CN108778324A - 罗非鱼的正黏样病毒 - Google Patents

Abstract

本文描述了新发现的鱼的RNA病毒的分离和表征。还描述了用于检测分离的病毒、减毒活病毒疫苗和灭活的病毒疫苗的方法。

Description

罗非鱼的正黏样病毒

相关申请的交叉引用

要求于2016年1月10日提交的美国临时专利申请号62/276,873和2016年6月21日提交的美国临时专利申请号62/352,570的权益，其内容通过引用以它们的整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及新发现的鱼的RNA病毒的分离和表征。还公开了用于检测分离的病毒、减毒活病毒疫苗和灭活的病毒疫苗的方法。

背景技术

罗非鱼是近百种热带丽鱼科鱼的通用名称，其在全球是在鲤鱼之后的第二最多养殖的食用鱼。基于来自联合国粮食和农业组织(FAO)的报告，尼罗罗非鱼—罗非鱼(Oreochromis niloticus)—是养殖用于消费的主要罗非鱼品种之一，2012年全球产量达到320万吨(mt)(FAO)。罗非鱼物种在温暖气候的国家养殖，以色列是其最北部的分布点之一。

根据以色列农业部，在以色列每年消费7,662吨罗非鱼，占全部淡水鱼消费的43％。在过去二十年里，罗非鱼在贝特谢安山谷的产量从每年1,600吨上升到5,700吨。

2009年8月，养鱼户报告贝特谢安山谷地区的罗非鱼突然出现高死亡率。在杂交灰罗非鱼中，总死亡率达到30％-40％。红罗非鱼杂交生产的损害更为严重，在一些鱼塘中达到高达100％的损失。在养成池和水库池中都观察到幼鱼和成鱼的死亡。在幼鱼中，死亡事件的特征在于初始食欲不振，在池塘边缘处观察到弱鱼，掠食性鸟类的存在增加，和不同速率的最终鱼死亡率。检测到已知寄生虫的存在增加，并且处理似乎减轻了一些损失。在较大的鱼中，食欲不振和嗜睡明显，并且在几天内急性高死亡率，随后恢复鱼类种群。神经坏死病毒的存在的诊断测试为阴性。

在2010年夏天，罗非鱼的死亡率报告在6月从贝特谢安山谷和地中海沿岸地区二者开始。主要损失伴随着性反转和初始养成。在Nir-David的鱼健康中心的测试不会产生疾病模型，也不能表征病原体。不明原因的流行病事件在2011和2012年的整个夏天继续。在2011和2012年的死亡事件的初始统计分析未揭示寄生虫的存在和罗非鱼农场中的死亡率的显著相关性。鉴定的寄生虫随物种变化，并且因此可能无法解释流行病事件。此外，已知这种寄生虫可能是次级病原体，并且不是死亡率的主要原因。细菌的存在和死亡事件没有显著的相关性。另外，疾病的发作和临床症状不是已知的罗非鱼病毒病原体的特征。

因此，对于确定最近罗非鱼流行病事件的病原体存在需要。

发明内容

本文提供了CNCM(巴斯德研究所)保藏的登记号为CNCM I-4892的分离的罗非鱼病毒(TLV)。

本文还提供了分离的正黏样病毒，其具有由与SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24中的每个至少90％同一的核酸序列组成的基因组。

本文进一步描述了分离的核酸，其包括与选自SEQ ID NOs 25-48的核酸至少90％同一的核酸。

本公开内容还描述了用于检测罗非鱼病毒(TLV)感染性的方法，其包括从怀疑感染了TLV的受试者分离样品；从样品产生cDNA模板；和使用至少一种寡核苷酸引物扩增来自cDNA模板的核酸，至少一种寡核苷酸引物包括与选自SEQ ID Nos：25-48的至少一个序列至少90％同一的核酸序列，其中核酸序列用引物的扩增指示样品中存在TLV。

本文还描述了分离的减毒和分离的灭活罗非鱼病毒(TLV)。在具体实施方式中，分离的病毒组合物中的任一者还包括佐剂。

另外提供了用于检测TLV的试剂盒，其包括描述的核酸，和通过使用分离的灭活或减毒病毒使受试者针对TLV接种疫苗的方法。

通过参考附图进行的以下详细描述，前述和其它目的、特征和优势将变得更加显而易见。

附图说明

图1是在感染5天之后感染的罗非鱼细胞的电子显微照片(EM)。细胞展现了细胞区室和细胞器的解体。细胞质液泡包含大小和形态不同的丰富的病毒样结构(右图箭头)。

图2显示维持在15℃-33℃下的未感染的(上图)和感染的(下图)罗非鱼鳍细胞(TFC)。感染细胞在15℃下展现正常形态，没有明显的CPE。在23℃-33℃，细胞展现细胞质空泡化和细胞变圆，其最终引起细胞培养物的死亡。

图3是类似于正黏病毒的PB1RNA聚合酶的TLV的重叠群4的系统发育分析。使用TREX-MAFFT序列比对软件组装系统发育树，将已知的正黏病毒PB1氨基酸序列与TLV的序列比较。

图4是显示通过亚致死辐射在TLV中产生突变的图表。TLV以增加的UV剂量辐射，并且通过在96微孔板上的病毒滴定测定残留的感染性，如图表中所显示。在维持残留感染性的最高剂量下，挑选和繁殖病毒克隆。

图5是显示与安慰剂治疗组相比两个减毒的TLV克隆的安全性状况的图表。

图6是显示通过IP注射当面临致死剂量的野生型TLV时，疫苗原型的效力的图表。

图7是电泳凝胶，其显示在感染的培养物中使用Con19引物检测TLV，并表明TLV具有在其繁殖周期期间不通过DNA阶段的RNA基因组。使用从感染的和未感染的TFC提取的DNA或RNA测定Con19作为病毒重叠群Con19引物(泳道1-5)或内源罗非鱼对照TL-NA引物(泳道6-10)的特异性。使用Aurum Total RNA Mini试剂盒(BIO-RAD Cat#732-6820)，RNA被用于产生总的cDNA。泳道分布如下：MW：100bp DNA梯；1：用Con19引物测定来自感染的TFC的cDNA；2：用Con19引物测定来自未感染TFC的cDNA；3：Con19病毒片段克隆至用Con19引物测定的质粒中；4：用Con19引物测定来自感染的TFC的DNA；5：用Con19引物测定来自未感染的TFC的DNA；6：用TL-NA测定来自感染的TFC的cDNA(内源对照)；7：用TL-NA测定来自未感染的TFC的cDNA(内源对照)；8：用TL-NA测定来自感染的TFC的DNA(内源对照)；9：用TL-NA测定来自未感染的TFC的DNA(内源对照)；10：阴性对照：在没有模板的反应中测试两个引物组。

图8是电泳凝胶，其显示使用Con4作为诊断工具来鉴定来自感染的鱼的TLV。TLV在实验感染的鱼和场流行病中容易鉴定。从鱼脑提取RNA，并且用作模板，用于使用Con4引物(上图)或作为对照的罗非鱼内源标记物(TL-NA)(下图)的RT-PCR。泳道1-19：天然罗非鱼用TLV注射并且与未暴露的鱼共同栖息。在26天观察期内，收集病鱼/死鱼并且保持在-80℃，用于进一步评估。泳道20–在以色列的罗非鱼养殖场的流行病期间取样的病鱼。泳道21–从相同的养殖场收集的健康鱼。MW–100bp分子标记物，NC–阴性对照，水用作模板，PC-阳性对照，从感染TLV的TFC提取RNA。

图9是当用如图中显示的灭活的TLV制剂接种时，显示通过IP注射剧毒的TLV受到挑战的罗非鱼的累积死亡率的图。在IP接种疫苗28天之后，通过IP注射剧毒的TLV受到挑战的罗非鱼的累积死亡率，其中：x-来自未感染的TFC细胞的培养基，x–天然鱼，Δ-乳液中福尔马林灭活的TLV与弗氏不完全佐剂–IFA(1:1)，◇-福尔马林灭活的TLV，和Ο-包含安慰剂的乳液-来自未感染的细胞的培养基与弗氏不完全佐剂–IFA(1:1)。

描述的序列的简要描述

使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示在此提供的核酸和/或氨基酸序列，如37C.F.R.1.822中所定义。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是任何提及展现的链应理解为包括互补链。如本文所描述：

SEQ ID NO：1是重叠群4的序列。

SEQ ID NO：2是重叠群4的理论翻译。

SEQ ID NO：3是重叠群7的序列。

SEQ ID NO：4是重叠群7的理论翻译。

SEQ ID NO：5是重叠群5的序列。

SEQ ID NO：6是重叠群5的理论翻译。

SEQ ID NO：7是重叠群6的序列。

SEQ ID NO：8是重叠群6的理论翻译。

SEQ ID NO：9是重叠群8的序列。

SEQ ID NO：10是重叠群8的理论翻译。

SEQ ID NO：11是重叠群14的序列。

SEQ ID NO：12是重叠群14的理论翻译。

SEQ ID NO：13是重叠群15的序列。

SEQ ID NO：14是重叠群15的理论翻译。

SEQ ID NO：15是重叠群12的序列。

SEQ ID NO：16是重叠群12的理论翻译。

SEQ ID NO：17是重叠群16的序列。

SEQ ID NO：18是重叠群16的理论翻译

SEQ ID NO：19是重叠群20的序列。

SEQ ID NO：20是重叠群20的理论阶段1翻译。

SEQ ID NO：21是重叠群20的理论阶段2翻译。

SEQ ID NO：22是重叠群21的序列。

SEQ ID NO：23是重叠群21的理论翻译。

SEQ ID NO：24是重叠群19的序列。

SEQ ID NOs.25和26分别是对重叠群4特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.27和28分别是对重叠群7特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.29和30分别是对重叠群5特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.31和32分别是对重叠群6特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.33和34分别是对重叠群8特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.35和36分别是对重叠群14特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.37和38分别是对重叠群15特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.39和40分别是对重叠群12特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.41和42分别是对重叠群16特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.43和44分别是对重叠群20特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.45和46分别是对重叠群21特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NOs.47和48分别是对重叠群19特异性的正向和反向引物。

SEQ ID NO：49是来自减毒TLV的突变区段4序列。

SEQ ID NO：50是来自减毒TLV的突变区段5序列。

具体实施方式

I.缩写

TFC 罗非鱼鳍细胞

TLV 罗非鱼病毒

II.术语

除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文以其它方式清楚指示，单数术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示。类似地，除非上下文以其它方式清楚指示，词“或(or)”旨在包括“和(and)”。还要理解的是，给出核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且提供用于描述。尽管在本公开内容的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等同的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。术语“包含(comprise)”意思是“包括(include)”。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁语例如(exempli gratia)，并且在本文用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。

在冲突的情况下，以本说明书为准，包括术语的解释。另外，所有的材料、方法和实例是示意性的并且不旨在是限制性的。

施用：通过选择的途径将组合物引入受试者。可以通过本领域技术人员已知的任何途径施用活性化合物或组合物，比如TLV减毒疫苗菌株。施用可以是局部的或全身的。

扩增：当提及核酸使用时，指增加样品或样本中的核酸分子的拷贝数的任何技术。扩增的实例是聚合酶链反应(PCR)，以其所有目前实践的变体，其中在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下使从受试者收集的生物样品与一对寡核苷酸引物接触。引物在合适的条件下延伸，从模板解离，并且然后再退火、延伸和解离以扩增核酸的拷贝数。可以使用标准技术，通过电泳、限制内切核酸酶切割模式、寡核苷酸杂交或连接、和/或核酸测序来表征体外扩增的产物。PCR的非限制性实例包括RT-PCR和qPCR。体外扩增技术的其它实例包括链置换扩增(见美国专利号5,744,311)；无转录等温扩增(见美国专利号6,033,881)；修复链反应扩增(见WO 90/01069)；连接酶链反应扩增(见EP-A-320 308)；间隙填充连接酶链反应扩增(见美国专利号5,427,930)；偶联的连接酶检测和PCR(见美国专利号6,027,889)；和NASBA^TMRNA无转录扩增(见美国专利号6,025,134)。

