CN108567955A

CN108567955A - 一种防治糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN108567955A
Application number: CN201810188020.4A
Authority: CN
Inventors: 赖先荣; 曾勇; 范刚
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2018-09-25

Abstract

本发明公开了一种防治糖尿病肾病的药物组合物，其特征是：它是由下述重量配比的原料药制备而成：姜黄1～15份、小檗皮1～8份、余甘子1～15份、蒺藜1～8份。本发明通过观察四味姜黄汤不同配伍剂量对糖尿病肾病大鼠的药效结果并结合主成分分析法挖掘能够有效干预早期糖尿病肾病的四味姜黄汤最佳量效配伍，促进其临床应用及新药开发。

Description

一种防治糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种防治糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法，属于医药领域。

背景技术

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，是糖尿病最常见的慢性并发症之一，也是导致终末期肾衰竭的主要原因。因此，DN早期的防治尤为重要。DN属于藏医学的“京尼萨库”病(汉译：尿频症)的范畴，“京尼”意为尿频，“萨库”意为消耗体能的混浊之液，即小便频繁、尿液混浊、消耗体能是该病的本质特征。具体治法用“勇哇西汤”(小檗皮、姜黄、余甘子、蒺藜四味藏药组方，即现代制剂“四味姜黄汤散”的处方来源)煎汤内服，四味姜黄汤主治之证，属于藏医学中尿频症范畴。

但是藏医药经典著作《四部医典》中仅记载了该处方各药味的名称，“有药无量”，没有记载具体药物的剂量，后世藏药药品标准中收载的处方剂量也有差异，因此需要进一步研究用于糖尿病肾病的处方剂量及其作用机制，以利于指导藏医临床用药。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法。

本发明提供了一种防治糖尿病肾病的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成：姜黄1～15份、小檗皮1～8份、余甘子1～15份、蒺藜1～8份。

优选的，它是由下述重量配比的原料药制备而成：姜黄1～2份、小檗皮3～7份、余甘子1～7份、蒺藜2～8份。

进优选的，它是由下述重量配比的原料药制备而成：姜黄3份、小檗皮10份、余甘子3份、蒺藜6份。

进一步地，它是由各重量配比原料药的原生药粉、水或有机溶剂的提取物，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述的制剂为口服制剂。

进一步地，所述的制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、汤剂或合剂。

本发明提供了一种所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：取各重量配比的原料药，直接打粉，或者加入水或有机溶剂提取，再加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，即得。

进一步地，所述的水提方法为：取各重量配比的原料药，加水提取三次，第一次加水12倍量，浸泡1小时，煎煮1小时，滤过，加水再煎煮2次，每次加水10倍量，每次1小时，合并滤液，浓缩，即得。

本发明提供了所述药物组合物在制备治疗和/或预防糖尿病肾病的药物中的用途。

本发明提供了一种所述药物组合物的质量控制方法，所述方法测定没食子酸，鞣花酸，木兰花碱，盐酸小檗碱，盐酸药根碱，盐酸巴马汀和姜黄素7种成分的含量。

进一步地，所述成分的含量为：没食子酸30.64mg·g^-1，鞣花酸48.60mg·g^-1，木兰花碱49.32mg·g^-1，盐酸小檗碱39.47mg·g^-1，盐酸药根碱42.24mg·g^-1，盐酸巴马汀47.66mg·g^-1，姜黄素62.73mg·g^-1。

本发明提供了一种所述药物组合物的高效液相检测方法，色谱条件为：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液。

进一步地，所述的固定相为Capcell Pak C18-MGⅡ色谱柱；色谱柱规格：柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。

进一步地，流速为0.8mL·min-1。

进一步地，进样量10μL。

进一步地，柱温30℃。

进一步地，0～60min检测波长为270nm，60～70min检测波长为430nm。

进一步地，流动相梯度洗脱条件为：0→8min，3％→3％A；8→15min，3％→17％A；15→20min，17％→17％A；20→33min，17％→20％A；33→38min，20％→25％A；38→48min，25％→25％A；48→70min，25％A～80％A。

