CN108623696A

CN108623696A - 一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法

Info

Publication number: CN108623696A
Application number: CN201810358946.3A
Authority: CN
Inventors: 吴志猛; 周志昉; 赵恺
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN108623696B

Abstract

本发明公开了一种利用纤维素固定化CBD‑EndoS融合酶的方法，属于固定化酶技术领域。本发明利用CBD‑EndoS的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上，不同于传统固定化酶“先纯化后固定”，实现了一步固定纯化，将粗酶中的CBD‑EndoS蛋白固定在纤维素载体上，操作简单，方便快速，大大简化了固定化步骤。应用本发明的方法制备的固定化酶反复使用5次后，酶活仍保持在初始酶活88％以上；固定化酶于4℃条件下保存30天后，酶活仍保持在初始酶活90％以上。本发明有望实现工业化，有助于EndoS酶在抗体修饰研究领域的广泛应用。

Description

一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法

技术领域

本发明涉及一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法，属于固定化酶技术领域。

背景技术

EndoS是一种来源于化脓链球菌的糖苷内切酶，可以高度特异性地水解抗体Fc结构域上的N糖链。因为抗体连接了先天免疫和适应性免疫，是许多人类免疫反应的中心因素，所以分析和调控EndoS的酶活性会对生物医学的众多领域产生影响。临床上，EndoS增强了化脓性链球菌逃避人类免疫反应的能力，因此Endo-S抑制剂能够用于改善炎症患者的症状。在治疗上，EndoS已经在动物模型中显示出巨大的治疗潜力，可以用于依赖自身抗体的多种自身免疫疾病的治疗；微调EndoS的特异性和活性是将其作为人类蛋白质治疗剂进一步发展的重要研究方向。在生物技术上，EndoS是一种独特的糖蛋白修饰酶，具有除去抗体上糖链的功能，而其突变体具有将糖链连接到抗体上的功能；利用EndoS及其突变体将均一的糖链连接到抗体上，产生均一糖基化抗体库，其对于发挥工程化抗体的全部潜力是至关重要的。

目前EndoS的菌体表达量较低，无法满足未来大规模的抗体修饰研究的需要。酶的固定化是一种将酶限制在一定的载体上，可以连续催化合成产物，并且在反应结束后可以回收和再利用的技术。因此发展EndoS酶的固定化技术及其应用，有助于实现EndoS酶在抗体研究领域的广泛应用。

纤维素是蛋白质固定化的理想载体，因为其具有低成本，惰性，稳定的优点，并且容易以不同形式获得。有研究表明，异源蛋白质融合纤维素结合域(CBD)后形成杂交蛋白质，其具有活性且能够和纤维素结合。因此，通过纤维素结合域将融合蛋白吸附到纤维素上可以作为一种简便的酶固定化技术。另一方面，纤维素载体及其标签还具有一步实现蛋白纯化和固定化的潜力。(参考文献Barbosa O,Ortiz C,Berenguer-Murciaetal.Strategies for the one-step immobilization–purification of enzymes asindustrial biocatalysts[J].Biotechnology advances,2015,33(5):435-456.)

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有纤维素结合活性和糖苷内切活性的双功能融合蛋白CBD-EndoS，含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供含有SEQ ID NO.2所示CBD序列的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pET系列载体，如pET34b(+)、pET35b(+)等。

在本发明的一种实施方式中，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供表达所述双功能融合蛋白CBD-EndoS的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为重组大肠杆菌细胞，所述重组大肠杆菌是用所述的表达载体构建的重组质粒pCBD-EndoS转化至E.Coli BL21的重组细胞。

本发明的第四个目的是提供所述双功能融合蛋白CBD-EndoS的构建方法，所述方法是将糖苷内切酶(EndoS)基因片段，定向克隆至含有纤维素结合域(CBD)的pET系列载体，构建具有纤维素结合活性和糖苷内切活性的双功能融合蛋白CBD-EndoS的载体，并转入E.Coli BL21感受态菌株，经IPTG低温诱导，获得高含量的CBD-EndoS融合蛋白。

本发明的第五个目的是提供一种酶的固定化方法，所述方法是以纤维素微球作为固定化载体，利用SEQ ID NO.2所示的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上。