动物：活的多细胞脊椎动物生物体，其类别包括例如鱼、哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物二者。类似地，术语受试者包括人和兽医受试者二者，例如人、非人灵长类、鱼、狗、猫、马和母牛。类似地，术语“受试者”包括人和兽医受试者二者，比如鱼。

减毒病毒：已经被改变的病毒，以便降低或消除其毒力。减毒病毒是“活的”，但是具有降低或消除的破坏或杀死宿主细胞的能力，并且因此引起与病毒相关联的病理学。

生物样品：可以直接或间接从生物体获得的任何样品，包括全血、血浆、血清、泪液、粘液、唾液、尿液、胸水、胸膜液、胃液、汗液、精液、阴道分泌物、痰、来自溃疡和/或其它表面出疹的液体、水疱、脓肿、组织、细胞(比如，成纤维细胞、外周血单核细胞、或肌肉细胞)、细胞器(比如线粒体)、器官、和/或组织提取物、细胞(比如，成纤维细胞、外周血单核细胞、或肌肉细胞)、细胞器(比如线粒体)或器官。生物样品也可以是实验室研究样品比如细胞培养上清液。使用本领域技术人员熟知的方法收集或获得样品。在本公开内容中，“生物样品”与“样品”互换地使用。

cDNA(互补DNA)：缺少内部非编码区段(内含子)和转录调控序列的DNA片段。cDNA还可以包含非翻译区(UTR)，其负责相应的RNA分子中的翻译控制。在实验室中通过从细胞提取的信使RNA的逆转录合成cDNA。

互补：双链DNA或RNA链由碱基对的两条互补链组成。当一个核酸分子的碱基与另一个核酸分子的碱基形成氢键时，发生互补的结合。通常，碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)互补，而胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)互补。例如，一个ssDNA分子的序列5'-ATCG-3'可以结合至另一ssDNA的3'-TAGC-5'以形成dsDNA。在该实例中，序列5'-ATCG-3'是3'-TAGC-5'的反向互补体。类似地，由ssRNA分子产生的cDNA将是RNA序列的反向互补体。

接触：放置为直接物理关联。包括固体和液体形式。接触可以利用分离的细胞在体外发生或通过施用至受试者在体内发生。

检测：确定存在或不存在试剂(比如信号或特定核苷酸核酸探针、氨基酸或蛋白质，例如TLV蛋白质或核酸)。在一些实例中，这可以进一步包括量化。

诊断：通过其体征、症状和各种测试和方法例如本文公开的方法的结果鉴定疾病的过程。

荧光团：一种化学化合物，当通过暴露于特定刺激比如限定波长的光被激发时，其发射光(发荧光)，例如以不同波长(比如更长波长的光)。

荧光团是较大类的发光化合物的一部分。发光化合物包括化学发光的分子，其不需要特定波长的光来发光，而是使用化学能量来源。因此，化学发光分子(比如水木发光蛋白)的使用可不再需要外部电磁辐射源，比如激光器。在Nazarenko等的美国专利号5,866,366中提供了可用于本文公开的探针和引物的特定荧光团的实例，比如4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'二磺酸、吖啶和衍生物比如吖啶和吖啶异硫氰酸酯、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸酯(荧光黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、亮黄、香豆素和衍生物比如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆满(香豆满151)；焰红染料(cyanosine)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5"-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物比如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物比如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；乙啡啶；荧光素和衍生物比如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)和QFITC(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物比如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-丁酸芘；活性红4(Cibacron^TMBrilliant Red 3B-A)；罗丹明和衍生物比如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；LightCycler红640；Cy5.5；和Cy56-羧基荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；亚甲基二吡咯二氟化硼(BODIPY)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；吖啶、芪、-6-羧基-荧光素(HEX)、TET(四甲基荧光素)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、德克萨斯红、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、Cy3、Cy5、(Applied Biosystems)、LC红640、LC红705、Yakima黄等。

灭活的病毒：已经被灭活或“杀死”以便消除其毒力的病毒。尽管没有传染性，但是灭活的病毒颗粒可以激发免疫应答，并且可以形成疫苗的基础。病毒灭活的非限制性方法包括加热、UV暴露或化学方式，比如暴露于甲醛(福尔马林)。

分离的：已经基本上与生物体的细胞中的其它生物组分分离或纯化的生物组分(比如核酸分子，蛋白质或细胞器)，在该生物体中该组分是天然存在的，其它生物组分即其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经分离的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。

标记：直接或间接缀合至另一分子以利于检测该分子的可检测的化合物或组合物。标记的具体非限制性实例包括放射性同位素(比如S³⁵和P³²)、酶底物、辅助因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。

寡核苷酸：通过天然磷酸二酯键连接的多个连接的核苷酸，长度在约6和约300个核苷之间。寡核苷酸类似物指与寡核苷酸起类似作用但是具有非天然存在部分的部分。具体的寡核苷酸和寡核苷酸类似物可以包括长度高达约300个核苷酸的线性序列，例如至少6个碱基的序列(比如DNA或RNA)，例如至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100或甚至200或300个碱基长，或从约6至约50个碱基，例如约10-25个碱基，比如12、15或20个碱基。

正黏病毒科：RNA病毒家族，其包括流感病毒。本文描述的TLV病毒的表征和测序指示它是正黏病毒。正黏病毒科可以具有丝状或球形衣壳。它们的RNA基因组通过依赖病毒编码的RNA的RNA聚合酶被分割以及被转录和复制。

探针和引物：可以基于本发明中提供的核酸分子容易地制备核酸探针和引物。探针包括连接至可检测的标记或报道分子的分离的核酸。典型的标记包括放射性同位素、酶底物、辅助因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。

引物是短的核酸分子，优选地长度为10个核苷酸或更多的DNA寡核苷酸。引物可以通过核酸杂交与互补的目标DNA链退火以形成引物和目标DNA链之间的杂交体，并且然后引物通过DNA聚合酶沿着目标DNA链延伸。引物对可用于核酸序列的扩增，例如，通过PCR或本领域已知的其它核酸扩增方法。

纯化：术语纯化不要求绝对纯度；而是，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的蛋白质制剂是其中提到的蛋白质比在细胞内其天然环境中的蛋白质更纯的蛋白质制剂。

定量的实时PCR：用于检测和测量在PCR的每个循环期间产生的产品的方法，该产品与在开始PCR之前存在的模板核酸的量成比例。获得的信息，比如扩增曲线，可用于量化模板核酸序列的初始量。

序列同一性：两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性，根据序列之间的相似性来表达，也称为序列同一性。序列同一性通常根据百分比同一性(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。

疫苗：诱导受试者获得针对特定致病剂(病原体)比如病毒或细菌的免疫保护的组合物。疫苗尤其可以包括病原体的抗原片段，其又诱导受试者中的免疫应答。其它疫苗实例包括减毒活疫苗或杀死疫苗，其中病原体本身是疫苗的基础。本文描述的疫苗是减毒活TLV菌株。接种疫苗是提供疫苗从而保护受试者以抵抗病原体的过程。疫苗是免疫原性组合物的示例性类型。

病毒：在活细胞内部复制的微观传染性生物。病毒基本上由被蛋白质外壳围绕的单个核酸的核心组成，并且具有仅在活细胞内部复制的能力。“病毒复制”是通过发生至少一个病毒生命周期的另外病毒的产生。病毒可能会破坏宿主细胞的正常功能，引起细胞表现为由病毒所确定的方式。例如，当未感染的细胞通常不这样做时，病毒感染可导致细胞产生细胞因子，或响应于细胞因子。

病毒粒子：完整的病毒颗粒包括包膜、衣壳和核酸元素。

III.几个实施方式的概述

本文描述了CNCM(巴斯德研究所)保藏的登记号为CNCM I-4892的分离的罗非鱼病毒(TLV)。

本文还描述了分离的正黏样病毒，其具有由与SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24中的每个至少90％同一的核酸序列组成的基因组。

本文进一步描述了分离的核酸，其包括与选自SEQ ID NOs 25-48的核酸至少90％同一的核酸。

在具体实施方式中，核酸进一步包括可检测的标记，比如荧光标记、放射性标记或化学标记。

本公开内容还描述了用于检测罗非鱼病毒(TLV)感染性的方法，其包括从怀疑感染了TLV的受试者分离样品；从样品产生cDNA模板；和使用至少一种寡核苷酸引物扩增来自cDNA模板的核酸，至少一种寡核苷酸引物包括与选自SEQ ID Nos：25-48的至少一个序列至少90％同一的核酸序列，其中核酸序列用引物的扩增指示样品中存在TLV。

在本文描述的检测方法的具体实施方式中，利用至少一个引物对进行扩增，至少一个引物对具有与选自下列的引物对至少90％同一的序列：SEQ IDNOs 25和26；SEQ IDNOs 27和28；SEQ ID NOs 29和30；SEQ ID NOs 31和32；SEQ ID NOs 33和34；SEQ ID NOs35和36；SEQ ID NOs 37和38；SEQ ID NOs 39和40；SEQ ID NOs 41和42；SEQ ID NOs 43和44；SEQ ID NOs45和46；和SEQ ID NOs 47和48。

本公开内容还包括用于检测罗非鱼病毒(TLV)感染性的试剂盒，其包含至少一种描述的分离的核酸。

在具体实施方式中，试剂盒包含至少一种分离的核酸，其为具有与选自下列的引物对至少90％同一的序列的至少一种寡核苷酸引物对：SEQ ID NOs25和26；SEQ ID NOs 27和28；SEQ ID NOs 29和30；SEQ ID NOs 31和32；SEQ ID NOs 33和34；SEQ ID NOs 35和36；SEQ ID NOs 37和38；SEQ ID NOs39和40；SEQ ID NOs 41和42；SEQ ID NOs 43和44；SEQ IDNOs 45和46；和SEQ ID NOs 47和48。

在具体实施方式中，试剂盒进一步包括可检测的标记，其在具体实施方式中可以与试剂盒中至少一种分离的核酸相关联。

本文还描述了分离的减毒和分离的灭活的罗非鱼病毒(TLV)。

本文另外描述了通过下述方法产生的分离的减毒罗非鱼病毒(TLV)：通过罗非鱼细胞将TLV传代至少10次，以亚致死辐射剂量照射TLV；并分离感染的减毒克隆体。在具体实施方式中，通过罗非鱼细胞使分离的减毒TLV传代至少20次。在其它具体实施方式中，亚致死辐射剂量在3.2-6.8mJ/cm²之间，比如6.8mJ/cm²。本文提供的示例性分离的减毒TLV由CNCM(巴斯德研究所)保藏，登记号为CNCM I-5075。