糖尿病肾病是糖尿病慢性微血管并发症之一，泛指糖尿病导致的肾小球病变：肾小球毛细血管基底膜增厚、系膜扩张，细胞外基质增加，进展期可出现弥漫性肾小球硬化等病理改变，导致临床出现蛋白尿，渐进性肾功能损害，高血压，水肿，晚期出现严重肾功能衰竭。DN属于藏医学的“京尼萨库”病(汉译：尿频症)的范畴，而四味姜黄汤主治之证，属于藏医学中尿频症(糖尿病、京尼萨库病)范畴，全方由姜黄、小檗皮、余甘子和蒺藜四味药组成。方中姜黄，味辛、苦，性温，治毒病、尿频，制赤巴增盛之热邪，作为君药；小檗皮，味苦、涩，性凉，解毒，清肾热，配合姜黄除赤巴增盛之热，作为臣药；蒺藜，味甘、涩，性温，养肾，治肾病，辅助君药利尿通淋，作为将药；余甘子，味甘、酸、涩，性凉，和合三因，调和诸药，作为马药(药引)。

本发明通过观察四味姜黄汤不同配伍剂量对糖尿病肾病大鼠的药效结果并结合主成分分析(principal components analysis，PCA)法及多元逐步回归分析，挖掘能够有效干预早期糖尿病肾病的四味姜黄汤最佳药效配伍，促进其临床应用及新药开发。

本发明通过观察四味姜黄汤不同配伍剂量对糖尿病肾病大鼠的药效结果并结合主成分分析法挖掘能够有效干预早期糖尿病肾病的四味姜黄汤最佳量效配伍，促进其临床应用及新药开发。特别地，本发明计量配比为姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝3：10：3：6的各项指标更为接近空白组，而更为远离模型组，说明本发明中姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝3：10：3：6的计量配比对DN的各项指标的改善最显著，接近于空白组。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为四味姜黄汤散供试品(A)高效液相色谱图，1.没食子酸；2.木兰花碱；3.鞣花酸；4.盐酸药根碱；5.盐酸巴马汀；6.盐酸小檗碱；7.姜黄素。

图2为混合对照品(B)高效液相色谱图，1.没食子酸；2.木兰花碱；3.鞣花酸；4.盐酸药根碱；5.盐酸巴马汀；6.盐酸小檗碱；7.姜黄素。

图3为透射电镜观察四味姜黄方对DN大鼠肾脏病理形态学的影响(×15000)。

图4为四味姜黄汤8个不同配伍剂量对DN大鼠药效学指标的主成分分析-得分图；

图5为四味姜黄汤8个不同配伍剂量对DN大鼠药效学指标的主成分分析-载荷图。

图6为四味姜黄汤8个不同配伍剂量对DN大鼠药效学指标的主成分分析-聚类图。

图7为四味姜黄汤优化配比对db/db小鼠药效学指标的主成分分析-得分图。

图8为四味姜黄汤优化配比对db/db小鼠药效学指标的偏最小二乘分析图。

图9为四味姜黄汤优化配比对db/db小鼠药效学指标的分层聚类分析图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明药物组合物的制备

1、提取工艺

处方：姜黄3份、小檗皮10份、余甘子3份、蒺藜6份。

以上四味，加水提取三次，第一次加水12倍量，浸泡1小时，煎煮1小时，滤过，药渣加水再煎煮2次，每次加水10倍量，每次1小时，合并滤液，浓缩至所需的浓度。

2、质量控制

HPLC测定藏药四味姜黄汤散中没食子酸，鞣花酸，木兰花碱，盐酸小檗碱，盐酸药根碱，盐酸巴马汀和姜黄素7种成分的方法：

采用Capcell Pak C18-MGⅡ(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，流动相A为乙腈、流动相B为0.1％磷酸水溶液；流速0.8mL·min-1；进样量10μL；柱温30℃；检测波长为270nm(0～60min)和430nm(60～70min，姜黄素)；梯度洗脱。7种成分的含量分别为30.64mg·g^-1、48.60mg·g^-1、49.32mg·g^-1、39.47mg·g^-1、42.24mg·g^-1、47.66mg·g^-1和62.73mg·g^-1。

