见细胞病原体的情况下，加入包括结合于罕见细胞病原体群体的结合搭配物的粒子试剂。另外，对于病原体上细胞目标罕见分子的每个群体来说，加入包括结合于群体中的细胞目标罕见分子的针对细胞目标罕见分子的结合搭配物的试剂。

短语“非细胞目标罕见分子”是指未结合于细胞和/或在样品中自由循环的目标罕见分子。这类非细胞的目标罕见分子包含可用于疾病的医疗诊断的生物分子，包含(但不限于)例如用于检测癌症、心肌损害、心血管疾病、神经疾病、止血、胎儿母体评估、繁殖力、骨骼状态、激素水平、维生素、过敏、自身免疫性疾病、高血压、肾病、糖尿病、肝病、感染性疾病的生物标记物和可用于疾病的医疗诊断的其它生物分子。

如上文所提及，在一些情况下，目标罕见分子的一个或多个群体可以是非细胞的目标罕见分子的群体。在这类情况下，对于非细胞的目标罕见分子的每个群体来说，加入捕捉粒子实体，其包括非细胞的目标罕见分子的结合搭配物，该结合搭配物结合于群体中的非细胞的目标罕见分子以形成粒子结合的非细胞的目标罕见分子，由此得到呈微粒形式的非细胞的目标罕见分子，以增强非细胞的目标罕见分子的一种或不同群体的浓度超过非罕见分子，从而形成浓缩样品。

粒子的组成可以是有机或无机的、磁性或非磁性的。有机聚合物包含(借助于说明而非限制)硝化纤维、乙酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(苯乙烯/二乙烯基苯)、聚(苯乙烯/丙烯酸酯)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、三聚氰胺树脂、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)，例如本身使用或结合其它材料使用且包含其乳胶、微米粒子和奈米粒子形式。粒子还可以包括例如碳(例如碳纳米管)、金属(例如金、银和铁，包含其金属氧化物)、胶体、树枝状分子、树突、核酸、支链DNA和脂质体。

粒子实体的粒子直径取决于例如以下一个或多个：目标罕见分子的性质、样品的性质、基本上无吸收性的膜的性质和孔径、粒子对膜的粘附性、粒子的表面、基本上无吸收性的膜的表面、液体离子强度、液体表面张力和液体中的组分以及附接的亲和剂和MS标记前体的数目、大小、形状和分子结构。粒子直径必须足够大以减小背景影响到可接受的水平，但不应大到引起分离粒子与非罕见分子的效率低。在根据本文所述的原理的一些实例中，粒子的平均直径应至少约0.02微米(20nm)并且不超过约200微米，或不超过约120微米。在一些实例中，粒子具有例如约0.1微米到约20微米，或约0.1微米到约15微米，或约0.1微米到约10微米，或约0.02微米到约0.2微米，或约0.2微米到约1微米，或约1微米到约5微米，或约1微米到约20微米，或约1微米到约15微米，或约1微米到约10微米，或约5微米到约20微米，或约5到约15微米，或约5到约10微米，或约6到约15微米，或约6到约10微米的平均直径。在一些实例中，粒子对表面的粘附性强到粒子直径可以小于基本上无吸收性的膜的孔径。在其它实例中，粒子足够大于基本上无吸收性的膜的孔径，使得物理上粒子无法穿过基本上无吸收性的膜的孔隙掉落。

捕捉粒子实体还包含对非细胞的目标罕见分子具有特异性的结合搭配物。短语“结合搭配物”是指作为特异性结合对的一员的分子。特异性结合对的一员是如下两个不同分子中的一个，其表面或腔中具有一个区域，该区域特异性结合于另一分子的特定空间和极性组织并且由此定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补。特异性结合对的成员可以是例如抗原-抗体或半抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、酶-底物、核酸双螺旋、IgG-蛋白A等免疫学对和例如DNA-DNA或DNA-RNA等多核苷酸对的成员。结合搭配物可以共价或非共价结合于粒子试剂的粒子。“非共价”意指结合搭配物由于氢键、范德华力、静电力、疏水性作用、物理包埋于粒子中和带电相互作用中的一种或多种而结合于粒子。“共价”意指结合搭配物通过键或连接基团结合于粒子，连接基团可以是脂肪族或芳香族并可以包括具有2到约60个或更多个包含碳、氧、硫、氮和磷的原子的链。

在一些实例中，将样品从受试者身体收集到合适的容器中，容器例如(但不限于)杯子、袋子、瓶子、毛细管或针。血液样品可以收集到VACUTAINER(血液收集管，可购自BD)。容器可以含有递送样品的收集介质。收集介质通常是无水介质并且可以包括当与血液样品混合时有效实现血液样品中的血小板失活的量的血小板失活剂。

血小板失活剂包含(但不限于)螯合剂，例如包括三乙酸部分或其盐、四乙酸部分或其盐、五乙酸部分或其盐或六乙酸部分或其盐的试剂。在一些实例中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)和其盐或乙二醇四乙酸酯(EGTA)和其盐。血小板失活剂的有效量取决于例如以下一种或多种：血小板失活剂的性质、血液样品的性质、血小板活化水平和离子强度。在一些实例中，对于EDTA作为抗血小板剂来说，容器中无水EDTA的量是将产生约1.0到约2.0mg/mL的血液或约1.5mg/mL的血液的浓度的量。血小板失活剂的量是足够实现血小板失活至少约90％或至少约95％或至少约99％的量。

如上文所提及，任选地，增强目标罕见分子的一种或多种不同群体的浓度超过非罕见分子，以形成浓缩样品。在一些实例中，在样品接触基本上无吸收性的膜前，样品经受使用多孔基质的过滤程序，该多孔基质保留目标罕见分子，同时允许非罕见分子穿过多孔基质，由此增强目标罕见分子的浓度。在一种或多种目标罕见分子是非细胞，即，未与细胞或其它生物粒子缔合的情况下，样品与一种或多种捕捉粒子实体组合，其中每个捕捉粒子实体包括非细胞目标罕见分子每一群体的非细胞目标罕见分子的结合搭配物，使得非细胞的目标罕见分子呈微粒形式，即形成粒子结合的非细胞的目标罕见分子。样品与捕捉粒子实体的组合保持在允许非细胞的目标罕见分子与捕捉粒子实体的对应结合搭配物结合的温度下一段时间。通常采用中等温度，其可以在约5℃到约70℃或约15℃到约70℃或约20℃到约45℃范围内。培育期时间段是例如约0.2秒到约6小时，或约2秒到约1小时，或约1分钟到约5分钟。

样品与基本上无吸收性的膜接触的时间段可能取决于例如以下一个或多个：目标罕见细胞和/或粒子结合的目标罕见分子的不同群体的性质和大小、基本上无吸收性的膜的性质、基本上无吸收性的膜的孔径、施加于基本上无吸收性的膜上的样品的真空度、待过滤的体积和基本上无吸收性的膜的表面积。在一些实例中，接触时间是约1分钟到约1小时、约5分钟到约1小时或约5分钟到约45分钟，或约5分钟到约30分钟，或约5分钟到约20分钟，或约5分钟到约10分钟，或约10分钟到约1小时，或约10分钟到约45分钟，或约10分钟到约30分钟，或约10分钟到约20分钟。

在本文中的方法中，对于目标罕见分子的每个不同群体，未浓缩或浓缩的样品可以与包括对目标罕见分子的一种群体的目标罕见分子具有特异性并与其结合的结合搭配物的亲和剂一起培育。亲和剂还包括MS标记前体或第一改变剂，该第一改变剂促进MS标记从每个不同MS标记前体形成或从亲和剂释放包括MS标记前体的实体。在许多实例中，以上组合提供于水性介质中，水性介质可以仅仅是水或也可以含有有机溶剂，例如极性非质子溶剂；极性质子溶剂，如例如二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、有机酸或醇；以及可与水混溶的非极性溶剂，如例如二噁烯，量为按体积计约0.1％到约50％，或约1％到约50％，或约5％到约50％，或约1％到约40％，或约1％到约30％，或约1％到约20％，或约1％到约10％，或约5％到约40％，或约5％到约30％，或约5％到约20％，或约5％到约10％。在一些实例中，水性介质的pH值通常是中等pH值。在一些实例中，水性介质的pH值是约5到约8，或约6到约8，或约7到约8，或约5到约7，或约6到约7，或生理pH值。多种缓冲液可以用于实现所需pH值并在任何培育期期间维持pH值。例示性缓冲液包含(但不限于)硼酸盐、磷酸盐(例如磷酸盐缓冲生理食盐水)、碳酸盐、TRIS、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。

采用的水性介质的量取决于大量因素，例如(但不限于)样品的性质和量、试剂的性质和量、目标罕见细胞的稳定性和目标罕见分子的稳定性。在一些实例中，每10mL样品的水性介质的量是约5mL到约100mL，或约5mL到约80mL，或约5mL到约60mL，或约5mL到约50mL，或约5mL到约30mL，或约5mL到约20mL，或约5mL到约10mL，或约10mL到约100mL，或约10mL到约80mL，或约10mL到约60mL，或约10mL到约50mL，或约10mL到约30mL，或约10mL到约20mL，或约20mL到约100mL，或约20mL到约80mL，或约20mL到约60mL，或约20mL到约50mL，或约20mL到约30mL。

在目标罕见分子中的一种或多种是细胞的一部分的情况下，水性介质还可以包括用于溶解细胞的溶解剂。溶解剂是破坏细胞膜的完整性，由此释放细胞的细胞内内含物的化合物或化合物的混合物。溶解剂的实例包含(但不限于)例如非离子型清洁剂、阴离子型清洁剂、两性清洁剂、低离子强度水溶液(低渗溶液)、细菌剂、脂族醛和引起补体依赖性溶解的抗体。多种辅助物质可以存在于稀释介质中。水性介质中的所有物质都以足以实现所需作用或功能的浓度或量存在。