在具体实施方式中，本文描述的分离的减毒或灭活的TLV菌株是免疫原性组合物的一部分，比如还包括佐剂的组合物。

本公开内容另外描述了针对罗非鱼病毒(TLV)感染对受试者接种疫苗的方法。在具体实施方式中，这种接种疫苗包括使受试者感染描述的分离的减毒或灭活的TLV。在其它实施方式中，接种疫苗包括向受试者施用包括描述的分离的减毒或灭活的TLV的免疫原性组合物。

IV.罗非鱼病毒和其检测方法

从2009年开始，以色列北部的养鱼户观察到在其农场中罗非鱼的疾病和高死亡率。这些事件在每个连续的夏天都在继续。本文描述了疾病和死亡事件的病原体的分离和表征，病原体为被称为罗非鱼病毒(TLV)的新发现的正黏样病毒。

TLV的初级表征指示球形、多形性RNA病毒，其在23℃-33℃之间以温度依赖方式繁殖。病毒已经生长至高滴度，并且在2014年6月15日以登记号CNCM I-4892保藏在CNCM(巴斯德研究所)。

基因组分析揭示了分段的RNA基因组，其与GenBank数据库中的序列几乎没有同源性。然而，BlastX分析显示TLV重叠群4(在本文叙述为SEQ NO：1)包括流感RNA依赖性RNA聚合酶亚单位PB1的推定保守结构域。

已经从TLV确定了连续(重叠群)序列，在本文叙述为SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24。

在具体实施方式中，描述的TLV包含具有与阐释为SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24的那些序列具有相同序列的基因组。然而，要认识到，来自描述的TLV序列的基因组变化将存在于不同的分离的TLV中。因此，在具体实施方式中，本文描述的分离的TLV具有这样的基因组，其中重叠群中的任一个可以小于100％同一于叙述为SEQ IDNOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24的序列。这种序列可以与描述的重叠群序列中的一个或多个至少99％、95％、90％、85％、80％或甚至更少同一。

分离的基因组序列可以如描述的合成产生或作为DNA(例如cDNA)或作为本文描述的序列的较短RNA或DNA片段合成产生。这种片段的非限制性用途包括用于本领域已知的用于检测样品中的病毒的任何方法的探针和引物。在具体实施方式中，片段(其可以是探针)可以与待检测的重叠群序列的反向互补序列至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或甚至更少同一。类似地，与待检测的序列相比，用于检测TLV的分离的探针的长度可以是95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％，其间的任何百分比，或甚至更小。例如，重叠群4(SEQ ID NO：1)长为1620个核苷酸(nt)。因此描述的重叠群4的分离的探针可以与SEQ ID NO:1的序列同一，但是长度可以显著地更短，比如长为1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50nt，或其间的任何长度。例如在其它实施方式中，可用作重叠群4(SEQ ID NO：1)的探针的分离的核酸可以长为35-1620nt，比如50-1600nt，1000-1600nt，500-1500nt，750-1200nt，和其间的任何长度。应当理解，每个重叠群序列的分离的核酸片段，包括DNA或RNA片段，可以类似地被用作单个重叠群的探针序列。

类似地，使用从描述的序列开发的引物，叙述为SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24的序列，或任何更短的包括性序列，可以如本文所描述的被扩增。在具体实施方式中，引物可以长为12-35nt，比如15-25nt、18-30nt等。可用于扩增描述的序列的引物的具体非限制性实例包括本文阐释为SEQ ID NOs 25-48的寡核苷酸引物，或与SEQ IDNOs 25-48至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至更多同一的引物。

叙述为SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24的分离的核酸序列，以及其片段(包括探针和引物)，可以被共价修饰以包括如本文所描述的可检测的标记。这种标记的具体非限制性实例包括放射性同位素、酶底物、辅助因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。在具体实施方式中，标记是放射性标记。在其它实施方式中，标记是荧光标记，比如本文描述的荧光标记中的任何一种。

本文另外描述了检测样品比如从受试者(例如罗非鱼)收集的样品中的TLV的方法。该方法包括检测样品中的TLV核酸，其指示样品中存在TLV。

在具体实施方式中，从个体受试者比如罗非鱼分离样品。在其它实施方式中，从种群比如鱼的种群收集样品。在仍其它实施方式中，从其中受试者居住的环境比如鱼池等收集样品。当样品是来自一个或多个受试者的样品时，样品中TLV核酸或蛋白质的存在指示受试者感染了TLV。

核酸分离和其检测方法是本领域熟知的。在具体实施方式中，通过标准杂交技术，包括阵列，比如微阵列，本文描述的标记探针或引物可用于检测样品中的TLV。其它检测方法包括任何合适的核酸扩增方法，比如PCR和其变型，包括RT-PCR和qPCR。

作为正黏样病毒，TLV具有在其繁殖周期期间不通过DNA阶段的RNA基因组。因此，当处于DNA形式时，本文描述的分离的核酸是合成的。还将认识到，通过标准方法扩增TLV核酸的方法将包括逆转录步骤以产生cDNA作为PCR方法等的基础。逆转录和PCR的方法是本领域已知的。

本文还描述了用于检测样品中的TLV的试剂盒。描述的试剂盒包括上述TLV-特异性探针和引物中的至少一种。在具体实施方式中，试剂盒包括用于从样品分离病毒RNA的试剂。在其它实施方式中，试剂盒包括用于逆转录和DNA扩增的试剂和/或酶。在仍其它实施方式中，试剂盒包括至少一个引物对，比如来自本文阐释为SEQ ID NOs 25-48的寡核苷酸的各个对，或与SEQ IDNOs 25-48至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至更多同一的引物。在具体实施方式中，提供的TLV特异性核酸用可检测的标记预先标记。在其它实施方式中，可检测的标记连同用于将标记与核酸关联的任选的试剂和/或酶包括在试剂盒中。

V.减毒和灭活的罗非鱼病毒疫苗

本文进一步描述了减毒和灭活的TLV分离物，其可赋予对野生型TLV感染的抗性。

在通过罗非鱼细胞传代多次之后，分离和克隆本文提供的减毒病毒，随后暴露于非致死的诱变条件，比如紫外辐射或化学诱变剂。

在具体实施方式中，通过本领域已知的方法(例如其中每次传代是感染和由感染产生的病毒的分离的周期)，通过首先使病毒通过罗非鱼细胞传代至少10次，比如通过罗非鱼细胞10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次，产生减毒的TLV菌株。在具体实例中，每次传代在暴露于诱变条件之后，然后是下一个传代周期。在其它实施方式中，在最终传代之后，发生使收集的病毒暴露于非致死的(本文还描述为“亚致死”)诱变条件(例如其中病毒可以继续感染细胞的条件)。在一些实施方式中，使在减毒下的病毒暴露于紫外(UV)辐射的亚致死剂量，比如3.2-6.8mJ/cm²，和更具体而言6.8mJ/cm²。

在具体实施方式中，通过罗非鱼鳍细胞将野生型TLV传代20代，使细胞暴露于6.8mJ/cm²的UV辐射剂量，并且然后分离个体病毒克隆体，产生减毒的TLV菌株。

当作为免疫原性组合物被提供给受试者时，比如在疫苗中，描述的减毒TLV菌株可以赋予对TLV感染的部分或完全的抗性，使得受野生型TLV攻击的接种疫苗的鱼的种群将显示至少60％的存活率，比如60％-100％存活率，比如70％、80％、85％、90％、95％、95％-100％或甚至高达约100％的存活率。

如本文所描述减毒TLV的具体实例是这样的减毒TLV，其已经于2016年4月1日保藏在CNCM(巴斯德研究所)，登记号为CNCM I-5075。

灭活的(杀死的)病毒免疫原性组合物可以根据本领域已知的方法产生，包括利用如本文所描述的福尔马林孵育。

在具体实施方式中，减毒和/或灭活的TLV分离物是免疫原性组合物(例如TLV疫苗)的组分，其包括减毒和/或灭活的病毒、药学上可接受的载体和任选地一种或多种佐剂或其它免疫刺激剂。

在具体实施方式中，药学上可接受的载体可以是水或缓冲液，或另外地组合物稳定剂。

在某些实施方式中，疫苗被制备为用于注射的液体溶液、乳液或悬液。在鱼疫苗的实例中，可以通过将鱼浸入水中来递送。因此，可以制备液体乳液或可乳化的浓缩物以添加到容纳鱼的水中。在施用之前，还可以制备适于溶解或悬浮在液体载体或适合于与固体食物混合的固体(例如粉末)形式。在具体实施方式中，疫苗可以是用于与无菌稀释剂重构的冷冻干燥培养物。例如0.9％生理盐水。在干燥(例如冷冻干燥)之前，可以向疫苗添加各种成分，比如防腐剂、抗氧化剂或还原剂、各种赋形剂等。这种赋形剂也可以在干燥步骤之后添加至干燥病毒。

在具体实施方式中，免疫原性组合物包括佐剂或其它免疫刺激剂。佐剂是本领域熟知的。具体的非限制性实例包括胞壁酰二肽、抗生物素蛋白、氢氧化铝、磷酸铝、油、油乳剂、皂苷、硫酸葡聚糖、葡聚糖、细胞因子、嵌段共聚物、免疫刺激性寡核苷酸和可以与减毒和/或灭活的TLV混合的本领域已知的其它物质。

在其它实施方式中，描述的免疫原性组合物(疫苗)另外包括至少一种稳定剂以防止其降解，增强保质期，或改善冻干效率。与描述的疫苗一起使用的稳定剂的非限制性实例包括SPGA(Bovarnik等，1950,J.Bacteriology,第59卷，第509页)，脱脂牛奶，明胶，牛血清白蛋白，碳水化合物例如山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖、乳糖，蛋白质比如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，和缓冲液，比如碱金属磷酸盐。

通过使至少一名受试者感染本文描述的减毒TLV疫苗和/或使受试者暴露于灭活的TLV，描述的减毒和/或灭活的TLV免疫原性组合物(疫苗)可用于针对TLV的疫苗接种方法。

在具体实施方式中，疫苗被单独口服施用至鱼，比如通过其饲料或通过强制口服施用，或通过注射，比如经由肌肉内或腹膜内路径。

在可选的实施方式中，通过将疫苗喷雾、溶解和/或浸入水中，可以将疫苗同时施用至包含在水体中的整个鱼类种群。这种种群接种疫苗方法可以用于各种环境，比如池塘、水族馆、自然栖息地、养鱼场和淡水水库。

提供下述实施例以阐释某些具体特征和/或实施方式。这些实施例不应被解释为将本公开内容限于描述的具体特征或实施方式。

实施例

实施例1：罗非鱼病毒的分离和表征

从罗非鱼鳍开发细胞系，并且其用于从2012年的死亡事件期间收集的鱼分离RNA病毒。病毒暂时被指定为罗非鱼病毒–TLV。如下分离病毒：将源自患病罗非鱼的冷冻器官的样品解冻，集中在一起，匀化，过滤通过0.2μm过滤器，并接种在天然罗非鱼鳍细胞(TFC)上。将TFC感染的培养物在28℃下孵育，并且每天监测细胞病变效应(CPE)。在接种4-7天之后可见CPE，并且包括清晰的蚀斑形成(图2)。在模拟感染的TFC对照培养物中CPE是不明显的。用来自展现CPE的TFC培养物的上清液对TFC天然培养物二次接种，重复超过20代，具有相似的CPE结果。

罗非鱼细胞系以高滴度繁殖分离的病毒。感染的细胞培养物的电子显微镜分析显示了细胞内的病毒粒子结构(图1)。TLV病毒的形状为球形，并且显示大小和多形性形态的变化。在受感染的细胞中，病毒颗粒出现在细胞质液泡中，并且具有～65nm的平均直径。

