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CN108779078A - 激酶的新型抑制剂和探针及其用途 - Google Patents

激酶的新型抑制剂和探针及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于2,5‑二氨基嘧啶的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂。本发明还涉及用于布鲁顿酪氨酸激酶的基于2,5‑二氨基嘧啶的亲和探针和此类探针用于测量Btk活性、用于评估Btk调节剂的活性和用于评估此类调节剂的药代动力学和药效动力学性质的用途。

Description

激酶的新型抑制剂和探针及其用途
发明领域
本发明涉及基于2,5-二氨基嘧啶的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂。本发明还涉及用于布鲁顿酪氨酸激酶的基于2,5-二氨基嘧啶的亲和探针和此类探针用于测量Btk活性、评估Btk调节剂的活性和评估此类调节剂的药代动力学和药效动力学性质的用途。
背景
布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)是除了在自然杀伤细胞和T细胞外仅在造血细胞中表达的胞质非酪氨酸激酶。Btk参与数个信号传导途径，特别是参与B细胞受体(BCR)途径，这在B细胞的发育和分化中至关重要[Mohamed, A. J.等人，Bruton's tyrosine kinase (Btk):function, regulation, and transformation with special emphasis on the PHdomain. Immunol. Rev. 228, 58-73 (2009)]。
在细胞中，Btk通过其上游激酶经由酪氨酸残基(Tyr551)的磷酸化、接着另一酪氨酸残基(Tyr223)的自磷酸化而活化。完全活化的Btk接着使其底物(包括BCR途径中的PLC-γ2)磷酸化。
广泛的体内和临床研究强有力地表明Btk牵涉多发性B-细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病例如类风湿性关节炎和狼疮的发展[Rickert, R. C. New insights into pre-BCRand BCR signalling with relevance to B cell malignancies. Nat. Rev. Immunol.13, 578-591 (2013)]。
已经开发了多个Btk抑制剂(图1)。
来自Celera/Pharmacyclics/Janssen的共价不可逆抑制剂依鲁替尼(CRA-032765, PCI-32765, Imbruvica®)在2013年11月成为了首个临床上获批的Btk靶向药物[Pan, Z.等人，Discovery of selective irreversible inhibitors for Bruton'styrosine kinase. ChemMedChem. 2, 58-61 (2007)]。
来自Celgene的CC-292 (AVL-292)是目前正进行临床试验的第二个共价不可逆抑制剂[Singh, J.等人发明人; Celgene Avilomics Research, Inc.,受让人，2,4-Diaminopyrimidines useful as kinase inhibitors. 美国专利US 8,609,679. 2013Dec 17]。
依鲁替尼和CC-292均与Btk中位于ATP结合口袋边缘的半胱氨酸残基(Cys481)形成共价键。
其它临床阶段的Btk抑制剂包括来自ONO Pharmaceutical的化合物和来自HanmiPharmaceutical的PRN1008/HM71224[Yamamoto, S. & Yoshizawa T. 发明人; OnoPharmaceutical Co., Ltd., 受让人, Purinone derivative. 美国专利US 8,940,725.2015 Jan 27; Hanmi Pharmaceutical Company Limited, Safety, PK/PD, Food EffectStudy of Orally Administered HM71224 in Healthy Adult Male Volunteers. 可获得于: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01765478 (Accessed: 2015年7月4日)]。
来自Gilead/Roche的非共价可逆Btk抑制剂GDC-0834在I期临床试验中进行了评估，但尚未报道最新进展[Liu, L等人，Significant species difference in amidehydrolysis of GDC-0834, a novel potent and selective Bruton's tyrosine kinaseinhibitor. Drug Metab. Dispos. 39, 1840-1849 (2011)]。
靶结合(target engagement)是指预期生物靶标被药物分子占据[Copeland, R.A., Pompliano, D. L. & Meek, T. D. Drug-target residence time and itsimplications for lead optimization. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 730-739(2006)]。这一信息对于在分子水平建立表型观察结果和抑制剂-生物分子相互作用之间的关联性而言是至关重要的。由于其固有的反应基团，靶向的共价药物特别适于发展可用于测量靶占据程度的小分子亲和探针[Potashman, M. H. & Duggan, M. E. Covalentmodifiers: an orthogonal approach to drug design. J. Med. Chem. 52, 1231-1246(2009); Singh, J., Petter, R. C., Baillie, T. A. & Whitty, A. The resurgenceof covalent drugs. Nat. Rev. Drug Discov. 10, 307-317 (2011)]。
PCI-33380基于依鲁替尼的骨架而设计并且已经用于细胞和体内研究，这些研究证实了抑制剂结合事件和由于Btk的功能抑制而引起的细胞反应的表型读出之间的关联[Honigberg, L. A.等人，The Bruton tyrosine kinase inhibitor PCI-32765 blocksB-cell activation and is efficacious in models of autoimmune disease and B-cell malignancy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 13075-13080 (2010)]。
此外，在临床试验中使用荧光探针在确定患者的合适药物剂量方面起到重要的作用[O'Brien, S.等人，Ibrutinib as initial therapy for elderly patients withchronic lymphocytic leukaemia or small lymphocytic lymphoma: an open-label,multicentre, phase 1b/2 trial. Lancet Oncol. 15, 48-58 (2014)]。
除了PCI-33380，同样利用依鲁替尼骨架的其它Btk荧光探针最近也被报道用于活细胞中的Btk成像(图2) [Turetsky, A., Kim, E., Kohler, R. H., Miller, M. A. &Weissleder, R. Single cell imaging of Bruton's tyrosine kinase using anirreversible inhibitor. Sci. Rep. 4, 4782 (2014); Zhang, Q., Liu, H. & Pan,Z. A general approach for the development of fluorogenic probes suitable forno-wash imaging of kinases in live cells. Chem. Comm. 50, 15319-15322(2014)]。
如图3中所描绘，亲和探针通常包括三个组成部分：识别基团、反应基团和报告基团。所述识别基团将探针导入所靶向蛋白的结合口袋里并促进所述反应基团与生物分子之间的共价键的形成。所述报告基团提供鉴别复杂蛋白质组内与探针结合的蛋白的便利手段。
图4显示检查药物分子的靶结合的测定法的一般方案。通过顺序添加抑制剂和探针到生物样品(细胞、组织等)中，探针标记的条带的强度将给出未被抑制剂占据的那些生物靶标的直接读出。随着抑制剂的浓度增加，条带强度的降低指示一部分生物靶标被抑制剂结合。
发明概述
本发明的目的是提供一系列新型的基于2,5-二氨基嘧啶骨架的Btk共价抑制剂。本发明的另一目的是将该系列的抑制剂开发为新型的亲和Btk探针。所得探针能够选择性地标记Btk并提供在活细胞中直接测量Btk抑制剂的靶结合（target engagement）的有效方法。
一个方面是具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R选自键、羰基亚烷基氨基(例如，羰基C1-6亚烷基氨基)、(((氮杂环烷-2-基)-烷基)氧代甲烷)-1,N-二基(例如(((C5-7氮杂环烷-2-基)-C0-2烷基)氧代甲烷)-1,N-二基)；优选R选自、和；
其中R1选自烷基、芳基烷基、羟烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、氨基烷基和杂芳基烷基；优选R1选自、、、,、、和；更优R1选自、、、、和；
其中
p是0、1、2或3，优选0；
q是0、1、2或3，优选0；
R11是含有选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环的末端基团的取代基；优选R11是被选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环作为末端基团的取代基取代的烷基，其中所述烷基中的一个或多个CH2部分任选被选自-NH-、-CO-、-SO2- 和-SO-的二价基团替代；更优选R11选自、、、和。
一个方面是作为Btk抑制剂的上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐。
一个方面是上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐，其作为Btk抑制剂用于治疗B-细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病例如类风湿性关节和狼疮。
本发明的另一方面涉及包含治疗有效量的上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐作为Btk抑制剂以及一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
一个方面是Btk亲和探针，其包括Btk抑制剂部分、报告物部分和连接所述Btk抑制剂部分与报告物部分的连接物部分；其中所述Btk抑制剂部分可衍生自上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐。
