CN108653327A - 一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，它涉及活化富血小板凝胶制备技术领域。本发明是要解决目前液体PRP及传统凝胶中因子降解快、作用时间短的问题。本发明利用枸橼酸钠抗凝剂的采血耗材根据患者的损伤面积进行采集特定体积的外周血，采用特定富血小板血浆分离技术分离出高血小板含量的血浆；收集捐赠的新鲜、健康皮肤组织进行原代皮肤间充质干细胞培养，收集第4、5代细胞进行冻存备用；分泌型富血小板凝胶包含富血小板血浆、皮肤间充质干细胞、医用CaCl₂溶液及含硫酸庆大霉素的乏血小板血浆，经富血小板血浆与皮肤间充质干细胞混合后，平铺于无菌瓶皿中，利用Ca²⁺对枸橼酸钠抗凝剂的抑制作用进行凝胶制备。

Description

一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备 方法

技术领域

本发明涉及一种分泌型富血小板凝胶的制备方法。

背景技术

慢性皮肤损伤是指由于各种各样的系统和局部因素，不能通过正常的愈合阶段，不能及时有序地修复、恢复解剖结构和功能的完整性。其原因包括以下4个方面：a伤口出现感染或大量坏死组织滞留；b血管功能不全，伤口局部微循环差；c生长因子含量减少，活性降低以及各种生长因子之间调节失控；d修复细胞出现过度凋亡的情况，胞膜受体结构发生改变，对信号反应迟钝，使生长因子与受体间存在应答障碍等。临床上慢性皮肤损伤多指由各种原因所导致的创面接受超过了1个月的治疗但未愈合且仍无愈合倾向者。慢性伤口也被定义为：一个组织，由于不同的临床条件，糖尿病、肥胖、化疗、压力等而愈合能力受损，皮肤创面有偏离急性创面愈合的趋势。在我国，慢性皮肤损伤发病率较高，其中绝大部分为创(烧)伤及感染所致，比例高达67.5％。随着社会经济的发展，创伤的发病率呈逐年上升趋势，由创伤所致的伤口相关并发症也随之升高，而且随着我国逐渐步入老龄化社会，老年人口增多，慢性皮肤损伤的患病率很可能也会因此随之增加。

传统常规的治疗慢性皮肤损伤方法，如换药和清创仅能清除伤口部位存在的感染和坏死组织，无法改善影响慢性伤口愈合的其它方面，因此需进行重建伤口处的血液供应，改善微循环，增加伤口处生长因子的浓度及其活性，并改善生长因子与其受体间的应答障碍，防止伤口内细胞出现过度的凋亡。因此，慢性皮肤损伤修复开始使用外源性生长因子来进行治疗，相继出现生长因子/纤维蛋白制剂的研究。许多生长因子相关产品及血小板裂解液产品，确已被临床证实对慢性伤口的治疗有一定效果，但这些产品大多为不能实现持续因子分泌供应，同时目前产品以液态为主，易挥发流失，且有些为异源性，存在免疫排斥反应可能，因此在临床实际应用中效果并不理想。富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)技术是模拟体内的血小板激活过程，将富集的血小板，通过凝血酶和钙离子激活血小板的凝血与释放功能，将α颗粒中存在的生长因子、免疫调节因子和血管形成因子释放出来。这些因子中，非常重要的是血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子β(TGF-β)，类胰岛素生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，可以起到促进细胞增殖分化、促进皮肤组织修复作用。由于PRP来源于自体，可制备成凝胶状态，无免疫排斥反应，采集容易，对机体损伤小，近20年来已成为用于慢性伤口的治疗的一个新的突破点。

慢性皮肤损伤分为：炎症期，增殖期和重塑期，体内研究表明在炎症期，损伤组织和炎性细胞释放的炎症因子和趋化因子可促进MSCs迁移归巢到创面，MSCs通过分化为创面修复细胞和旁分泌机制发挥抗炎和抗凋亡作用。在增殖期，MSCs也可通过旁分泌机制发挥抗菌和促进创面血管形成等作用而加速创面愈合。在重塑期，MSCs则通过调控创面中I、III型胶原比例实现创面的塑形改造。真皮间充质干细胞(DMSCs)位于皮肤的真皮层，在皮肤细胞损伤和坏死过程中起到补充和调节作用，为皮肤和毛囊的更新提供了细胞基础，临床上用于皮肤的移植、组织损伤的修复，具有潜在的应用价值。目前很多研究都是利用液态PRP联合骨髓或脐带间充质干细胞进行皮肤损伤治疗，这种方法易使PRP中成分挥发流失，使自身作用时间减短，同时使细胞活性降低，效果大大减弱；DMSCs较骨髓或脐带间充质干细胞采集和分离容易，且是皮肤来源，可更好的进行皮肤细胞分化和所需因子分泌。本发明的分泌型富血小板凝胶本身具有丰富的慢性皮肤愈合因子，同时使用过程中能够进行因子的分泌补充，因此，可以避免液体PRP及传统凝胶中因子降解快、作用时间短的问题，为慢性皮肤损伤的治疗提供新的方法。