在一些实例中，在目标罕见分子中的一种或多种是细胞的一部分的情况下，可能需要固定样品的细胞。细胞的固定使细胞固定并保持细胞结构且维持细胞处于近似于细胞处于类似体内的条件下的条件下和所关注的抗原能够被特定亲和剂识别的条件下。采用的固定剂的量是保持细胞，但不会在随后测定中导致错误结果的量。固定剂的量可能取决于例如固定剂的性质和细胞的性质中的一种或多种。在一些实例中，固定剂的量是以重量计约0.05％到约0.15％或约0.05％到约0.10％或约0.10％到约0.15％。用于固定细胞的试剂包含(但不限于)例如交联剂，例如醛类试剂(如例如甲醛、戊二醛和多聚甲醛)；醇(如例如C1-C5醇，例如甲醇、乙醇和异丙醇)；酮(例如C3-C5酮，例如丙酮)。名称C1-C5或C3-C5是指醇或酮中的碳原子数目。可以使用缓冲水性介质，在固定细胞上进行一个或多个洗涤步骤。

必要时，在固定后，细胞制剂还可以进行渗透。在一些情况下，例如醇(例如甲醇或乙醇)或酮(例如丙酮)等固定剂也引起渗透并且不需要额外渗透步骤。渗透使得能够穿过细胞膜接近所关注的目标分子。采用的渗透剂的量是破坏细胞膜并且使得能够接近目标分子的量。渗透剂的量取决于渗透剂的性质和细胞的性质和量中的一种或多种。在一些实例中，渗透剂的量是约0.01％到约10％，或约0.1％到约10％。用于细胞渗透的试剂包含(但不限于)醇(如例如C1-C5醇，例如甲醇和乙醇)；酮(例如C3-C5酮，例如丙酮)；清洁剂(如例如皂苷、TRITON X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚缓冲液，可购自西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))和TWEEN-20(聚山梨醇酯20，可购自西格玛奥德里奇)。可以使用缓冲水性介质，在渗透过的细胞上进行一个或多个洗涤步骤。

如上文所提及，本文中的方法中所采用的亲和剂是对目标罕见分子具有特异性的试剂。亲和剂是特异性结合对的一员，该特异性结合对的一员是如下两个不同分子中的一个，其表面或腔中具有一个区域，该区域特异性结合于另一分子的特定空间和极性组织并且由此定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补。特异性结合对的成员可以是例如抗原-抗体或半抗原-抗体等免疫学对的成员，不过其它特异性结合对包含例如生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、酶-底物、适体、核酸双螺旋、IgG-蛋白A和例如DNA-DNA、DNA-RNA等核酸对。在细胞的情况下，亲和剂是特异性地识别或结合于与细胞缔合的目标分子抗原的试剂。

特异性结合包含与基本上不太识别其它分子相比，两种不同分子中的一种特异性识别另一种。另一方面，非特异性结合包含分子之间的相对独立于特定表面结构的非共价结合。非特异性结合可能由包含分子之间的疏水性相互作用在内的若干因素引起。

用于免疫测定中以鉴别细胞的对目标分子具有特异性的抗体可以是单克隆或多克隆的。这类抗体可以通过所属领域中众所周知的技术制备，例如宿主免疫接种和收集血清(多克隆)，或制备连续杂交细胞系和收集分泌蛋白(单克隆)，或克隆和表达至少编码天然抗体特异性结合所需的胺基酸序列的核苷酸序列或其诱变型式。

抗体可以包含完整免疫球蛋白或其片段，该等免疫球蛋白包含多种类别和同型，例如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可以包含例如Fab、Fv和F(ab')₂和Fab'。另外，适当时可以使用免疫球蛋白的聚集体、聚合物和结合物或其片段，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。

多克隆抗体和单克隆抗体可以通过所属领域中众所周知的技术制备。举例来说，在一种方法中，单克隆抗体通过体细胞杂交技术来获得。单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein,《自然(Nature)》265:495-497,1975的标准技术产生。单克隆抗体技术的综述可见于《淋巴细胞融合瘤(Lymphocyte Hybridomas)》,Melchers等人编,Springer-Verlag(纽约1978)；《自然(Nature)》266:495(1977)；《科学(Science)》208:692(1980)；和《酶学方法(Methods of Enzymology)》73(B部分):3-46(1981)。一般来说，单克隆抗体可以通过已知技术来纯化，例如(但不限于)色谱法，例如DEAE色谱法、ABx色谱法和HPLC色谱法；以及过滤。

亲和剂可以是与目标核酸互补的核酸(例如多核苷酸)。多核苷酸是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物形式或其类似物。以下是多核苷酸的非限制性实例∶基因或基因片段的编码区或非编码区、由连接分析界定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质体、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，那么可以在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可以例如通过结合标记组分而进一步修饰。

亲和剂包括MS标记前体或促进MS标记从MS标记前体形成的改变剂，其中MS标记与目标罕见分子的一种群体的目标罕见分子相对应。MS标记允许区分目标罕见分子的一种群体与罕见分子的其它群体。此外，可以选择MS标记，以避免MS分析中质量重叠，避免MS分析中的背景干扰，并允许多路复用。

短语“质谱分析标记”或“MS标记”是指具有独特质量，优选低于3kDA，使得每个独特质量与目标罕见分子的每个不同群体相对应并用于测定目标罕见分子的每个不同群体的存在和/或量的一种分子或一组基团。MS标记是具有界定质量的分子并包含(但不限于)多肽、聚合物、脂肪酸、碳水化合物、有机胺、核酸和有机醇，举例来说，其质量可以通过例如取代和链大小来变化。在聚合物质的情况下，重复单元数目调整成使得质量在不与来自样品的背景质量重叠的区域中。短语“MS标记”还包含被亲和粒子捕捉的分析物、衍生得到分析物离子的衍生的分析物和呈离子形式的未衍生的分析物。MS标记由于结构和电离时的碎片化而产生独特质量图案。

术语“分析物”是指有待检测的分子。示例性分析物包含(借助于说明而非限制)药物、代谢物、农药和污染物。代表性分析物还包含(借助于说明而非限制)生物碱、类固醇、内酰胺、氨基烷基苯、苯并杂环、嘌呤、来源于大麻的药物、激素、包含蛋白质的多肽、免疫抑制剂、维生素、前列腺素、三环抗抑郁剂、抗肿瘤剂、包含多核苷和多核苷酸在内的核苷和核苷酸、包含美沙酮(methadone)、安宁(meprobamate)、血清素、度冷丁(meperidine)、利多卡因(lidocaine)、普鲁卡因胺(procainamide)、乙酰普鲁卡因胺(acetylprocainamide)、普萘洛尔(propranolol)、灰黄霉素(griseofulvin)、丙戊酸、丁酰苯(butyrophenone)、抗组胺剂、氯胺苯醇(chloramphenicol)、抗胆碱能药物的混杂个别药物以及所有上述物质的代谢物和衍生物。还包含与疾病病况相关的代谢物；氨基糖苷类，例如庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamicin)、托普霉素(tobramycin)和阿米卡星(amikacin)；和农药，例如多卤化联苯、磷酸酯、硫代磷酸酯、氨基甲酸酯和多卤化亚磺酰胺和其代谢物和衍生物。术语“分析物”还包含多肽和蛋白质、多糖和核酸中的两种或超过两种的组合。这类组合包含例如细菌、病毒、染色体、基因、线粒体、细胞核和细胞膜的组分。蛋白质分析物包含例如免疫球蛋白、细胞因子、酶、激素、癌症抗原、营养标记物和组织特异性抗原。这类蛋白质包含(借助于说明而非限制)鱼精蛋白、组蛋白、白蛋白、球蛋白、硬蛋白质、磷蛋白质、粘蛋白、色素蛋白、脂蛋白、核蛋白、糖蛋白、T细胞受体、蛋白多糖、HLA、未分类蛋白质(例如促生长素、促乳素、胰岛素、胃蛋白酶)、在人类血浆中发现的蛋白质、凝血因子、蛋白质激素(如例如促卵泡激素、促黄体激素、促黄体素、促乳素、绒膜促性腺激素)、组织激素、细胞因子、癌症抗原(如例如PSA、CEA、α-胎蛋白、酸性磷酸酶、CA19.9、CA15.3和CA125)、组织特异性抗原(如例如碱性磷酸酶、肌血球素、CPK-MB和降血钙素)和肽激素。所关注的其它聚合物质是粘多糖和多糖。如上文所指出，术语分析物进一步包含寡核苷酸和多核苷酸分析物，例如m-RNA、r-RNA、t-RNA、DNA和DNA-RNA双螺旋。

“MS标记前体”是在改变剂作用下产生MS标记的任何分子。MS标记前体本身可以是通过改变剂的作用，通过裂解、通过与部分反应、通过衍生或通过加入或通过减去分子、电荷或原子或上述两个或更多个的组合转化成另一MS标记的MS标记。

术语“改变剂”是指能够改变MS标记前体的物质。在某些实施例中，改变剂能够与MS标记前体相互作用，获得具有在约1Da到约3kDa范围内或在约1Da到约50Da范围内或在约50Da到约150Da范围内或在约150Da到约700Da范围内或在约700Da到约3kDa范围内的独特质量的MS标记。在一些实例中，MS标记的独特质量低于约3kDa。MS标记前体可以通过键破坏，形成中性、负离子或正离子或自由基来改变。改变剂对MS标记前体的改变可以通过加入原子、电荷或电子到MS标记前体或从MS标记前体减去原子、电荷或电子或通过使MS标记前体中的键裂解或键而形成。改变剂包含(但不限于)化学试剂，例如(但不限于)催化剂(例如酶(包含假酶)和金属)、氧化剂、还原剂、酸、碱、促进取代反应或置换反应的试剂；以及电离试剂。在一些实例中，改变剂通过促进MS标记前体与部分反应以形成例如MS标记来促进MS标记从MS标记前体形成。在一些实例中，改变剂通过促进MS标记从MS标记前体释放来促进MS标记从MS标记前体形成。