在本发明的一种实施方式中，所述纤维素微球包括type 20(particle size:20μm)、type50(particle size:50μm)、type101(form:fibers)。

在本发明的一种实施方式中，所述融合蛋白包括具有糖苷键催化性质的酶。

在本发明的一种实施方式中，所述融合蛋白为CBD-EndoS，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所融合的糖苷内切酶包括但不限于性质和功能与EndoS，EndoH相似或相同的酶。

在本发明的一种实施方式中，所述固定是将纤维素微球直接与重组菌株pCBD-EndoS/E.Coli BL21的发酵粗酶液混合，室温下或4℃振荡反应半小时，将融合蛋白CBD-EndoS固定在纤维素微球上；再将纤维素微球用KPB缓冲液清洗后即可用于抗体修饰反应，反应后用KPB缓冲液清洗后可以长期保存或重复利用。

在本发明的一种实施方式中，所述固定是在≥100mM NaCl、20～100mM K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液中，pH 4.5～8.0的溶液中，4～30℃固定至少20min。

在本发明的一种实施方式中，所述固定是将纤维素微球放入KPB缓冲液预处理5～15min，离心弃上清，加入粗酶液，4～30℃振荡至少20min，即可将CBD-EndoS固定在纤维素载体上。

在本发明的一种实施方式中，所述KPB缓冲液含有≥100mM NaCl、20～100mMK₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 4.5～8.0。

本发明还要求保护所述固定化酶在食品、生物、医药、化工领域中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括在同一个反应体系内进行一步或多步修饰抗体。

本发明的优点和有益效果：本发明利用CBD-EndoS的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上，不同于传统固定化酶“先纯化后固定”，实现了一步固定纯化，将粗酶中的CBD-EndoS蛋白固定在纤维素载体上，操作简单，方便快速，大大简化了固定化步骤。优化后的固定化体系为：100mM NaCl，50mM KPB，pH 6.0，20℃，30min，在此条件下CBD-EndoS蛋白结合量为21mg/g cellulose。CBD融合表达的固定化方法可以保持酶的构型，保证酶的动力学性能和酶的稳定性。固定化酶反复使用5次后，酶活仍保持在初始酶活88％以上；固定化酶于4℃条件下保存30天后，酶活仍保持在初始酶活90％以上。同时，纤维素载体具有成本低，高度特异性等优点，降低了生产成本。本发明有望实现工业化，有助于EndoS酶在抗体修饰研究领域的广泛应用。

附图说明

图1是固定化CBD-EndoS凝胶电泳分析图，各泳道分别为：M：标准分子量蛋白；1：CBD-EndoS破壁粗酶液；2：纤维素固定化CBD-EndoS后剩余；3：6M尿素洗脱纤维素载体。

图2为固定化CBD-EndoS水解SGP高效液相色谱图；

图3是固定化CBD-EndoS水解利妥昔单抗凝胶电泳图，各泳道分别为：M：标准分子量蛋白；1：利妥昔单抗样品；2：固定化CBD-EndoS水解60min；

图4为固定化CBD-EndoS的重复使用性检测结果；

图5为固定化CBD-EndoS的稳定性检测结果；

图6是不同纤维素载体固定化CBD-EndoS凝胶电泳图，个泳道分别为M：标准分子量蛋白；1：CBD-EndoS破壁粗酶液；2：Sigmacell Cellulose(Sigma)固定化CBD-EndoS；3：α-Cellulose(aladdin)固定化CBD-EndoS；4：Cellulose,Microcrystalline(SangonBiotech)固定化CBD-EndoS；