发明内容

本发明是要解决目前液体PRP及传统凝胶中因子降解快、作用时间短的问题，提供一种用于慢性皮肤损伤的治疗的方法，为慢性皮肤损伤的治疗提供支持。

本发明的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，是按照如下步骤进行的：

一、血液采集与高浓度PRP分离

根据慢性皮肤损伤面积用枸橼酸钠采血管按如下公式进行外周全血采集；

V≥2S～5S；其中，V为采血体积，单位为mL；S为伤口面积，单位为cm²；

采集的外周血采用PRP的分离方法进行分离：

A、将采集的外周全血在2～8℃条件运送到分离室，将外周全血混匀后，取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；

B、将混匀后外周全血进行离心收集富含血小板血浆，离心条件为150～200g，15min，离心完毕取出此步下层富含血小板血浆和上层乏血小板血浆，记录体积并抽取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；

C、将步骤B收取的血浆进行第二次离心，离心条件为900～1300g，20min，吸出上层乏血小板血浆，留取下层富血小板血浆，保证留取的下层富血小板血浆体积是步骤A外周全血体积的1/10，利用移液器吹打底部充分悬起贴于离心管底部的血小板沉淀，然后进行皮肤愈合相关因子浓度检测并进行计数血小板浓度；最终计算血小板的分离效率及浓缩倍数；

血小板的分离效率＝步骤B离心收集血浆的血小板浓度×步骤B离心收集血浆的体积/(外周全血血小板浓度×外周全血的体积)×100％；

血小板浓缩倍数＝富血小板血浆中血小板浓度/步骤B离心收集血浆的血小板浓度；

二、皮肤采集与真皮间充质干细胞分离、培养及冻存

1)取材：取皮肤组织用无菌镊子移入盛标本贮存液的样本采集瓶中并封口，在2～8℃条件下运回实验室进行分离操作；

2)消毒、漂洗：

D、复合抗生素的制备：用生理盐水将万古霉素、盐酸环丙沙星、头孢噻肟钠、庆大霉素和两性霉素分别配制成储存浓度，分装后于-20℃保存；储存液浓度分别为：万古霉素0.05～0.2g/mL，盐酸环丙沙星15～25mg/mL，头孢噻肟钠0.15～0.25g/mL，庆大霉素3500～4500U/mL，两性霉素B 15～25mg/mL；

E、含复合抗生素的洗涤液配制：取样本采集瓶，加入体积为50mL的医用生理盐水，然后向其中加入步骤D配制的抗生素，加入体积分别为：万古霉素2～7μL，环丙沙星20～30μL，头孢噻肟钠120～130μL，庆大霉素70～80μL，两性霉素B 20～30μL；

F、用无菌镊子将步骤1)采集的样本组织从采集瓶中取出放入无菌器皿中，然后向无菌器皿中加入20mL含复合抗生素的洗涤液，消毒5～10min，将样本组织再用生理盐水漂洗3次以去除抗生素和血细胞；

3)细胞分离：

G、刮掉样品中皮肤的皮下组织及血管，再将皮肤剪至2～5mm边长的方形，将每个方形组织块的表皮切除，组织去除表皮及皮下组织，留下真皮层后移入无菌器皿内，将组织切割成大小为0.5～1.5mm²的块；

H、组织酶解分离细胞：将大小为0.5～1.5mm²的真皮组织放入15mL离心管中，加入3mL复合胶原酶溶液中，在温度为37℃，转速为133rpm摇床孵育2h后取出在安全柜中吹打出细胞，然后用100μm细胞滤网过滤出组织块，进行取样计数及活率；

