CN108753710A - 一种无血清完全培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无血清完全培养基及其应用，所述无血清完全培养基，包括依次或混合使用的以下两种培养基：其中，培养基I是在基础培养基中添加L‑谷氨酰胺、1％‑4％能有效促进细胞粘附和扩展的血清替代物，L‑谷氨酰胺的浓度为2mM/L；培养基II是在基础培养基中添加L‑谷氨酰胺、7％‑10％用于培养ESC和iPSC的血清替代物，L‑谷氨酰胺的浓度为2mM/L。本发明还提供了所述无血清完全养基在培养间充质干细胞中的应用。本发明所使用的培养基成分简单配制简便，提供的乳牙间充质干细胞培养方法有利于体外培养人乳牙间充质干细胞，维持干细胞的“干性”及多向分化能力。

Description

一种无血清完全培养基及其应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清完全培养基及其应用。

背景技术

干细胞被普遍定义为能自我更新和多系分化的克隆形成细胞，根据细胞来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。当受精卵分裂发育成胚泡时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具分化为体内所有组织的能力，但是对其的研究利用牵涉到一定的伦理问题。成体干细胞来自成年动物的许多组织和器官，在特定的条件下，成体干细胞能够进行一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。在口腔中也发现了多种干细胞，例如上皮内的干细胞、牙髓中的干细胞和牙周膜中的干细胞等，还有与牙齿相关组织有关的间充质干细胞。他们不仅有自我更新能力，还能多系分化成各种组织。利用患者的自体干细胞，可分化为包括培养牙本质、牙髓在内的各种组织，为口腔颌面外科的损伤修复提供了无限可能。

剥落乳牙牙髓干细胞(SHED：stem cells from exfoliated deciduous teeth)是从人类乳牙牙髓中分离出来的具有较强增殖能力和多向分化潜能的成体间充质干细胞，有学者又称为未成熟的牙髓干细胞(immature dental pulp stem cells)。SHED不仅表达STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、MUC18、CD146和CD166等间充质干细胞标志，还表达胚胎干细胞标志(Oct4和Nanog)、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-3和SSEA-4)以及肿瘤识别抗原(TRA-1-60和TRA-A-81)等。与牙髓干细胞相比，脱落乳牙干细胞增殖活性高、群体倍增时间短、克隆形成能力强，细胞中MMP1、TIMP1、MMP2、TIMP2和IL-6等炎性因子表达水平较高。多向分化能力与DPSC相似，包括成骨、成牙本质、成脂、成软骨、成肌等，而SHED细胞的成血管、成神经分化能力强于DPSC。由于其可表达多种神经细胞标志，在神经诱导培养基诱导下，βⅢ-tubulin、GAD等神经细胞标志性蛋白的表达水平上调，细胞突起较多，形成类似神经干细胞的球样集落。在血管内皮生长因子的刺激下，脱落乳牙干细胞可表达VEGF2、CD31、血管内皮钙粘蛋白等血管内皮标志性蛋白，形成毛细血管。此外SHED细胞还具有诱导周边宿主分化形成骨形成细胞的特性。体内移植实验可以形成牙本质牙髓样组织、成牙本质样细胞及骨样组织，但不能形成完整牙髓牙本质复合体样结构。以上提示了SHED是一类更为原始、属于发育早期的干细胞。

根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》的要求：干细胞制剂制备所使用的培养基成分应有足够的纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准，残留的培养基对受者应无不良影响，即满足干细胞的正常生长的情况下，不影响干细胞的生物学活性(包括干细胞的“干性”及分化能力)。在干细胞制剂制备过程中，应尽量避免使用抗生素；除特殊情况外，应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清应确保其无特定动物源性病毒污染。

在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可以简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。进行无血清培养的培养基其组分应满足以下要求：(1)含有基础培养基，含氨基酸、维生素、无机盐和葡萄糖等；(2)细胞粘附因子：胶原蛋白和纤连蛋白等；(3)激素和生长因子：促进细胞有丝分裂和体外扩增，包括胰岛素，表皮生长因子等；(4)结合蛋白：如转铁蛋白或白蛋白；(5)微量元素和抗氧化剂：亚硒酸钠、β-巯基乙醇等。