MS标记前体的性质可能取决于例如以下一种或多种：MS标记的性质、采用的MS方法的性质、采用的MS检测器的性质、目标罕见分子的性质、亲和剂的性质、采用的任何免疫测定的性质、样品的性质、采用的任何缓冲液的性质、分离的性质。在一些实例中，MS标记前体是质量可以通过取代和/或链大小而变化的分子。由MS标记前体产生的MS标记是不应存在于待分析的样品中的具有界定质量的分子。此外，MS标记应在MS检测器检测到的范围内，不应具有重叠质量并且应可以通过初级质量检测。用于本发明的方法中的MS标记前体的实例(借助于说明而非限制)包含(借助于说明而非限制)多肽、有机和无机聚合物、脂肪酸、碳水化合物、环状烃、脂肪族烃、芳香族烃、有机羧酸、有机胺、核酸、有机醇(例如烷基醇、酰基醇、酚类、多元醇(例如二醇)、硫醇、环氧化物、伯胺、仲胺和叔胺、吲哚、叔铵和季铵化合物、氨基醇、氨基硫醇、酚类胺、吲哚羧酸、酚类酸、插烯酸、羧酸酯、磷酸酯、羧酰胺、来自聚酰胺和聚酯的羧酸、腙、三甲基硅烷基烯醇醚、缩醛、缩酮、氨基甲酸酯、脲、胍、异氰酸酯、磺酸、磺酰胺、磺酰脲、硫酸酯、单酸甘油酯、甘油醚、神经鞘胺醇碱、神经胺、脑苷脂、类固醇、前列腺素、碳水化合物、核苷和治疗药物。

MS标记前体可以包含1到约100,000个MS标记，或约10到约100,000个MS标记，或约100到约100,000个MS标记，或约1,000到约100,000个MS标记，或约10,000到约100,000个MS标记。MS标记前体可以由蛋白质、多肽、聚合物、粒子、碳水化合物、核酸、脂质或能够通过附接包含MS标记的多个重复单元的其它大分子构成。多个MS标记允许扩增，因为每个MS标记前体可以产生许多MS标记。

在多肽MS标记前体下，举例来说，多肽的链长可以调整，得到处于不具有背景峰的质量区域中的MS标记。此外，MS标记可以由具有独特质量的不存在于测试的样品中的MS标记前体产生。多肽MS标记前体可以包括其它氨基酸或衍生氨基酸，这允许方法多路复用，从而一次获得超过一个结果。多肽MS标记前体的实例包含(但不限于)例如聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚半胱氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚甲硫氨酸、聚脯氨酸、聚苯丙氨酸、聚酪氨酸、聚色氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚天冬酰胺、聚谷氨酰胺、聚组氨酸、聚赖氨酸和聚精氨酸。通过氨基酸或衍生氨基酸的混合物来区分的多肽MS标记前体产生具有偶数或奇数选择离子的有或无自由基的质量。在一些实例中，多肽能够通过催化来改性。举例来说，借助于说明而非限制，苯酚和芳族胺可以加入聚苏氨酸，使用过氧化酶作为催化剂。在另一实例中，借助于说明而非限制，使用过氧化酶作为催化剂，电子可以转移到芳香族胺。在另一实例中，借助于说明而非限制，使用磷酸酶作为催化剂，可以从有机磷酸酯中移出磷酸酯。

在另一实例中，借助于说明而非限制，衍生剂用作部分以从MS标记前体产生MS标记。举例来说，二硝基苯基和其它硝基苯基衍生物可以由MS标记前体形成。其它实例包含(借助于说明而非限制)酯化、酰化、硅烷化、保护性烷基化、通过酮-碱缩合(例如希夫碱(Schiffbase))衍生、环化、形成荧光衍生物和无机阴离子。衍生反应可以在MS分析前，但在亲和力反应后进行微观反应，或用于产生结合于亲和试剂的MS标记前体。

在一些实例中，MS标记前体可以包括同位素，例如(但不限于)²H、¹³C和¹⁸O，其保留在衍生自MS标记前体的MS标记中。MS标记可以通过初级质量或电离后的二级质量检测。在一些实例中，MS标记前体是具有相对较高的引起键裂解的潜能的MS标记前体，例如(但不限于)烷基化胺、缩醛、伯胺和酰胺，例如其中MS标记可以产生具有偶数或奇数选择离子的有或无自由基的质量。多肽的选择可以产生独特的MS谱特征。

如上文所提及，改变剂可以是酶(其包含假酶)。在一些实例中，催化可以在用例如以下各物固定的水不溶性酶衍生物下进行：硅胶、木炭、DEAE-纤维素、DEAE-SEPHADEX(交联葡聚糖凝胶，可购自西格玛奥德里奇)、纤维素柠檬酸盐、高岭土、纤维素磷酸盐、酸性粘土、AMBERLITE XE-97(由Rohm&Haas制造的羧酸阳离子交换树脂)、羧甲基纤维素、玻璃、石英、dowex-50、淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚氨基酸或氨基苯甲基纤维素。交联剂可以用于固定酶。这类交联剂包含(但不限于)例如戊二醛、己二亚胺酸二甲酯、碳化二亚胺、顺丁烯二酸酐、MDA亚甲基二苯胺、酰肼和酰基叠氮化物。

在一些实例中，根据本文所述的原理的用于达成目的的酶是具有高转换率的任何酶，其可以将酶底物(例如MS标记前体)转化成在未转化的底物存在下被质谱仪的质量检测器检测到的MS标记。酶不应在测试的样品中，或如果存在于样品中，必须在测试前将其从样品中去除。适合于达成此目的的酶的实例包含(但不限于)例如磷酸酶(例如碱性磷酸酶、脂质磷酸酶、酪氨酸磷酸酶、丝氨酸磷酸酶、苏氨酸磷酸酶和组氨酸磷酸酶)；氧化酶(例如辣根过氧化物酶、铜胺氧化酶、D-氨基酸氧化酶、半乳糖氧化酶、血浆胺氧化酶、色氨酸过氧化酶、尿酸酶氧化酶和黄嘌呤氧化酶)；β-半乳糖苷酶；转移酶(例如D-丙氨酸转移酶、糖基转移酶、酰基转移酶、烷基转移酶、芳基转移酶、单碳转移酶、酮转移酶、醛转移酶、含氮转移酶、磷转移酶、硫转移酶和戊糖基转移酶)；肽酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶(凝乳酶)、肾素、凝血酶、胰蛋白酶、基质金属肽酶、组织蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和羧基肽酶)；醛缩酶(例如羧基醛缩酶、醛醛缩酶、含氧酸、色氨酸酶)；脂肪酸酶(例如脂肪酸胺水解酶、脂肪酸合成酶和胆碱乙酰基转移酶)和上述两种或更多种的组合(例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、过氧化酶、酰化酶、天冬酰胺酶、催化酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、转化酶、脂肪酶、葡萄糖磷酸变位酶、核糖核酸酶、乙酰胆碱酯酶、醇脱氢酶、醛缩酶、胆碱酯酶、柠檬酸合成酶、尿素酶、戊基葡萄糖苷酶、羧基肽酶、胆碱酯酶、荧光素酶、核糖核酸酶、丙酮酸激酶和枯草杆菌蛋白酶中的两种或更多种)。

用于酶的底物是包括在酶对底物的作用下释放的MS标记的MS标记前体。可以是酶底物的一部分的这类MS标记包含(借助于说明而非限制)例如酚类(来自例如磷酸对硝基苯酯、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷、氨基酸、肽、碳水化合物(6-磷酸基-D-葡糖酸酯)、脂肪酸(乙酰基-CoA)、烷基胺、甘油等底物)；以及萘酚(来自例如磷酸对硝基萘酯、对硝基-萘基-β-D-半乳糖苷等底物)。

可以用于从附接到亲和剂的部分释放MS标记的金属包含(但不限于)例如过渡金属(例如钯、铂、金、钌、铑或铱)、螯合金属(例如铁、铜、钴、镁与乙二胺四乙酸酯(EDTA)络合、N-(2-羟基乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)或反式-1,2-环己烷二胺四乙酸(CDTA))、金属氧化剂(例如次氯酸钠、高碘酸钾、氧化银、铬酸、高锰酸钾和过硼酸钠)和金属还原剂(例如氢化锂铝、硼氢化钠、抗坏血酸钠、亚磷酸盐和钠)。

MS标记可以直接检测或释放的MS标记可以进一步与另一化合物反应以形成衍生MS标记，通过MS技术检测衍生MS标记。衍生MS标记是由获自MS标记前体的MS标记形成的化合物，其中该化合物也可以由MS技术来检测。这种形成衍生MS标记的方法进一步增强了根据本文所述的原理的方法的多路复用能力。举例来说，释放的苯酚或萘酚可以在过氧化酶存在下与芳香族胺偶合(参见例如美国专利第5,182,213号，其相关公开内容以引用的方式并入本文中)。在一个实例中，释放的萘酚与例如α-苯二胺二盐酸盐等苯二胺在过氧化活性物质存在下在碱性介质中偶合，产生衍生MS标记。可以使用不同萘酚和/或不同苯二胺实现多路复用。

内标是质谱分析的一个重要方面。在一些实例中，除了用于检测罕见目标分子的MS标记外，还可以加入可以测量的第二质量标记(作为内标)。内标的结构与MS标记类似，质量略微变化。可以制备包括额外氨基酸或衍生氨基酸的内标。可替代地，内标可以通过并入例如(但不限于)²H(D)、¹³C和¹⁸O的同位素标记来制备。MS同位素标记具有高于天然存在的物质的质量。举例来说，同位素标记的MS标记，例如甘油-C-d7、乙酸钠-C-d7、丙酮酸钠-C-d7、D-葡萄糖-C-d7、氘化葡萄糖和右旋糖-C-d7，将分别充当甘油、乙酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖和右旋糖的内标。