4)细胞培养

I、完全培养基配制：基础培养基为a-MEM，加入EGF 110～130ng/mL，胰岛素130～170ng/mL，转铁蛋白10～20μg/mL，抗坏血酸10～20μg/mL及体积百分含量为5％UltraGRO血清替代物；

J、细胞接种培养所得细胞悬液于1300rpm离心5min弃上清，利用完全培养基重悬至5×10⁴/mL，接种至6孔细胞培养板中，每孔2mL，72h后进行换液处理；

K、细胞传代及冻存

细胞每3天进行换液处理，换液时应用生理盐水对细胞皿底进行吹打洗涤，去除杂质，待细胞密度达70％，进行传代处理，经500μL 0.3×TrypLE Express消化3min后，用500μL基础培养基稀释吹打出间充质细胞以去除内皮类细胞，细胞离心后用步骤I的完全培养基重悬至3.75×10⁴/mL接种至T75培养瓶中，每瓶10mL，培养至P4-P5代进行无血清冻存；

三、含皮肤间充质干细胞生物分泌型富血小板凝胶制备

利用新鲜或冻存的DMSCs细胞及新鲜分离的PRP进行分泌型富血小板凝胶制备，用浓缩倍数为1.5～2倍的富血小板血浆按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀，将3M透气透明敷料加入到所需面积的平皿中，将含细胞的富血小板血浆重悬液平铺在3M透气透明敷料上，铺设厚度为2～5mm，利用注射器多点滴加的方式加入医用CaCl₂溶液，每毫升含细胞的富血小板血浆重悬液需加入300～500μL/mL医用CaCl₂溶液，在温度为37℃静置20min，即凝固为分泌型富血小板凝胶。

本发明包含以下有益效果：

(1)本发明PRP的分离采用两步离心法进行，第一步为150～200g(9，3)15min，利用低转速将血浆和血细胞分开，保证血小板留在血浆内而不沉入血细胞中；收取第一步离心的全部血浆进行第二次离心，离心条件为900-1300g(9，3)20min，使血小板尽可能沉降于管底及底层血浆中，使上层血小板含量较低，增强血小板浓缩效率。

(2)皮肤组织为体表材料，微生物种类较多，使用双抗(工作浓度为100U/ml的青霉素和工作浓度为0.1mg/ml的链霉素)或酒精对组织活性会产生影响且很难消毒彻底，本发明在原代细胞制备前利用复合抗生素对皮肤组织进行消毒，其中包含万古霉素，盐酸环丙沙星，头孢噻肟钠，庆大霉素，两性霉素，降低原代培养污染的可能。

(3)本发明所使用的细胞为皮肤间充质干细胞，皮肤来源广泛，不受伦理制约，分离简单，且细胞本身为皮肤来源，为体内皮肤前体细胞的种子细胞，可更好的应用于皮肤的治疗。

(4)慢性皮肤损伤后，自身皮肤不宜再进行采集皮肤而产生创面，且自体皮肤细胞的扩增及修复能力可能会降低，根据皮肤间充质干细胞的低免疫原性的特点，本发明所需细胞为采自异体的捐献者的新鲜、健康皮肤组织(儿童包皮、眼部及耳后皮肤等)。

(5)本发明利用复合胶原酶进行组织处理分离细胞，解决单一酶消化不能充分解离细胞的难题，也避免使用胰酶消化对细胞的损伤。

(6)本发明所制备的皮肤间充质干细胞经扩增纯化后进行超低温冷冻保存，应用时即可对其进行复苏，避免了患者应用时的时间限制。

(7)本发明是利用CaCl₂对枸橼酸钠抗凝剂的去除而使患者血浆中自身凝血酶发挥凝学作用制备含皮肤间充质干细胞生物分泌型富血小板凝胶，不需添加异种来源凝血酶，降低免疫反应及病原微生物引入风险，保证使用过程的安全性。

(8)本发明的生物材料的使用前对损伤面进行清创后予以外敷并利用无菌透气材料进行包扎，每2天需对凝胶进行含硫酸庆大霉素的乏血小板血浆补充，保证其中皮肤间充质干细胞的活性、分泌能力及无菌性。

(9)本发明的分泌型富血小板凝胶本身具有丰富的慢性皮肤愈合因子，同时使用过程中能够进行因子的分泌补充，因此，可以避免液体PRP及传统凝胶中因子降解快、作用时间短的问题，为慢性皮肤损伤的治疗提供新的方法。