该方法专属性强，结果准确可靠，可作为四味姜黄汤散的质量控制方法。

实施例2本发明药物组合物的制备

1、提取工艺

处方：姜黄3份、小檗皮6份、余甘子3份、蒺藜6份。

2、质量控制

同实施例1。

实施例3HPLC法测定藏药四味姜黄汤散中7种成分的含量

1、材料与仪器

1.1仪器

HPLC色谱仪(Agilent 1260型，配备在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱，美国安捷伦公司)；

色谱柱：Capcell Pak C₁₈-MGⅡ(4.6mm×250mm，5μm,日本资生堂公司)；优普纯水制造系统(型号：UPH-I-10T，成都超纯科技有限公司)。

血糖仪(ACCCU-CHEK Performa)(罗氏卓越型，配套血糖试纸及一次性采血针，罗氏诊断产品(上海)有限公司生产)；

全波长多功能读数仪(VARIOSKAN FLASH 2.4.3，美国Thermo公司)；

恒温培养振荡器(ZHWY-100H，上海智城分析仪器制造有限公司)；透

射电镜(H-600IV，日本日立公司)。

1.2药品与试剂姜黄为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎，余甘子为大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实，蒺藜为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，以上3味药材均购自成都市国际商贸城药材市场，经成都中医药大学赖先荣副研究员检验，符合《中国药典》2015年版(一部)正文项下有关规定。

小檗皮，产地西藏，由西藏甘露藏药厂提供，经成都中医药大学范刚副研究员DNA条形码鉴定其品种，为藏医临床使用的小檗科植物刺红珠Berberis dictyophyllaFranch.的干燥茎中皮层，符合六省区藏药标准小檗皮药材项下的有关规定。

含量测定用四味姜黄汤散样品，由成都中医药大学民族医药学院提供，按中华人民共和国卫生部药品标准(藏药第一册，1995年版)该品种项下制法配制，姜黄15g、小檗皮12.5g、余甘子25g、蒺藜25g。

没食子酸对照品(批号110831-201204)、盐酸药根碱对照品(批号110733-201108)、盐酸巴马汀对照品(批号110732-201309)、盐酸小檗碱对照品(批号110713-201212)和姜黄素对照品(批号110823-201004)由中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用；

木兰花碱对照品(CAS:2141-09-5，99.77％)和鞣花酸对照品(CAS:476-66-4，MF:C14H608，99.65％)由四川赛因斯特生物科技有限公司提供；

磷酸，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

盐酸二甲双胍(批号20160120，贵州圣济堂制药有限公司)，在使用时用双蒸水配成20mg/mL的溶液；

STZ(批号S-0130，Sigma公司)；

血尿素氮试剂盒(批号20161111)、血肌酐试剂盒(批号20160803)、血尿酸试剂盒(批号20161118)及血清总蛋白定量试剂盒(批号20161115)均购自南京建成生物科技有限公司；

TGF-β1试剂盒(批号21F305)和VEGF试剂盒(批号21F322)购自依科赛生物科技(太仓)有限公司。

2、方法与结果

2.1HPLC法测定藏药四味姜黄汤散中7种成分的含量

2.1.1色谱条件

Capcell Pak C₁₈-MGⅡ(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(见表1)；检测波长为270nm(0～60min)和430nm(60～70min，姜黄素)；流速0.8mL/min；进样量10μL；柱温30℃。其中理论塔板数按没食子酸，盐酸小檗碱和姜黄素峰计算应不低于2000，5000和4000。

表1四味姜黄汤散HPLC梯度洗脱条件

T/min	A乙腈(％)	B 0.1％磷酸溶液(％)
			0	3	97
8	3	97
			15	17	83
20	17	83
			33	19	81
38	25	75
			48	25	75
70	80	20

2.1.2对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定，于容量瓶中，加90％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得没食子酸1.2480mg/mL、木兰花碱1.4200mg/mL、鞣花酸0.3780mg/mL、盐酸药根碱0.1180mg/mL、盐酸巴马汀0.0799mg/mL、盐酸小檗碱0.4908mg/mL和姜黄素0.3020mg/mL对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液1mL，放入同一10mL容量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸124.80μg/mL、木兰花碱142.00μg/mL、鞣花酸37.80μg/mL、盐酸药根碱11.80μg/mL、盐酸巴马汀7.99μg/mL、盐酸小檗碱49.08μg/mL、姜黄素30.20μg/mL的混合对照品溶液，避光冷藏备用。