MS标记前体或改变剂可以通过键直接共价附接或通过中间连接基团附接到亲和剂(得到改性的亲和剂)。在一些实施例中，改性的亲和剂的制备可以通过采用适合于通过直接键将MS标记前体或改变剂附接到亲和剂的官能团来进行。采用的官能团的性质取决于例如以下一个或多个：MS标记前体的性质、改变剂的性质和亲和剂的性质，包含如例如可以是亲和剂的一部分的载体粒子和标记粒子的一个或多个不同粒子的性质。大量合适的官能团可用于附接到氨基和醇；这类官能团包含例如活化酯，包含例如羧酸酯、亚胺酯、磺酸酯和磷酸酯；活化亚硝酸酯；醛；酮；以及烷基化剂。

连接基团可以是具有1到约60个或更多个原子或1到约50个原子或1到约40个原子或1到30个原子或约1到约20个原子或约1到约10个原子的链，原子各独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷、通常碳和氧组成的群组。连接基团中的杂原子数目可以在约0到约8、约1到约6或约2到约4的范围内。连接基团的原子可以被除氢外的原子取代，原子例如为碳、氧和氮中的一个或多个，呈例如烷基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基形式。一般说来，为了方便合成，可以任意选择特定连接基团的长度，其限制条件为在连接的分子能够执行与本文中所公开的方法相关的功能下连接基团造成的干扰最小。

连接基团可以是脂肪族或芳香族。当存在杂原子时，氧将通常呈氧基或氧代基存在，键结于碳、硫、氮或磷；硫将通常呈硫醚或硫羰基存在；氮将通常呈硝基、亚硝基或氨基存在，通常键结于碳、氧、硫或磷；磷将通常键结于碳、硫、氧或氮，通常呈膦酸酯和磷酸酯单酯或二酯。连接基团中存在的官能团可以包含酯、硫酯、酰胺、硫酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮基、硫醚、羧酸酯等等。连接基团还可以是大分子，例如多糖、肽、蛋白质、核苷酸和树枝状分子。

在一些实施例中，视具体情况，MS标记前体或改变剂和亲和剂可以非共价地连接在一起。采用结合对、通常特异性结合对的成员，其中一个成员连接到亲和剂并且另一成员连接到MS标记前体或改变剂。结合对成员的结合引起亲和剂与MS标记前体或改变剂的非共价连接。结合对成员可以直接连接到MS标记前体或改变剂和亲和剂中的一或两个，或通过中间连接基团间接连接，上文所论述连接基团的性质。在一些实例中，特异性结合对的成员具有相对较高的结合常数，例如(借助于说明而非限制)抗生物素蛋白(抗生蛋白链菌素)-生物素结合、荧光素(FITC)和用于FITC的抗体、若丹明(德克萨斯红)和用于若丹明的抗体、毛地黄皂苷(DIG)和用于DIG的抗体、非人类物种抗体(例如山羊、兔、小鼠、鸡、绵羊)和抗物种抗体。

改性的亲和剂可以通过在单独的个别反应中将每个不同亲和剂连接到MS标记前体或改变剂且接着组合改性的亲和力剂以形成包括改性的亲和剂的混合物来制备。可替代地，不同亲和剂可以组合并且可以在组合上进行将亲和剂连接到MS标记前体或改变剂的反应。这允许方法多路复用，一次获得超过一个结果。

本发明的方法中采用的每个不同的改性的亲和剂的量取决于例如以下一个或多个：目标罕见分子的每个不同群体的性质和可能量、MS标记的性质、亲和剂的性质、细胞(如果存在)的性质、粒子(如果采用)的性质以及阻断剂(如果采用)的量和性质。在一些实例中，采用的每个不同的改性的亲和剂的量是约0.001μg/μL到约100μg/μL，或约0.001μg/μL到约80μg/μL，或约0.001μg/μL到约60μg/μL，或约0.001μg/μL到约40μg/μL，或约0.001μg/μL到约20μg/μL，或约0.001μg/μL到约10μg/μL，或约0.5μg/μL到约100μg/μL，或约0.5μg/μL到约80μg/μL，或约0.5μg/μL到约60μg/μL，或约0.5μg/μL到约40μg/μL，或约0.5μg/μL到约20μg/μL，或约0.5μg/μL到约10μg/μL。

采用的改变剂数目可以是每个采用的MS标记前体一个，或每两个MS标记前体一个，或每三个MS标记前体一个，多达所有MS标记前体一个，这取决于以下一个或多个：MS标记前体的性质、改变剂的性质、改变剂在介质中是自由还是改性的亲和剂的一部分、以及使用的不同亲和试剂的性质和数目。举例来说，在每个MS标记前体包含不同MS标记与亲和剂的不稳定酯键或不稳定酰胺键的情况下，可以采用引起二硫键、酯键或酰胺键水解以得到不同MS标记的单个改变剂。在利用一种改变剂的其它实例中，或可以采用比MS标记前体数目少的改变剂。在另一实例中，不同改变剂可以用于针对使用的每个不同类型的亲和剂产生MS标记。

在水性介质中包括样品(任选地浓缩)和改性的亲和剂的组合通过保持在使改性的亲和剂与细胞上或粒子试剂上的目标罕见分子结合的温度下一段时间来处理。对于包括改变剂的每个改性的亲和剂，改变剂所作用于的MS标记前体包含于其中使MS标记前体转化成MS标记的组合中。在一些实例中，加入额外部分，其中改变剂促进该部分与MS标记前体的反应，从而产生MS标记。在一些实例中，改性的亲和剂包括MS标记前体并且改变剂作为介质中未结合的物质包含于组合中。在此实例中，改变剂作用于亲和剂的MS标记前体以产生MS标记。在一些实例中，采用从亲和剂释放包括MS标记前体的实体的第一改变剂，并且随后采用第二改变剂以促进MS标记从MS标记前体形成。

此处理的温度和持续时间取决于例如样品的性质、目标罕见分子的性质、非罕见分子的性质、改性的亲和剂的性质、MS标记前体的性质和改变剂的性质。在一些实例中，通常采用中等温度并且通常是恒定温度，优选室温。在保持期期间的温度通常在例如约5℃到约99℃或约15℃到约70℃或约20℃到约45℃的范围内。保持期是例如约0.2秒到约24小时，或约1秒到约6小时，或约2秒到约1小时，或约1到约15分钟。时间段取决于例如介质的温度和多种试剂的结合速率。

已经结合于目标罕见分子的改性的亲和剂，即改变剂作用于的亲和剂，任选地与未结合于目标分子的改性的亲和剂分离。在一些实例中，此分离包含减少样品中的非罕见分子的数目。

处理过的样品与基本上无吸收性的膜的接触持续足以实现目标罕见细胞或粒子结合的目标罕见分子保留在基本上无吸收性的膜的表面上，从而获得如上文所论述的具有目标罕见细胞或粒子结合的目标罕见分子的不同群体的基本上无吸收性的膜的表面的时间段。该时间段可能取决于例如以下一个或多个：目标罕见细胞或粒子结合的目标罕见分子的不同群体的性质和大小、多孔基质的性质、多孔基质的孔径、施加于多孔基质上的血液样品的真空度、有待过滤的体积和多孔基质的表面积。在一些实例中，接触时期是例如约1分钟到约1小时、约5分钟到约1小时或约5分钟到约45分钟，或约5分钟到约30分钟，或约5分钟到约20分钟，或约5分钟到约10分钟，或约10分钟到约1小时，或约10分钟到约45分钟，或约10分钟到约30分钟，或约10分钟到约20分钟。

如果第一改变剂不促进MS标记从MS标记前体形成，那么保留物经受第二改变剂，该第二改变剂促进MS标记从MS标记前体，从亲和剂形成。

保留物进行MS分析，以确定每个不同MS标记的存在和/或量。每个不同MS标记的存在和/或量与目标罕见细胞和/或粒子结合的目标罕见分子的每个不同群体的存在和/或量有关。

MS分析确定分子的质荷比(m/z)以进行准确鉴别和测量。MS法可以通过若干技术使分子电离成作为粒子的质量，该等技术可以包含(但不限于)例如大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)、电喷雾电离(electrosprayionization，ESI)、感应电喷雾电离(inductive electrospray ionization，iESI)、化学电离(chemical ionization，CI)和电子电离(EI)、高速原子轰击(fast atom bombardment，FAB)、场解吸/场电离(FC/FI)、热喷雾电离(thermospray ionization，TSP)、纳米喷雾电离。通过若干技术在质量检测器中过滤和分离质量，该等技术包含(借助于说明而非限制)飞行时间(Time-of-Flight，TOF)、离子阱、四极滤质器、区段质量分析、多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)和傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transformion cyclotron resonance，FTICR)。MS法使用例如微通道板、电子倍增器或法拉第杯(Faraday cup)检测分子。MS法可以作为串联MS/MS法重复，其中来自第一MS的带电质量粒子分离到第二MS。

质量分析器包含(但不限于)例如四极、飞行时间(TOF)分析器、扇形磁场、傅里叶变换离子阱和四极离子阱。串联(MS-MS)质谱仪是具有超过一个分析器的仪器。串联质谱仪包含(但不限于)例如四极-四极、扇形磁场-四极、四极-飞行时间。质谱仪的检测器可以是(借助于说明而非限制)例如光电倍增管、电子倍增管或微通道板。

在通过质谱分析进行分析后，每个不同质谱分析标记的存在和/或量与目标罕见细胞和/或粒子结合的目标罕见分子的每个不同群体的存在和/或量有关。MS标记与目标分子之间的关系是通过所采用的对目标分子具有特异性的改性的亲和剂建立。校验仪用于建立来自MS标记的信号的量与样品中的目标罕见分子的量之间的关系。样品可以进行进一步分析。