附图说明

图1为试验2中皮肤间充质干细胞原代5天显微镜观察结果图；

图2为试验2中皮肤间充质干细胞原代8天显微镜观察结果图；

图3为试验2中皮肤间充质干细胞传代的P1代显微镜观察结果图；

图4为试验2中P3代皮肤间充质干细胞流式细胞仪细胞表型检测结果图；

图5为试验3中不含皮肤间充质干细胞的富血小板凝胶凝固情况结果图；

图6为试验5糖尿病大鼠慢性皮肤损伤模型的治疗效果测量结果图。

具体实施方式

具体实施方式一：一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，是按照如下步骤进行的：

一、血液采集与高浓度PRP分离

根据慢性皮肤损伤面积用枸橼酸钠采血管按如下公式进行外周全血采集；

V≥2S～5S；其中，V为采血体积，单位为mL；S为伤口面积，单位为cm²；

采集的外周血采用PRP的分离方法进行分离：

A、将采集的外周全血在2～8℃条件运送到分离室，将外周全血混匀后，取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；

B、将混匀后外周全血进行离心收集富含血小板血浆，离心条件为150～200g，15min，离心完毕取出此步下层富含血小板血浆和上层乏血小板血浆，记录体积并抽取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；

C、将步骤B收取的血浆进行第二次离心，离心条件为900～1300g，20min，吸出上层乏血小板血浆，留取下层富血小板血浆，保证留取的下层富血小板血浆体积是步骤A外周全血体积的1/10，利用移液器吹打底部充分悬起贴于离心管底部的血小板沉淀，然后进行皮肤愈合相关因子浓度检测并进行计数血小板浓度；最终计算血小板的分离效率及浓缩倍数；

血小板的分离效率＝步骤B离心收集血浆的血小板浓度×步骤B离心收集血浆的体积/(外周全血血小板浓度×外周全血的体积)×100％；

血小板浓缩倍数＝富血小板血浆中血小板浓度/步骤B离心收集血浆的血小板浓度；

二、皮肤采集与真皮间充质干细胞分离、培养及冻存

1)取材：取皮肤组织用无菌镊子移入盛标本贮存液的样本采集瓶中并封口，在2～8℃条件下运回实验室进行分离操作；

2)消毒、漂洗：

D、复合抗生素的制备：用生理盐水将万古霉素、盐酸环丙沙星、头孢噻肟钠、庆大霉素和两性霉素分别配制成储存浓度，分装后于-20℃保存；储存液浓度分别为：万古霉素0.05～0.2g/mL，盐酸环丙沙星15～25mg/mL，头孢噻肟钠0.15～0.25g/mL，庆大霉素3500～4500U/mL，两性霉素B 15～25mg/mL；

E、含复合抗生素的洗涤液配制：取样本采集瓶，加入体积为50mL的医用生理盐水，然后向其中加入步骤D配制的抗生素，加入体积分别为：万古霉素2～7μL，环丙沙星20～30μL，头孢噻肟钠120～130μL，庆大霉素70～80μL，两性霉素B 20～30μL；

F、用无菌镊子将步骤1)采集的样本组织从采集瓶中取出放入无菌器皿中，然后向无菌器皿中加入20mL含复合抗生素的洗涤液，消毒5～10min，将样本组织再用生理盐水漂洗3次以去除抗生素和血细胞；

3)细胞分离：

G、刮掉样品中皮肤的皮下组织及血管，再将皮肤剪至2～5mm边长的方形，将每个方形组织块的表皮切除，组织去除表皮及皮下组织，留下真皮层后移入无菌器皿内，将组织切割成大小为0.5～1.5mm²的块；

H、组织酶解分离细胞：将大小为0.5～1.5mm²的真皮组织放入15mL离心管中，加入3mL复合胶原酶溶液中，在温度为37℃，转速为133rpm摇床孵育2h后取出在安全柜中吹打出细胞，然后用100μm细胞滤网过滤出组织块，进行取样计数及活率；

4)细胞培养

I、完全培养基配制：基础培养基为a-MEM，加入EGF 110～130ng/mL，胰岛素130～170ng/mL，转铁蛋白10～20μg/mL，抗坏血酸10～20μg/mL及体积百分含量为5％UltraGRO血清替代物；