病毒的初级表征显示病毒繁殖是温度依赖性的并且发生在23℃-33℃下。病毒在罗非鱼细胞培养物中繁殖并且在>24℃而不是15℃的温度下引起细胞病变效应(CPE)(图2)。这种观察结果与疾病发生的现场观察结果一致。在细胞培养物中的整个病毒传代中，我们能够维持CPE并繁殖病毒。

为了实现Koch的假设，并且确定TLV确实是疾病的病原体，建立了疾病模型，其中组织培养物分离的TLV被用于感染健康的天然罗非鱼。注射的鱼展现与现场报告一致的疾病体征。鱼食欲不振，显示嗜睡，变得瘦弱并且最终死亡。死亡率范围从30％-100％。而且，TLV是从研究中死亡的鱼中分离和识别的，实现了Koch的TLV为病原体的假设。

通过病毒基因组测序完成病毒的进一步表征。病毒的测序揭示了与感染的培养物相关联的多个序列，其不重叠成单个序列，表明分段的基因组。在本文测定和呈现的十二个序列中，两个(重叠群8和16)显示与Genbank(罗非鱼湖病毒(Eyngor et al 2014；Genbank登记号KJ605629.1)内已知序列的同源性；其余序列不与任何其它Genbank序列共享同源性。然而，BlastX分析在属于流感RNA依赖性RNA聚合酶亚单位PB1的病毒片段(重叠群4)中的一个中识别出推定的保守结构域。完整序列(其中U表示为T)在本文叙述为SEQ ID NO：1(起始和终止密码子分别在nt 38和1595处预测)。序列(符合读框+2)的520个氨基酸理论翻译被叙述为SEQ ID NO：2。

其它测定的序列和推定的翻译产品包括：重叠群7(SEQ ID NO：3)和其框架2翻译(SEQ ID NO：4)；重叠群5(SEQ ID NO：5)，和其第6段翻译(SEQ ID NO：6)；重叠群6(SEQ IDNO：7)和其第6段翻译(SEQ ID NO：8)：重叠群8(SEQ ID NO:9)和其第6段翻译(SEQ ID NO：10)；重叠群14(SEQ ID NO:11)和其第5段翻译(SEQ ID NO：12)；重叠群15(SEQ ID NO:13)和其第6段翻译(SEQ ID NO：14)；重叠群12(SEQ ID NO:15)和其第5段翻译(SEQ ID NO：16)；重叠群16(SEQ ID NO:17)和其第3段翻译(SEQ ID NO：18)；重叠群20(SEQ ID NO:19)，其第1段(SEQ ID NO：20)和第2段(SEQ ID NO：21)翻译；重叠群21(SEQ ID NO:22)和其第5段翻译(SEQ ID NO：23)；和重叠群19(SEQ ID NO：24)的核酸序列。

阐释为SEQ ID NO：2的氨基酸序列类似于正黏病毒的PB1RNA聚合酶。使用TREX-MAFFT序列分析软件，与已知的正黏病毒PB1氨基酸序列(比如来自流感病毒)相比，系统发育进化树类似于TLV的系统发育进化树。该分析结果呈现在图3中，这表明分离的TLV可以是罗非鱼品种的水产养殖中的新兴病原体和正黏病毒科中的新属。

实施例2：罗非鱼病毒检测

该实施例表明在源自患病罗非鱼的感染的培养物或感染的器官(肝、脾、肾、脑)中的TLV检测：

通过PCR检测感染样品中的TLV RNA鉴定TLV感染性。根据制造商的说明书(BIO-RAD Cat#732-6820)，使用Aurum Total RNA Mini试剂盒，从感染病毒的TFC或从源自患病罗非鱼的器官产生样品RNA，并且根据制造商的说明书(Thermo scientific Cat#AB 1453/A)，使用逆转录酶Verso cDN试剂盒，从分离的RNA产生cDNA。然后根据标准方案，使用产生的cDNA作为模板，并且利用用于鉴定重叠群4(SEQ ID NOs 25-26)的一组引物进行RT-PCR反应(如图8中所显示)。重叠群4包含推定的保守结构域，属于流感RNA依赖性RNA聚合酶亚单位PB1。

在表1中显示了鉴定的12个重叠群之间的特异性相关性。表1是16个观察的TLV重叠群的总结比较。使用下一代测序技术对蔗糖梯度纯化的TLV测序。基因组分析显示16个不同的重叠群(在400-1620bp的范围内)，其与GenBank中出现的已知序列不相似。为了确定这些序列实际上是否与TLV相关联，设计特异性引物以扩增每个序列，并且使用由感染和未感染的TFC产生的模板上的引物组进行RT-PCR。显示在16个重叠群中有12个是病毒来源的，仅出现在感染的培养物中(见表1)。对感染和未感染的培养物呈阳性的四个重叠群被认为是未公布的内源罗非鱼序列(粗体)。

表1用特异性引物测定的16个重叠群的RT-PCR结果的总结，特异性引物设计为每个用来自感染和未感染的TFC的模板测定。

在图7中证实了TLV的检测，其为显示使用重叠群19引物在感染的培养物中检测TLV的电泳凝胶，并且这表明TLV具有在其繁殖周期期间不通过DNA阶段的RNA基因组。重叠群19仅在逆转录酶反应之后在感染的培养物上测定时在RT-PCR反应中扩增(图7泳道1)。用重叠群19引物测定来自未感染的细胞和从感染和未感染的细胞提取的DNA的样品为阴性(图7泳道2、4和5)。使用扩增罗非鱼内源基因的引物验证测试的提取物中基因组DNA和cDNA的存在(图7泳道6-9)。使用Aurum Total RNA Mini试剂盒(BIO-RADCat#732-6820)从感染和未感染的TFC提取RNA。使用逆转录酶Verso cDN试剂盒(Thermo scientific Cat#AB1453/A)产生总的cDNA。使用DNeasy(QIAGEN Cat#69504)从感染和未感染的TFC产生DNA。

如所指示，除了显示重叠群与TLV的特异性相关性以外，图7还表明TLV具有在其生命周期期间不通过DNA阶段的RNA基因组(比较泳道5、6、8和9)。

实施例3：减毒TLV疫苗菌株的产生和表征

为了产生减毒病毒菌株，将TLV分离物在罗非鱼鳍细胞上持续地传代20代，并以递增的强度经历UV照射(图4)。在6.8mJ/cm²的亚致死剂量下，病毒克隆被挑选并繁殖为单个病毒克隆。

为了测试推定的减毒克隆，通过浸泡1小时，用两种克隆病毒和安慰剂对照接种罗非鱼。接种的组为：(1)安慰剂对照：没有病毒抗原的培养基；(2)TLV p10(克隆6)–将病毒在培养物中传代10次，UV照射并克隆；和(3)TLVp20(克隆4)–将TLVp10在培养物中传代10次，UV照射和克隆。监测鱼的死亡率或与疾病相关的其它不良事件，持续35天(图5)。

安慰剂组的生存率为100％，在整个研究期间未观察到异常。暴露于TLVp10(克隆6)的组确实显示与暴露于TLV病毒相关的约20％的死亡率。用TLVp20(克隆4)接种的鱼没有展现任何疾病征兆，并且在进食和行为模式上与安慰剂对照组相当。TLV p20(克隆4)，也称为TLV克隆4，于2016年4月1日保藏在CNCM(巴斯德研究所)，登记号为CNCM I-5075。该克隆的部分序列表征揭示TLV基因组的至少区段4和5的缺失(在这里分别显示为SEQ IDNOs 49和50)。认识到，这些序列的突变体特异性部分可用于检测减毒菌株，并将它们与野生型菌株区分开。

为了确定疫苗的效力，用高滴度的野生型TLV病毒注射在安全部分存活的鱼，野生型TLV病毒已经在培养的罗非鱼鳍细胞中传代4次。安慰剂组的一部分未被野生型病毒攻击，以排除在研究的整个效力部分中的任何不相关的死亡率。

效力攻击的结果显示在图6中。受到攻击的安慰剂组展现明显是TLV感染的死亡模式。鱼变得昏睡和食欲不振，鱼皮的颜色变暗，并且在暴露后12天开始死亡，在20天达到峰值，并且在效力试验期间达到100％死亡率。未受到攻击的安慰剂组是平安无事的，并且显示没有疾病征兆。用TLV p10(克隆6)接种的鱼展现延迟开始的死亡率，仅在攻击后20天开始，并且峰值达到28％的死亡率。用TLV p20(克隆4)接种的鱼没有显示疾病征兆，并且在行为上与未受到攻击的安慰剂组相当。在观察期间观察到2.9％(单条鱼)的死亡率水平。

这些结果表明TLV p20(克隆4)显示对于测试的安全性和效力参数均有利的接种疫苗概况。

实施例4：灭活的TLV疫苗菌株的产生和表征

为了产生灭活的TLV疫苗菌株，将TLV暴露于0.2％甲醛并且传代直到暴露的病毒为非传染性的。然后通过注射和不注射商业佐剂，在活鱼上测试分离的灭活菌株赋予对TLV感染的抗性的能力。结果显示在图9中。如图中所显示，当在攻击之前28天注射包含灭活的TLV(0.2％甲醛)与弗氏不完全佐剂–IFA(1:1)的乳液时，通过IP注射TLV攻击的罗非鱼(10gr)的死亡率从对照组91.7％(11/12)的死亡率下降到至33％(8/24，相对存活百分比＝RPS＝63.4)。相反，当在用TLV攻击之前28天向罗非鱼(10gr)单独注射灭活的TLV(0.2％甲醛)或注射包含来自未感染的细胞的安慰剂培养基与弗氏不完全佐剂–IFA(1:1)的乳液时，没有获得免疫保护，死亡率为100％(分别为26/26和24/24)。

鉴于可以应用公开发明的原理的许多可能的实施方式，应该认识到，阐释的实施方式仅是本发明的优选实例，并且不应被视为限制本发明的范围。而是，本发明的范围由权利要求所限定。因此，我们要求保护落在这些权利要求的范围和精神内的全部发明。