一个方面是上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐作为Btk亲和探针的一部分的用途，所述Btk亲和探针包括Btk抑制剂部分、报告物部分和连接所述Btk抑制剂部分与报告物部分的连接物部分；其中所述Btk抑制剂部分可衍生自上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐。
一个方面是Btk亲和探针，如下式(Ic)所示：
其中所述Btk抑制剂部分可衍生自上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐；
其中X和Y独立地选自键、-O(CO)-、-NRa(CO)-、-NRa-、、-O-、-S-、-S-S-、-O-NRa-、-O(CO)O-、-O(CO)NRa-、-NRa(CO)NRa-、N=CRa-、-S(CO)-、-S(O)-和-S(O)2-；
其中形成含N杂环；
Ra是氢或烷基。
一个实施方案是Btk亲和探针，其中所述连接物部分共价连接所述Btk抑制剂部分和所述报告物部分。另一实施方案是Btk亲和探针，其中所述Btk 抑制剂部分修饰Btk酶的半胱氨酸残基。另一实施方案是Btk亲和探针，其中所述Btk抑制剂部分共价修饰Btk酶的半胱氨酸残基。再一实施方案是Btk亲和探针，其中所述半胱氨酸残基在Btk酶的ATP结合口袋内。再一实施方案是Btk亲和探针，其中所述半胱氨酸残基是Btk酶的Cys 481。一个实施方案是Btk亲和探针，其中所述连接物部分选自键、任选取代的烷基部分、任选取代的杂环部分、任选取代的酰胺部分、酮部分、任选取代的氨基甲酸酯部分、酯部分或其组合。另一实施方案是Btk亲和探针，其中所述连接物部分是键。
还在此描述的是Btk亲和探针，其中所述报告物部分选自标记物、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记物、光亲和标记物、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记物、荧光团、含金属部分、放射性部分、新型官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射易激部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物、掺入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光解的基团、氧化还原剂、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光性基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记物或其组合。另一实施方案是Btk亲和探针，其中所述报告物部分是荧光团。再一实施方案是Btk亲和探针，其中所述荧光团是Bodipy荧光团。再一实施方案是Btk亲和探针，其中所述Bodipy荧光团是Bodipy FL荧光团。
本文呈现的是Btk亲和探针，其中所述Btk抑制剂部分衍生自Btk的不可逆抑制剂。一个实施方案是Btk亲和探针，其中所述Btk的不可逆抑制剂是；
。
另一实施方案是具有以下结构的Btk亲和探针：
。
另一实施方案是Btk亲和探针，其中所述探针选择性地标记Btk的磷酸化构象。另一实施方案是Btk亲和探针，其中所述Btk的磷酸化构象是Btk的活化或非活化形式。另一实施方案是Btk亲和探针，其中所述Btk的磷酸化构象是Btk的活化形式。一个实施方案是Btk亲和探针，其中所述探针是细胞可透过的。
一个方面是用于评估潜在Btk抑制剂在哺乳动物中的效力的方法，其包括将潜在的Btk抑制剂施用于所述哺乳动物，将本文所述的Btk亲和探针施用于所述哺乳动物或从所述哺乳动物分离的细胞；测量所述Btk亲和探针的报告物部分的活性，和将报告物部分的活性与标准进行比较。
另一方面是用于评估Btk抑制剂在哺乳动物中的药效动力学的方法，其包括将Btk抑制剂施用于所述哺乳动物，将本文呈现的Btk亲和探针施用于所述哺乳动物或从所述哺乳动物分离的细胞；和在施用抑制剂后在不同时间点测量所述Btk亲和探针的报告物部分的活性。
另一方面是Btk酶的体外标记方法，包括使活化Btk酶与本文所述的Btk亲和探针接触。一个实施方案是Btk酶的体外标记方法，其中所述接触步骤包括与本文呈现的 Btk亲和探针一起孵育活化Btk酶。
另一方面是Btk酶的体外标记方法，包括使表达Btk酶的细胞或组织与本文所述的Btk亲和探针接触。
一个方面是用于检测标记的Btk酶的方法，包括通过电泳分离蛋白（所述蛋白包含被本文所述的Btk亲和探针标记的Btk酶）和通过荧光检测所述Btk亲和探针。
本发明包括下列技术方案：
技术方案1
具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R选自键、羰基亚烷基氨基、(((氮杂环烷-2-基)-烷基)氧代甲烷)-1,N-二基；优选R选自(((C5-7氮杂环烷-2-基)-C0-2烷基)氧代甲烷)-1,N-二基)；
其中R1选自烷基、芳基烷基、羟烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、氨基烷基和杂芳基烷基；优选R1选自芳基烷基、羟烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、氨基烷基和杂芳基烷基；或优选R1选自、、、、和；或优选R1选自、、和；
其中
p是0、1、2或3，优选0；
q是0、1、2或3，优选0；
R11是含有选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环的末端基团的取代基；优选R11是被选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环作为末端基团的取代基取代的烷基，其中所述烷基中的一个或多个CH2部分任选被选自-NH-、-CO-、-SO2- 和-SO-的二价基团替代；更优选R11选自、、、和。
技术方案2
化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
。
技术方案3
药物组合物，其含有治疗有效量的根据技术方案1-2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体。
技术方案4
根据技术方案1-2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自自身免疫疾病、异种免疫疾病、炎性疾病、癌症和血栓栓塞性疾病。
技术方案5
根据技术方案1或2所述的化合物在制备Btk亲和探针中的用途。
技术方案6
以下任一化合物在制备Btk亲和探针中的用途：
。
技术方案7
如下式(Ic)所示的Btk亲和探针：
其中所述Btk抑制剂部分可衍生自具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物：
其中R选自键、羰基亚烷基氨基、(((氮杂环烷-2-基)-烷基)氧代甲烷)-1,N-二甲；优选R选自(((C5-7氮杂环烷-2-基)-C0-2烷基)氧代甲烷)-1,N-二甲)；
其中R1选自烷基、芳基烷基、羟烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、氨基烷基和杂芳基烷基；优选R1选自芳基烷基、羟烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、氨基烷基和杂芳基烷基；或优选R1选自、、、、和；或优选R1选自、、和；
其中
p是0、1、2或3，优选0；
q是0、1、2或3，优选0；
R11是含有选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环的末端基团的取代基(例如，可通过从R11的末端基团除去氢原子而进行衍生化)；优选R11是被选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环作为末端基团的取代基取代的烷基，其中所述烷基中的一个或多个CH2部分任选被选自-NH-、-CO-、-SO2-和-SO-的二价基团替代；更优选R11选自、、、和；
其中X和Y独立地选自键、-O(CO)-、-NRa(CO)-、-NRa-、、-O-、-S-、-S-S-、-O-NRa-、-O(CO)O-、-O(CO)NRa-、-NRa(CO)NRa-、N═CRa-、-S(CO)-、-S(O)-和-S(O)2-；
其中形成含N杂环；
Ra是氢或烷基；
其中所述连接物部分选自键、任选取代的烷基部分、任选取代的杂环部分、任选取代的酰胺部分、酮部分、任选取代的氨基甲酸酯部分、酯部分或其组合；
其中所述报告物部分选自标记物、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记物、光亲和标记物、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记物、荧光团、含金属部分、放射性部分、新型官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射易激部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物、掺入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光解的基团、氧化还原剂、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光性基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记物或其组合。
技术方案8
根据技术方案7所述的Btk亲和探针，其中所述连接物部分是键。
技术方案9
根据技术方案7所述的Btk亲和探针，其中所述报告物部分是荧光团。
技术方案10
根据技术方案9所述的Btk亲和探针，其中所述荧光团是Bodipy荧光团。
技术方案11
根据技术方案10所述的Btk亲和探针，其中所述Bodipy荧光团是Bodipy FL荧光团。
技术方案12
具有下列结构的Btk亲和探针
。
技术方案13
用于评估潜在的Btk抑制剂在哺乳动物中的效力的方法，其包括将潜在的Btk抑制剂施用于所述哺乳动物，将技术方案7-12任一项所述的Btk亲和探针施用于所述哺乳动物或从所述哺乳动物分离的细胞；测量所述Btk亲和探针的报告物部分的活性，和将报告物部分的活性与标准进行比较。
技术方案14
用于评估Btk抑制剂在哺乳动物中的药效动力学的方法，其包括将Btk抑制剂施用于多个哺乳动物，将技术方案7-12的Btk亲和探针施用于所述多个哺乳动物或从多个哺乳动物分离的细胞；和在施用所述抑制剂后在不同时间点测量所述Btk亲和探针的报告物部分的活性。
技术方案15
Btk酶的体外标记方法，包括使表达Btk酶的细胞或组织与技术方案7-12的Btk亲和探针接触。
技术方案16
检测标记的Btk酶的方法，包括通过电泳分离蛋白，其中所述蛋白包含被技术方案7-12的Btk亲和探针标记的Btk酶；和通过荧光检测所述Btk亲和探针。
应了解本文中所述的方法和组合物不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞株、构建体和试剂且在一些实施方案中可改变。同样应了解本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，且并非意欲限制本文中所述的方法和组合物的范围，其仅由随附权利要求来限制。
除非上下文另外明确指出，否则如本文中及随附权利要求中所使用，单数形式“一”以及“所述”包含复数提及。
本文中所提及的所有出版物、专利申请和专利都以引用的方式全文并入以用于描述和揭示例如所述出版物中所述的构建体和方法。