Ultroser G是由Pall公司生产的一种血清替代物，其生物学活性是胎牛血清(FBS)的5倍。该血清替代物已成功用于贴壁细胞的体外培养以及产前诊断中羊水细胞的染色体组型分析。KnockOut Serum Replacement(KnockOut SR)是由GIBCO公司生产的一种成分明确的，无胎牛血清成分的培养基添加物，能够支持来源于动物或人的培养于饲养层上的多能干细胞的增殖，这种血清替代物拥有将近20年使用历史，并且该种血清替代物可用于临床前和临床研究。

申请号为201710241721.5的中国专利申请“一种人脐带间充质干细胞无血清培养基”公开了一种包括Ultroser G、bFGF、L-谷氨酰胺的无血清完全培养基的组成。尽管该申请中仅用Ultroser G这一种血清替代物就能很好的培养间充质干细胞，但实施例只给出了培养一个代次细胞的生长状况，未对该培养基长期培养间充质干细胞后干细胞的遗传状态、活性、分化状态做出说明。

申请号为201610877358的中国专利申请“一种培养基及其应用与培养牙髓干细胞”公开了一种培养牙髓间充质干细胞的无血清培养基，除血清替代物外还添加了9种额外的物质，包括细胞因子，白蛋白等，培养基组分复杂。根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》的要求：若培养基中含有人的血清成分，如白蛋白、转铁蛋白和各种细胞因子等，应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种无血清完全培养基及其应用。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种无血清完全培养基，包括依次或混合使用的以下两种培养基：

其中，培养基I是在基础培养基中添加L-谷氨酰胺、1％-4％能有效促进细胞粘附和扩展的血清替代物，L-谷氨酰胺的浓度为2mM/L；

培养基II是在基础培养基中添加L-谷氨酰胺、7％-10％用于培养ESC和iPSC的血清替代物，L-谷氨酰胺的浓度为2mM/L。

优选地，所述培养基I中血清替代物为Ultroser G。

优选地，所述培养基II中血清替代物为KnockOut Serum Replacement。

优选地，所述基础培养基选自α-MEM、DMEM、DMDM/F12或IMEM/F12。培养基I和培养基II中所使用的基础培养基可以相同也可以不同。

优选地，培养基II中还可以包括EGF、bFGF，所述EGF的浓度为10ng/ml，所述bFGF的浓度为10ng/ml。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种有丝分裂原，对间充质干细胞的增殖有明显的促进作用，表皮生长因子(EGF)能促进间充质干细胞体外增殖。

本发明还提供了所述无血清完全养基在培养间充质干细胞中的应用，尤其是在培养乳牙间充质干细胞中的应用。

本发明还提供了一种乳牙间充质干细胞的无血清培养方法，所述方法使用如权利要求1所述的培养基I和培养基II的混合培养基培养每代次的干细胞，其中混合培养基中培养基I与培养基II的血清替代物比例为1:1-1:5。

本发明提供的另一种乳牙间充质干细胞的无血清培养方法，所述方法包括以下步骤:

a、使用如权利要求1所述的培养基I孵育传代后的细胞4h-24h后，移除该种培养基；

b、使用如权利要求1所述的培养基II继续培养至细胞汇合度达80％-90％。

c、每次传代皆用上述培养方式。

本发明提供的另一种乳牙间充质干细胞的无血清培养方法，所述方法使用如权利要求1所述的培养基I与培养基II的混合培养基，培养基I与培养基II的比例范围是1:5-3:7，且随着培养代次的增加，混合培养基中培养基I的比例是逐渐增加。

本发明的有益效果是：

本发明所使用的培养基成分简单配制简便，使用的血清替代物均已有长久的研究使用历史，其中KnockOut SR还被批准用于临床，避免了特定动物源性病毒的污染。本发明提供的乳牙间充质干细胞培养方法有利于体外培养人乳牙间充质干细胞，维持干细胞的“干性”及多向分化能力。