图7为时间对纤维素载体吸附CBD-EndoS蛋白的影响；

图8为温度对纤维素载体吸附CBD-EndoS蛋白的影响；

图9为NaCl浓度对纤维素载体吸附CBD-EndoS蛋白的影响；

图10为pH对纤维素载体吸附CBD-EndoS蛋白的影响。

具体实施方式

实施例1融合酶CBD-EndoS的构建与表达

以SEQ ID NO.3所示的pET28a-EndoS质粒为模板，通过引物F1、R1，PCR扩增得到EndoS基因。

F1：GGTACAGCACCAATGGAAGAGAAGACAGTTCAGGTTCAG；

R1：GATCCTCAGTGGTGGTGATGATGATGTTTCTTCAGCAGCTGGCG；

以实验室保藏的pET35b质粒为模板，通过引物F2、R2，PCR扩增得到pET35b载体。

F2：GAAACATCATCATCACCACCACTGAGGATCCGAATTCGAGCTC；

R2：AACTGTCTTCTCTTCCATTGGTGCTGTACCAAGAACTT；

由于pET28a-EndoS扩增引物和pET35b-CBD扩增引物包含反向互补序列，因此扩增得到的Endo-S基因和pET-35b载体存在同源互补片段。通过T4DNA聚合酶酶切处理EndoS基因和pET-35b载体形成粘性末端，连接后得到重组质粒pET35b-CBD-EndoS。将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态，测序正确后保藏菌株。

将构建所得E.coli BL21pET35b-CBD-EndoS菌株于TB培养基中37℃振荡培养至OD0.6-0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，低温诱导24小时。离心收集菌体，用KPB缓冲液重悬，研磨仪破壁处理10min，离心收集上清，即为粗酶液。粗酶液磁珠纯化后得到约40mg/LCBD-EndoS蛋白。

若将菌株于优化培养基()中发酵，培养及诱导条件同TB培养基，粗酶液磁珠纯化后得到约70mg/L CBD-EndoS蛋白。

实施例2融合酶CBD-EndoS的固定化

将纤维素微球(Sigma cell Cellulose，type50)放入KPB缓冲液预处理10min，离心弃上清，加入粗酶液，室温或4℃振荡半小时，即可将CBD-EndoS固定在纤维素载体上。

为了检验纤维素载体的吸附特性，用6M咪唑将纤维素上结合的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图1。

实施例3固定化CBD-EndoS的酶活检测

将已经结合上CBD-EndoS的纤维素载体保存在KPB缓冲液中，置于4℃冰箱。使用时将其取出，离心弃上清，加入反应缓冲液和底物，即可用于水解抗体。本发明以两种具有代表性的水解底物(唾液酸糖肽和利妥昔单抗)为例，检测其酶活。

(1)唾液酸糖肽(SGP)

反应条件：37℃，1h

反应体系：SGP 2mg/mL

固定化CBD-EndoS 1.5mg/mL

PBS Buffer 100mM,pH 6.0

反应结束后取样，通过高效液相色谱法(HPLC)定性检测酶活，结果如图2。结果表明，此反应条件下，90％以上SGP被固定化CBD-EndoS酶水解。

(2)利妥昔单抗(Rituximab)

反应条件：37℃，60min

反应体系：美罗华 10mg/mL

固定化CBD-EndoS 15μg/mL

PBS Buffer 100mM,pH 7.4

反应结束后取样，通过SDS-PAGE凝胶电泳法定性检测酶活，利妥昔单抗重链(50KDa)上糖链被水解后分子量减少1KDa，结果如图3。结果表明，此反应条件下，利妥昔单抗重链上糖链被固定化CBD-EndoS酶完全水解。

实施例4固定化CBD-EndoS的重复使用性检测

将实施例3制备获得的固定化酶用于水解唾液酸糖肽(SGP)，反复使用5次后，分别测定酶活，结果如图4。结果表明，固定化酶反复使用5次后，酶活仍保持在初始酶活88％以上。

实施例5固定化CBD-EndoS的稳定性检测

将实施例3制备获得的固定化酶保存于4℃冰箱，分别在第1/5/10/15/20/30天取样用于水解唾液酸糖肽(SGP)，测定酶活，结果如图5。结果表明，固定化酶于4℃条件下保存30天后，酶活仍保持在初始酶活90％以上。

对照例1

具体实施方式同实施例1，区别在于采用其它方式连接，例如通过His标签连接到琼脂糖颗粒上，每克琼脂糖颗粒结合11.2mg的EndoS酶，而本申请连接方式，每克纤维素能够结合20mg的CBD-EndoS酶，比琼脂糖颗粒连接方式的酶的负载量高。

对照例2

具体实施方式同实施例2，区别在于固定化载体分别替换为Cellulose,Microcrystalline(Sangon Biotech)或α-Cellulose(aladdin)，结果如图6。结果表明，Cellulose吸附的杂蛋白少，对于CBD-EndoS的特异性吸附效果最佳。