除非另外说明，否则术语“烷基”本身或作为另一分子的一部分时意指直链或支链或环状烃基或其组合。在一些实施方案中，烷基链为完全饱和、单不饱和或多不饱和的。在其它实施方案中，烷基链包括具有指定碳原子数目(即C0-C10 或C0-10 是指0-10个碳，且C0-烷基是指键)的二价基团和多价基团。在其它实施方案中，饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或多个双键或三键的烷基。在另一实施方案中，不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。在其它实施方案中，除非另外说明，否则术语“烷基”还包括本文更详细定义的烷基的衍生物，例如“杂烷基”、“卤代烷基”和“同系烷基(homoalkyl)”。
如本文中所使用的术语“生物物理探针”指的是检测或监测分子中的结构变化的探针。在一些实施方案中，此类分子包括但不限于蛋白，且所述“生物物理探针”用于检测或监测蛋白与其它大分子的相互作用。在其它实施方案中，生物物理探针的实例包括但不限于自旋标记物、荧光团和可光激活的基团。
如本文中所使用的术语“羰基”指的是含有选自-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-及-C(S)-的部分的基团，其包括但不限于含有至少一个酮基和/或至少一个醛基和/或至少一个酯基和/或至少一个羧酸基团和/或至少一个硫酯基团的基团。这些羰基包括酮、醛、羧酸、酯以及硫酯。在一些实施方案中，这些基团为线性、分枝或环状分子的一部分。
如本文中所使用的术语“化学发光基团”指的是在不额外加热的情况下由于化学反应而发光的基团。仅举例来说，在碱和金属催化剂的存在下，鲁米诺(luminol)(5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮)与氧化剂(如过氧化氢(H2O2))反应产生激发态产物(3-氨基邻苯二甲酸盐，3-APA)。
如本文中所使用的术语“发色团”指的是吸收可见光波长、UV波长或IR波长的光的分子。
如本文中所使用的术语“Cys 481”指的是在图5中在激酶中与Btk中的Cys 481对应的位置处发现的半胱氨酸(即，以黑体突出的“C”)。
在其它实施方案中，如本文中所使用的术语“可检测标记物”指的是可使用分析技术观测到的标记物，这些分析技术包括但不限于荧光、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见吸收光谱、质谱、核磁共振、磁共振以及电化学方法。
如本文中所使用的术语“染料”指的是含有发色团的可溶着色物质。
如本文中所使用的术语“电子致密基团”指的是当以电子束照射时散射电子的基团。这些基团包含但不限于钼酸铵、碱式硝酸铋、碘化镉、99％、碳酰肼、六水合氯化铁、六亚甲基四胺、98.5％、无水三氯化铟、硝酸镧、三水合乙酸铅、三水合柠檬酸铅、 硝酸铅、高碘酸、磷钼酸、磷钨酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银(Ag检定：8.0-8.5％)“强”、四苯基卟吩银(S-TPPS)、氯金酸钠、钨酸钠、硝酸铊、氨基硫脲(TSC)、乙酸铀酰、硝酸铀酰以及硫酸氧钒。
在其它实施方案中，如本文中所使用的术语“能量转移剂”指的是贡献或接受来自另一分子的能量的分子。仅举例来说，荧光共振能量转移(FRET)为偶极-偶极偶合过程，通过这个过程荧光供体分子的激发态能量非辐射性地转移到未激发受体分子上，其随后以较长波长荧光发射获赠的能量。
术语“增强”意指增加或延长所需效应的效力或持续时间。举例来说，“增强”治疗剂的效应指的是在治疗疾病、病症或病状期间增加或延长治疗剂的效力或持续时间、效应的能力。如本文中所使用，“增强有效量”指的是在治疗疾病、病症或病状期间足以增强治疗剂的效应的量。当用于患者中时，对于此用途有效的量应取决于疾病、病症或病状的严重性和过程、先前的治疗、患者的健康状态和对药物的反应，以及主治医师的判断。
如本文中所使用的术语“荧光团”指的是经激发后发射光子且进而发荧光的分子。
在一些实施方案中，如本文中所使用的术语“标记物”指的是并入化合物中且易于检测、藉此检测和/或监测其物理分布的物质。
如本文中所使用的术语“键联(linkage)”指的是由连接物的官能团与另一分子之间的化学反应形成的键或化学部分。在一些实施方案中，这些键包括但不限于共价键和非共价键，而这些化学部分包括但不限于酯、碳酸酯、亚胺、磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键以及寡核苷酸键。水解上稳定的键联意谓所述键联在水中实质上稳定且在适用pH值下(包括但不限于在生理条件下)长期(或许甚至无限期地)不与水反应。水解上不稳定或可降解的键联意谓所述键联可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。在其它实施方案中，酶促不稳定或可降解的键联意谓所述键联可由一或多种酶降解。仅举例来说，PEG和相关聚合物包括在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的连接物基团中的可降解键联。这些可降解键联包括但不限于由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中这些酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。其他水解可降解键联包括但不限于碳酸酯键；由胺与醛反应形成的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键；由氨基(包括但不限于在诸如PEG的聚合物的末端上)与肽的羧基形成的肽键；以及由亚磷酰胺基(包括但不限于在聚合物的末端上)与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
短语“测量报告物部分的活性”(或类似措词的短语)指的是用于量化(在绝对、近似或相对术语中)研究中的系统中的报告物部分的方法。在一些实施方案中，此类方法包括量化报告物部分的任何方法，所述报告物部分是染料；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应性化合物；抗体或抗体片段；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属部分；放射性部分；新型官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；光化辐射易激部分；配体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；掺入重原子的部分；可化学裂解的基团；可光解的基团；氧化还原剂；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光性基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记物或上述的任何组合。
如本文中所使用的术语“掺有重原子的部分”指的是掺有通常比碳更重的原子的离子的基团。在一些实施方案中，这些离子或原子包括(但不限于)硅、钨、金、铅和铀。
如本文中所使用的术语“纳米粒子”指的是具有约500nm至约1nm之间的粒度的粒子。
如本文中所使用的术语“药学上可接受的”指的是不消除化合物的生物活性或性质且相对无毒的物质，包括但不限于，盐、载体或稀释剂。在一个实施方案中，将所述物质施用于个体而不引起不想要的生物效应或以有害的方式与其包含于其中的组合物的任何组分相互作用。
如本文中所使用的术语“光亲和标记物”指的是具有在暴露于光之后与该标记物对其具有亲和性的分子形成键联的基团的标记物。仅举例来说，在一些实施方案中，此键联为共价或非共价的。
如本文中所使用的术语“光笼蔽部分”指的是在特定波长下照射后共价或非共价地结合其它离子或分子的基团。
如本文中所使用的术语“可光异构化部分”指的是其中经光照射后从一种异构形式变为另一种异构形式的基团。
如本文中所使用的术语“放射性部分”指的是其核自发发出核辐射(诸如α粒子、β粒子或γ粒子)的基团；其中，α粒子为氦核，β粒子为电子，且γ粒子为高能光子。
如本文中所使用的术语“自旋标记物”指的是含有展现未成对电子自旋的原子或原子团(即稳定顺磁基团)的分子，其在一些实施方案中通过电子自旋共振光谱检测且在另一些实施方案中连接到另一分子上。这些自旋标记分子包括但不限于硝酰基以及氮氧自由基(nitroxides)，且在一些实施方案中为单一自旋标记物或双重自旋标记物。
本发明化合物的短语“治疗有效量”指的是足以以适用于任何医疗的合理的利益/风险比治疗病症的化合物的量。然而，应理解，本发明的化合物和组合物的总日使用量由主治医师在合理的医疗判断范畴内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平取决于各种因素，包括受治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间，给药途径和所使用的具体化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医疗领域公知的类似因素。例如，以低于获得期望治疗效应所需的水平开始化合物的剂量，并且逐渐增加剂量直至获得期望的效应在本领域技术人员的能力范畴内。
如本文中所使用的术语“药学上可接受的载体”是指无毒的惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或任何类型的制剂助剂。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖，例如但不限于乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如但不限于玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物例如但不限于羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂例如但不限于可可脂和栓剂蜡；油例如但不限于花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；酯类，例如但不限于，油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂例如但不限于氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒的相容性润滑剂，例如但不限于，月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及根据制剂师的判断，着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
如本文中所使用的术语“个体”是指动物，其为治疗、观察或实验的对象。在一个实施方案中所述个体为哺乳动物，包括但不限于人类。