序列表

<110> 科瓦克斯公司

<120> 罗非鱼的正黏样病毒

<130> 3099/1.2

<150> US 62/276,873

<151> 2016-01-10

<150> US 62/352,570

<151> 2016-06-21

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 1

ctcttaatta cgcactatta ctgtactacc ataaggtatg tgggcatttc aagaaggagt 60

ttgcaaaggt aacctgttgt caggcccgac ctcaatgaag gcaccggatt cagcagcgag 120

agagtcaata gacagagcgt ctgaaatcat gacaggaaaa tcgtacaatg ctgtccacac 180

tggggactta agtaagctgc ctaatcaggg agaaagccca ctgaggatag ttgattccga 240

cctctactca gagaggagtt gctgttgggt tatagagaag gagggcagaa ttgtgtgcaa 300

aagtaccacg ctcacccgcg gtatgacgag cctgttgaac acaacaaagt gtagttctcc 360

atctgagctc atatgtaagg ttttgacagt ggaatcccta tctgaaaaga taggtgatac 420

gagcgtcgag gagttacttt ctcatggcag gtactttaag tgcgcacttc gcgaccaaga 480

gaggggtaaa cccaagagca gagctatctt tctgtcacat cctttcttca ggttgctttc 540

ctctgtagta gagacgcacg ctagatctgt gctgtcaaag gtctcagcag tgtacaccgc 600

tactgctagt gcagaacaac gggctatgat ggccgcacag gttgtagagt caagaaaaca 660

tgttcttaat ggcgactgta ctaagtataa tgaggcaatc gacgcagaca cactgctaaa 720

agtgtgggat gcaataggca tggggtcaat tggagtcatg ctcgcttaca tggtgcgcag 780

gaaatgcgtt ctcattaaag acactctagt agagtgtcca ggaggtatgt tgatggggat 840

gtttaacgca actgccacct tggcactgca agggacgact gacagattcc tgtctttcag 900

cgacgacttt ataacatcgt ttaactcgcc tgctgaatta cgcgagatag aggatctgct 960

tttcgtaagc tgtcataact tgtcgctaaa gaagagttac atttcagttg cctcactgga 1020

aataaactcg tgtaccctca ctagggacgg tgacctagcc acagggttag gttgtactgc 1080

tggtgtcccc ttcagggggc cacttgtgac tctgaaacag actgcagcta tgttatctgg 1140

cgctgttgac tcaggagtta tgccattcca ctcagcagaa cgtctgttcc agataaagca 1200

gcaggaatgt gcctataggt ataacaaccc cacttacaca acgaggaatg aggacttcct 1260

ccccacatgc ctgggaggga agactgtaat tagctttcaa tctctactga cttgggattg 1320

ccacccattt tggtaccaag tgcaccctga tggcccagac actatagatc agaaagtcct 1380

gtctgtcctt gcctcaaaga ctcgcagaag gagaacccga ctagaggctc tctcagactt 1440

ggaccccctg gtccctcata ggctcctcgt atcggagtca gatgttagca agatcagagc 1500

agctaggcag gctcacttga agtccttggg cttggaacaa cccacaaact ttaactatgc 1560

tatttataaa gcagtccagc ccaccgctgg gtgctaagta actatatagg cgaatgagag 1620

<210> 2

<211> 519

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 2

Met Trp Ala Phe Gln Glu Gly Val Cys Lys Gly Asn Leu Leu Ser Gly

1 5 10 15

Pro Thr Ser Met Lys Ala Pro Asp Ser Ala Ala Arg Glu Ser Ile Asp

20 25 30

Arg Ala Ser Glu Ile Met Thr Gly Lys Ser Tyr Asn Ala Val His Thr

35 40 45

Gly Asp Leu Ser Lys Leu Pro Asn Gln Gly Glu Ser Pro Leu Arg Ile

50 55 60

Val Asp Ser Asp Leu Tyr Ser Glu Arg Ser Cys Cys Trp Val Ile Glu

65 70 75 80

Lys Glu Gly Arg Ile Val Cys Lys Ser Thr Thr Leu Thr Arg Gly Met

85 90 95

Thr Ser Leu Leu Asn Thr Thr Lys Cys Ser Ser Pro Ser Glu Leu Ile

100 105 110

Cys Lys Val Leu Thr Val Glu Ser Leu Ser Glu Lys Ile Gly Asp Thr

115 120 125

Ser Val Glu Glu Leu Leu Ser His Gly Arg Tyr Phe Lys Cys Ala Leu

130 135 140

Arg Asp Gln Glu Arg Gly Lys Pro Lys Ser Arg Ala Ile Phe Leu Ser

145 150 155 160

His Pro Phe Phe Arg Leu Leu Ser Ser Val Val Glu Thr His Ala Arg

165 170 175

Ser Val Leu Ser Lys Val Ser Ala Val Tyr Thr Ala Thr Ala Ser Ala

180 185 190

Glu Gln Arg Ala Met Met Ala Ala Gln Val Val Glu Ser Arg Lys His

195 200 205

Val Leu Asn Gly Asp Cys Thr Lys Tyr Asn Glu Ala Ile Asp Ala Asp

210 215 220

Thr Leu Leu Lys Val Trp Asp Ala Ile Gly Met Gly Ser Ile Gly Val

225 230 235 240

Met Leu Ala Tyr Met Val Arg Arg Lys Cys Val Leu Ile Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Val Glu Cys Pro Gly Gly Met Leu Met Gly Met Phe Asn Ala Thr

260 265 270

Ala Thr Leu Ala Leu Gln Gly Thr Thr Asp Arg Phe Leu Ser Phe Ser

275 280 285

Asp Asp Phe Ile Thr Ser Phe Asn Ser Pro Ala Glu Leu Arg Glu Ile

290 295 300

Glu Asp Leu Leu Phe Val Ser Cys His Asn Leu Ser Leu Lys Lys Ser

305 310 315 320

Tyr Ile Ser Val Ala Ser Leu Glu Ile Asn Ser Cys Thr Leu Thr Arg

325 330 335

Asp Gly Asp Leu Ala Thr Gly Leu Gly Cys Thr Ala Gly Val Pro Phe

340 345 350

Arg Gly Pro Leu Val Thr Leu Lys Gln Thr Ala Ala Met Leu Ser Gly

355 360 365

Ala Val Asp Ser Gly Val Met Pro Phe His Ser Ala Glu Arg Leu Phe

370 375 380

Gln Ile Lys Gln Gln Glu Cys Ala Tyr Arg Tyr Asn Asn Pro Thr Tyr

385 390 395 400

Thr Thr Arg Asn Glu Asp Phe Leu Pro Thr Cys Leu Gly Gly Lys Thr

405 410 415

Val Ile Ser Phe Gln Ser Leu Leu Thr Trp Asp Cys His Pro Phe Trp

420 425 430

Tyr Gln Val His Pro Asp Gly Pro Asp Thr Ile Asp Gln Lys Val Leu

435 440 445

Ser Val Leu Ala Ser Lys Thr Arg Arg Arg Arg Thr Arg Leu Glu Ala

450 455 460

Leu Ser Asp Leu Asp Pro Leu Val Pro His Arg Leu Leu Val Ser Glu

465 470 475 480

Ser Asp Val Ser Lys Ile Arg Ala Ala Arg Gln Ala His Leu Lys Ser

485 490 495

Leu Gly Leu Glu Gln Pro Thr Asn Phe Asn Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala

500 505 510

Val Gln Pro Thr Ala Gly Cys

515

<210> 3

<211> 1234

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 3

actctctatt accaaataca tttacttctg aaaaatgagt cagtttgaga aatcattcaa 60

gggcagaact gaggtcacaa taaccgaata tcgctctcat actgtcaaag atgtgcacag 120

aagcttactt acggctgaca aatctctaag gaagtcattc tgctttagga acgccctaaa 180

ccagttcttg gataaagatt tgcctctttt gcccattcgg ccaaaattag agtccagggt 240

tgctgtgaaa aagtctaagc tgaggagtca gctgtcgttc agacccggtt tgactcagga 300

ggaagcaatt gatctttaca acaagggcta tgatggtgac agcgtctcag gtgccttaca 360

agacagggta gtcaatgagc ctgtagctta ctcgagtgca gataatgaca aatttcacag 420

gggcttggcg gctctagggt acactttggc tgatagagca tttgatacgt gcgaatccgg 480

cttcgtgaga gcaattccta ctactccatg tgggttcata tgttgtgggc caggttcttt 540

caaagattca cttggatttg tgataaaaat cggcgaattc tggcacatgt atgacgggtt 600

ccaacacttc gtcgctgtcg aagatgctaa gttcttagca agtaagtctc cttcgttttg 660

gttggcaaaa cgtcttgcaa agaggctgaa tctggtccca aaagaggatc catctgtagc 720

agcagctgag tgcccttgta aaaaagtgtg ggaagctagt tttgctaggg cacctactgc 780

actagatcca tttggaggca gggccttctg cgaccagggt tgggtgtacc acagggacgt 840

agggtatgca acagctaacc acatatcaca ggagacactt tttcaacagg cgctttcagt 900

gaggaacctt ggaccgcaag gtagtgcaaa tgtctcaggc tcaatacata ccgccctgga 960

caggctcaga gcagcgtaca gtaggggaac acccgcctct agatctatac ttcaagggct 1020

tgcgaatctc atcacacctg taggtgaaaa ctttgaatgt gatctcgaca agaggaagct 1080

caatataaag gcattacgtt ctcccgagag gtacattacg atagagggcc tggttgtaaa 1140

cctggacgat gtggttagag ggttctacct tgacaaggcg aaagtcactg ttctctcgag 1200

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<210> 4

<211> 400

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 4

Met Ser Gln Phe Glu Lys Ser Phe Lys Gly Arg Thr Glu Val Thr Ile

1 5 10 15

Thr Glu Tyr Arg Ser His Thr Val Lys Asp Val His Arg Ser Leu Leu

20 25 30

Thr Ala Asp Lys Ser Leu Arg Lys Ser Phe Cys Phe Arg Asn Ala Leu

35 40 45

Asn Gln Phe Leu Asp Lys Asp Leu Pro Leu Leu Pro Ile Arg Pro Lys

50 55 60

Leu Glu Ser Arg Val Ala Val Lys Lys Ser Lys Leu Arg Ser Gln Leu

65 70 75 80

Ser Phe Arg Pro Gly Leu Thr Gln Glu Glu Ala Ile Asp Leu Tyr Asn

85 90 95

Lys Gly Tyr Asp Gly Asp Ser Val Ser Gly Ala Leu Gln Asp Arg Val

100 105 110

Val Asn Glu Pro Val Ala Tyr Ser Ser Ala Asp Asn Asp Lys Phe His

115 120 125

Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Arg Ala Phe Asp

130 135 140

Thr Cys Glu Ser Gly Phe Val Arg Ala Ile Pro Thr Thr Pro Cys Gly

145 150 155 160

Phe Ile Cys Cys Gly Pro Gly Ser Phe Lys Asp Ser Leu Gly Phe Val

165 170 175

Ile Lys Ile Gly Glu Phe Trp His Met Tyr Asp Gly Phe Gln His Phe

180 185 190

Val Ala Val Glu Asp Ala Lys Phe Leu Ala Ser Lys Ser Pro Ser Phe

195 200 205

Trp Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys Arg Leu Asn Leu Val Pro Lys Glu

210 215 220

Asp Pro Ser Val Ala Ala Ala Glu Cys Pro Cys Lys Lys Val Trp Glu

225 230 235 240

Ala Ser Phe Ala Arg Ala Pro Thr Ala Leu Asp Pro Phe Gly Gly Arg

245 250 255

Ala Phe Cys Asp Gln Gly Trp Val Tyr His Arg Asp Val Gly Tyr Ala

260 265 270

Thr Ala Asn His Ile Ser Gln Glu Thr Leu Phe Gln Gln Ala Leu Ser

275 280 285

Val Arg Asn Leu Gly Pro Gln Gly Ser Ala Asn Val Ser Gly Ser Ile

290 295 300

His Thr Ala Leu Asp Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Ser Arg Gly Thr Pro

305 310 315 320

Ala Ser Arg Ser Ile Leu Gln Gly Leu Ala Asn Leu Ile Thr Pro Val

325 330 335

Gly Glu Asn Phe Glu Cys Asp Leu Asp Lys Arg Lys Leu Asn Ile Lys

340 345 350

Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Tyr Ile Thr Ile Glu Gly Leu Val Val

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Asn Leu Asp Asp Val Val Arg Gly Phe Tyr Leu Asp Lys Ala Lys Val

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Thr Val Leu Ser Arg Ser Lys Trp Met Gly Tyr Glu Asp Leu Pro Gln