对照例3

具体实施方式同实施例2，区别在于固定化时间、温度、NaCl浓度、pH。

(1)时间对酶固定化的影响

分别在(0min，5min，10min，20min，30min，60min，120min)取样监测固定化进程。结果如图7所示，微晶纤维素在30min时结合酶量达到饱和状态的88％，考虑到结合效率，选择30min为固定化体系优化时间。

(2)温度对酶固定化的影响

温度从热力学角度影响微晶纤维素结合CBD-EndoS蛋白，且温度过高会使造成酶活损失，因此选择在(4℃，20℃，30℃)条件下检测微晶纤维素的蛋白结合量。结果如图8所示，微晶纤维素在不同温度下结合CBD-EndoS量无明显差别，考虑到未来工业化应用成本，选择20℃为固定化体系优化温度。

(3)NaCl浓度对酶固定化的影响

由于纤维素结合结构域(CBD)与纤维素结合方式为非共价结合，反应体系中NaCl浓度会影响微晶纤维素结合CBD-EndoS蛋白。控制固定化体系NaCl浓度分别为(0mM，50mM，100mM，250mM，500mM，1M)，检测微晶纤维素的蛋白结合量。结果如图9所示，在0～100mM浓度范围内，随着体系中NaCl浓度的增加，纤维素结合CBD-EndoS量明显增长；在100～500mM浓度范围内，纤维素结合酶量增长不明显。考虑到未来工业化应用成本，因此选择100mM NaCl为固定化体系优化浓度。

(4)pH对酶固定化的影响

固定化体系中pH会影响CBD-EndoS蛋白的空间构象，构象变化会影响纤维素载体与蛋白之间非共价键的形成，从而影响微晶纤维素结合CBD-EndoS蛋白量。控制固定化体系pH分别为(4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)，检测微晶纤维素的蛋白结合量。结果如图10所示，在pH 4.5-5.5之间，纤维素载体结合蛋白量达到最高值的98％～100％；在pH 6.0-7.0之间，蛋白量结合量为最高值的83％～86％；在pH 7.0-8.0之间，蛋白结合量相对稳定，均为最高值的83％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Lys Ser Ala Gln Thr Asn Ser

1 5 10 15

Ile Thr Pro Ile Ile Lys Ile Thr Asn Thr Ser Asp Ser Asp Leu Asn

20 25 30

Leu Asn Asp Val Lys Val Arg Tyr Tyr Tyr Thr Ser Asp Gly Thr Gln

35 40 45

Gly Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser

50 55 60

Tyr Val Asp Asn Thr Ser Lys Val Thr Ala Asn Phe Val Lys Glu Thr

65 70 75 80

Ala Ser Pro Thr Ser Thr Tyr Asp Thr Tyr Val Glu Phe Gly Phe Ala

85 90 95

Ser Gly Ala Ala Thr Leu Lys Lys Gly Gln Phe Ile Thr Ile Gln Gly

100 105 110

Arg Ile Thr Lys Ser Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Thr Asn Asp Tyr

115 120 125

Ser Phe Asp Ala Ser Ser Ser Thr Pro Val Val Asn Pro Lys Val Thr

130 135 140

Gly Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Val Leu Gly Thr Ala Pro Met Glu Glu

145 150 155 160

Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro Ser Ile Asp Ser Leu His

165 170 175

Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Lys Glu Glu Leu Ser Lys

180 185 190

Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Lys Ala Gln

195 200 205

Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Met Lys Ile Pro Glu

210 215 220

Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe

225 230 235 240

Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro Thr Glu Lys Asp Lys Val

245 250 255

Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val Asp Leu Ala Phe Ile Phe

260 265 270

His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe Trp Lys Glu Leu Ala Thr