J、细胞接种培养所得细胞悬液于1300rpm离心5min弃上清，利用完全培养基重悬至5×10⁴/mL，接种至6孔细胞培养板中，每孔2mL，72h后进行换液处理；

K、细胞传代及冻存

细胞每3天进行换液处理，换液时应用生理盐水对细胞皿底进行吹打洗涤，去除杂质，待细胞密度达70％，进行传代处理，经500μL 0.3×TrypLE Express消化3min后，用500μL基础培养基稀释吹打出间充质细胞以去除内皮类细胞，细胞离心后用步骤I的完全培养基重悬至3.75×10⁴/mL接种至T75培养瓶中，每瓶10mL，培养至P4-P5代进行无血清冻存；

三、含皮肤间充质干细胞生物分泌型富血小板凝胶制备

利用新鲜或冻存的DMSCs细胞及新鲜分离的PRP进行分泌型富血小板凝胶制备，用浓缩倍数为1.5～2倍的富血小板血浆按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀，将3M透气透明敷料加入到所需面积的平皿中，将含细胞的富血小板血浆重悬液平铺在3M透气透明敷料上，铺设厚度为2～5mm，利用注射器多点滴加的方式加入医用CaCl₂溶液，每毫升含细胞的富血小板血浆重悬液需加入300～500μL/mL医用CaCl₂溶液，在温度为37℃静置20min，即凝固为分泌型富血小板凝胶。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：复合胶原酶溶液为含质量百分含量为0.05～0.1％I型胶原酶和质量百分含量为0.03～0.05％IV胶原酶的a-MEM溶液。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：消毒、漂洗及细胞分离操作均在生物安全中进行，所用器械均采用高压蒸汽灭菌消毒。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：储存液浓度分别为：万古霉素0.1g/mL，盐酸环丙沙星20mg/mL，头孢噻肟钠0.2g/mL，庆大霉素4000U/mL，两性霉素B 20mg/mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：万古霉素5μL，环丙沙星25μL，头孢噻肟钠125μL，庆大霉素75μL，两性霉素B 25μL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：用于皮肤间充质干细胞基础培养基为a-MEM，加入EGF 120ng/mL，胰岛素150ng/mL，转铁蛋白15μg/mL，抗坏血酸15μg/mL及体积百分含量为5％UltraGRO血清替代物。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：用浓缩倍数为1.8～2倍的富血小板血浆按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：富血小板血浆按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀，将3M透气透明敷料加入到所需面积的平皿中，将含细胞的富血小板血浆重悬液平铺在3M透气透明敷料上，铺设厚度为3～5mm。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：利用注射器多点滴加的方式加入医用CaCl₂溶液，每毫升含细胞的富血小板血浆重悬液需加入400～500μL/mL医用CaCl₂溶液。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

为验证本实施例的效果进行以下实验：

试验1：本试验进行血液采集与高浓度PRP分离

根据慢性皮肤损伤面积进行外周血采集，抗凝剂为枸橼酸钠，V≥2S～5S，V为采血体积(ml)，S为伤口面积(cm²)；

PRP的分离方法：用枸橼酸钠采血管进行外周全血采集并2-8度条件运送到分离室，将外周全血混匀后取少量进行计数血小板浓度3次，计算外周全血中血小板总量；将混匀后外周全血进行离心收集富含血小板血浆，离心条件为150-200g(9，3)(9，3)是离心时的升速和降速曲线，表示是快升速慢降速。15min，离心完毕取出此步全部血浆，记录体积并抽取少量进行计数血小板浓度3次；将收取的血浆进行第二次离心，离心条件为900-1300g(9，3)20min，取出上层乏血小板血浆(Platelet-poor plasma，PPP)，留取下层富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)，保证其体积是外周全血体积的1/10，利用移液器吹打底部充分悬起贴于离心管底部的血小板沉淀，取少量PRP进行皮肤愈合相关因子浓度检测，同时进行计数血小板浓度以确定最终计算血小板的分离效率及浓缩倍数。

血小板的分离效率＝第一次离心收集血浆的血小板浓度×第一次离心收集血浆的体积/(外周全血血小板浓度×外周全血的体积)×100％；

血小板浓缩倍数＝PRP中血小板浓度/第一次离心收集血浆的血小板浓度；

本试验中，采集50mL成人外周血，第一次离心收集得到20mL血浆，第二次离心浓缩后弃上层15mL乏血小板血浆，最终血小板的分离效率为62.42％，浓缩倍数为1.66倍，结果见表一；取少量PRP进行ELISA检测皮肤愈合相关因子检测，发现其中PDGF，TGF-β，bFGF，EGF，VEGF均含量丰富，结果见表二。