2.1.3供试品溶液制备

按处方比例精密称定四味姜黄汤散供试品0.5g，置具塞锥形瓶中，加入盐酸90％甲醇溶液(2:100，v/v)50mL，摇匀，称重，超声20min，冷却再称重，用同一溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

将供试品溶液，混合对照品溶液分别按实施例3“2.1.1”项下色谱条件，进样10μL。结果显示，供试品色谱呈现与(混合)对照品色谱保留时间相应的色谱峰。如图1和图2所示所示。

2.1.4含量测定

按处方比例取实验室自制四味姜黄汤散供试品0.5g，各3份，精密称定，按实施例3“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备，照实施例3“2.1.1”项下色谱条件测定，计算含量，见表2。

表2四味姜黄汤散含量测定结果(n＝3)

	样品1	样品2	样品3	平均值
					成分	/(mg.g-1)	/(mg.g-1)	/(mg.g-1)	/(mg.g-1)
没食子酸	7.6496	7.6263	7.6687	7.6482
					木兰花碱	13.7959	13.8347	13.7767	13.8024
鞣花酸	3.7465	3.7116	3.7289	3.7290
					盐酸药根碱	0.9291	0.9442	0.9215	0.9316
盐酸巴马汀	0.6750	0.6848	0.6769	0.6789
					盐酸小檗碱	4.6855	4.6797	4.6688	4.6780
姜黄素	3.7720	3.7939	3.8010	3.7890

结果测得四味姜黄汤散中没食子酸、木兰花碱、鞣花酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和姜黄素的含量分别为7.6482mg/g、13.8024mg/g、3.7290mg/g、0.9316mg/g、0.6789mg/g、4.6780mg/g和3.7890mg/g。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1原料药用量配比对治疗糖尿病肾病作用的影响

1材料

1.1动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量220～250g，由成都达硕实验动物有限公司中心提供，生产许可证号：SCXK(川)2015～030。

1.2药品与试剂

四味姜黄汤由姜黄、小檗皮、余甘子、蒺藜四味药组成，姜黄、余甘子、蒺藜3味药材均购自成都市国际商贸城药材市场，经成都中医药大学赖先荣副研究员鉴定，符合《中国药典》2015年版(一部)正文项下有关规定。小檗皮药材，产地西藏，由西藏甘露藏药厂提供，经成都中医药大学赖先荣、范刚副研究员鉴定，符合六省区藏药标准小檗皮药材项下的有关规定。根据药品标准收载的各药味临床用药剂量范围，以最低用量的1/3为低限、最高用量的2倍为高限，大鼠按人用量的10倍量作为等效剂量(大鼠标准体重0.2kg、成年人标准体重70kg)，采用均匀设计法设成8个配伍，配伍量及浓度如表1、2、2-1：

表1四味姜黄汤不同配伍剂量及浓度(大鼠模型用剂量)

表2四味姜黄汤不同配伍剂量(按体型系数公式折算的人用剂量)

表2-1四味姜黄汤不同配伍剂量(按大鼠等效剂量为人用量10倍折算的人

用剂量)

①盐酸二甲双胍对照组，按人用量1.5g/70kg/日，约20mg/kg，大鼠按人用量的10倍量作为等效剂量，即大鼠给药剂量为200mg/kg/日。

②盐酸小檗碱对照组，治疗糖尿病肾病临床有效人用量1.2g/70kg/日，17.1mg/kg，大鼠按人用量的10倍量作为等效剂量，即大鼠给药剂量为171mg/kg/日。

③盐酸小檗碱+盐酸小檗胺对照组，按盐酸小檗胺人用量336mg/70kg/日，4.8mg/kg，大鼠按人用量的10倍量作为等效剂量，即大鼠给药剂量为48mg/kg/日；按盐酸小檗碱治疗糖尿病肾病临床有效人用量1.2g/70kg/日，17.1mg/kg，大鼠按人用量的10倍量作为等效剂量，即大鼠给药剂量为171mg/kg/日；按以上剂量混合制备。