附图说明

图1为用含2％Ultroser G的培养基培养乳牙间充质干细胞4-5小时后细胞贴壁观察结果；

图2为用含10％KnockOut Serum Replacement的培养基培养的乳牙间充质干细胞在培养4-5小时后细胞贴壁观察结果；

图3为用含10％FBS的培养基培养乳牙间充质干细胞4-5小时后细胞贴壁观察结果；

图4为3种不同培养基培养18小时后乳牙间充质干细胞形态观察结果；

图5为使用含10％KnockOut Serum Replacement的培养基培养乳牙间充质干细胞不同时间点的细胞形态图片；

图6为乳牙间充质干细胞用含10％FBS的培养基培养3个代次和用含2％UltroserG的培养基培养3个代次后细胞形态图片；

图7为实施例1中乳牙间充质干细胞使含2％的Ultroser G的培养基促细胞贴壁6小时后细胞贴壁形态图片；

图8为乳牙间充质干细胞使用实施例1的培养方式培养3个代次后的细胞形态图片；

图9为乳牙间充质干细胞使用实施例2的培养方式培养第一个代次6小时后细胞的贴壁形态图片；

图10为实施例2培养3个代次后与用含10％胎牛血清的培养基培养3个代次后的细胞形态图片；

图11为乳牙间充质干细胞使用实施例3的培养方式培养3个代次后与含胎牛血清的培养基培养培养3个代次后的细胞形态图片。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

本发明中所用的Ultroser G均为溶解后配制的溶液，按照Pall公司提供的说明书将Ultroser G冻干粉充分溶解于20ml无菌无热源注射用水中，进行无菌分装，保存于-20℃冰箱中，使用时低温解冻。

对比例：3种培养基分别培养乳牙间充质干细胞

对比例中使用3种培养基：

①2％Ultroser G，2mM/L L-Glu的DMEM培养基；

②10％KnockOut Serum Replacement，2mM/L L-Glu的DMEM培养基；

③10％FBS，2mM/L L-GLu的DMEM培养基。

试验步骤：新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法，用I型胶原酶消化后，过滤离心获得乳牙间充质干细胞进行原代培养；原代培养基采用无血清培养基I与无血清培养基Ⅱ等体积混合后的培养基，培养周期7-14天，原代培养结束后将培养有乳牙间充质干细胞的方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中；吸弃原始培养基，加入磷酸盐缓冲溶液(DPBS)洗涤一次；吸弃DPBS溶液，加入胰蛋白酶37℃消化4分钟，然后DPBS重悬细胞，并将细胞悬液均分至3个离心管中离心，400G室温离心5分钟；离心结束后，分别加入3种培养基进行培养；4小时后观察细胞贴壁状况，并拍照记录。

结果分析：

(1)通过观察发现，培养4小时后，使用培养基①和培养基③培养的细胞在其方瓶底部均观察到发生粘附的细胞，且使用培养基①培养的细胞大部分贴壁，贴壁率要高于使用培养基③即传统的胎牛血清培养的细胞，而使用培养基②培养的乳牙间充质干细胞，未观察到任何贴壁细胞，如图1、2及3所示。

(2)培养18小时后，再次观察在3种培养基中培养的乳牙间充质干细胞的贴壁和生长状况。使用培养基①和培养基③培养的细胞全部贴壁，使用培养基②培养的细胞只有少量贴壁。此时，培养基①培养的细胞较培养基③培养的细胞相比更狭长，呈现出标准的纺锤状，如图4所示。

(3)在培养基②的培养体系中，乳牙间充质干细胞的生长方式更倾向于胚胎干细胞，细胞缓慢贴壁，贴壁的单个细胞增殖形成克隆，随后克隆连接成片，细胞排列紧密，形态十分狭长。KnockOut Serum Replacement这种血清替代物本是用于培养胚胎干细胞和诱导的多能干细胞，在培养过程中，它要求这两种细胞都事先有饲养层细胞存在，因此在用培养基②培养乳牙间充质干细胞6天后，因细胞贴壁较差，细胞的汇合度还不到30％，生长缓慢(如图5所示)。实验证明KnockOut Serum Replacement不利于乳牙间充质干细胞粘附，但能更好维持干细胞的多潜能性，抑制分化。