表一 血小板的分离效率及浓缩倍数

注：V1为外周全血总体积，C1为外周全血血小板浓度；V2为第一次离心收集血浆体积，C2为第一次离心收集血浆中血小板浓度；V3为第二次离心收集PRP体积，C3为第二次离心收集PRP血小板浓度；

表二 PRP中皮肤愈合相关因子含量

试验2：皮肤采集与真皮间充质干细胞(DMSCs)分离、培养及冻存

一、取材

在手术室内将手术切除的皮肤组织用无菌镊子移入盛标本贮存液的样本采集瓶中并封口，2-8℃运回实验室进行分离操作。

二、消毒、漂洗及分离

a复合抗生素的制备：用生理盐水将各种抗生素分别配制成储存浓度，分装后于-20℃保存。储存液浓度分别为：万古霉素0.1g/mL，盐酸环丙沙星20mg/mL，头孢噻肟钠0.2g/mL，庆大霉素4000U/mL，两性霉素B 20mg/mL。

b含复合抗生素的洗涤液配置：取一样本采集瓶，加入体积为50mL的医用生理盐水，后向其中分别加入之前配好的复合抗生素，加入体积分别为：万古霉素5μL，环丙沙星25μL，头孢噻肟钠125μL，庆大霉素75μL，两性霉素B 25μL。

c用无菌镊子将样本组织从采集瓶中取出放入无菌器皿，加入到20ml含复合抗生素的洗涤液中，消毒5-10min，将样本组织再用生理盐水漂洗3次以去除抗生素和血细胞。

细胞分离：

a用手术刀片刮掉皮肤的皮下组织及血管，再利用眼科剪将皮肤剪至2-5mm边长的方形，用手术刀片将每个方形组织块的表皮切除，组织尽可能去除表皮及皮下组织，留下真皮层。组织移入新的无菌器皿内，用手术刀片将组织切割成大小约1mm²的小块。

b组织酶解分离细胞：将大小约1mm²的小块真皮组织放入15mL离心管中，加入3mLI型胶原酶和IV胶原酶复合溶液(复合胶原酶溶液为含0.05-0.1％I型胶原酶和0.03-0.05％IV胶原酶的a-MEM溶液)中37度，133rpm摇床孵育2h，取出安全柜中吹打出细胞后，用100μm细胞滤网过滤出组织块，进行取样计数及活率。

以上步骤均在生物安全中进行，所用器械均采用高压蒸汽灭菌消毒。

三、细胞培养及冻存

a完全培养基配制：基础培养基为a-MEM，加入EGF 120ng/mL，胰岛素150ng/mL，转铁蛋白15μg/mL，抗坏血酸15μg/mL及5％UltraGRO血清替代物；

b细胞接种培养所得细胞悬液于1300rpm离心5min弃上清，利用完全培养基重悬至5×10⁴/mL接种至6孔细胞培养板中，每孔2mL，72h后进行换液处理；

c细胞传代及冻存

细胞每3天进行换液处理，换液时应用生理盐水对细胞皿底进行吹打洗涤，去除汗腺细胞及细胞碎片等杂质，细胞培养第5天时状态如图1所示，培养第8天时状态如图2所示，待细胞密度达70％则进行传代处理，经500μL0.3×TrypLE Express消化3min后用500μL基础培养基稀释吹打出间充质细胞以去除内皮类细胞，细胞离心后用完全培养基重悬至3.75×10⁴/mL接种至T75培养瓶中，每瓶10mL，细胞传代后形态如图3所示，对P3代细胞进行消化处理流式细胞仪检测其表型，包括CD73，CD90，CD105及CD34、CD45、检测结果如图4所示，细胞低表达或不表达CD34、CD45，但CD73、CD90、CD105表达量均高于98％。同时，将P3代细胞用完全培养基重悬后接种于24孔板中，每孔7000个，培养24h后用PBS清洗2次再换成不含添加物的基础培养基a-MEM继续培养48h，收取上清，以基础培养基a-MEM为空白对照，采用ELISA方法检测皮肤愈合相关的因子分泌情况，结果见表三。检测后将细胞传至P4-P5代后进行无血清冻存，冻存液为含10％DMSO、10％血清替代物的基础培养基，冻存密度为2×10⁶/mL/支。