在一些实施方案中，术语“取代基”(也被称作“非干扰取代基”)指的是用于替代分子上的另一基团的基团。这些基团包括但不限于卤素、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C5-C12芳烷基、C3-C12环烷基、C4-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯基、二甲苯基、联苯、C2-C12烷氧基烷基、C5-C12烷氧基芳基、C5-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)其中m是1-8、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO2, -CN, -NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫基烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、═S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C6-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)其中各m是1-8、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等等。在一些实施方案中，前述列举中的每一R基团包括但不限于H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基，或烷芳基。当取代基由其从左向右书写的常规化学式指定时，其同样涵盖可由从右向左书写结构产生的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-等同于-OCH2-。
在一些实施方案中，仅举例来说，烷基和杂烷基(包括被称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基包括但不限于：-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)═NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN和-NO2。在其它实施方案中，前述列举中的每一R基团包括但不限于氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基(thioalkoxy)或芳烷基。在一些实施方案中，当两个R基团连接到同一氮原子上时，其可与氮原子结合以形成5元环、6元环或7元环。在其它实施方案中，例如，-NR2包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。
在另一些实施方案中，举例来说，芳基和杂芳基的取代基包括但不限于-OR、═O、═NR、═N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)═NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN、-NO2、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目为0至该芳族环体系上的开放价的总数目。在另一实施方案中，在上述列举中的每一R基团包括但不限于氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。
除非另外指出，利用质谱、NMR、HPLC、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
本文中提出的化合物包括经同位素标记的化合物，其与本文中提出的在各种式和结构中描述的那些化合物相同，但一个或多个原子被具有与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子替代。在一些实施方案中，可并入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分别诸如 2H、3H、13C、14C、15N、18O、 17O、35S、18F、36Cl。本文中描述的某些经同位素标记的化合物(例如诸如3H和14C的放射性同位素并入其中的那些化合物)可用于药物和/或底物组织分布检测。此外，在其它实施方案中，用诸如氘(即2H)的同位素取代提供某些由较高代谢稳定性产生的治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量需求降低。
在其它实施方案中，本文中描述的化合物具有不对称碳原子且因此以对映异构体或非对映异构体形式存在。在一些实施方案中，基于其物理化学差异，例如通过色谱和/或分级结晶将非对映异构混合物分离为其单个的非对映异构体。在其它实施方案中，通过与适当光学活性化合物(例如，醇)反应将对映异构混合物转变为非对映异构混合物，分离非对映异构体且将单个的非对映异构体转变(例如，水解)为相应的纯对映异构体而将对映异构体分离。包括非对映异构体、对映异构体及其混合物的所有这些异构体均被视作本文中描述的组合物的一部分。
在附加或其它实施方案中，本文所述的化合物以前药形式使用。在附加或其它实施方案中，本文所述的化合物在施用于有需要的生物体后代谢以生成随后用于产生期望效应包括期望的治疗效应的代谢物。
本文描述的方法和制剂包括使用N-氧化物、结晶形式(也被称作多晶型)或药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本文所述的化合物以互变异构体形式存在。所有互变异构体均包括于本文中提出的化合物的范畴内。在一些实施方案中，本文中描述的化合物以非溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。本文中提出的化合物的溶剂化形式也视为揭露于本文中。
在其它实施方案中是本文中描述的化合物，其以若干互变异构形式存在。所有这些互变异构形式均被视作本文中描述的组合物的一部分。同样，例如在一些实施方案中，本文中的任何化合物的所有烯醇-酮形式均被视作本文中描述的组合物的一部分。
在其它实施方案中，本文中描述的化合物具有酸性且在一些实施方案中与药学上可接受的阳离子形成盐。本文中的一些化合物具有碱性且在一些实施方案中与药学上可接受的阴离子形成盐。包括二盐在内的所有这些盐在本文中描述的组合物的范畴内且在一些实施方案中通过常规方法来制备。例如，在其它实施方案中，通过在水性、非水性或部分水性介质中使酸性实体与碱性实体接触来制备盐。通过使用以下技术中的至少一种来回收盐：过滤；以非溶剂沉淀，接着过滤；蒸发溶剂；或(在水溶液的情况下)冻干。
在一些实施方案中，当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换，或与有机碱配位时，形成本文中公开的化合物的药学上可接受的盐。另外，在其它实施方案中，使用起始物质或中间体的盐来制备所公开的化合物的盐形式。
在另一些实施方案中，药学上可接受的盐的类型包括但不限于：(1)与无机酸或与有机酸形成的酸加成盐，其中所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；所述有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换；或与有机碱配位时形成的盐。在再一实施方案中，可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。在一些实施方案中，可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。
在一些实施方案中，使用多种方法来分析和鉴别药学上可接受的盐的相应抗衡离子，这些方法包括但不限于离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、感应耦合等离子体、原子吸收光谱、质谱或其任何组合。
应了解，在一些实施方案中，盐的提及包括其溶剂加成形式或晶体形式，尤其是溶剂化物或多晶型物。在其它实施方案中，溶剂化物含有化学计量或非化学计量之量的溶剂，且通常在结晶过程中与药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)形成。在再一实施方案中，当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇时形成醇化物。多晶型物包括相同元素组成的化合物的不同晶体堆积排列。在一个实施方案中，多晶型物具有不同的X射线衍射图案、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学性质和电学性质、稳定性和溶解性。在其它实施方案中，诸如重结晶溶剂、结晶速率和储存温度的各种因素使得单一晶体形式占优势。
在其它实施方案中，药学上可接受的盐、多晶型物和/或溶剂化物的筛检和表征使用多种技术来实现，所述技术包括但不限于热分析、X射线衍射、光谱学、蒸气吸附以及显微镜检查。在再一实施方案中，热分析方法专注于热化学降解或热物理过程(包括但不限于多晶型转变)，且使用这些方法分析多晶型之间的关系、测定重量损失以找出玻璃化转变温度或用于赋形剂相容性研究。这些方法包括但不限于差示扫描量热法(DSC)、调制差示扫描量热法(MDSC)、热重分析(TGA)，以及热重和红外分析(TG/IR)。X射线衍射方法包括但不限于单晶和粉末衍射计以及同步加速器源。使用的各种光谱技术包括但不限于拉曼、FTIR、UVIS和NMR(液态和固态)。各种显微镜检查技术包括但不限于偏振光显微镜检查、伴随能量分散型X射线分析(EDX)的扫描电子显微镜检查(SEM)、伴随EDX的环境扫描电子显微镜检查(在气体或水蒸气气氛中)、IR显微镜检查，以及拉曼显微镜检查。
附图简述
通过参考以下陈述说明性实施方案(其中利用本发明方法、组合物、装置和设备的原理)的详细描述和其随附附图来获得对于本发明方法和组合物的特征和优点的较好理解：
图1显示代表性Btk抑制剂的结构。
图2显示代表性荧光探针的结构。
图3显示亲和探针的组成部分。
图4显示通过抑制剂与亲和探针之间的竞争分析测量靶结合的一般方案。
图5显示含有与Btk中的Cys 481对应的保守半胱氨酸(箭头)的激酶中的ATP结合口袋的序列比对。还显示蛋白登录号。
图6显示探针14对重组Btk的浓度依赖性标记。
图7显示探针14对重组Btk的时间依赖性标记。
图8显示活细胞中探针14主要标记的内源性Btk(浓度过程)。
图9显示细胞标记的时间过程实验的结果。
图10显示自探针14标记的裂解物的Btk免疫沉淀结果。泳道1：细胞裂解物；泳道2：除去内在IgG后的上清液；泳道3：免疫沉淀后的上清液；泳道4：洗脱前最后一次冲洗的上清液；泳道5：通过将LDS样品缓冲液施加到蛋白A琼脂糖凝胶珠上的第一次洗脱的上清液。
图11显示探针14(0.5 µM)对Btk的标记被依鲁替尼和化合物2(1 µM)完全竞争。
图12显示活细胞中抑制剂（依鲁替尼和化合物2）对Btk占据程度的测量。通过Gelpro32测量条带密度，并且使用Graphpad Prism测定IC50值。
图13显示OCI-Ly7细胞(a)和Jurkat细胞(b)中的竞争实验。将1.5×106个细胞与化合物一起以1μM预培养1h，之后用探针14在0.5μM标记2h，然后裂解、量化并通过SDS/PAGE和荧光凝胶扫描(荧光, CY2)分析。
发明详述
本文公开的是Btk抑制剂的合成和表征。本文还公开的是标记ATP结合口袋中独特的非催化半胱氨酸残基处的Btk的细胞可透过探针的合成和表征。
Btk抑制剂
本文描述的Btk抑制剂具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)，或其药学上可接受的盐：
其中R选自键、羰基亚烷基氨基(例如, 羰基C1-6亚烷基氨基)、(((氮杂环烷-2-基)-烷基)氧代甲烷)-1,N-二基(例如(((C5-7氮杂环烷-2-基)-C0-2烷基)氧代甲烷)-1,N-二基)；优选R选自、和；
其中R1选自烷基、芳基烷基、羟烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、氨基烷基和杂芳基烷基；优选R1选自、、、、、、和；更优选R1选自、、、、和；
其中
p是0、1、2或3，优选0；
q是0、1、2或3，优选0；
R11是含有选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环的末端基团的取代基；优选R11是被选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环作为末端基团的取代基取代的烷基，其中所述烷基中的一个或多个CH2基团任选被选自-NH-、-CO-、-SO2-和-SO-的二价基团替代；更优选R11选自、、、和。