(4)随着培养代次的增加，用培养基①培养3代后的干细胞促细胞粘附的优势逐渐消失，增殖能力逐渐落后于胎牛血清培养的细胞，而细胞形态出现极大变化，不再是干细胞特有的狭长状，而是缩短，偏圆而且有很多触角的细胞，而使用培养基③培养的细胞，形态依然呈纺锤状，如图6所示。

实施例1：乳牙牙髓间充质干细胞无血清培养

无血清完全培养基I：含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，2％Ultroser G溶液，充分混匀，4℃冰箱保存。

无血清完全培养基Ⅱ:含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，10％knockout SR血清替代物，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF。

培养方法：

1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法，用I型胶原酶消化后，过滤离心获得间充质干细胞进行原代培养，原代培养采用无血清完全培养基I与无血清培养基完全Ⅱ等体积混后的培养基培养，培养周期7-14天；

2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方瓶中的细胞原始培养基吸弃，加入7.5ml DPBS洗涤一次；

3)加入0.8ml 0.25％的胰蛋白酶消化4分钟，消化结束后用无血清完全培养基I重悬细胞；

4)将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟；

5)离心后去上清，用无血清完全培养基I以4×10⁴cells/ml接种于新的T25方瓶中，共5ml；

6)将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养6小时；

7)将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中，无菌移除培养瓶中的无血清完全培养基1，加入与之等量的完全培养基Ⅱ，继续培养直至细胞汇合度达80％-90％；

8)进行新一轮的传代培养。

依据上述方式培养3代后与使用10％FBS的DMEM培养基培养原代细胞后传代培养3个代次的乳牙间充质干细胞进行形态及表型标志表达方面的检测。

结果分析：

(1)在用培养基I培养6小时后，乳牙间充质干细胞全部贴壁，但贴壁后细胞形态并非标准的纺锤状，而是伸出了许多触角，这充分显示出细胞与方瓶底部存在许多锚定位点，这与Ultroser G十分有利于细胞粘附有关，如图7所示。

(2)培养3代后，从图8可知，细胞呈现出标准的纺锤状，且排列方式呈现出干细胞特有的旋涡状，与单用含Ultroser G的培养基或单用含KnockOut Serum Replacement的培养基培养的细胞相比，在细胞形态、汇合度上表现更为优异。

实施例2乳牙牙髓间充质干细胞无血清培养

将培养基I和培养基II混合制得培养基III：含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，1％Ultroser G溶液，5％KnockOut SR血清替代物，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF充分混匀，4℃冰箱保存。

培养方法：

1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法，用I型胶原酶消化后，过滤离心获得间充质干细胞进行原代培养，原代培养采用培养基III进行培养，培养培养周期7-14天；

2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方瓶中的细胞原始培养基吸弃，加入7.5ml DPBS洗涤一次；

3)加入0.8ml 0.25％的胰蛋白酶消化4分钟后用无血清完全培养基III重悬细胞；

4)将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟；

5)离心后去上清，使用无血清完全培养基III以4×10⁴cells/ml接种于新的T25方瓶中，共5ml，二氧化碳培养箱37℃，5％二氧化碳浓度,饱和湿度中培养直至细胞的混合度达80％-90％；

6)依据上述方式培养3代后与使用10％FBS的DMEM培养基培养进行原代培养后传代培养3个代次的乳牙间充质干细胞进行形态及表型标志表达方面的检测。

结果分析：

经连续传代培养3个代次后，在倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状态可知，上述培养方法培养的乳牙间充质干细胞与传统的胎牛血清培养的乳牙间充质干细胞在细胞形态上无明显差异，参见图10。均为标准的纺锤状，细胞生长排列方式为旋涡状。流式细胞检测结果表明二者在表型标志的表达方面无明显差异，见表1。

实施例3：乳牙牙髓间充质干细胞无血清培养

无血清完全培养基I：含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，4％Ultroser G溶液，充分混匀，4℃冰箱保存。

无血清完全培养基II:含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，10％KnockOut SR血清替代物，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF。