275 280 285

Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly Thr Arg Val Ile Arg Thr

290 295 300

Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp Asn Ser Gly Ile Ala Glu

305 310 315 320

Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu Gly Asn Lys Ala Leu Ala

325 330 335

Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp Gly Leu

340 345 350

Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Glu

355 360 365

Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln Val Phe Glu Glu Ile Gly

370 375 380

Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys Ser Arg Leu Phe Ile Met

385 390 395 400

Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro Leu Ile Glu Arg Gly Ala

405 410 415

Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val Tyr Gly Ser Gln Gly Glu

420 425 430

Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg Pro Glu Lys Thr Met Glu

435 440 445

Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu Gln Tyr Met

450 455 460

Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gln Glu Gly Asn Leu Trp

465 470 475 480

Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp Lys Ala Asn Gly Ile Asn

485 490 495

Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg Tyr Ala Arg Trp Gln Pro

500 505 510

Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg

515 520 525

Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr Ala Lys Gln Lys Glu Phe

530 535 540

Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser Asp Tyr Ser Val Ser Lys

545 550 555 560

Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ile Asp

565 570 575

Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg Glu Ala Val Met Ala Gln

580 585 590

Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg Phe Asn Gly Thr Leu Arg

595 600 605

Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu Gly Leu Asn Lys Phe Lys

610 615 620

Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu Ser Arg Ile Thr Lys Leu

625 630 635 640

Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys Pro Gly Lys Asp Thr Leu

645 650 655

Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp Asn Lys Glu Glu Pro Ala

660 665 670

Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Gly Leu Thr Gly Leu Lys

675 680 685

Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu Thr Leu Ala Gly Leu Asp

690 695 700

Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val Asp Ile Ser Gly Asn Lys

705 710 715 720

Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg Gln Ile Phe Asp Thr Met

725 730 735

Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser Asn Glu Gln Thr Val Lys

740 745 750

Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr Pro Asp Thr Tyr Gly Lys

755 760 765

Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu Lys Val Asp Leu Gln Ser

770 775 780

Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln Gly Thr Leu Ile Asn Ser

785 790 795 800

Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His Lys Ile Ala Gly Arg Ser

805 810 815

Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn Phe Lys Val Ser Tyr Glu

820 825 830

Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr Leu Gly Thr Thr Thr Asp

835 840 845

Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr Tyr Lys Val Asp Phe Phe

850 855 860

Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His Thr Ala Lys Val Ile Val

865 870 875 880

Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu Ala Glu Gly Ala Thr Val

885 890 895

Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala Arg Lys Val Phe Asp Gly

900 905 910

Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser Leu Gly Trp Asp Ser Lys

915 920 925

Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp Gly Leu Ile Lys His Trp

930 935 940

Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro Glu Thr Thr Asn Lys Pro

945 950 955 960

Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Asn Leu

965 970 975

Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe Asp Asp Glu Lys Tyr Trp

980 985 990

Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly Glu Arg Ala Thr Ala Phe

995 1000 1005

Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys Tyr Trp Arg Val Val

1010 1015 1020

Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro Val Val Pro Glu

1025 1030 1035

Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp Thr Ile Met

1040 1045 1050

Lys Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys Asp Lys

1055 1060 1065

Phe Ser Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met Ala

1070 1075 1080

Leu Glu Thr Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile

1085 1090 1095

Asn Ala Asn Ala Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln

1100 1105 1110

Leu Leu Lys Lys His His His His His His

1115 1120

<210> 2

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtcagttg aattttacaa ctctaacaaa tcagcacaaa caaactcaat tacaccaata 60

atcaaaatta ctaacacatc tgacagtgat ttaaatttaa atgacgtaaa agttagatat 120

tattacacaa gtgatggtac acaaggacaa actttctggt gtgaccatgc tggtgcatta 180

ttaggaaata gctatgttga taacactagc aaagtgacag caaacttcgt taaagaaaca 240

gcaagcccaa catcaaccta tgatacatat gttgaatttg gatttgcaag cggagcagct 300

actcttaaaa aaggacaatt tataactatt caaggaagaa taacaaaatc agactggtca 360

aactacactc aaacaaatga ctattcattt gatgcaagta gttcaacacc agttgtaaat 420

ccaaaagtta caggatatat aggtggagct aaagttcttg gtacagcacc a 471

<210> 3

<211> 8177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tcctcagtgg tggtgatgat gatgtttctt cagcagctgg 240