表三 DMSCs分泌皮肤愈合相关因子量检测

试验3：不含皮肤间充质干细胞的富血小板凝胶制备

取3支15mL离心管，分别加入1mL制备好的新鲜PRP，命名为ct、a和b，向a管中加入300μL医用CaCl₂溶液，b管中加入500μL医用CaCl₂溶液，ct管中不加任何添加物质，37℃孵育，每5min观察一次凝胶形成情况，ct管未见凝胶形成，b管中15min发现有凝胶产生，a管中20min发现有凝胶产生，如图5所示。

试验4：含皮肤间充质干细胞生物分泌型富血小板凝胶制备

利用新鲜或冻存的DMSCs细胞及新鲜分离的PRP进行分泌型富血小板凝胶制备，用新鲜高浓缩PRP按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀，将3M透气透明敷料加入到所需面积的平皿中，将细胞的PRP重悬液平铺在3M透气透明敷料上，厚度为2-5mm之间，利用注射器多点滴加的方式加入医用CaCl₂溶液，300-500μL/mL，37℃ 30min后即可凝固为分泌型富血小板凝胶。

试验5：糖尿病大鼠慢性皮肤损伤模型的治疗效果观察

糖尿病大鼠背部左右两侧进行损伤，对两侧伤口进行清创后根据伤口面积大小及形状进行普通PRP凝胶及含皮肤间充质干细胞的分泌型富血小板凝胶制备，左侧施以含皮肤间充质干细胞的分泌型富血小板凝胶，右侧用普通PRP凝胶，将凝胶面朝向伤口予以外敷，在3M透气透明敷料外侧用凡士林纱布进行包扎，为保证其中皮肤间充质干细胞的活性及分泌能力，每2天需对凝胶进行含硫酸庆大霉素的乏血小板血浆补充，一般作用时间为10-15天，根据病情程度决定治疗次数。本试验中，作用时间为15天，15天时拆去包扎材料，对伤口面积及恢复情况进行拍照，之后每隔5天进行拍照对比伤口情况，通过观察不同时期的创面颜色和创面面积可知，含DMSCs的分泌型富血小板凝胶能够促进慢性皮肤损伤愈合，促进效果较普通PRP凝胶明显，如图6所示。

Claims (8)

1.一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于它是按以下步骤进行：

一、血液采集与高浓度PRP分离

根据慢性皮肤损伤面积用枸橼酸钠采血管按如下公式进行外周全血采集；

V≥2S～5S；其中，V为采血体积，单位为mL；S为伤口面积，单位为cm²；

采集的外周血采用PRP的分离方法进行分离：

A、将采集的外周全血在2～8℃条件运送到分离室，将外周全血混匀后，取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；

B、将混匀后外周全血进行离心收集富含血小板血浆，离心条件为150～200g，15min，离心完毕取出此步下层富含血小板血浆和上层乏血小板血浆，记录体积并抽取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；

C、将步骤B收取的血浆进行第二次离心，离心条件为900～1300g，20min，吸出上层乏血小板血浆，留取下层富血小板血浆，保证留取的下层富血小板血浆体积是步骤A外周全血体积的1/10，利用移液器吹打底部充分悬起贴于离心管底部的血小板沉淀，然后进行皮肤愈合相关因子浓度检测并进行计数血小板浓度；最终计算血小板的分离效率及浓缩倍数；

血小板的分离效率＝步骤B离心收集血浆的血小板浓度×步骤B离心收集血浆的体积/(外周全血血小板浓度×外周全血的体积)×100％；

血小板浓缩倍数＝富血小板血浆中血小板浓度/步骤B离心收集血浆的血小板浓度；

二、皮肤采集与真皮间充质干细胞分离、培养及冻存

1)取材：取皮肤组织用无菌镊子移入盛标本贮存液的样本采集瓶中并封口，在2～8℃条件下运回实验室进行分离操作；

2)消毒、漂洗：

D、复合抗生素的制备：用生理盐水将万古霉素、盐酸环丙沙星、头孢噻肟钠、庆大霉素和两性霉素分别配制成储存浓度，分装后于-20℃保存；储存液浓度分别为：万古霉素0.05～0.2g/mL，盐酸环丙沙星15～25mg/mL，头孢噻肟钠0.15～0.25g/mL，庆大霉素3500～4500U/mL，两性霉素B 15～25mg/mL；