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<210> 5

<211> 1228

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 5

ccaattaccg tctaagaatt taccagtttt tgatgacttg ttgaagaata tatagaaaac 60

ttgggctcag aggggccctt ggcagcctgt gcagctttcc gcgcatgggt ggcctatttc 120

gttgcctatc ttccaacagc tcctgctgtc tctttgaggc agtgatacag actcttccca 180

cttctcttac attttatgac accgtcctgt ttctgaatgg caatgcactc ttccagcaga 240

tttgtattcc ctgtcccctc aatcctggag tcggcaattg ctgagagccc gtggctagcc 300

accaccagga agcagcttcc tgtagcctgc agaggtagac caacaacaac accaatactc 360

ccgtccccct gcgaggggct ccaacactca gcaaggacac cgtcgcaaag gccccaagca 420

attgaggcaa gcaactccct gagggtgacc tggtcgccta tctgcagcct gtggccaatg 480

atcagaaacc tcggaggcgg gattatagca gtctgattca actttttgta gttctttcct 540

ctttctcctg ctgctgcttt ctttgcaaaa tagccaccaa ccagccctgg gcaagcacga 600

taggaatccc cactcaggta tgggaaccac tgagcatcct ccaaagtctg aatcctctcg 660

tcgagagcaa ccaaactgac gtacctagcc ttccagacct caatgcgaac acacactctc 720

aatagagagt tatggtcctt catcatttga atcatagctg cgtcccctga ggcttttatc 780

accttcatct ttgagcccag tgcaggcaca caggttgcgc agtattcagt ccatctgctg 840

gttaatataa ggctccttcc gaccctcatc cctgcttctg gcgccttcct tgatttctta 900

gcgttctccc tctctctctt cttttcactg gctctcagaa ccttagcctc ctgaccatcg 960

agggagtgag tgtgcatttt aaagaggaat gcagcagcat cagatatcac actgttgtcc 1020

tccctgttaa aggaacttcc aaacacatga ccacaagctt cattgaaaac ctcaaggttt 1080

cttgggagtt cagcttgtgc ctgcgaagta ctgggtgaac tttcatccat tgctacctct 1140

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<210> 6

<211> 354

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 6

Met Val Arg Thr Thr Lys Thr Ser Met Ala Ala Ala Ser Thr Val Ala

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Pro Glu Val Ala Met Asp Glu Ser Ser Pro Ser Thr Ser Gln Ala Gln

20 25 30

Ala Glu Leu Pro Arg Asn Leu Glu Val Phe Asn Glu Ala Cys Gly His

35 40 45

Val Phe Gly Ser Ser Phe Asn Arg Glu Asp Asn Ser Val Ile Ser Asp

50 55 60

Ala Ala Ala Phe Leu Phe Lys Met His Thr His Ser Leu Asp Gly Gln

65 70 75 80

Glu Ala Lys Val Leu Arg Ala Ser Glu Lys Lys Arg Glu Arg Glu Asn

85 90 95

Ala Lys Lys Ser Arg Lys Ala Pro Glu Ala Gly Met Arg Val Gly Arg

100 105 110

Ser Leu Ile Leu Thr Ser Arg Trp Thr Glu Tyr Cys Ala Thr Cys Val

115 120 125

Pro Ala Leu Gly Ser Lys Met Lys Val Ile Lys Ala Ser Gly Asp Ala

130 135 140

Ala Met Ile Gln Met Met Lys Asp His Asn Ser Leu Leu Arg Val Cys

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Val Arg Ile Glu Val Trp Lys Ala Arg Tyr Val Ser Leu Val Ala Leu

165 170 175

Asp Glu Arg Ile Gln Thr Leu Glu Asp Ala Gln Trp Phe Pro Tyr Leu

180 185 190

Ser Gly Asp Ser Tyr Arg Ala Cys Pro Gly Leu Val Gly Gly Tyr Phe

195 200 205

Ala Lys Lys Ala Ala Ala Gly Glu Arg Gly Lys Asn Tyr Lys Lys Leu

210 215 220

Asn Gln Thr Ala Ile Ile Pro Pro Pro Arg Phe Leu Ile Ile Gly His

225 230 235 240

Arg Leu Gln Ile Gly Asp Gln Val Thr Leu Arg Glu Leu Leu Ala Ser

245 250 255

Ile Ala Trp Gly Leu Cys Asp Gly Val Leu Ala Glu Cys Trp Ser Pro

260 265 270

Ser Gln Gly Asp Gly Ser Ile Gly Val Val Val Gly Leu Pro Leu Gln

275 280 285

Ala Thr Gly Ser Cys Phe Leu Val Val Ala Ser His Gly Leu Ser Ala

290 295 300

Ile Ala Asp Ser Arg Ile Glu Gly Thr Gly Asn Thr Asn Leu Leu Glu

305 310 315 320

Glu Cys Ile Ala Ile Gln Lys Gln Asp Gly Val Ile Lys Cys Lys Arg

325 330 335

Ser Gly Lys Ser Leu Tyr His Cys Leu Lys Glu Thr Ala Gly Ala Val

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Gly Arg

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<211> 1023

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 7

tctcaatcaa gcacttaaaa ctgtacctgg gcatttcgcc cacacgatag gacatatagt 60

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gatcaattac aggattcaat ctacgcattt ttgtatagct aagaaaagta cgagcaagaa 180

gataagcatt tgacttctta taagcaactt catcctgcat cgcggaccac tcgctgatga 240

gctggtgacg ctttatttcg gctggtagta ggacttccac tgcggaaaag tggcacttgt 300

atggggagtg attctcctcc agtgactcaa ctaataccca acactgtttt gtgctattgt 360

ctctgcagct ccacttgtat tcagttctga agccgtttgg cgtcatatat gttctatcta 420

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agg 1023

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<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 8

Met His Phe Tyr Leu Gln Asp Cys Pro Met Ser Trp Leu Arg Val Ile

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Arg Thr Leu Thr Leu Phe Ser Thr Leu Phe Ser Gly Ser Asp Gln Cys

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Val Asp Asn Met Trp Arg Phe Tyr Gly Arg Ser Asn Tyr Thr Ser Ser

35 40 45

Val Val Ile Asp Gly Asp Lys Tyr Ser Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser

50 55 60

Ser Asp Tyr Leu Asp Pro Ala Val Gln Lys Val Val Leu Gly Leu Asp

65 70 75 80

Gly Asn Asn Glu Val Ile Asp Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Met Tyr

85 90 95

Asp Leu Glu Gly Ser Lys Gly Glu Leu His His Leu Asn Cys Asn Phe

100 105 110

Val Glu Lys Arg Cys Asn Pro Thr Leu Asn Phe Met Leu Gly Gly Phe

115 120 125

Val Leu Cys Pro Gly Ile Ser Arg Lys Glu Leu Glu Pro Val Thr Asp

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Lys Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Pro Gly Arg Gly Lys Ile Arg Thr

145 150 155 160

Ile Lys Ile Ser Ser Lys Leu Phe Glu Thr Ser Leu Cys Leu Ser Lys

165 170 175

Arg Arg Pro Ile Phe Ser Thr Cys Met Leu Met Ser Arg Gly Leu Cys

180 185 190

Thr Asn Cys Lys Arg Thr Ile Asp Arg Thr Tyr Met Thr Pro Asn Gly

195 200 205

Phe Arg Thr Glu Tyr Lys Trp Ser Cys Arg Asp Asn Ser Thr Lys Gln

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Cys Trp Val Leu Val Glu Ser Leu Glu Glu Asn His Ser Pro Tyr Lys

225 230 235 240

Cys His Phe Ser Ala Val Glu Val Leu Leu Pro Ala Glu Ile Lys Arg

245 250 255

His Gln Leu Ile Ser Glu Trp Ser Ala Met Gln Asp Glu Val Ala Tyr

260 265 270

Lys Lys Ser Asn Ala Tyr Leu Leu Ala Arg Thr Phe Leu Ser Tyr Thr

275 280 285

Lys Met Arg Arg Leu Asn Pro Val Ile Asp Leu Ser Ile Ser Pro Pro

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Val Thr Val Arg Ser Cys Cys Lys Ile Asn Lys Tyr Met

305 310 315

<210> 9

<211> 926

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 9

cataatcctc tattagaacg tcgtaacctt tagcgaaagc gtcgaaagcg atcatctcgc 60

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 10

Pro Lys Pro Arg Ile Glu Trp Val Ala Pro Pro Arg Leu Ala Asp Ile

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Ser Lys Glu Thr Ala Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Gly Phe Phe Glu Cys

20 25 30

Ser Lys Phe Leu Ala Cys Gly Glu Glu Cys Gly Leu Asp Gln Glu Ala

35 40 45

Arg Glu Leu Ile Leu Asn Glu Tyr Ala Arg Asp Arg Glu Phe Glu Phe

50 55 60

Arg Asn Gly Gly Trp Ile Gln Arg Tyr Thr Val Ala Ser His Lys Pro

65 70 75 80

Ala Thr Gln Lys Ile Leu Pro Leu Pro Ala Ser Ala Pro Leu Ala Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Met Leu Ile Ala Arg Ser Thr Thr Gln Ala Gly Lys Val

100 105 110

Leu His Ser Asp Asn Thr Ser Ile Leu Ala Val Pro Val Met Arg Asp

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Ser Gly Lys His Ser Lys Arg Arg Pro Thr Ala Ser Thr His His Leu

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Val Val Gly Leu Ser Lys Pro Gly Cys Glu His Asp Phe Glu Phe Asp

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Gly Tyr Arg Ala Ala Val His Val Met His Leu Asp Pro Lys Gln Ser

165 170 175

Ala Asn Ile Gly Glu Gln Asp Phe Val Ser Thr Arg Glu Ile Tyr Lys

180 185 190

Leu Asp Met Leu Glu Leu Pro Pro Ile Ser Arg Lys Gly Asp Leu Asp

195 200 205

Arg Ala Ser Gly Leu Glu Thr Arg Trp Asp Val Ile Leu Leu Leu Glu

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Cys Leu Asp Ser Thr Arg Val Ser Gln Ala Val Ala Gln His Phe Asn