根据本发明的Btk抑制剂的实例包括但不限于：
Btk活性探针化合物
本文所述的Btk亲和探针化合物由包含Btk抑制剂的部分(或Btk抑制剂部分)、连接物部分和报告物部分组成。在一个实施方案中，Btk的抑制剂是不可逆抑制剂。在另一实施方案中，Btk的不可逆抑制剂结合到Btk的ATP结合口袋中的非催化残基上；在其它实施方案中，所述非催化残基是半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述Btk亲和探针与Btk的至少一个非催化残基形成共价键。在另一实施方案中，所述Btk亲和探针与Btk的至少一个非催化残基形成非共价键。在另一些实施方案中，所述Btk亲和探针在Btk的ATP结合口袋内形成氢键结合。在再一实施方案中，所述Btk亲和探针与Btk酶具有范德华引力。
在其它一些实施方案中，本文所述的Btk亲和探针是活性依赖性的以使该探针仅与活性Btk酶结合。在其它实施方案中，所述Btk亲和探针与已经通过上游激酶的磷酸化而活化（switched on）的Btk酶结合。在再一实施方案中，本文所述的Btk亲和探针是不依赖于活性的以使该探针与尚未通过上游激酶的磷酸化而活化的Btk酶结合。在一些实施方案中，所述Btk亲和探针标记Btk酶的磷酸化构象。在其它实施方案中，所述Btk亲和探针标记非磷酸化构象的Btk。
在一些实施方案中，所述Btk亲和探针可透过细胞。
在其它实施方案中，所述连接物部分选自键、经取代烷基部分、经取代杂环部分、经取代酰胺部分、酮部分、经取代氨基甲酸酯部分、酯部分或其任何组合。在其它实施方案中，所述报告物部分是使用标准或改进的实验室设备检测的部分。
一个方面是如下式(Ic)所示的Btk亲和探针：
其中所述Btk抑制剂部分可衍生自上述具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的化合物；
其中X和Y独立地选自键、
其中形成含N杂环；
Ra是氢或烷基。
在一个实施方案中，所述Btk抑制剂部分衍生自具有通式(Ia)或(Ib)或(Ib-1)或(Id)的Btk抑制剂：
其中R选自键、羰基亚烷基氨基(例如, 羰基C1-6亚烷基氨基)、(((氮杂环烷-2-基)-烷基)氧代甲烷)-1,N-二基(例如(((C5-7氮杂环烷-2-基)-C0-2烷基)氧代甲烷)-1,N-二基)；优选R选自
其中R1选自烷基、芳基烷基、羟烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、氨基烷基和杂芳基烷基；优选R1选自 更优选R1选自
其中
p是0、1、2或3，优选0；
q是0、1、2或3，优选0；
R11是含有选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环的末端基团的取代基；优选R11是被选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环作为末端基团的取代基取代的烷基，其中所述烷基中的一个或多个CH2部分任选被选自-NH-、-CO-、-SO2- 和-SO-的二价基团替代；更优选R11选自 。
根据本发明的Btk抑制剂部分由其衍生的Btk抑制剂的实例包括但不限于：
在一个实施方案中，所述Btk抑制剂部分选自
在一个实施方案中，所述Btk抑制剂衍生自Btk的不可逆抑制剂。在一些实施方案中，这些Btk的不可逆抑制剂应当具有以下特征中的至少一个：效力、选择性和细胞透过性。在其它实施方案中，这些Btk的不可逆抑制剂具有上述特征中的至少两个，且在其它实施方案中，具有至少所有的上述特征。
在另一实施方案中，所述连接物部分选自键、聚合物、水溶性聚合物、任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基烷基、任选取代的杂环烷基烯基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环烷基烯基烷基。在一些实施方案中，所述连接物部分选自键。在一些实施方案中，所述连接物部分是任选取代的杂环。在其它实施方案中，所述杂环选自氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、吡咯啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、吡唑、吡咯、咪唑、三唑、四唑、噁唑、异噁唑、环氧乙烯、噻唑、异噻唑、二硫杂环戊烷、呋喃、噻吩、哌啶、四氢吡喃、硫杂环己烷、吡啶、吡喃、噻喃、哒嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、噁嗪、噻嗪、二噻烷和二氧杂环己烷。在一些实施方案中，所述杂环是哌嗪。在其它实施方案中，所述连接物部分被卤素、CN、OH、NO2、烷基、S(O)和S(O)2任选取代。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物是PEG基团。
在其它实施方案中，所述连接物部分提供所述报告物部分与所述Btk抑制剂部分之间的足够的空间分离。在其它实施方案中，所述连接物部分是稳定的。在再一实施方案中，所述连接物部分基本不影响所述报告物部分的反应。在其它实施方案中，所述连接物部分向所述Btk亲和探针提供化学稳定性。在其它实施方案中，所述连接物部分向所述Btk亲和探针提供足够的溶解度。
在一些实施方案中，诸如水溶性聚合物的键联在一端与Btk抑制剂部分结合和在另一端与报告物部分结合。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物经由所述Btk抑制剂部分的官能团或取代基结合。在另一些实施方案中，所述水溶性聚合物经由所述报告物部分的官能团或取代基结合。在其它实施方案中，亲水性聚合物与Btk抑制剂部分和报告物部分的共价连接代表一种增加所述Btk亲和探针（包括蛋白、肽和特别是疏水性分子）的水溶性(诸如在生理环境中)、生物利用度，增加血清半衰期、增加药效动力学参数或延长循环时间的方法。在另一些实施方案中，这些亲水性聚合物的另外重要的特征包括生物相容性和没有毒性。在其它实施方案中，对于终产物制品的治疗用途，所述聚合物是药学上可接受的。
在一些实施方案中，亲水性聚合物的实例包括但不限于：聚烷基醚类及其烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙烯/丙二醇及其甲氧基或乙氧基封端的类似物，聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉，聚烷基噁唑啉和聚羟烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺，聚烷基丙烯酰胺和聚羟烷基丙烯酰胺(例如，聚羟丙基甲基丙烯酰胺及其衍生物)；聚丙烯酸羟烷酯；多聚唾液酸及其类似物，亲水性肽序列；多糖及其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素及其衍生物，例如，羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；几丁质及其衍生物，例如，壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖；透明质酸及其衍生物；淀粉；藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸及其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如：苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物、其三元共聚物、其混合物及上述的衍生物。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物是任何结构形式，包括但不限于，线性、叉状或分枝的。在一些实施方案中，水溶性的、具有2至约300个末端的聚合物主链是特别有用的。在其它实施方案中，多官能聚合物衍生物包括但不限于，具有两个末端的线性聚合物，其中每个末端键合至相同或不同的官能团。在一些实施方案中，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在其它实施方案中，所述聚合物的分子量范围宽广，包括但不限于，约100 Da至约100,000Da或更大。在另一些实施方案中，所述聚合物的分子量为约100 Da至约100,000 Da，包括但不限于约100,000 Da、约95,000 Da、约 90,000 Da、约 85,000 Da、约 80,000 Da、约 75,000 Da、约 70,000 Da、约 65,000 Da、约 60,000 Da、约 55,000 Da、约 50,000 Da、约45,000 Da、约 40,000 Da、约 35,000 Da、30,000 Da、约 25,000 Da、约 20,000 Da、约15,000 Da、约 10,000 Da、约 9,000 Da、约 8,000 Da、约 7,000 Da、约 6,000 Da、约 5,000 Da、约 4,000 Da、约 3,000 Da、约 2,000 Da、约 1,000 Da、约 900 Da、约 800 Da、约700 Da、约 600 Da、约 500 Da、约 400 Da、约 300 Da、约 200 Da和约 100 Da。在一些实施方案中，所述聚合物的分子量是约100 Da至50,000 Da。在一些实施方案中，所述聚合物的分子量是约100 Da至40,000 Da。在一些实施方案中，所述聚合物的分子量是约1,000 Da至40,000 Da。在一些实施方案中，所述聚合物的分子量是约5,000 Da至40,000 Da。在一些实施方案中，所述聚合物的分子量是约10,000 Da至40,000 Da。在一些实施方案中，所述聚(乙二醇)分子是支化聚合物。在另一些实施方案中，所述支链PEG的分子量是约1,000 Da至约 100,000 Da，包括但不限于，约100,000 Da、约95,000 Da、约90,000 Da、约85,000 Da、约80,000 Da、约75,000 Da、约70,000 Da、约65,000 Da、约60,000 Da、约55,000 Da、约50,000 Da、约45,000 Da、约40,000 Da、约35,000 Da、约30,000 Da、约25,000 Da、约20,000Da、约15,000 Da、约10,000 Da、约9,000 Da、约8,000 Da、约7,000 Da、约6,000 Da、约5,000 Da、约4,000 Da、约3,000 Da、约2,000 Da和约1,000 Da。在一些实施方案中，所述支链PEG的分子量是约1,000 Da至约50,000 Da。在一些实施方案中，所述支链PEG的分子量是约1,000 Da至约40,000 Da。在一些实施方案中，所述支链PEG的分子量是约5,000 Da至约40,000 Da。在一些实施方案中，所述支链PEG的分子量是约5,000 Da至约20,000 Da。基本上水溶性主链的上述列举决不是穷举的且仅为说明性的，并且在一些实施方案中，具有如上描述的性质的聚合物质适用于本文所述的方法和组合物。
在另一些实施方案中，调整与本文所述的Btk抑制剂部分和报告物部分连接的水溶性聚合物的数目以提供改变的(包括但不限于，增加或降低的)药理学、药代动力学或药效动力学特征诸如体内半衰期。在一些实施方案中，所述Btk亲和探针的半衰期与没有水溶性连接物的Btk亲和探针相比增加至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%，增加到约2倍、约5倍、约10倍、约50倍或至少约100倍。