④小檗皮对照组，小檗皮的临床用量为3-5g/日，剂量的高低限为1.5-10g/日，折算为大鼠的剂量为0.428-0.714g/kg，按0.7g/kg计。

该制剂提取工艺为：按表1的试验号1～8中原料药的比例称取各原料药，分3次提取，第1次加12倍量水，浸泡1.0h，煎煮1.0h，纱布滤过；将第1次过滤得到的滤渣再煎煮2次，每次加10倍量水，1h/次，纱布滤过。将3次的滤液收集在一起浓缩至表1的浓度。

盐酸二甲双胍(贵州省贵阳市清镇医药工业园区，国药准字H52020955)，在使用时用双蒸水配成20mg.ml^-1的溶液；STZ(Sigma公司，批号：S-0130)；尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血尿酸及血清总蛋白定量试剂盒(以上试剂盒均购自南京生物建成)；TGF-β1、VEGF ELISA试剂盒，购自依科赛生物科技(太仓)有限公司。

1.3仪器

罗氏卓越型(ACCCU-CHEK Performa)血糖仪(配套血糖试纸及一次性采血针)，罗氏诊断产品(上海)有限公司生产；

VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪美国Thermo公司；

恒温培养振荡器(ZHWY-100H),上海智城分析仪器制造有限公司。

2方法

2.1动物分组、造模及给药

大鼠适应性饲养1周后，按体质量分层后进行随机分组，选取7只大鼠作为空白对照组，其余为糖尿病模型组。

禁食不禁水12h，根据预实验，模型组以60mg.kg^-1体质量单次腹腔注射1％的STZ(临用前溶解于0.1mol.L^-1，4℃，PH 4.5的无菌柠檬酸钠缓冲液)，空白组注射同样剂量柠檬酸钠缓冲液，4小时后给模型组以50％葡萄糖按2g.kg^-1体重ig(灌胃给药)，防止大鼠低血糖死亡，72h后尾尖采血测空腹血糖，以空腹血糖﹥16.7mmol.L^-1为糖尿病造模成功，未成模剔除。

待早期糖尿病肾病形成后模型组和空白组ig生理盐水，其余各组ig给予相应药物，即分别给予表1中试验号1～8的药物以及各药物对照组，所有组均按1ml.100g^-1体质量给药，每天1次，连续给药30d。

2.2标本收集

给药30d后，动物禁食不禁水12h，测末次血糖，称体重，按0.7ml/100g体重用20％乌拉坦麻醉大鼠，打开腹腔，腹主动脉取血，3 000r.min^-1离心，取上清；取完血清后快速取出左侧肾脏，去除包膜，称重，计算肾指数(肾质量/体质量)。

另每组选取2～3只大鼠的部分肾组织用2.5％戊二醛溶液固定，进行超微结构观察及测定肾小球基底膜厚度，电镜结果图3。

图3显示，正常对照组大鼠肾小球基底膜厚薄均匀，足细胞排列整齐，基质均匀无增厚，足突间未见沉积物；模型组基底膜明显增厚，并可见电子致密物沉积，足细胞足突数量减少、融合，部分已消失溶解。与模型组比较二甲双胍组、藏药四味姜黄方各配伍组干预后能够有效改善病理损伤，肾小球基底膜厚度有所减少。其中二甲双胍组、第3组和第5组对DN大鼠肾小球结构损伤的保护作用更为明显。

2.3观察指标及检测方法

2.3.1大鼠一般状态

包括大鼠精神、毛色、体质量、饮食饮水、尿量等情况。

2.3.2生化指标测定

应用7600型全自动生化分析仪测定血清FBG，BUN，Scr，UA，血清总蛋白。

2.3.3ELISA法检测血清TGF-β1、VEGF。

3结果

3.1一般状况观察

与正常组比较，模型组出现明显的多饮、多尿、多食，并逐渐出现精神萎靡，反应迟钝，毛色泛黄无光泽，脱毛、体质量下降等症状；与模型组比较，给药组动物状态较好，体重增长比模型组高。

3.2对病理组织学的影响

分别在空白组、模型组和给药组中抽取四只大鼠做预实验，观察组织病理形态观察。

正常组大鼠肾组织未见病理改变；模型组大鼠肾组织可见部分肾小球脱落，肾小球系膜增生，毛细血管袢闭合，肾小管刷状缘脱落，血管周围少量纤维化，各治疗组肾组织病理改变较模型组均有不同程度的改善。