225 230 235 240

Arg His Arg Leu Ala Leu Ser Val Cys Lys Asp Glu Phe Arg Lys Gly

245 250 255

Tyr Gln Leu Ala Ser Glu Ile Arg Gly Thr Ile Pro Leu Ser Ser Leu

260 265 270

Tyr Tyr Ser Leu Cys Ala Val Arg Leu Arg Met Thr Val His Pro Phe

275 280 285

Ala Arg

290

<210> 11

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 11

ctgagcagcg agagaaccat cagcgaaagc accaggtaat agacaaactt atatttctct 60

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ataccggtga cttcccgtgt caaagcttct aaatactccc aaatctcaga aacatctgct 240

tgagctgcat ctgctaggcc gatgacccca gcatagttgt aaacacccat gccaattgct 300

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cttgaggcca gcatggtctt gtagtcgtcc acagtgggtc tggtacagtc acactgacct 420

ggcagtacgg tggaatacac ctccaaatct ctgcactcgc tactgtggct gcacctggaa 480

acgttgtata gaacaacccc actatcttcg tcaatcctaa cttcagtagc tttccaatca 540

cctcttcccc ctgctttggg aagtttgtac ccgagggctg ggaagctgtt aggtactgca 600

tgtaacccag tgcagaacga cccacccgag gatggggtta caatgtagtg cacccccata 660

gtgcaggagc aactctccat cctgaatttg gatgcaaatc cacgccttat ttcactttct 720

atctccctac tttggtaggt attgtttaga tatgattgta gtcgttttat ccttaaactt 780

tcatcacttg ctagtgcgca aactaggcag cttatcagga ccagcgcctg catagctatt 840

ggagtctgag ataagagaaa catttggctc catcctgaat ttggatgcaa atccacg 897

<210> 12

<211> 298

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 12

Val Asp Leu His Pro Asn Ser Gly Trp Ser Gln Met Phe Leu Leu Ser

1 5 10 15

Gln Thr Pro Ile Ala Met Gln Ala Leu Val Leu Ile Ser Cys Leu Val

20 25 30

Cys Ala Leu Ala Ser Asp Glu Ser Leu Arg Ile Lys Arg Leu Gln Ser

35 40 45

Tyr Leu Asn Asn Thr Tyr Gln Ser Arg Glu Ile Glu Ser Glu Ile Arg

50 55 60

Arg Gly Phe Ala Ser Lys Phe Arg Met Glu Ser Cys Ser Cys Thr Met

65 70 75 80

Gly Val His Tyr Ile Val Thr Pro Ser Ser Gly Gly Ser Phe Cys Thr

85 90 95

Gly Leu His Ala Val Pro Asn Ser Phe Pro Ala Leu Gly Tyr Lys Leu

100 105 110

Pro Lys Ala Gly Gly Arg Gly Asp Trp Lys Ala Thr Glu Val Arg Ile

115 120 125

Asp Glu Asp Ser Gly Val Val Leu Tyr Asn Val Ser Arg Cys Ser His

130 135 140

Ser Ser Glu Cys Arg Asp Leu Glu Val Tyr Ser Thr Val Leu Pro Gly

145 150 155 160

Gln Cys Asp Cys Thr Arg Pro Thr Val Asp Asp Tyr Lys Thr Met Leu

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Ala Ser Arg Gln Pro Lys Ser Phe Val Val Ala Gly Leu Ile Ile Leu

180 185 190

Cys Leu Leu Ala Ser Ser Val Ala Ile Gly Met Gly Val Tyr Asn Tyr

195 200 205

Ala Gly Val Ile Gly Leu Ala Asp Ala Ala Gln Ala Asp Val Ser Glu

210 215 220

Ile Trp Glu Tyr Leu Glu Ala Leu Thr Arg Glu Val Thr Gly Met Thr

225 230 235 240

Leu Gly Glu Phe Cys Ser Ile Lys Ser Leu Val Cys Lys Ser Asp Asn

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Ile Gly Lys Phe Lys Glu Gln Phe Ala Ala Phe Gly Glu Ala Ile Leu

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Ala Ile Val Phe Gly Met Leu Glu Lys Tyr Lys Phe Val Tyr Tyr Leu

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Val Leu Ser Leu Met Val Leu Ser Leu Leu

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 13

ctcatgctac catccttagt gaacggtact aagtaccata agaagctttc agaccaatta 60

tccctgcttt caaaagtaat tagttaactt agaaaggcct ccccaacaag acaacgaaac 120

agctgggtaa ttagagttca aatgtgatcc ctttagggat tggcactaac ccaactctgt 180

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tggcaaccct gctcaactca gtcagtggtc gagtgctggt caccagcgct gatctcttgg 300

tccagtgtgg aaactttgga gatggcgcac agagccagta ctttgcttcc cttctagtgt 360

agaaggtagt tgaacagaga tgcatgtccc ctttgactag ataggctcct ttcgggcctc 420

ttactgctgt accctcctgg gcaagtaccc ttctgactgg taatccgggg ctcacttcat 480

acttccattt caaaggtacc ttttctccac catcggttgg gtgactcgtc aatacaatcc 540

aggttgtgcc atttgtattg ggtgtaaacc cagttgcaca aaagaaccat acgttcgagg 600

caccagagta atgctctagg agcagtcgat ggaacagccc agtctgactt ccgctgtcct 660

tggggagggt gcttttgcgc gtgataattc tctcaagctc accaatcttg taggacattg 720

tgtctattac tatacggtat gcaatgcaaa gagagt 756

<210> 14

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<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 14

Ser Leu Cys Ile Ala Tyr Arg Ile Val Ile Asp Thr Met Ser Tyr Lys

1 5 10 15

Ile Gly Glu Leu Glu Arg Ile Ile Thr Arg Lys Ser Thr Leu Pro Lys

20 25 30

Asp Ser Gly Ser Gln Thr Gly Leu Phe His Arg Leu Leu Leu Glu His

35 40 45

Tyr Ser Gly Ala Ser Asn Val Trp Phe Phe Cys Ala Thr Gly Phe Thr

50 55 60

Pro Asn Thr Asn Gly Thr Thr Trp Ile Val Leu Thr Ser His Pro Thr

65 70 75 80

Asp Gly Gly Glu Lys Val Pro Leu Lys Trp Lys Tyr Glu Val Ser Pro

85 90 95

Gly Leu Pro Val Arg Arg Val Leu Ala Gln Glu Gly Thr Ala Val Arg

100 105 110

Gly Pro Lys Gly Ala Tyr Leu Val Lys Gly Asp Met His Leu Cys Ser

115 120 125

Thr Thr Phe Tyr Thr Arg Arg Glu Ala Lys Tyr Trp Leu Cys Ala Pro

130 135 140

Ser Pro Lys Phe Pro His Trp Thr Lys Arg Ser Ala Leu Val Thr Ser

145 150 155 160

Thr Arg Pro Leu Thr Glu Leu Ser Arg Val Ala Thr Tyr Leu Glu Ala

165 170 175

Ile Ser Lys Gly Ala Thr Asp Val Asn Glu Ser Trp Cys Ser Tyr His

180 185 190

Arg Val Gly Leu Val Pro Ile Pro Lys Gly Ile Thr Phe Glu Leu

195 200 205

<210> 15

<211> 635

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 15

catctttaca caaatggagt agcttacctc cctggggaaa atgacactga agattcactt 60

tttatttaag catttcacgg aaatgattga tagcagcaga agtgtctgcc ttaagggcca 120

tcctgtcatc ttgtgaacct tcagtgtcct tcaaagcagt tgccaggact tcctcgagaa 180

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ctgagaggcc ttcgccaatt gttagggaaa gcaaatccgg acttgcattg acaagaaact 480

ccagagcaac tacagtgttg actgtgtctc tagtcactgt catgccattg agcgtgaaat 540

cgtagagctt cccttggccc tctcttagcg ttggaatttg agccatactt attcctggat 600

atgctgtcca attggaaatg ttagtgtaga tgagg 635

<210> 16

<211> 190

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 16

Leu Ile Tyr Thr Asn Ile Ser Asn Trp Thr Ala Tyr Pro Gly Ile Ser

1 5 10 15

Met Ala Gln Ile Pro Thr Leu Arg Glu Gly Gln Gly Lys Leu Tyr Asp

20 25 30

Phe Thr Leu Asn Gly Met Thr Val Thr Arg Asp Thr Val Asn Thr Val

35 40 45

Val Ala Leu Glu Phe Leu Val Asn Ala Ser Pro Asp Leu Leu Ser Leu

50 55 60

Thr Ile Gly Glu Gly Leu Ser Glu Glu Thr Lys Phe Lys His Leu Leu

65 70 75 80

Val Lys His Ala Gly Met Thr Arg Lys Arg Ile Glu Glu Arg Leu Gly

85 90 95

Arg Ile Ser Arg Arg Val Ser Val Thr Val Asp Ala Ile Ile Ile Thr

100 105 110

Asn Arg Lys Gly Gln Arg Phe Glu Phe Asn Arg Lys Gln Tyr Leu Asp

115 120 125

Ile Ala Lys Gln Ala Met Lys Leu Lys Leu Pro Gly Ile Asn Cys Val

130 135 140

Asp Ile Pro Thr Ala Leu Ala Phe Leu Glu Glu Val Leu Ala Thr Ala

145 150 155 160

Leu Lys Asp Thr Glu Gly Ser Gln Asp Asp Arg Met Ala Leu Lys Ala

165 170 175

Asp Thr Ser Ala Ala Ile Asn His Phe Arg Glu Met Leu Lys

180 185 190

<210> 17

<211> 560

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 17

ccccttaatc cttaatagac cgttaacttt cttttgaaat ggactcgcgg tttgcacagc 60

taactggggt tttctgtgac gatttcactt atagcgaagg gagtcgaagg ttcctaagtt 120

cttacagtac agtagagaga cgtccaggag tccccgtaga gggtgactgt tatgactgtt 180

tgaagaataa gtggattgcc tttgagctgg aaggccagcc gcggaaattt ccaaaggcga 240

cagttcgttg cattttgaac aatgatgcca catacgtttg ctctgagcaa gagtaccagc 300

agatttgtaa ggtacaattc aaggattatt tggagatcga cggggttgtt aaagttgggc 360

acaaggcatc ctacgatgct gagctaaggg aacggctatt ggaactacca catccaagga 420

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agacagctga actaaagagg caatatggat tcttcgagtg ctcaaagttc ctcgcctgcg 540

gtgaggaatg tggtcttgac 560

<210> 18

<211> 174

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 18

Met Asp Ser Arg Phe Ala Gln Leu Thr Gly Val Phe Cys Asp Asp Phe

1 5 10 15

Thr Tyr Ser Glu Gly Ser Arg Arg Phe Leu Ser Ser Tyr Ser Thr Val

20 25 30

Glu Arg Arg Pro Gly Val Pro Val Glu Gly Asp Cys Tyr Asp Cys Leu

35 40 45

Lys Asn Lys Trp Ile Ala Phe Glu Leu Glu Gly Gln Pro Arg Lys Phe

50 55 60

Pro Lys Ala Thr Val Arg Cys Ile Leu Asn Asn Asp Ala Thr Tyr Val

65 70 75 80

Cys Ser Glu Gln Glu Tyr Gln Gln Ile Cys Lys Val Gln Phe Lys Asp

85 90 95

Tyr Leu Glu Ile Asp Gly Val Val Lys Val Gly His Lys Ala Ser Tyr

100 105 110

Asp Ala Glu Leu Arg Glu Arg Leu Leu Glu Leu Pro His Pro Arg Ser

115 120 125

Gly Pro Lys Pro Arg Ile Glu Trp Val Ala Pro Pro Arg Leu Ala Asp

130 135 140

Ile Ser Lys Glu Thr Ala Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Gly Phe Phe Glu

145 150 155 160

Cys Ser Lys Phe Leu Ala Cys Gly Glu Glu Cys Gly Leu Asp

165 170

<210> 19

<211> 521

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 19

gtccgattac tttttccgct tggtgatgtc acgatggata gaaaatacag attctgtgtc 60

agtaatcttg acagagatga gtcggtcgta cgtcactttg tgccattacc ccccttggag 120

cttgtgctgc ggcggcaaga catcacaacc tggtcaagtc tggatcctgg atcgaaaaca 180

ttgtctagga tgttcagaga tctcagagtt aatgacactg agtcagccaa cttggcagga 240

gagtgcaatg gtgataggga gctgggtcca agtagtaacg gagcacggaa ttttgcacac 300

ttcaacatcg gaaaggcagg cgccaagaag ggtcatgtgg aggatatctg acatggctgg 360

cgataggact ttatgagggc ggtccagggg caattgaagc tccgcgaacc tactgactcc 420

tcagctagaa cattatagtg aaccatgtga cattgataat ttagctttag taaaaaaatg 480

gataagcttc agctctggca aagtatgact ttaaggacgt g 521

<210> 20

<211> 116

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 20

Val Arg Leu Leu Phe Pro Leu Gly Asp Val Thr Met Asp Arg Lys Tyr

1 5 10 15

Arg Phe Cys Val Ser Asn Leu Asp Arg Asp Glu Ser Val Val Arg His

20 25 30

Phe Val Pro Leu Pro Pro Leu Glu Leu Val Leu Arg Arg Gln Asp Ile

35 40 45

Thr Thr Trp Ser Ser Leu Asp Pro Gly Ser Lys Thr Leu Ser Arg Met

50 55 60

Phe Arg Asp Leu Arg Val Asn Asp Thr Glu Ser Ala Asn Leu Ala Gly

65 70 75 80

Glu Cys Asn Gly Asp Arg Glu Leu Gly Pro Ser Ser Asn Gly Ala Arg

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Asn Phe Ala His Phe Asn Ile Gly Lys Ala Gly Ala Lys Lys Gly His