cgcttttcaa tacagtcttt cagaacgcct gcattggcgt tgatggctgt cacatcaaaa 300

attttgctat tcagacttgt ttccagtgcc atttctttga ttttcagttc atccagcatt 360

ttctggctaa acttatcctt ctgctgactc agttctttgg cggtggtcac ggtcttcata 420

atggtgtctg cgttcggcag cgggtagccc aggatttgta attccggaac caccgggcta 480

ctatagcggt cgccttttgt gtcgaacacc acgcgccaat atttgctggt gatattattc 540

agtgtgttac taaaggctgt tgcgcgctcg ccctgggcac tataggtatc cacggtaatc 600

cagtacttct catcatcgaa tttgttcgga ttttccagta aattgtccag gttgtagtcc 660

ttaatattga agatctgcag actcgcctct tggatcggct tgttggttgt ttcagggtta 720

cgggcgctgt cattgaaaaa gcgccagtgc ttgattaaac catcttcctt cagtttaaag 780

ataatgctct gcttgctatc ccaacccagg ctaatgttgt ctgtttcact gcccagctga 840

ccatcaaaca ccttacgggc attcacagga tcggcactgc caccgatcac tgtggcgccc 900

tcggctaaat tcaccatcat ggttttttcg tcacccacaa taactttggc ggtgtgcact 960

gctttggttt tgtcggccgg gctaaagaag tccactttgt atgtctcctc tttatcggtg 1020

gccagtgttt tatcggttgt ggtacccagt gtgctatcgg tcactttaac cgtgtagttt 1080

tcatagctca ccttgaaatt gttgtagtga tagttgctat ccacaaagct acggccggcg 1140

atcttatgat tctggtatgc tttatagtct gcttcactat tgatcagggt accctggttg 1200

gtaacggtac cgaacagcag ctggctctgc agatccactt tttcgttggc cacaggcagg 1260

cgcaggcttg ttttgccgta ggtgtccgga tagtggccgg tcggcttctg tttgtcaaat 1320

ttcacggtct gttcattgct gccaacatga ttgctgatgg tgctcagcat ggtgtcgaag 1380

atctggcggt tctcggtgcc cggtgccagg tccagtttat tgccgctgat gtcaactttt 1440

tctaaacttg ttaatgtggc tgcatccaga cctgccaggg tttcacggtc gaaaccgctc 1500

aggtccagtt ccttcagacc ggtcaggccg ctcactttca ggctaacagg cggaatggtt 1560

gcaggctctt ctttattgtc ttttttatag gtttccagca cggtttccag tgtgtctttg 1620

cccggcttca tgtttgcagg cagcacgcta cggtccagct ttgtgatgcg gctcagaccg 1680

atcagatcca gctgggccag ctttttaaat ttattcaggc cttccagact ctgaatggcc 1740

ggattatcca ggcgcagtgt accattgaag cgttccaggt cgcctttacg ggtgccaacc 1800

tgggccataa ctgcttcgcg cagggccttg tccggaaagt ctttttcatc aatcagatca 1860

tagcttttgt ccttcagcat aactgtcttc agggccttgc taacgctata gtcgctatgg 1920

aagatgttgt ctgtggcgtc cttaaactcc ttctgtttgg catatttctt cggctgatgg 1980

gccacgccat cacggtcgat tgcgtagctg aagataccgc ctttcacgcc acctgtcttc 2040

ggttgccaac gtgcatagcg ttcggcgcgt gtgccggtaa tatctgtatt aatgccattt 2100

gccttgtctt catccttgcg gctgttgata tcataccaca ggttgccttc ctgggcgttt 2160

tcctcataga agctgaagcc aatcatgtac tgctccgggc ggatgtactt gctataaccc 2220

tgccaacgtt cctccatggt cttctccggg cggttgctaa ccggttccca accgcccttt 2280

tcaccctgac tgccgtacac ctgaactaac agcaggttaa tgtaaggggc gccacgttcg 2340

attaacggat tcttgtcggc catgtaggtg ctatccatga tgaacaggcg gctcttgtca 2400

acgcctttcg gaccgatcag cttgccgatt tcctcaaaaa cctggatgct gcgttcaacg 2460

ccggcggtgt cttctttttt gtccactttc ggaatgctat cgtgttccac gtcaacgtcc 2520

aggccatcca ggttgtactt gtacacgtac tcgtcaacaa tggctttggc cagtgcctta 2580

ttgccctccg gggtgttagg atacttgctg gtatcttcgg caataccgct gttatcgccg 2640

ccggccagga aacgccaagg aattgtgcga atcacacggg tgccctgctt gtttaatttc 2700

ggaacgtgtt ttgtggctaa ttctttccag aacagactgt aatccttggt ccagtcgtgg 2760

aagatgaagg ccagatccac ctctttcggc agttcaccca tgctattcac cttgtctttc 2820

tcggtcgggt cgctggtttt gtcatgccag gtgcgaaaat agccaccata cagcgggccg 2880

tgtaacggtt tcatcggaat cttctccggg atcttcatct tggctaattc ctgtgcctgt 2940

ttatcggcct gctgggcttt tgccagaatc tccttaactt tctggctttc ctgacctgcc 3000

ttactcagtt cctctttgaa ttctttcttg ctattctcac ttaagtaatg cagactgtcg 3060

atgctcggca ggcccttctg aacctgaact gtcttctctt cgcccatggt atatctcctt 3120

cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg ggaattgtta tccgctcaca attcccctat 3180

agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atctcgatcc tctacgccgg acgcatcgtg 3240

gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat 3300

ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg 3360

gcaggccccg tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg 3420

gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat 3480

aagggagagc gtcgagatcc cggacaccat cgaatggcgc aaaacctttc gcggtatggc 3540

atgatagcgc ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata 3600

cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc 3660

cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta 3720

cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc 3780

cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc 3840

cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg 3900

taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc 3960

gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt 4020

tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac 4080

gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg 4140

cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg 4200

caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca 4260

acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga 4320

tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga 4380

tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac 4440

caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact 4500

ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa 4560

aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 4620

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 4680

taagttagct cactcattag gcaccgggat ctcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc 4740

cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct 4800

tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt ttcggcgagg 4860

accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc ggaatcttgc 4920

acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc gagaagcagg 4980

ccattatcgc cggcatggcg gccccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga 5040

cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg atacgcgagc 5100

gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct 5160

tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc accattatgt 5220

tccggatctg catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa 5280

cgaagcgctg gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc cataccgcca 5340

gttgtttacc ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg 5400

tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat cccccttaca 5460

cggaggcatc agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa 5520

gccagacatt aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa caggcagaca 5580

tctgtgaatc gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc gcgcgtttcg 5640

gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt 5700

aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc 5760

ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc 5820

ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga 5880

tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 5940

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 6000

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 6060

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 6120

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 6180

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 6240

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 6300

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 6360

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 6420

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 6480

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 6540

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 6600

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 6660

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 6720

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat 6780

aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctctaggcc 6840

gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt 6900

cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt 6960

tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa 7020

ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga 7080

tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata 7140

tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc 7200

gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca 7260

atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg 7320

gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt 7380

cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg 7440

ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg 7500

gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat 7560

tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaaga 7620

attaattcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 7680

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat 7740

tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa 7800

tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca 7860

agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg 7920

gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta 7980

aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg 8040

cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa 8100

gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg 8160

gcgcgtccca ttcgcca 8177

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtacagcac caatggaaga gaagacagtt caggttcag 39

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatcctcagt ggtggtgatg atgatgtttc ttcagcagct ggcg 44

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaaacatcat catcaccacc actgaggatc cgaattcgag ctc 43

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aactgtcttc tcttccattg gtgctgtacc aagaactt 38

Claims

1.一种双功能融合蛋白，其特征在于，具有纤维素结合活性和糖苷内切活性，并含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.含有编码权利要求1所述双功能融合蛋白的基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，包括pET系列载体。

4.表达权利要求1所述双功能融合蛋白的细胞。

5.一种构建权利要求1所述双功能融合蛋白的方法，其特征在于，将编码糖苷内切酶的基因片段，定向克隆至含有纤维素结合域的pET系列载体，构建具有纤维素结合活性和糖苷内切活性的双功能融合蛋白CBD-EndoS的载体，并转入细胞中，培养细胞，收集细胞产生的双功能融合蛋白。

6.一种酶的固定化方法，其特征在于，以纤维素微球作为固定化载体，利用SEQ IDNO.2所示的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白包括具有糖苷键催化性质的酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固定是将纤维素微球放入KPB缓冲液预处理5～15min，离心弃上清，加入粗酶液，4～30℃振荡至少20min。

9.应用权利要求6～8任一所述方法制备的固定化酶。

10.权利要求9所述的固定化酶在食品、生物、医药、化工领域中的应用。