如上文所提及，基本上无吸收性的膜可以包括超过一个孔隙并且可以启动电场以从个别孔隙选择性地释放液滴。释放的液滴进行质谱分析，以确定与特定MS标记所位于的个别孔隙相邻的区域。移出与该区域相对应的膜上的液体以供分析。与个别孔隙相邻的液体可以通过上述任一方法移出。用于分析的方法包含(但不限于)例如免疫分析、酶扩增、细胞过滤、核酸测序、质量分析、化学分析、核酸扩增、核酸表达、细胞生长和细胞反应测定或其两者或更多者的组合。

在一个实例中，样品被收集到具有合适细胞缓冲液的容器中。所收集的样品进行过滤以浓缩细胞结合的目标罕见分子的数目，超过样品中的其它分子，例如非罕见细胞。将包括连接到对细胞结合的目标罕见分子具有特异性的抗体的改变剂的亲和剂与保留在过滤装置的基本上无吸收性的膜上的浓缩样品组合。合适的培育期后，将膜用缓冲液洗涤。将MS标记前体加入膜上的样品中。亲和剂的改变剂是包括亲和剂和细胞结合的目标分子的免疫复合物的一部分。如果目标罕见分子存在于样品中，那么改变剂作用于MS标记前体以产生与目标罕见分子相对应的MS标记。基本上无吸收性的膜经受电场并且收集MS标记。在一些实施例中，将喷雾液体或喷雾溶剂加入到包括基本上无吸收性的膜的孔中，暴露于电场，并且任选地真空，以从多孔膜释放液滴。如果目标罕见分子存在于样品中，那么MS标记将产生与目标罕见分子相对应的独特谱。此谱可能与膜上的罕见细胞的浓度和位置相关。可以鉴别膜上的罕见细胞的位置，以移出罕见细胞以供进一步分析。在以上实例中，描绘仅仅一个目标罕见分子的检测；然而，应了解，可以在单个方法中使用如上文所论述的多种MS标记前体确定单个样品上的许多目标罕见分子。

在另一实例中，样品被收集到具有合适细胞缓冲液的容器中。所收集的样品进行过滤以浓缩细胞结合的目标罕见分子的数目，超过样品中的其它分子，例如非罕见细胞。将包括连接到对细胞结合的目标罕见分子具有特异性的抗体的MS标记前体的亲和剂与保留在过滤装置的基本上无吸收性的膜上的浓缩样品组合。合适的培育期后，将膜用缓冲液洗涤。将改变剂加入膜上的样品中。亲和剂的MS标记前体是包括亲和剂和细胞结合的目标分子的免疫复合物的一部分。如果目标罕见分子存在于样品中，那么改变剂作用于MS标记前体以产生与目标罕见分子相对应的MS标记。基本上无吸收性的膜经受电场并且收集MS标记。在一些实施例中，将喷雾液体或喷雾溶剂加入到包括基本上无吸收性的膜的孔中，暴露于电场，并且任选地真空，以从多孔膜释放液滴。如果目标罕见分子存在于样品中，那么MS标记将产生与目标罕见分子相对应的独特谱。此谱可能与膜上的罕见细胞的浓度和位置相关。在上述实例中，描绘仅仅一个目标罕见分子的检测；然而，应了解，可以在单个方法中使用如上文所论述的多种MS标记前体确定单个样品上的许多目标罕见分子。

在另一实例中，样品被收集到容器中，并以稀释或未稀释的形式加入到基本上无吸收性的膜中。在此实例中，目标罕见分子非微粒，即目标罕见分子未结合于细胞或其它粒子。将所收集的样品与包括附接针对目标罕见分子的抗体的粒子的粒子试剂组合。在允许未结合细胞的目标罕见分子与粒子上的抗体结合而得到粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子的培育期后，样品经受过滤以浓缩粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子的数目，超过样品中的其它分子，例如非罕见细胞。将保留在过滤装置的表面上的样品用合适缓冲液洗涤。将包括连接到对粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子具有特异性的抗体的改变剂的亲和剂与保留在过滤装置的膜上的浓缩样品组合。合适的培育期后，将膜用缓冲液洗涤。将MS标记前体加入到膜上的样品中。亲和剂的改变剂是包括亲和剂和粒子结合的未结合细胞的目标分子的免疫复合物的一部分。如果目标罕见分子存在于样品中，那么改变剂作用于MS标记前体以产生与目标罕见分子相对应的MS标记。基本上无吸收性的膜经受电场并且收集MS标记。在一些实施例中，将喷雾液体或喷雾溶剂加入到包括基本上无吸收性的膜的孔中，暴露于电场，并且任选地真空，以从多孔膜释放液滴。如果目标罕见分子存在于样品中，那么MS标记将产生与目标罕见分子相对应的独特谱。此谱可能与膜上的罕见细胞的浓度和位置相关。在上述实例中，描绘仅仅一个未结合细胞的目标罕见分子的检测；然而，应了解，可以在单个方法中使用如上文所论述的多种MS标记前体确定单个样品上的许多目标罕见分子(细胞结合与未结合细胞)。

在另一实例中，液体样品被收集到容器中，并以稀释或未稀释的形式加入基本上无吸收性的膜中。在此实例中，目标罕见分子非微粒，即目标罕见分子未结合于细胞或其它粒子。将所收集的样品与包括附接针对目标罕见分子的抗体的粒子的粒子试剂组合。在允许未结合细胞的目标罕见分子与粒子上的抗体结合而得到粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子的培育期后，样品经受过滤以浓缩粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子的数目，超过样品中的其它分子，例如非罕见细胞。将保留在过滤装置的表面上的样品用合适缓冲液洗涤。将包括连接到对粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子具有特异性的抗体的MS标记前体的亲和剂与保留在过滤装置的膜上的浓缩样品组合。合适的培育期后，将膜用缓冲液洗涤。将改变剂加入到膜上的样品中。亲和剂的MS标记前体是包括亲和剂和粒子结合的未结合细胞的目标分子的免疫复合物的一部分。如果目标罕见分子存在于样品中，那么改变剂作用于MS标记前体以产生与目标罕见分子相对应的MS标记。基本上无吸收性的膜经受电场并且收集MS标记。在一些实施例中，将喷雾液体或喷雾溶剂加入到包括基本上无吸收性的膜的孔中，暴露于电场，并且任选地真空，以从多孔膜释放液滴。如果目标罕见分子存在于样品中，那么MS标记将产生与目标罕见分子相对应的独特谱。此谱可能与膜上的罕见细胞的浓度和位置相关。在以上实例中，描绘仅仅一个未结合细胞的目标罕见分子的检测；然而，应了解，可以在单个方法中使用如上文所论述的多种MS标记前体确定单个样品上的许多目标罕见分子(细胞结合与未结合细胞)。

在另一实例中，样品被收集到容器中，并以稀释或未稀释的形式加入到基本上无吸收性的多孔膜中。在此实例中，目标罕见分子非微粒，即目标罕见分子未结合于细胞或其它粒子。将所收集的样品与包括附接针对目标罕见分子的抗体的粒子的粒子试剂组合。在允许未结合细胞的目标罕见分子与粒子上的抗体结合而得到粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子的培育期后，样品经受过滤以浓缩粒子结合的未结合细胞的目标罕见分子的数目，超过样品中的其它分子，例如非罕见细胞。将保留在过滤装置的表面上的样品用合适缓冲液洗涤。将改变剂加入到膜上的样品中，该改变剂使未结合细胞的目标罕见分子转变成MS标记。合适的培育期后，将膜用缓冲液洗涤。如果目标罕见分子存在于样品中，那么改变剂作用于目标罕见分子以产生与目标罕见分子相对应的MS标记。基本上无吸收性的膜经受电荷场并且收集MS标记。在一些实施例中，将喷雾液体或喷雾溶剂加入到包括基本上无吸收性的膜的孔中，暴露于电场，并且任选地真空，以从多孔膜释放液滴。如果目标罕见分子存在于样品中，那么MS标记将产生与目标罕见分子相对应的独特谱。此谱可能与膜上的罕见细胞的浓度和位置相关。在以上实例中，描绘仅仅一个未结合细胞的目标罕见分子的检测；然而，应了解，可以在单个方法中使用如上文所论述的多种MS标记前体确定单个样品上的许多目标罕见分子(细胞结合与未结合细胞)。

采用粒子扩增的方法的实例

如上文所提及，在一种方法中，利用粒子扩增，并且使粒子聚集或群集，以形成包括MS标记或MS标记前体的粒子聚集体。

短语“粒子扩增”是指粒子聚集体或粒子簇的形成，其中指示单一目标罕见分子的大量标记粒子得以增强。在一些实例中，指示目标罕见分子的粒子聚集体中的标记分子数目是10¹⁰:1，或10⁹:1，或10⁸:1，或10⁷:1，或10⁶:1，或10⁵:1，或10⁴:1，或10³:1，或10²:1，或10:1，或10¹⁰:10²，或10¹⁰:10³，或10¹⁰:10⁴，或10¹⁰:10⁵。粒子扩增通过采用与许多较小的标记粒子缔合的较大粒子(载体粒子)来实现，该等较小的标记粒子具有许多与其缔合的MS标记或MS标记前体。

术语“与……缔合”是指两个部分彼此结合的方式。缔合可以通过如上定义的共价或非共价结合。附接可以通过两个部分之间的直接键来实现，或者可以在两个部分之间采用连接基团。连接基团可以例如如上所述。

载体粒子的组成可以例如如上针对捕捉粒子实体所述。载体粒子的大小大到足以容纳一个或多个标记粒子。标记粒子与单个载体粒子的比率可以是例如10⁶:1，或10⁵:1，或10⁴:1，或10³:1，或10²:1，或10:1。载体粒子的直径还可能取决于例如以下一个或多个：目标罕见分子的性质、样品的性质、基本上无吸收性的膜的性质和孔径、粒子对膜的粘附性、粒子表面、膜表面、液体离子强度、液体表面张力和液体中的组分以及缔合的标记粒子的数目、大小、形状和分子结构。当在过滤分离步骤中采用多孔基质时，载体粒子的直径应该大到足以容纳大量标记粒子，从而实现粒子扩增的益处，但小到足以穿过过滤装置的基本上无吸收性的膜的孔隙。在一些实例中，载体粒子的平均直径应该是至少约0.1微米并且不超过约1微米或不超过约5微米。在一些实例中，载体粒子的平均直径是约0.1微米到约5微米，或约1微米到约3微米，或约4微米到约5微米，约0.2微米到约0.5微米，或约1微米到约3微米，或约4微米到约5微米。