3.3 PCA分析结果

3.3.1四味姜黄汤不同配伍剂量-药效学数据分析

表3四味姜黄汤不同配伍剂量对糖尿病肾病的药效学数据(n＝7)

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

本发明对四味姜黄汤8个不同配伍剂量进行了与“治糖尿病肾病”作用相关的药效学研究，结果见表3。

实验结果表明：采用STZ诱导糖尿病肾病大鼠模型，在造模10周后，给药4周，对照组、四味姜黄汤不同配伍组与模型组相比各项指标都有不同程度的改善，具体为：

①与空白组比较，模型组的肾指数增加有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、配伍剂量组1、3组的肾指数降低有显著性意义(P＜0.05)。

②与空白组比较，模型组的血尿素氮水平升高有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、盐酸小檗碱+盐酸小檗胺组、小檗皮组、配伍剂量组1～6的血尿素氮水平降低有显著性意义(P＜0.05)。

③与空白组比较，模型组的血肌酐水平升高有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、小檗碱组、盐酸小檗碱+盐酸小檗胺组、小檗皮组、配伍剂量组2～7的血肌酐水平降低有显著性意义(P＜0.05)。

④与空白组比较，模型组的血尿酸水平升高有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、盐酸小檗碱+盐酸小檗胺组、小檗皮组、配伍剂量组1、3和5～8的血尿酸水平降低有显著性意义(P＜0.05)。

⑤与空白组比较，模型组的血清总蛋白水平降低有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、盐酸小檗碱+盐酸小檗胺组、配伍剂量组1～7的血清总蛋白水平升高有显著性意义(P＜0.05)。

⑥与空白组比较，模型组的空腹血糖水平升高有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、小檗碱组、盐酸小檗碱+盐酸小檗胺组、小檗皮组、各配伍剂量组的空腹血糖水平降低有显著性意义(P＜0.05)，且均优于二甲双胍组。

⑦与空白组比较，模型组的TGF-β1水平升高有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、小檗碱组、盐酸小檗碱+盐酸小檗胺组、小檗皮组、配伍剂量组1、3、5的TGF-β1水平降低有显著性意义(P＜0.05)。

⑧与空白组比较，模型组的VEGF水平升高有显著性意义(P＜0.01)；与模型组比较，配伍剂量组1～7的VEGF水平降低有显著性意义(P＜0.05)。

本实验结果显示，随糖尿病肾病的进展，血清TGF-β1、VEGF水平逐渐升高,且血清TGF-β1水平与VEGF呈正相关。推测肾脏局部TGF-β1、VEGF表达增多，两者协同促进新生血管的生成，改变了肾脏的微血管结构，参与了糖尿病肾病的发生。从图4可以看出各剂量配比组与空白组、模型组有较好的空间分离度，说明各剂量配比组有不同于模型组、空白组的特征，但是较为接近模型组，而较为远离空白组，说明各配比组对DN的各项指标都有一定的改善，但是难以改善到空白组的程度；配比1、2、3、4、5、6组较好，其中配比第5组的影响较为明显。图5表示各数据变量与主成分的相关性，代表各数据变量的影响程度，可以看出肾指数、BUN水平、FBG水平、TGF-β1、VEGF水平对主成分1(PC1)的载荷最大，表明它们是主要影响因素；这可能与该药物降血糖作用、抑制细胞外基质合成因子TGF-β1与VEGF有关。然而糖尿病肾病的发展与细胞外机制的增加和堆积密切相关，研究表明转换生长因子(TransformingGrowth Factor，TGF-β1)和VEGF都可增加细胞外基质的合成。TGF-β1是糖尿病肾病发病过程中复杂的细胞因子网络中的核心因子，有五种异构体，这五种异构体中只有TGF-β1在哺乳动物肾脏的表达最多。TGF-β1有促使细胞肥大、增加细胞外基质产生、通过抑制基质降解酶合成而减少细胞外基质降解的作用。VEGF是一种高度特异性的血管内皮生长因子，通过改变血管内皮细胞功能与结构、增加肾小球毛细血管的通透性、促进细胞外基质的合成而参与DN的病程进展。临床研究表明，在DN早期时糖尿病患者尿VEGF水平即上调，且患者尿VEGF水平与DN病变进展具有临床相关性，糖尿病患者尿VEGF的高表达水平导致肾小球滤过膜结构的病理性改变，造成白蛋白等大分子通过。