在另一实施方案中，X选自键、-O(CO)-、-NRa(CO)-、-NRa-、、-O-、-S-、-S-S-、-O-NRa-、-O(CO)O-、-O(CO)NRa、-NRa(CO)NRa-、-N═CRa-、-S(CO)-、-S(O)-和-S(O)2-；
其中形成含N杂环。在一个实施方案中，X是NRa(CO)。在另一实施方案中，X是键。在另一实施方案中，X是-O(CO)-。
在另一实施方案中，Y选自键、-O(CO)-、-NRa(CO)-、-NRa-、、-O-、-S-、-S-S-、-O-NRa-、-O(CO)O-、-O(CO)NRa、-NRa(CO)NRa-、-N═CRa-、-S(CO)-、-S(O)-和-S(O)2-；
其中
形成含N杂环。在再一实施方案中，Y是键。在一个实施方案中，Y是-NRa(CO)-。在再一实施方案中，Ra是氢。在再一实施方案中，Ra是烷基。
在另一实施方案中，所述报告物部分选自标记物、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记物、光亲和标记物、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记物、荧光团、含金属部分、放射性部分、新型官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射易激部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物、掺入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光解的基团、氧化还原剂、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光性基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记物或其组合。
在另一实施方案中，所述报告物部分是荧光团。在另一实施方案中，所述荧光团选自：BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、荧光素、5(6)-羧基荧光素、2,7-二氯荧光素、N,N-双(2,4,6-三甲基苯基)-3,4:9,10-苝双(二甲酰亚胺)、HPTS、乙基曙红、DY-490XL MegaStokes、DY-485XL MegaStokes、Adirondack Green 520、ATTO465、ATTO 488、ATTO 495、YOYO-1,5-FAM、BCECF、BCECF、二氯荧光素、罗丹明110、罗丹明123、罗丹明绿、YO-PRO-1、SYTOX Green、Sodium Green、SYBR Green I、Alexa Fluor 500、FITC、Fluo-3、Fluo-4、fluoro-emerald、YoYo-1 ssDNA、YoYo-1 dsDNA、YoYo-1、SYTORNASelect、Diversa Green-FP、Dragon Green、EvaGreen、Surf Green EX、SpectrumGreen、Oregon Green 488、NeuroTrace 500525、NBD-X、MitoTracker Green FM、LysoTracker Green DND-26、CBQCA、PA-GFP (后活化)、WEGFP (后活化)、FlASH-CCXXCC、Azami Green monomeric、Azami Green、EGFP (Campbell Tsien 2003)、EGFP (Patterson2001)、荧光素、Kaede Green、7-苄基氨基-4-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑、Bexl、阿霉素、Lumio Green和SuperGlo GFP。
在另一实施方案中，所述荧光团选自：BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY581/591和BODIPY TR。在再一实施方案中，所述荧光团是BODIPY FL。在某些实施方案中，所述荧光团不是BODIPY 530。在一些实施方案中，所述荧光团具有约500至约600 nm的最大激发。在一些其它实施方案中，所述荧光团具有约500至约550 nm的最大激发。在另一些实施方案中，所述荧光团具有约550至约600 nm的最大激发。在再一实施方案中，所述荧光团具有约525至约575 nm的最大激发。在其它实施方案中，所述荧光团具有约510至约670 nm的最大激发。在另一实施方案中，所述荧光团具有约510至约600 nm的最大激发。在另一实施方案中，所述荧光团具有约600至约670 nm的最大激发。在另一实施方案中，所述荧光团具有约575至约625 nm的最大激发。
在一些实施方案中，形成的键联是稳定的键联。在其它实施方案中，在缀合物包含两个组成部分的情况下，所述连接物部分在所述Btk抑制剂部分和所述报告物部分之间形成键联，在一些实施方案中，形成稳定的键联。在一些实施方案中，所述连接物部分是稳定的并提供控制和确定所述Btk抑制剂部分和所述报告物部分之间的距离的手段。另外，在一些实施方案中，选择所述连接物部分以便保持所述探针的溶解性。在其它实施方案中，选择包含所述连接物部分的单元的数量和顺序以便控制第一组成部分与第二组成部分之间的长度以及连接物的疏水和亲水特征。
在本发明的上下文中，空间分离是指热化学和光化学非活性的制造距离的基团并且在一些实施方案中用于连接两个或更多个上述限定类型的不同的部分。在其它实施方案中，基于各种特征包括其疏水性、亲水性、分子柔性和长度来选择间隔物。因此，在一些实施方案中，所述间隔物包含任选被一个或多个杂原子诸如氧原子、氮原子和/或硫原子插入或终止的碳原子链。因此，在一些实施方案中，所述间隔物包含一个或多个酰胺、酯、氨基、醚和/或硫醚官能团，且任选芳族或单/多不饱和烃、聚氧乙烯诸如聚乙二醇、寡/多酰胺诸如聚-.α-丙氨酸、聚甘氨酸、聚赖氨酸和一般而言的肽、低聚糖、寡/多磷酸盐。此外，在其它实施方案中，所述间隔物由其合并单位组成。在其它实施方案中，所述间隔物的长度可变，考虑到所述Btk亲和探针的活性/官能部分的期望或必要定位和空间定向。
不限制本文所述的组合物的范围，在一些实施方案中，所述报告物部分是Bodipy。在本发明的上下文中，术语报告物部分是指其本身或作为检测系列的一部分可被检测的基团。
在一些实施方案中，化合物(14)保留化合物(11)的溶解性和膜透过性，以允许通过SDS-PAGE和激光密度测定法检测和量化标记的Btk。
在一些实施方案中，本文所述的标记的Btk亲和探针通过一种或多种程序提纯，包括但不限于亲和色谱；阴离子交换或阳离子交换色谱(使用，包括但不限于，DEAESEPHAROSE)；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用，包括但不限于，SEPHADEX G-75)；疏水作用色谱；尺寸排阻色谱，金属螯合物色谱；超滤/渗滤（diafiltration）；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；聚焦层析；置换色谱；电泳术(包括但不限于制备型等电点聚焦)、差别溶解(包括但不限于硫酸铵沉淀)或提取。在其它实施方案中，表观分子量通过GPC通过与球蛋白标准品比较来估计(PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal,Eds.) IRL Press 1989, 293-306)。
此外，在一些实施方案中，以下公开的合成程序包括各种提纯，诸如柱色谱、快速色谱、薄层色谱(TLC)、重结晶、蒸馏、高压液相色谱(HPLC)等。另外，在其它实施方案中，也使用用于鉴定和量化化学反应产物的各种技术，诸如质子和碳-13核磁共振(1H和13C NMR)、红外和紫外光谱(IR和UV)、X-射线晶体学、元素分析(EA)、HPLC和质谱(MS)。
除非另外指出，在一些实施方案中，使用质谱、NMR、HPLC、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的方法。
本文使用的缩写具有下列含义
DMF 二甲基甲酰胺
HOBt 羟基苯并三唑
EDCI 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
DCM 二氯甲烷
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
DIEA N,N-二异丙基乙胺
EtOAc 乙酸乙酯
MeOD 氘化甲醇
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
合成实施例
除非另外指出，否则所有试剂均商购且不经进一步提纯而使用。所有收率是指色谱收率。无水二甲基甲酰胺(DMF)由氢化钙蒸馏。盐水是指氯化钠在蒸馏水中的饱和溶液。通过0.25 mm烟台硅胶板(HSGF254)上进行的薄层色谱(TLC)使用UV灯作为显色剂来监测反应。快速柱色谱使用烟台硅胶(ZCX-II, 粒径 0.048-0.075 mm)进行。1H-NMR和13C-NMR谱在Bruker Advance 400 (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz )或Bruker Advance 300 (1H: 300MHz, 13C: 75 MHz)波谱仪上在环境温度记录，化学位移值以相对于作为标准的TMS (δH0.00和δC 0.00)、二甲亚砜(δH 2.50和δC 39.52)或甲醇(δH 3.31和δC 49.00)的ppm计。数据如下报告：化学位移, 多重性 (s = 单峰, d = 双峰, t = 三重峰, q = 四重峰, br =宽, m = 多重锋), 耦合常数和质子数。HR-MS使用Bruker Apex IV RTMS获得。化合物的纯度通过Agilent 1200 HPLC或1260 HPLC上获得的HPLC色谱图确定。通过AgilentPN959990-902 Eclipse Plus C18 250 mm × 4.6 mm柱，使用水–MeCN梯度在10 min内MeCN由50%至98%或50%至65%来进行分析。在254 nm检测，使用平均峰面积来确定纯度。所有化合物确定为 >95%纯。
实施例1 N-(2-(3-(3-丙烯酰胺基丙酰胺基)苯基氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(3)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为3-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为白色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C32H28F3N7NaO4 [M+Na+]的计算值：654.2053；实测值：654.2058。
实施例2 (S)-1-丙烯酰基-N-(3-((5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)吡咯烷-2-甲酰胺(4)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为(S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-甲酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为白色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C34H30F3N7NaO4 [M+Na+]的计算值：680.2209；实测值：680.2204。