培养方法：

1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法，用I型胶原酶消化后，过滤离心获得间充质干细胞进行原代培养，培养基为4ml无血清完全培养基Ⅱ与1ml无血清完全培养基Ⅰ的混合培养基，培养周期7-14天；

2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方瓶中的细胞原始培养基吸弃，加入5mlDPBS洗涤一次；

3)加入0.8ml 0.25％的胰蛋白酶消化4分钟后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞；

4)将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟；

5)离心后去上清，使用无血清完全培养基Ⅱ以5×10⁴cells/ml接种于新的T25方瓶中,共接种4ml，然后再加入1ml培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀，然后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％；

6)在细胞达到上述汇合度时，将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中，吸弃原始培养基，加入5ml DPBS洗涤一次，弃DPBS；

7)加入0.4ml胰蛋白酶37℃消化4分钟；

8)消化结束后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞，并将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟，离心结束后去上清；

9)用无血清完全培养基Ⅱ以5×10⁴cells/ml接种于新的方瓶中,共接种3.8ml，然后再加入1.2ml培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀，然后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％；

10)在细胞再次达到上述汇合度时，将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中，吸弃原始培养，加入5ml DPBS洗涤一次，弃DPBS；

11)加入0.4ml胰蛋白酶37℃消化4分钟后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞，并将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟，离心结束后去上清；

12)用无血清完全培养基Ⅱ以5.7×10⁴cells/ml接种于新的方瓶中，共接种3.5ml，然后再加入1.5ml培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％。

实验结果：

培养细胞三个代次后，其细胞形态、生长方式与采用含胎牛血清的培养基培养3个代次后细胞的形态没有区别，如图11所示。此外，将使用上述实施例3的培养方式收获的细胞与收获的使用含胎牛血清的培养基培养的细胞进行表面标志物表达分析，可知在表面标志物的表达方面上述三种培养方式与胎牛血清培养体系没有差异，如表1所示。

表1不同培养方式所收获的细胞表面标志物的检测结果

	CD90	CD73	CD105	CD34
					实施例1	99.8％	99.82％	90％	0.16％
实施例2	99.99％	100％	90％	0.12％
					实施例3	99.99％	99.99％	89.88％	2.29％
使用胎牛血清的培养方式	99.99％	100％	88.76％	0.08％

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种无血清完全培养基，其特征在于，包括依次或混合使用的以下两种培养基：

其中，培养基I是在基础培养基中添加L-谷氨酰胺、1％-4％能有效促进细胞粘附和扩展的血清替代物，L-谷氨酰胺的浓度为2mM/L；

培养基II是在基础培养基中添加L-谷氨酰胺、7％-10％用于培养ESC和iPSC的血清替代物，L-谷氨酰胺的浓度为2mM/L。

2.根据权利要求1所述的无血清完全培养基，其特征在于，所述培养基I中血清替代物为Ultroser G。

3.根据权利要求1所述的无血清完全培养基，其特征在于，所述培养基II中血清替代物为KnockOut Serum Replacement。

4.根据权利要求1所述的无血清完全培养基，其特征在于，所述基础培养基选自α-MEM、DMEM、DMDM/F12或IMEM/F12。

5.根据权利要求1所述的无血清完全培养基，其特征在于，所述培养基II中还包括EGF、bFGF。

6.权利要求1-5任一项所述的培养基在培养间充质干细胞中的应用。

7.一种乳牙间充质干细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求1所述的培养基I和培养基II的混合培养基培养每代次的干细胞，其中混合培养基中培养基I与培养基II的血清替代物比例为1:1-1:5。

8.一种乳牙间充质干细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

a、使用如权利要求1所述的培养基I孵育传代后的细胞4h-24h后，移除该种培养基；

b、使用如权利要求1所述的培养基II继续培养至细胞汇合度达80％-90％。

c、每次传代皆用上述培养方式。

9.一种乳牙间充质干细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求1所述的培养基I与培养基II的混合培养基，培养基I与培养基II的比例范围是1:5-3:7，且随着培养代次的增加，混合培养基中培养基I的比例是逐渐增加。