实验例2四味姜黄汤优化剂量对自发性糖尿病肾病db/db小鼠模型的影响

图7为四味姜黄汤优化配比对db/db小鼠药效学指标的主成分分析-得分图；图8为四味姜黄汤优化配比对db/db小鼠药效学指标的偏最小二乘分析图；图9为四味姜黄汤优化配比对db/db小鼠药效学指标的分层聚类分析图。相关药效学数据进行PCA主成分分析、HCA分层聚类分析，结果表明多有给药组与模型组(db/db组)明显分为两类，说明给药组对DN有明显的改善。

1、动物

采用南京大学-南京生物医药研究院提供的db/db小鼠(模型组)、db/m小鼠(空白组)。

db/db小鼠模型，表现类似人类的2型糖尿病，是用于研发治疗2型糖尿病药物常用的5种动物模型之一，也是FDA推荐的动物模型之一，基本可以反映出人类疾病的特点，有中等程度肥胖、血脂高等特点。

根据STZ诱导2型糖尿病大鼠模型的研究结果，确定的四味姜黄汤优化剂量比例为姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝3：10：3：6，折算为人用每日剂量为姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝1.5g：5g：1.5g：3g，按照体型系数公式计算动物给药量(因db/db小鼠的肥胖程度较高，没有标准的体形系数，但是其属于小鼠范畴，因此db/db小鼠的体型系数暂定为0.0898，db/db小鼠的标准体重0.05kg、db/m小鼠标准体重0.02kg、成年人标准体重70kg)。计算出人用等效剂量相当于db/db小鼠的约9倍。因此确定四味姜黄汤优化剂量分组为低剂量组(0.978g/kg，约相当于4倍)、中剂量组(1.957g/kg，约相当于9倍)、高剂量组(3.914g/kg，约相当于20倍)、原剂量组(1.305g/kg，约相当于9倍)，另设定小檗碱组(0.157g/kg，约相当于9倍)、二甲双胍组(0.196g/kg，约相当于9倍)、小檗皮组(0.652g/kg，约相当于9倍)。

1.1对肾脏器官指数和生化指标的影响

表9为四味姜黄汤散优化剂量对db/db糖尿病小鼠模型一般指标及生化指标的影响。

与db/m组比较，db/db组的肾脏器官指数和体重极显著性增加(P﹤0.01)；与db/db组比较，高剂量组、小檗碱组、原剂量组的肾脏器官指数显著性下降(P﹤0.05)，中剂量组、小檗碱组、原剂量组、小檗皮组的体重显著性下降(P﹤0.05)。

与db/m组比较，db/db组的空腹血糖指数(FBG)极显著性升高(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、高剂量组、小檗碱组的FBG显著性下降(P﹤0.05)。

与db/m组比较，db/db组的血尿素氮水平(BUN)极显著性升高(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的BUN显著性下降(P﹤0.05)。

与db/m组比较，db/db组的尿白蛋白排泄率(UAE)极显著性升高(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的UAE极显著性下降(P﹤0.01)。

与db/m组比较，db/db组的尿微量白蛋白排泄率(UAlb)极显著性升高(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的UAlb显著性下降(P﹤0.05)。

与db/m组比较，db/db组的血清肌酐水平(Scr)极显著性升高(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的Scr显著性下降(P﹤0.05)。

与db/m组比较，db/db组的血清尿酸水平(UA)极显著性升高(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的UA显著性下降(P﹤0.05)。

与db/m组比较，db/db组的转化生长因子-βl水平(TGF-β1)极显著性升高(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的TGF-β1显著性下降(P﹤0.05)。TGF-β1是作用最强的致肾纤维化细胞因子。

与db/m组比较，db/db组的血管内皮生长因子水平(VEGF)显著性升高(P﹤0.05)；与db/db组比较，小檗碱组的VEGF显著性下降。

表9四味姜黄汤散优化剂量对db/db糖尿病小鼠模型一般指标及生化指标的影响

数据格式表示为均值±标准差,n＝6；*p<0.05,**p<0.01，与db/db组比较.