E、含复合抗生素的洗涤液配制：取样本采集瓶，加入体积为50mL的医用生理盐水，然后向其中加入步骤D配制的抗生素，加入体积分别为：万古霉素2～7μL，环丙沙星20～30μL，头孢噻肟钠120～130μL，庆大霉素70～80μL，两性霉素B 20～30μL；

F、用无菌镊子将步骤1)采集的样本组织从采集瓶中取出放入无菌器皿中，然后向无菌器皿中加入20mL含复合抗生素的洗涤液，消毒5～10min，将样本组织再用生理盐水漂洗3次以去除抗生素和血细胞；

3)细胞分离：

G、刮掉样品中皮肤的皮下组织及血管，再将皮肤剪至2～5mm边长的方形，将每个方形组织块的表皮切除，组织去除表皮及皮下组织，留下真皮层后移入无菌器皿内，将组织切割成大小为0.5～1.5mm²的块；

H、组织酶解分离细胞：将大小为0.5～1.5mm²的真皮组织放入15mL离心管中，加入3mL复合胶原酶溶液中，在温度为37℃，转速为133rpm摇床孵育2h后取出在安全柜中吹打出细胞，然后用100μm细胞滤网过滤出组织块，进行取样计数及活率；

4)细胞培养

I、完全培养基配制：基础培养基为a-MEM，加入EGF 110～130ng/mL，胰岛素130～170ng/mL，转铁蛋白10～20μg/mL，抗坏血酸10～20μg/mL及体积百分含量为5％UltraGRO血清替代物；

J、细胞接种培养所得细胞悬液于1300rpm离心5min弃上清，利用完全培养基重悬至5×10⁴/mL，接种至6孔细胞培养板中，每孔2mL，72h后进行换液处理；

K、细胞传代及冻存

细胞每3天进行换液处理，换液时应用生理盐水对细胞皿底进行吹打洗涤，去除杂质，待细胞密度达70％，进行传代处理，经500μL 0.3×TrypLE Express消化3min后，用500μL基础培养基稀释吹打出间充质细胞以去除内皮类细胞，细胞离心后用步骤I的完全培养基重悬至3.75×10⁴/mL接种至T75培养瓶中，每瓶10mL，培养至P4-P5代进行无血清冻存；

三、含皮肤间充质干细胞生物分泌型富血小板凝胶制备

利用新鲜或冻存的DMSCs细胞及新鲜分离的PRP进行分泌型富血小板凝胶制备，用浓缩倍数为1.5～2倍的富血小板血浆按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀，将3M透气透明敷料加入到所需面积的平皿中，将含细胞的富血小板血浆重悬液平铺在3M透气透明敷料上，铺设厚度为2～5mm，利用注射器多点滴加的方式加入医用CaCl₂溶液，每毫升含细胞的富血小板血浆重悬液需加入300～500μL/mL医用CaCl₂溶液，在温度为37℃静置20min，即凝固为分泌型富血小板凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于复合胶原酶溶液为含质量百分含量为0.05～0.1％I型胶原酶和质量百分含量为0.03～0.05％IV胶原酶的a-MEM溶液。

3.根据权利要求1所述的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于储存液浓度分别为：万古霉素0.1g/mL，盐酸环丙沙星20mg/mL，头孢噻肟钠0.2g/mL，庆大霉素4000U/mL，两性霉素B 20mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于复合抗生素的洗涤液50mL中含有万古霉素5μL，环丙沙星25μL，头孢噻肟钠125μL，庆大霉素75μL，两性霉素B 25μL。

5.根据权利要求1所述的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于皮肤间充质干细胞基础培养基为a-MEM，加入EGF 120ng/mL，胰岛素150ng/mL，转铁蛋白15μg/mL，抗坏血酸15μg/mL及体积百分含量为5％UltraGRO血清替代物。

6.根据权利要求1所述的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于用浓缩倍数为1.8～2倍的富血小板血浆按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀。

7.根据权利要求1所述的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于富血小板血浆按1×10⁶/mL细胞密度进行重悬混匀，将3M透气透明敷料加入到所需面积的平皿中，将含细胞的富血小板血浆重悬液平铺在3M透气透明敷料上，铺设厚度为3～5mm。

8.根据权利要求1所述的一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于利用注射器多点滴加的方式加入医用CaCl₂溶液，每毫升含细胞的富血小板血浆重悬液需加入400～500μL/mL医用CaCl₂溶液。