标记粒子的组成可以例如如上针对捕捉粒子实体所述。标记粒子的大小可能取决于例如以下一个或多个：载体粒子的性质和大小、改变剂的MS标记或MS标记前体的性质和大小、目标罕见分子的性质、样品的性质、基本上无吸收性的膜的性质和孔径、粒子表面、膜表面、液体离子强度以及液体表面张力和液体中的组分。在一些实例中，标记粒子的平均直径应该至少约0.01微米并且不超过约0.1微米或不超过约1微米。在一些实例中，标记粒子的平均直径是约0.01微米到约1微米，或约0.01微米到约0.5微米，或约0.01微米到约0.4微米，或约0.01微米到约0.3微米，或约0.01微米到约0.2微米，或约0.01微米到约0.1微米，或约0.01微米到约0.05微米，或约0.1微米到约0.5微米，或约0.05微米到约0.1微米。在一些实例中，标记粒子可以是二氧化硅纳米粒子，其可以通过离子缔合连接到具有游离羧酸基的磁性载体粒子。

与标记粒子缔合的MS标记或MS标记前体的数目可能取决于例如以下一个或多个：MS标记或MS标记前体的性质和大小、标记粒子的性质和大小、连接臂的性质、标记粒子上的官能团的数目和类型以及MS标记前体上的官能团的数目和类型。在一些实例中，与单个标记粒子缔合的MS标记或MS标记前体的数目是约10⁷:1，或约10⁶:1，或约10⁵:1，或约10⁴:1，或约10³:1，或约10²:1，或约10:1。

如上文所提及，一些实例是关于疑似含有罕见分子和非罕见分子的一个或多个不同群体的样品中目标罕见分子的一个或多个不同群体的方法。对于目标罕见分子的每个不同群体来说，将其中目标罕见分子呈微粒形式的样品与包括对目标罕见分子的一种群体的目标罕见分子具有特异性并且结合于其的结合搭配物的亲和剂一起培育，该样品具有增强的目标罕见分子的一个或多个不同群体的浓度，超过非罕见分子的浓度。亲和剂包括MS标记前体或第一改变剂。对于目标罕见分子的每个不同群体，亲和剂包括粒子试剂。第一改变剂促进MS标记从MS标记前体形成或从亲和剂释放包括MS标记前体的实体。在培育期间，对于目标罕见分子的每个不同群体，粒子聚集体由亲和剂的粒子试剂形成。通过使培育的样品与基本上无吸收性的膜接触来形成保留物和滤液。保留物安置于基本上无吸收性的膜上。将喷雾液体或喷雾溶剂加入到包括基本上无吸收性的膜的孔中，暴露于电场，并且任选地真空，从多孔膜释放液滴。

在一些实例中，将真空施加于基本上无吸收性的膜上的样品，以促进液滴通过基本上无吸收性的膜的孔隙。施加的真空度可能取决于例如以下一个或多个：罕见细胞和/或粒子试剂的不同群体的性质和大小、基本上无吸收性的膜的性质以及基本上无吸收性的膜的孔径。在一些实例中，施加的真空度是约1毫巴到约100毫巴，或约1毫巴到约80毫巴，或约1毫巴到约50毫巴，或约1毫巴到约40毫巴，或约1毫巴到约30毫巴，或约1毫巴到约25毫巴，或约1毫巴到约20毫巴，或约1毫巴到约15毫巴，或约1毫巴到约10毫巴，或约5毫巴到约100毫巴，或约5毫巴到约80毫巴，或约5毫巴到约50毫巴，或约5毫巴到约30毫巴，或约5毫巴到约25毫巴，或约5毫巴到约20毫巴，或约5毫巴到约15毫巴，或约5毫巴到约10毫巴。真空的施加与电场的施加相配合，因此可以根据本文所述的原理选择性地从包括基本上无吸收性的膜的个别微孔释放液滴。

小滴进行MS分析，以确定每个不同MS标记的存在和/或量。每个不同MS标记的存在和/或量与样品中非细胞目标罕见分子的每个不同群体的存在和/或量有关。以此方式，可以鉴别样品以供进一步分析。在一个方法中，可以通过任何适宜的方法移出含有所关注的物质的基本上无吸收性的膜。这类方法的实例包含(但不限于)例如冲压所关注的基本上无吸收性的膜的部分或过滤。

粒子聚集体的大小取决于例如以下一个或多个：捕捉粒子的性质和大小、载体粒子的性质和大小、标记粒子的性质和大小、连接基团的性质和大小、MS标记或MS标记前体的性质和大小、改变剂的性质、目标罕见分子的性质、样品的性质、过滤基质的性质和孔径、粒子表面、基质表面、液体离子强度以及液体表面张力和液体中的组分。在根据本文所述的原理的一些实例中，粒子聚集体的平均直径是至少约0.1微米并且不超过约500微米，或不超过约1,000微米。在一些实例中，粒子聚集体的平均直径是约0.1微米到约1,000微米，或约0.1微米到约500微米，或约0.1微米到约100微米，或约0.1微米到约10微米，或约0.1微米到约5微米，或约0.1微米到约1微米，或约1微米到约10微米，或约10微米到约500微米，或约10微米到约100微米。

在一个实例中，目标罕见分子附接到细胞表面上，约10微米(μm)的量级。在此实例中具有约1μm的平均直径的载体粒子借助于第一连接基团连接到特定结合搭配物，例如针对目标罕见分子的抗体。第二连接基团以线性方式将其它载体粒子彼此连接。在此实例中，每个细胞的载体粒子数目是约1,000。此外，每个载体粒子约100个标记粒子(直径约200nm)借助于第三连接基团连接至其。对于每个标记粒子，约10⁵个MS标记(质量标记)借助于第四连接基团连接到其。在此实例中，MS标记具有约1nm的大小。连接基团可以选自如上所述的任何连接基团，并且其两个或更多个可以相同，或连接基团中的每一个可以彼此不同。在一些实例中，连接基团中的一个或多个具有可裂解部分，从而使得例如载体粒子可以彼此裂解或自细胞裂解，和/或标记粒子可以自载体粒子裂解，和/或MS标记或MS标记前体可以自标记粒子裂解。多个连接基团的裂解可以依次进行，其中连接基团的可裂解部分彼此不同。

如上文所提及，一个或多个连接基团可以包括可通过裂解剂裂解的可裂解部分。裂解剂的性质取决于可裂解部分的性质。可裂解部分的裂解可以通过化学或物理方法来实现，该等方法涉及例如以下一种或多种：氧化、还原、溶剂分解，例如水解、光解、热解、电解、超声处理和化学取代。可裂解部分和对应裂解剂的实例(借助于说明而非限制)包含可以使用例如硫醇等还原剂裂解的二硫化物；可以使用例如高碘酸盐等氧化剂裂解的二醇；可以通过高锰酸盐或四氧化锇裂解的二酮；可以用次硫酸盐裂解的重氮键或肟键；可以在碱性条件下裂解的β-砜；可以用碱裂解的其中α-碳例如用羰基或硝基活化的四烷基铵、三烷基锍、四烷基鏻；可以在碱性条件下使用如例如羟胺、氨或三烷基胺(例如三甲胺或三乙胺)等水解剂裂解的酯和硫酯键；其中在还原下进行消除的醌类；可以光解裂解的被取代的苯甲醚；可以热裂解的碳酸酯；其中配体可以用更高亲和力配体置换的金属螯合剂；可以用单态氧裂解的硫醚；在酸性条件下可裂解的腙键；季铵盐(可通过例如氢氧化钠水溶液裂解)；三氟乙酸可裂解的部分，如例如苯甲醇衍生物、替考拉宁糖苷配基、缩醛和硫缩醛；可以使用例如HF或甲酚裂解的硫醚；磺酰基(可通过例如三氟甲烷磺酸、三氟乙酸或苯硫基甲烷裂解)；亲核试剂可裂解的位点，例如邻苯二甲酰胺(可例如用被取代的肼裂解)；离子缔合(带相反电荷的部分的吸引)，其中裂解可以通过改变介质的离子强度、加入破坏性离子物质、降低或升高pH值、加入表面活性剂、超声处理和加入带电化学物质来实现；以及可用具有适当波长的光，如例如300nm或更大的UV光裂解的光可裂解键。

在一个实例中，可以使用与N-丁二酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)(SPDP)结合，形成可裂解的键，包括二硫键。举例来说，包括胺官能团的标记粒子结合于SPDP并且接着所得到的结合物可以与包括硫醇官能团的MS标记反应，使得MS标记部分连接到结合物。二硫化物还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧基乙基)膦(TCEP))可以用作改变剂以将硫醇化肽作为MS标记释放。

然后论述在过滤装置的膜上形成粒子聚集体(粒子簇)的一个实例(借助于说明而非限制)。使已经捕捉样品中的非微粒目标罕见分子的细胞或捕捉粒子与过滤载片的膜接触，其中膜的孔径如上针对保留细胞或粒子结合的目标罕见分子所述。在如上文所论述进行合适洗涤以去除非微粒物质和减少非罕见分子和非罕见细胞的数目后，针对目标罕见分子的每个不同群体，加入一组如上所述的载体粒子，其中每一组载体粒子包括对待测定的不同目标罕见分子具有特异性的特定结合搭配物。特定结合搭配物借助于第一连接基团连接到载体粒子。采用第二连接基团，将载体粒子彼此连接。在另一洗涤步骤后，加入标记粒子，其中每一组标记粒子包括针对待测定的不同目标罕见分子的MS标记或MS标记前体。标记粒子包括与载体粒子上的官能团反应的官能团。官能团的反应形成第三连接基团。MS标记或MS标记前体借助于第四连接基团结合于标记粒子。因此，形成包括目标罕见分子、载体粒子、标记粒子和MS标记或MS标记前体的粒子簇。