100 105 110

Val Glu Asp Ile

115

<210> 21

<211> 124

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 21

Ser Asp Tyr Phe Phe Arg Leu Val Met Ser Arg Trp Ile Glu Asn Thr

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Val Ile Leu Thr Glu Met Ser Arg Ser Tyr Val Thr

20 25 30

Leu Cys His Tyr Pro Pro Trp Ser Leu Cys Cys Gly Gly Lys Thr Ser

35 40 45

Gln Pro Gly Gln Val Trp Ile Leu Asp Arg Lys His Cys Leu Gly Cys

50 55 60

Ser Glu Ile Ser Glu Leu Met Thr Leu Ser Gln Pro Thr Trp Gln Glu

65 70 75 80

Ser Ala Met Val Ile Gly Ser Trp Val Gln Val Val Thr Glu His Gly

85 90 95

Ile Leu His Thr Ser Thr Ser Glu Arg Gln Ala Pro Arg Arg Val Met

100 105 110

Trp Arg Ile Ser Asp Met Ala Gly Asp Arg Thr Leu

115 120

<210> 22

<211> 509

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 22

ctcttttctc agtttaccac tttatgacct accaggaata gaagcttaag gatcaagata 60

atggaagcag agggacttcg tcatcctcag gcgggctttt cttcttaagc cgcttcttaa 120

tatagaaaaa ggtcttgaag cacacaactc ttagcctccg gaatactaaa actttgatac 180

tcccatagaa gggcacctgc ttcaacagag aaacaagttt actgagcagc gagagaacca 240

tcagcgaaag caccaggtaa tagacaaact tatatttctc tagcatccca aacactattg 300

caaggatagc ttccccaaag gctgcaaatt gctccttgaa tttgcctatg ttatcagatt 360

tacagacgag ggatttaatc gagcaaaact ctcctagcgt cataccggtg acttcccgtg 420

tcaaagcttc taaatactcc caaatctcag aaacatctgc ttgagctgca tctgctaggc 480

cgatgacccc agcatagttg taaacaccc 509

<210> 23

<211> 151

<212> PRT

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 23

Gly Val Tyr Asn Tyr Ala Gly Val Ile Gly Leu Ala Asp Ala Ala Gln

1 5 10 15

Ala Asp Val Ser Glu Ile Trp Glu Tyr Leu Glu Ala Leu Thr Arg Glu

20 25 30

Val Thr Gly Met Thr Leu Gly Glu Phe Cys Ser Ile Lys Ser Leu Val

35 40 45

Cys Lys Ser Asp Asn Ile Gly Lys Phe Lys Glu Gln Phe Ala Ala Phe

50 55 60

Gly Glu Ala Ile Leu Ala Ile Val Phe Gly Met Leu Glu Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Phe Val Tyr Tyr Leu Val Leu Ser Leu Met Val Leu Ser Leu Leu Ser

85 90 95

Lys Leu Val Ser Leu Leu Lys Gln Val Pro Phe Tyr Gly Ser Ile Lys

100 105 110

Val Leu Val Phe Arg Arg Leu Arg Val Val Cys Phe Lys Thr Phe Phe

115 120 125

Tyr Ile Lys Lys Arg Leu Lys Lys Lys Ser Pro Pro Glu Asp Asp Glu

130 135 140

Val Pro Leu Leu Pro Leu Ser

145 150

<210> 24

<211> 442

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 24

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taaggtgcta agactgcacg tcaagagact tctttccgaa atcttcggaa aatcgagata 120

ggtcactctg cccatcatcc tctctgtccc ttctgttttt gggattgaag tcgaccctag 180

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ctatattgtc ttcaccgctc tcgtcagcac catacctttc attcttccaa cttcgcttct 300

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tctcagcccc cgagtcactg tcacttgaca aataatctgc cacactcatc ctggcttata 420

gctatatttg gtgttagtag gg 442

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

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<211> 20

<212> DNA

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 30

tcgcattgag gtctggaagg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 31

tggcacttgt atggggagtg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 32

gtatgctaat gtcgcgtggc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 33

gggtgtactg tcatccgcaa 20

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 34

aaacctggct gtgaacacga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 35

cctagcgtca taccggtgac 20

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 36

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<211> 20

<212> DNA

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cctccccaac aagacaacga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 39

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 40

caacgctaag agagggccaa 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 41

cgaagggagt cgaaggttcc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 42

caacgaactg tcgcctttgg 20

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

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<212> DNA

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<400> 47

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<211> 20

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒

<400> 48

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<211> 595

<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒 p20 clone 4

<220>

<221> misc_feature

<222> (339)..(339)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (496)..(496)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 49

gcaaatcttt ctccaattac cgtctaagaa tttaccagtt tttgatgact tgttgaagaa 60

tatataggaa acttgggctc agaggggccc ttggcagcct gtgcagcttt ccgcgcatgg 120

gtggcctatt tcgttgccta tcttccaaca gctcctgctg tctctttgag gcagtgatac 180

agactcttcc cacttctctt acattttatg acaccgtcct gtttctgaat ggcaatgcac 240

tcttccagca gatttgtatt ccctgtcccc tcaatcctgg agtcggcaat tgctgagagc 300

ccgtggctag ccaccaccag gaagcagctt cctgtagcnt gcagaatgca gcagcatcag 360

atatcacact gttgtcctcc ctgttaaagg aacttccaaa cacatgacca caagcttcat 420

tgaaaacctc aaggtttctt gggagttcag cttgtgcctg cgaagtactg ggtgaacttt 480

catccattgc tacctnctgg tgcaacagtg ctggcagctg ccatatctag tgtttgtagt 540

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<212> DNA

<213> 罗非鱼湖病毒 p20 xlone 4

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (136)..(136)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (202)..(202)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (252)..(252)

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<220>

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<220>

<221> misc_feature

<222> (380)..(380)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 50

ggaagcagag ggacttggtc atcctcaggc gggctnttct tcttaagccg cttcttaata 60

tagaaaaagg tcttgaagca cacaactctt agcctccgga atactaaaac tttgatactc 120

ccatagaagg gcaccngctt caacagagaa acaagtttac tgagcagcga gagaaccatc 180

agcgaaagca ccaggtaata gncaaactta tatttctcta gcatcccaaa cactattgca 240

aggatagctt cnccaaaggc tgcaaattgn tccttgaagt tgcctatgtt atcntcaatc 300

ctaacttcag tagctttcca atcacctctt ccccctgctt gggaagtttg tacccgaggg 360

cgtgaagcnt ggagctgttn ggtactgcat gtaacccagt gcacaacgac c 411

Claims (19)

1.一种通过下述方法产生的分离的减毒罗非鱼病毒(TLV)，所述方法包括：

通过罗非鱼细胞将所述TLV传代至少10次，

以亚致死辐射剂量照射所述TLV；和

分离感染的减毒克隆。

2.根据权利要求1所述的分离的减毒TLV，其中所述TLV通过罗非鱼细胞传代至少20次。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的减毒TLV，其中所述亚致死辐射剂量是在3.2-6.8mJ/cm²之间的紫外辐射剂量。

4.根据权利要求3所述的分离的减毒TLV，其中所述亚致死辐射剂量是6.8mJ/cm²。

5.根据权利要求1所述的分离的减毒TLV，其包括以登记号CNCM I-5075保藏在CNCM(巴斯德研究所)的减毒TLV。

6.一种免疫原性组合物，其包括根据权利要求1-5中任一项所述的分离的减毒TLV，和佐剂。

7.一种针对罗非鱼病毒(TLV)感染对受试者接种疫苗的方法，其包括：

用根据权利要求1-5中任一项所述的分离的减毒TLV感染受试者或将根据权利要求6所述的免疫原性组合物施用至受试者，从而对所述受试者接种疫苗。

8.一种分离的正黏样病毒，其具有由与SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、22和24中的每个至少90％同一的核酸序列组成的基因组。

9.一种分离的核酸，其包括与选自SEQ ID NOs 25-48的核酸至少90％同一的核酸。

10.根据权利要求9所述的分离的核酸，进一步包括可检测的标记。

11.根据权利要求10所述的分离的核酸，其中所述可检测的标记是荧光标记、放射性标记或化学标记。

12.一种用于检测罗非鱼病毒(TLV)感染的方法，其包括：

从怀疑感染了TLV的受试者分离样品；

从所述样品产生cDNA模板；和

使用至少一种寡核苷酸引物从所述cDNA模板扩增核酸，所述至少一种寡核苷酸引物包括与选自SEQ ID Nos：25-48的至少一个序列至少90％同一的核酸序列，其中核酸序列用所述引物的扩增指示所述样品中存在TLV。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增用至少一个引物对进行，所述至少一个引物对具有与选自下列的引物对至少90％同一的序列：SEQ ID NOs 25和26；SEQ ID NOs27和28；SEQ ID NOs 29和30；SEQ ID NOs 31和32；SEQ ID NOs 33和34；SEQ ID NOs 35和36；SEQ ID NOs 37和38；SEQ ID NOs 39和40；SEQ ID NOs 41和42；SEQ ID NOs 43和44；SEQ ID NOs 45和46；和SEQ ID NOs 47和48。

14.一种用于检测罗非鱼病毒(TLV)感染的试剂盒，其包括根据权利要求9所述的至少一种分离的核酸。

15.根据权利要求14所述的用于检测罗非鱼病毒(TLV)感染的试剂盒，其中所述至少一种分离的核酸是具有与选自下列的引物对至少90％同一的序列的至少一个寡核苷酸引物对：SEQ ID NOs 25和26；SEQ ID NOs 27和28；SEQ ID NOs 29和30；SEQ ID NOs 31和32；SEQ ID NOs 33和34；SEQ ID NOs 35和36；SEQ ID NOs 37和38；SEQ ID NOs 39和40；SEQID NOs 41和42；SEQ ID NOs 43和44；SEQ ID NOs 45和46；和SEQ ID NOs 47和48。

16.根据权利要求14或权利要求15所述的试剂盒，进一步包括可检测的标记。

17.一种通过下述方法产生的分离的灭活罗非鱼病毒(TLV)，所述方法包括：

在甲醛中孵育TLV；和

通过罗非鱼细胞将所述TLV传代，直到所述TLV不再有感染性。

18.一种免疫原性组合物，其包括根据权利要求17所述的分离的灭活的TLV，和佐剂。

19.一种针对罗非鱼病毒(TLV)感染对受试者接种疫苗的方法，其包括：

将包括根据权利要求17所述的分离的灭活的TLV的组合物或根据权利要求18所述的免疫原性组合物施用至受试者，从而对所述受试者接种疫苗。