实施例3 (S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基丙酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(5)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为白色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C32H28F3N7NaO4 [M+Na+]的计算值：654.2053；实测值：654.2058。
实施例4 (S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基-4-甲基戊酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(6)的合成
步骤1:
将N-(2-((3-氨基苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(中间体1) (0.101g, 0.2mmol)溶于2ml干燥DMF中，冷却至0℃，接着在0℃添加Et3N(0.14ml, 1mmol)、HOBt (0.032g, 0.24mmol)、N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸 (0.069g,0.3mmol)和缓慢的EDCI (0.077g, 0.4mmol)。使反应缓慢达到室温并反应过夜。反应停止后，在减压下除去挥发性组分。残余物用饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过柱色谱提纯(梯度: 30-50% EtOAc/己烷)以得到为浅黄色固体的(S)-4-甲基-1-(3-(5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基氨基)苯基氨基)-1-氧代戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(0.105g)。
步骤2:
将(S)-4-甲基-1-(3-(5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基氨基)苯基氨基)-1-氧代戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(0.105g, 0.15mmol)溶于6ml DCM，用3ml TFA处理。混合物在室温搅拌2 h并真空浓缩。将该粗产物(约0.17mmol) 溶于2ml THF，冷却至0℃，添加DIEA (56µL,0.34mmol)、1ml水，接着缓慢添加丙烯酰氯(21µL,0.25mmol)。使反应至室温，反应2小时。停止反应后，在减压下除去挥发性组分。残余物用饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过柱色谱提纯(梯度: 30-60% EtOAc/己烷)以得到为白色固体的(S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基-4-甲基戊酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(6) (40.8mg, 经三个步骤30%)。
HRMS-ESI C35H34F3N7NaO4 [M+Na+]的计算值：696.2522；实测值：696.2516。
实施例5 (S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基-3-苯基丙酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(7)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为白色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C38H32F3N7NaO4 [M+Na+]的计算值：730.2366；实测值：730.2366。
实施例6 (S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基-3-羟基丙酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(8)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-羟基丙酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为浅黄色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C32H28F3N7NaO5 [M+Na+]的计算值：670.2002；实测值：670.1999。
实施例7 (S)-2-丙烯酰胺基-N1-(3-((5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)琥珀酰胺(9)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为(S)-4-氨基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-氧代丁酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为浅黄色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C33H30F3N8O5 [M+H+]的计算值：675.2291；实测值：675.2286。
实施例8 (S)-4-丙烯酰胺基-5-((3-((5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(10)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊二酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为浅黄色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C34H31F3N7O6 [M+H+]的计算值：690.2288；实测值：690.2283。
实施例9 (S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基-6-氨基己酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺三氟乙酸盐(11)的合成
步骤1:
将N-(2-((3-氨基苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(中间体1) (0.07g, 0.14mmol)、Nα-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-Nε-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸 (0.101g, 0.21mmol)、HATU (0.105g, 0.28mmol)溶于干燥DMF，冷却至0℃，然后添加DIEA (46µL, 0.28mmol)。使反应缓慢至室温并反应过夜。在停止反应的同时，在减压下除去挥发性组分。残余物用饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过柱色谱提纯(梯度: 30-60% EtOAc/己烷)以得到为黄色固体的(S)-(6-((3-((5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯叔丁酯(0.128g,96%)。
步骤2:
将(S)-(6-((3-((5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯叔丁酯(0.128g,0.13mmol)溶于1ml干燥DMF，用1ml吗啉处理，在室温反应3小时。在停止反应的同时，在减压下除去挥发性组分。残余物用饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过柱色谱提纯 (梯度: 2-4% MeOH/DCM)以得到为浅黄色固体的(S)-5-氨基-6-(3-(5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基氨基)苯基氨基)-6-氧代己基氨基甲酸叔丁酯(0.084g, 88%)。
步骤3:
将(S)-5-氨基-6-(3-(5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基氨基)苯基氨基)-6-氧代己基氨基甲酸叔丁酯(0.084g, 0.114mmol)溶于1ml THF，冷却至0℃，添加DIEA (38µL,0.23mmol)、0.5ml水，接着缓慢添加丙烯酰氯(18µL, 0.23mmol)。使反应至室温，反应2小时。在停止反应的同时，在减压下除去挥发性组分。残余物用饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩，得到为黄色固体的粗产物(0.080g)。将后者溶于1ml DCM，用0.5ml TFA处理。混合物在室温搅拌2 h并真空浓缩，获得的固体用乙醚洗涤，然后得到为黄色固体的标题化合物(11) (0.037 g, 经2个步骤47%)。
HRMS-ESI C35H36F3N8O4 [M+H+]的计算值：689.2812；实测值：689.2807。
实施例10 (S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基-3-(1H-咪唑-5-基)丙酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(12)的合成
除了在实施例4的步骤1中将N-(叔丁氧基羰基)-L-亮氨酸替换为(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(1H-咪唑-5-基)丙酸外，重复与实施例4类似的程序，以产生为浅黄色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C35H31F3N9O4 [M+H+]的计算值：698.2451；实测值：698.2447。
实施例11 (S)-N-(2-((3-(2-丙烯酰胺基-6-(戊-4-炔酰胺基)己酰胺基)苯基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺(13)的合成
除了将BODIPY® FL替换为戊-4-炔酸外，重复与实施例12类似的程序以制备为浅黄色固体的标题化合物。
HRMS-ESI C40H39F3N8NaO5 [M+Na+]的计算值：791.2893；实测值；791.2889。
实施例12
(S)-3-(3-(5-丙烯酰胺基-6-(3-(5-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯甲酰胺基)嘧啶-2-基氨基)苯基氨基)-6-氧代己基氨基)-3-氧代丙基)-5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-二吡咯并[1,2-c:1',2'-f][1,3,2]二氮杂硼杂苯-4-鎓-5-化物 (14)