在一些实例中，如上所述，采用如上文所论述的官能团的适当对应官能团，共价形成连接基团中的一种或多种。在一些实例中，如上文所论述非共价形成连接基团中的一种或多种。采用结合对、通常特异性结合对的成员，其中一个成员连接到一个连接基团部分并且另一成员连接到第二连接基团部分。当结合对成员结合时，形成包含结合对成员和两个连接基团部分的连接基团。结合对成员的结合引起最终形成连接基团的两个连接基团部分的非共价连接。连接基团部分可以是如上文所论述的键或连接基团。如上文所提及，结合对的成员具有相对较高的结合常数，例如(借助于说明而非限制)抗生物素蛋白(抗生蛋白链菌素)-生物素结合、荧光素(FITC)和用于FITC的抗体、若丹明(德克萨斯红)和用于若丹明的抗体、毛地黄皂苷(DIG)和用于DIG的抗体、非人类物种抗体(例如山羊、兔、小鼠、鸡、绵羊)和抗物种抗体。

在一些实例中，借助于说明而非限制，第一连接基团可以包含采用连接到生物素的二级抗体的不可裂解键，其中该二级抗体结合于针对目标罕见分子的抗体并且该生物素结合于载体粒子表面上的抗生蛋白链菌素。可替代地，抗体可以通过与粒子上的羧酸和抗体上的胺的酰胺键使用通常已知的生物结合方法直接结合于载体粒子。在另一实例中，第一连接基团可以包含采用通过二硫化物连接子连接到生物素和附接到抗体的小分子肽的可裂解键，该二硫化物连接子通过与例如SPDP的反应形成。在一些实例中，第二连接基团可以包含不可裂解的键，其中载体粒子在其表面上具有抗生蛋白链菌素分子并且生物素与小分子的结合物，例如生物素-FITC，用于形成连接基团。当对第二连接基团希望可裂解的键时，生物素-FITC剂包含可裂解部分，例如二硫键。第二连接基团的小分子部分，例如FITC部分，结合于载体粒子的表面上的小分子的结合搭配物(例如针对FITC的抗体)。第三连接基团可以包含不可裂解的键，其中连接部分具有通过酰胺键附接到FITC或生物素的肽，或第三连接基团可以包含可裂解的键，其中连接部分具有通过二硫键附接到FITC或生物素的肽。第三连接基团可以包含离子键，其中标记粒子上的电离胺或其它基团被吸引到标记粒子上的电离羧酸或其它基团。如上文所解释，MS标记或MS标记前体通过可裂解键附接到标记粒子，例如(但不限于)肽或其它MS标记通过二硫键附接。

短语“小分子”是指分子量在约100到约2,000，或约200到约2,000，或约300到约2,000，或约500到约2,000，或约1,000到约2,000，或约500到约1,500，或约1,000到约1,500，或约1,000到约1,200范围内的分子。小分子的实例包含(借助于说明而非限制)例如生物素、地高辛、地高辛配基、2,4-二硝基苯基、荧光素、若丹明、小肽(满足以上提及的分子量限度)、维生素B12和叶酸。小分子对的小分子结合搭配物的实例包含(借助于说明而非限制)例如生物素-针对生物素的结合搭配物(例如抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素和针对生物素的抗体)、地高辛-针对地高辛的结合搭配物(例如针对地高辛的抗体)、地高辛-针对地高辛的结合搭配物(例如针对地高辛的抗体)、2,4-二硝基苯基和针对2,4-二硝基苯基的结合搭配物(例如针对2,4-二硝基苯基的抗体)、荧光素-针对荧光素的结合搭配物(例如针对荧光素的抗体)、若丹明-针对若丹明的结合搭配物(例如针对若丹明的抗体)、肽-针对肽的结合搭配物(例如针对肽的抗体)、分析物-特异性结合搭配物(例如针对B12的内在因子、针对叶酸的叶酸结合因子)。

还可以充当MS标记的小分子肽的实例包含(借助于说明而非限制)包括以下中的两种或更多种的肽：组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸和其衍生物。在一些实例中，肽具有约100到约3,000质量单位的分子量并且可以含有3到30个氨基酸。在一些实例中，肽包括由以下组成的群组中选出的九种氨基酸：酪氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸，并且具有1,021.2、1,031.2、1,033.2、1,077.3、1,087.3、1,127.3、1,137质量单位的质量；或3个来自上述群组的氨基酸并且具有335.4、433.3、390.5、426.5和405.5质量单位的质量。肽中的氨基酸数目由例如采用的MS技术的性质决定。举例来说，当使用MAFDI来检测时，肽可以具有在约600到约3,000范围内的质量并且由约6到约30个氨基酸构成。可替代地，当使用EIS来检测时，肽具有在约100到约1,000范围内的质量并且例如由1到9个氨基酸或衍生物构成。在一些实例中，肽标记中的氨基酸数目可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个。

肽用作MS标记具有若干优点，其包含(但不限于)以下：1)相对容易结合于蛋白质、抗体、粒子和其它生物化学实体；2)质量相对容易改变，从而允许许多不同的质量，因此实现多路复用的测定格式和标准；以及3)质量针对使用的质谱仪可调节。对于结合来说，肽可以具有用于结合的末端半胱氨酸。对于电离来说，肽可以具有带电氨基。在一些实例中，氨基酸肽具有N端游离胺和C端游离酸。在一些实例中，氨基酸肽是用同位素标记或衍生的同位素。肽可以结合于小分子，例如生物素或荧光素，以结合于针对小分子的对应结合搭配物，在此实例中该结合搭配物是抗生蛋白链菌素或针对荧光素的抗体。生物素或荧光素可以结合在N端，其中C端为游离酸。

本文所述的方法包含痕量分析，即约1到约100,000拷贝的罕见细胞或目标罕见分子的微量材料。因为此方法包含在质谱仪的检测极限下的痕量分析，所以只有当检测体积极低，例如10^-15升时，才能够检测材料的这些微量，从而检测浓度。根据本文所述的原理的方法和设备的实例减少或避免蒸发。

获得释放用于罕见细胞或目标罕见分子的MS标记或MS标记前体的量的再现性要求测量载体和标记粒子的形成和基本上完全回收。因此，在一个方法中，载体粒子、标记粒子、连接基团和/或MS标记或MS标记前体借助于例如(但不限于)以下的荧光分子的存在可以发荧光：FITC、若丹明化合物、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、对苯二甲醛、荧光稀土螯合剂、氨基-香豆素、伞形酮、噁嗪、德克萨斯红、吖啶酮、二萘嵌苯、二环戊二烯并苯(如例如4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-二环戊二烯并苯和其变体)、9,10-双-苯基乙炔基蒽、方酸染料和荧光胺。接着荧光显微镜可以用于测定处理前后载体粒子、标记粒子、连接基团和/或MS标记或MS标记前体的位置。此充当系统功能的证实性测量，并且价值在于关于罕见细胞或目标罕见分子在细胞结构或捕捉粒子上的位置的其它信息。

用于进行方法的试剂盒

本发明的设备和试剂可以存在于适于进行本发明的方法的试剂盒中。在一个实施例中，试剂盒包括基本上无吸收性的膜与改性的亲和剂的包装组合，一个包装组合针对每个不同目标罕见分子。试剂盒还可以包括一个或多个未标记抗体或核酸探针，该等探针引导在非罕见细胞上，从而使得可以从分析中消除该等细胞。取决于改性的亲和剂是否包括MS标记前体或改变剂，试剂盒还可以包括不是改性的亲和剂一部分的另一MS标记前体或改变剂。试剂盒还可以包含针对与MS标记前体反应以产生MS标记的部分的底物。另外，试剂盒还可以包括例如固定剂、渗透剂和阻断剂中的一种或多种以防止非特异性结合于细胞。用于进行该方法的其它试剂也可以包含于试剂盒中，这类试剂的性质取决于待采用的特定格式。试剂可以每个在单独容器中，或多种试剂可以组合在一个或多个容器中，取决于试剂的交叉反应性和稳定性。试剂盒可以进一步包含其它用于进行该方法的分开包装的试剂，例如辅助试剂、粘合剂、用于收集样品的容器和用于进行分析的细胞支撑物，例如显微镜载片。

试剂盒中的多种试剂的相对量可以广泛变化，以提供基本上使需要在本发明方法期间发生的反应最佳化的试剂浓度并且进一步基本上最佳化方法的灵敏度。在适当情况下，试剂盒中的一种或多种试剂可以作为干粉提供，通常冻干，包含赋形剂，其一旦溶解，将提供具有适于进行根据本文所述的原理的方法的浓度的试剂溶液。试剂盒可以进一步包含利用根据本文所述的原理的试剂的方法的书面描述。

如本文所用，短语“至少”意指指定物品的数目可以等于或大于所叙述的数目。如本文所用，短语“约”意指所叙述的数目可以加上或减去10％；例如“约5”意指4.5到5.5的范围。

以下实例(借助于说明而非限制)进一步描述本发明的特定实施例并且打算描述且不限制本发明的范围。除非另有指示，否则本文中所公开的所有份数和百分比是按体积计。

以引用的方式并入

贯穿本公开已经参考且引用了其它文献，如专利、专利申请、专利公开案、期刊、书籍、论文、网络内容。所有这类文献在此出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

等效内容

根据包含对本文中引用的科学和专利文献的参考的本文档的完整内容，所属领域的技术人员将显而易见除本文示出且描述的之外的本发明的各种修改以及其许多进一步实施例。本文中的主题含有重要信息、范例和指南，其可以适于以各种实施例及其等效内容实践本发明。

实例

实例1∶从膜释放液滴

采用总共三个基本上无吸收性的膜用于测试。第一膜是基本上无吸收性的膜，其含有8×8mm²硅区，由6400个直径约70μm且高360μm的微孔组成。每个孔的底部被1μm厚的氮化硅(Si₃N₄)刚性膜覆盖，其中5μm洞近似居中于孔开口内。在膜表面与洞相交处形成的角度是90°。第二膜是8×8mm²的基本上无吸收性的1μm厚的氮化硅(Si₃N₄)刚性膜，其由具有含有5μm直径的约108,000个孔隙的区域的单个微孔组成，其中第二膜近似居中于微孔开口内。在膜表面与所有孔洞相交处形成的角度是90°，并且变化不超过1°。第三膜是柔性的基本上无吸收性的聚碳酸酯膜。第三膜是3.7cm²并且位于单个微孔的底部。第三膜具有8μm直径的约100,000个孔隙。在个别孔隙之间在膜表面与孔洞相交处形成的角度在30°到150°之间变化。

当在溶剂-空气界面处的电场强度的量值足以克服由液体表面张力引起的力时进行ESI。此时，将液体抽吸成圆锥形，从其中排出带电小滴。这些小滴经历蒸发和裂变循环，最终产生气相离子，被抽吸到质谱仪的真空系统中以供分析。在此实例中在直接从膜表面产生电喷雾中，待喷雾的溶液必须足够润湿含有微孔的芯片(被蚀刻的硅晶片外壳)的顶侧。显示理想的表面润湿性的溶剂本身将在加入溶剂时填充孔，因此在喷雾事件期间为连续溶剂递送提供毛细流动。Si₃N₄膜的背侧理想地应该具有与喷雾溶剂的非润湿性相互作用。这类相互作用将液体在5μm孔隙每一者上分离成单滴。个别小滴的存在产生高度曲率(与平坦的润湿表面相比)，此在施加电势下产生更大的电场强度，因此帮助形成电喷雾。另外，通过质谱仪的毛细管入口紧靠着膜的底侧定位，进一步增强电场强度，并且允许从所选的膜区域产生电喷雾，因此取得空间信息。喷雾溶剂应该具有足够极性并且表面张力低到足以在低于产生空气电击穿的电场强度的电场强度下允许电喷雾。

选择乙腈和甲醇作为直接膜喷雾的初始测试的喷雾溶剂。进行实验，其中用于THERMO LTQ(线性离子阱)质谱仪(来自Thermo Electron North America有限责任公司)的大气压入口(API)的标准直毛细管用以90°角弯曲使得开口向上的延伸毛细管替换。在所有实验中，膜位于底侧，与地面平行，距离弯曲的毛细管入口约1mm。使用二极管激光器照射膜底侧和弯曲的毛细管，并且用CMOS相机记录视频。

在第一组实验中，将50μL甲醇(或乙腈)直接吸取到膜顶侧上并且通过从抗静电枪引导等离子体到溶剂来施加电势。当以此方式施加电势时，目测不连续的喷雾事件，并且记录的质谱展示经由nanoESI喷洒相同溶液典型的峰。在溶剂耗尽时，谱显著不同并且是当起动在MS入口未受阻挡的抗静电枪时看到的谱的特征。

进一步实验展示多孔膜将喷雾，但喷雾的物质的量变化(20％cv)，并且分析物离子和含有分析物的带电小滴弹出的时间也变化超过100毫秒，使得难以捕获离子，因为离子捕获在短时间范围内进行且喷雾体积小；因此，产生无法定量的方法。作为对照，测试具有固定取向的孔隙并且柔性(引起超过1度的角度)的不可渗透的层。具有此层的结果是喷雾的物质变化超过20％CV。采用的具有根据本文所述的原理的特征的膜得到小于1％CV的喷雾量。

通过从柔性与非柔性膜喷雾含有四级肽(FC-2)的溶液，比较柔性和非柔性膜的性能。使用先前用于过滤血液的膜进行此比较。在柔性膜的情况下，膜定位在弯曲的MS入口上方约0.5mm处，并且向在位于膜上方约5mm处的电线(电场发生器)施加6.5kV电势。接着将含有FC-2肽的溶液(25μL含0.1％甲酸的4:1甲醇:水)施加于膜顶部，同时记录离子m/z 412的MS/MS谱。当以正离子模式电喷雾时，FC-2肽产生m/z 412下的分子态离子，其在经受CID时主要碎片成m/z 353。在非柔性膜的情况下，程序是相同的，改变如下∶电场发生器的电压设定成6.0kV并且施加的液体量是5μL。在每种情况下FC-2肽的浓度调整到1、10和100nM。柔性和非柔性膜的m/z 412的CID谱分别展示于图8A-C和图9A-C中。在液体施加到膜后1-3秒时间内从柔性膜形成喷雾，并且显影的喷雾的照片展示于图10中。在非柔性膜的情况下，未观测到可比的喷雾羽流，这表明喷雾从个别孔形成。

Claims (31)

1.一种设备，包括：

具有至少一个孔隙的基本上无吸收性的膜；

可操作地与所述基本上无吸收性的膜缔合的微孔；以及

电场发生器，其中所述设备被配置成使得由所述电场发生器产生的电场可操作地与所述微孔中的样品相互作用并且通过所述基本上无吸收性的膜中的所述至少一个孔隙排出所述样品的小滴。

2.根据权利要求1所述的设备，其中所述至少一个孔隙包括近端开口、远端开口和壁。

3.根据权利要求2所述的设备，其中所述至少一个孔隙的所述壁相对于所述近端开口和所述远端开口取向为90度。

4.根据权利要求2所述的设备，其中所述至少一个孔隙的所述壁从所述近端开口到所述远端开口逐渐变细。

5.根据权利要求2所述的设备，其中所述至少一个孔隙的所述壁从所述远端开口到所述近端开口逐渐变细。

6.根据权利要求1所述的设备，其中所述基本上无吸收性的膜包括多个孔隙。

7.根据权利要求6所述的设备，其中所述多个孔隙包括相同的尺寸。

8.根据权利要求6所述的设备，其中所述多个孔隙包括不同的尺寸。

9.根据权利要求1所述的设备，其中所述设备进一步包括质谱仪。

10.根据权利要求1所述的设备，其中所述设备被配置成使得所述电场发生器以感应方式传递所述电场到所述微孔中的所述样品。

11.一种用于检测来自非均质样品的目标分析物的方法，所述方法包括：

提供如下设备，所述设备包含包括至少一个孔隙的基本上无吸收性的膜、可操作地与所述膜缔合的微孔和可操作地与所述膜缔合的电场产生器；

将非均质样品引入到至少所述膜中；

将各包括第一分子的多种亲和剂引入到所述样品中，其中所述多种亲和剂特异性地结合所述样品中的所述目标分析物；

去除未结合的亲和剂；

将一种或多种额外分子引入到所述样品中，其中所述一种或多种额外分子与所述第一分子相互作用以形成质谱分析标记；

经由所述电场发生器提供电压到所述样品，以释放小滴穿过所述至少一个孔隙，其中所述小滴包括所述样品的一部分和所述质谱分析标记；以及

针对所述质谱分析标记的存在分析所述小滴，其中所述质谱分析标记的存在指示所述样品中存在所述目标分析物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一分子是质谱分析标记前体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种额外分子是改变剂，其与所述质谱分析标记前体相互作用以形成所述质谱分析标记。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一分子是改变剂。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种额外分子是与所述改变剂相互作用从而形成所述质谱分析标记的质谱分析前体标记。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一分子是质谱分析标记前体，并且所述一种或多种额外分子是与所述质谱分析标记前体相互作用从而形成所述质谱分析标记的第一和第二改变剂。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和剂是微粒。

18.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和剂非微粒。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述目标分析物是罕见细胞并且所述非均质样品是非均质生物样品。

20.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括通过定量所分析的质谱分析标记的量来定量所述样品中的所述目标分析物。

21.一种样品分析方法，包括：

将疑似包括目标分析物的样品引入到包括孔隙的膜中；

将一种或多种试剂引入到所述膜上的所述样品中，在目标分析物存在于样品中的情况下以产生与所述目标分析物缔合的质谱分析标记；

将电场施加于所述膜，由此产生所述样品的一个或多个小滴，所述一个或多个小滴从所述膜的所述孔隙排出并引入到质谱仪中；

经由所述质谱仪，通过检测所述质谱分析标记的存在来检测所述目标分析物的存在；

如果基于来自所述检测步骤的结果，存在所述目标分析物，那么从所述膜提取与所述膜的所述孔隙缔合的所述样品的一部分；以及

分析所述样品的提取部分。

22.根据权利要求21所述的方法，其中将一种或多种试剂引入到所述膜上的所述样品中包括：

将各包括第一分子的多种亲和剂引入到所述样品中，其中所述多种亲和剂特异性地结合所述样品中的所述目标分析物；

去除未结合的亲和剂；以及

将一种或多种额外分子引入到所述样品中，其中所述一种或多种额外分子与所述第一分子相互作用以形成质谱分析标记。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一分子是质谱分析标记前体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种额外分子是改变剂，其与所述质谱分析标记前体相互作用以形成所述质谱分析标记。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一分子是改变剂。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种额外分子是与所述改变剂相互作用从而形成所述质谱分析标记的质谱分析前体标记。

27.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一分子是质谱分析标记前体，并且所述一种或多种额外分子是与所述质谱分析标记前体相互作用从而形成所述质谱分析标记的第一和第二改变剂。

28.根据权利要求22所述的方法，其中所述亲和剂是微粒。

29.根据权利要求22所述的方法，其中所述亲和剂非微粒。

30.根据权利要求21所述的方法，其中所述目标分析物是罕见细胞并且所述样品是非均质生物样品。

31.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括通过定量所分析的质谱分析标记的量来定量所述样品中的所述目标分析物。