将化合物(11) (0.038g, 0.055mmol)、4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-(S)-不对称引达省-3-丙酸 (BODIPY® FL) (0.015g, 0.05mmol)、HATU (0.038g,0.1mmol)溶于干燥DMF，冷却至0℃，然后添加DIEA(41µL, 0.25mmol)。使反应缓慢至室温并反应过夜。在停止反应的同时，在减压下除去挥发性组分。残余物用饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩并通过柱色谱提纯(梯度: 60%EtOAc/己烷-1% MeOH/EtOAc)以得到为红色固体的指定产物(14) (0.033g, 70%)。
HRMS-ESI C49H48BF5N10NaO5 [M+Na+]的计算值：985.3720；实测值：985.3717。
生物测定
激酶酶学测定
激酶购买自Carna Biosciences。激酶酶学测定根据对于Cisbio Bioassays销售的HTRF® KinEase™ 测定法指定的方案进行。
Btk抑制剂的动力学研究
该激酶测定在室温进行。将在DMSO中系列稀释的化合物添加到含有0.5nM Btk的反应缓冲液中，孵育不同时段(0min、4min、8min、12min、16min和20min)。通过将ATP和底物添加到反应混合物中来起始酶反应。酶活性使用HTRF® KinEase™测定法测量。由HansBisswanger的书籍Enzyme Kinetics[Bisswanger, H. Enzyme Kinetics -principles and methods, 103-106 (Weinheim, 2002)]指导数据分析。
重组蛋白标记测定
在25 µL的PBS缓冲液中，0.5 µg的重组Btk与渐增浓度的探针14一起孵育2 h，然后通过SDS/PAGE和荧光凝胶扫描(荧光, CY2)来分析。然后将凝胶印迹分析（blotted），并通过标准银染色检测总Btk水平。浓度过程标记程序与时间过程标记程序类似。
细胞标记测定
用探针14标记Btk。总共1.5×106个细胞用1 μM的探针14处理不同时长(5 min、10min、20 min、30 min、1 h、2 h、3 h或4 h)，洗涤，在含有1 mM PMSF和10 mM NaF(Invitrogen)的细胞裂解缓冲液(Beyotime)中裂解并离心。使用NanoDrop 2000分光光度计量化样品蛋白浓度，将样品调整到相同浓度，然后通过SDS/PAGE和荧光凝胶扫描(荧光,CY2)分析。然后将凝胶印迹分析，并通过标准蛋白印迹检测总Btk水平。浓度过程标记程序与时间过程标记程序类似。
Btk的免疫沉淀。LY7细胞用0.5μM的探针14处理2h，在含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的结合缓冲液(20 mM Na3PO4, pH 7.5, 150 mM NaCl)中裂解。获得的裂解液用Protein A琼脂糖凝胶珠(GE healthcare, 17-5138-01)预孵育以除去内在的细胞IgG蛋白。与此同时，兔抗-Btk (CST, 8574S)用Protein A琼脂糖凝胶珠在4℃预孵育2小时。然后，将预处理的裂解液添加到预处理的固定化Protein A琼脂糖凝胶中，在4℃孵育2小时。免疫复合物用结合缓冲液洗涤四次，用LDS样品缓冲液(50 mM Tris-HCl, 2% SDS, 0.1%溴酚蓝, 10%甘油, 1% DTT)洗脱并通过蛋白印迹分析，如上所述。
竞争试验。LY7细胞用化合物(1 μM)预孵育1 h，之后在适当的时间和浓度条件下用探针14标记。然后，将细胞裂解并如上所述分析。
Btk抑制剂的靶结合。LY7细胞用不同浓度的化合物预孵育1 h，之后用探针14标记。然后，将样品裂解并如上所述分析。使用Gelpro32软件来分析Btk条带密度以获得半数最大活性位点占据值。
结果讨论
Btk抑制剂的结构-活性关系
本发明化合物的Btk抑制剂活性(基于激酶酶学测定)在下表中显示：
* 数值通过一式两份的单次运行测定，所有其余值是两次单独测量的平均值。
化合物14是Btk的选择性亲和探针
当用渐增浓度的探针14孵育重组Btk (0.5 µg)时，荧光信号相应增加，选择0.5 µM为用于之后步骤的探针浓度，因为其已经提供足够强的信号。当探针14与Btk孵育渐增的时段时，荧光信号的亮度在2小时时达到最大值(图6和7)。
在活OCI-Ly7细胞中，在Btk的预期分子量(约76 kDa)处呈现主条带，在较低分子量处呈现几个次要条带。该主条带也对抗-Btk抗体具有免疫反应性。浓度过程实验再次表明Btk条带强度在0.5 µM探针14时达到饱和。时间过程实验也表明2小时的孵育时间足以标记(图8和9)。为了进一步确认在这些细胞中Btk确实被探针14标记，Btk成功地自探针14-标记的裂解物免疫沉淀(图10)。总的来说，Btk确实是OCI-Ly7细胞中被探针14标记的主条带(图13a)。如所预期的，在Jurkat细胞（不表达Btk的T细胞株）中没有检测到明显的标记(图13b)。
2,5-二氨基嘧啶系列的抑制剂在活细胞中直接结合Btk
在优化标记条件后，检查探针14能否用来评估抑制剂对Btk的靶结合。检查了两种类型的结构不同的Btk抑制剂：临床批准的Btk药物依鲁替尼和化合物2（其含有与探针14相同的骨架）。细胞首先用抑制剂孵育1小时，接着用0.5 µM的探针14孵育2小时。如图11所示，两个化合物在1 µM时均有效阻断探针14对Btk的标记。为了测量活细胞中Btk被抑制剂占据的程度，OCI-Ly7细胞用渐增浓度的化合物孵育1小时，之后用探针14标记2小时。细胞裂解后，将蛋白内容物直接装载到凝胶上。在电泳后，测量条带的荧光密度。如图12中呈现的，依鲁替尼和化合物2对Btk占据的IC50 值分别为2 nM和8 nM。
应理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，各种修改或变化将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于各种目的在此通过引用以其全文并入。

Claims (22)

1.具有通式(Id)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中
p是0、1、 2或3；
q是0、1、2或3；且
R11是含有选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环的末端基团的取代基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中p是0且q是0。
3.根据前述权利要求任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R11是被选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环作为末端基团的取代基取代的烷基，其中所述烷基中的一个或多个CH2部分任选被选自-NH-、-CO-、-SO2- 和-SO-的二价基团替代。
4.根据前述权利要求任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R11选自 。
5.化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
。
6.药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1-5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体。
7.根据权利要求1-5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自自身免疫疾病、异种免疫疾病、炎性疾病、癌症和血栓栓塞性疾病。
8.根据权利要求1-5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备Btk亲和探针中的用途。
9.以下任一化合物或其药学上可接受的盐在制备Btk亲和探针中的用途：
。
10.如下式(Ic)所示的Btk亲和探针：
其中所述Btk抑制剂部分可衍生自具有通式(Id)的化合物：
其中
p是0、1、 2或3；
q是0、1、2或3；
R11是含有选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环的末端基团的取代基；
其中X和Y独立地选自键、-O(CO)-、-NRa(CO)-、-NRa-、、-O-、-S-、-S-S-、-O-NRa-、-O(CO)O-、-O(CO)NRa-、-NRa(CO)NRa-、N═CRa-、-S(CO)-、-S(O)-和-S(O)2-；
其中形成含N杂环；
Ra是氢或烷基；
其中所述连接物部分选自键、任选取代的烷基部分、任选取代的杂环部分、任选取代的酰胺部分、酮部分、任选取代的氨基甲酸酯部分、酯部分或其组合；
其中所述报告物部分选自标记物、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记物、光亲和标记物、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记物、荧光团、含金属部分、放射性部分、新型官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射易激部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物、掺入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光解的基团、氧化还原剂、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光性基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记物或其组合。
11.根据权利要求10所述的Btk亲和探针，其中p是0且q是0。
12.根据权利要求10-11任一项所述的Btk亲和探针，其中R11是被选自OH、COOH、CONH2、NH2和含氮杂环作为末端基团的取代基取代的烷基，其中所述烷基中的一个或多个CH2部分任选被选自-NH-、-CO-、-SO2- 和-SO-的二价基团替代。
13.根据权利要求10-12任一项所述的Btk亲和探针，其中R11选自 。
14.根据权利要求10-13任一项所述的Btk亲和探针，其中所述连接物部分是键。
15.根据权利要求10-14任一项所述的Btk亲和探针，其中所述报告物部分是荧光团。
16.根据权利要求15所述的Btk亲和探针，其中所述荧光团是Bodipy荧光团。
17.根据权利要求16所述的Btk亲和探针，其中所述Bodipy荧光团是Bodipy FL荧光团。
18.具有以下结构的Btk亲和探针：
。
19.用于评估潜在的Btk抑制剂在哺乳动物中的效力的方法，其包括将潜在的Btk抑制剂施用于所述哺乳动物，将权利要求10-18任一项所述的Btk亲和探针施用于所述哺乳动物或从所述哺乳动物分离的细胞；测量所述Btk亲和探针的报告物部分的活性，和将报告物部分的活性与标准进行比较。
20.用于评估Btk抑制剂在哺乳动物中的药效动力学的方法，其包括将Btk抑制剂施用于多个哺乳动物，将权利要求10-18任一项所述的Btk亲和探针施用于所述多个哺乳动物或从多个哺乳动物分离的细胞，和在施用所述抑制剂后在不同时间点测量所述Btk亲和探针的活性。
21.Btk酶的体外标记方法，包括使表达Btk酶的细胞或组织与权利要求10-18任一项所述的Btk亲和探针接触。
22.用于检测标记的Btk酶的方法，包括通过电泳分离蛋白，其中所述蛋白包含被权利要求10-18任一项所述的Btk亲和探针标记的Btk酶；和通过荧光检测所述Btk亲和探针。
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