综上所述，四味姜黄汤优化剂量对糖尿病肾病(DN)的肾脏指数及各项生化指标均有明显的改善，其作用机制可能与改善肾脏纤维化及调节TGF-β1表达水平有关。

1.2对肾脏病理组织学的影响

HE染色结果表明：与db/m组比较，db/db组的肾小管上皮细胞水肿、肾包膜狭窄、上皮细胞脱落、脂肪变性显著；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的以上病理表现得到了改善。PASM染色结果表明：与db/m组比较，db/db组的肾小管基底膜厚度显著增加(IOD)(P﹤0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的肾小管基底膜厚度显著降低(IOD)(P﹤0.01)。

1.3对肾脏H I F-1a、TGF-β1、VEGF基因表达的影响

HIF-1α、TGF-ββ1和VEGF已被确定为DN肾间质纤维化的关键的调节因素，应用实时定量PCR检测DN相关因子的mRNA表达。与db/m组比较，db/db组的HIF-1a、TGF-β1、VEGF基因(mRNA)表达水平极显著升高(P＜0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、小檗碱组、小檗皮组的HIF-1α基因(mRNA)表达水平显著降低(P＜0.05)，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、小檗碱组的TGF-β1、VEGF基因(mRNA)表达水平显著降低(P＜0.05)。

1.4对肾脏H I F-1a、TGF-β1、VEGF蛋白表达的影响

应用western blots方法检测DN相关因子的蛋白表达。与db/m组比较，db/db组的HIF-1a、TGF-β1、VEGF蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的HIF-1a、TGF-β1、VEGF蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)。

1.5对肾脏H I F-1a、TGF-β1、VEGF组织分布的原位检测

应用免疫组化方法检测DN相关因子的组织分布特点。与db/m组比较，db/db组的HIF-1a、TGF-β1、VEGF表达水平极显著升高(P＜0.01)；与db/db组比较，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、原剂量组、小檗碱组、小檗皮组的TGF-β1蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、小檗碱组、小檗皮组的VEGF蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)，二甲双胍组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、小檗碱组、小檗皮组的HIF-1a蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)，。

1.6对肠道菌群的影响

与db/m组比较，db/db组的群落组成和多样性具有极显著差异(P＜0.01)，厚壁菌门乳酸杆菌属比例显著增加，已知乳酸杆菌与脂代谢指标LDL-C(低密度脂蛋白)显著负相关，肠道中乳酸杆菌的数量增加，过高水平的LDL-C得到了改善和降低。与db/db组比较，小檗碱组的群落组成和多样性具有显著差异(P＜0.05)，显著降低了乳酸杆菌属的比例，但是其降低后比例也与正常组接近而且略有增加，明显增加了变形菌门肠杆菌属、大肠杆菌志贺菌属的比例，以上结果说明盐酸小檗碱对肠道菌群有明显的影响，随着LDL-C的降低而乳酸杆菌属比例恢复至与正常对照组接近的程度，提示含盐酸小檗碱成分的小檗皮可以较好地纠正db/db组的脂代谢紊乱，对高脂血症有明显的改善；低剂量组、高剂量组、原剂量组对肠道菌群的微生物群落组成和多样性没有显著性影响(P＞0.05)，低剂量组、高剂量组、原剂量组增加了乳酸杆菌属比例[刘婷婷,蔡德鸿.实时定量PCR法分析2型糖尿病患者肠道乳酸杆菌菌种数量的改变[J].世界华人消化杂志,2012,20(15):1359-1365.]，这与db/db组多处于糖尿病中后期，脂代谢紊乱的纠正需要更长期的治疗过程，因此其乳酸杆菌属比例增加以降低过高的LDL-C浓度，说明四味姜黄汤散可以改善LDL-C型高脂血症。

2四味姜黄汤优化剂量对STZ诱导糖尿病大鼠模型血清生物标志物的影响

采用LC-MS代谢组学方法对STZ诱导糖尿病大鼠模型血清生物标志物进行分析。与db/db组比较，db/m组、均匀设计配伍1组、均匀设计配伍2组、小檗碱组等4组的共同差异代谢标志物为Xanthosine(P﹤0.05)；与db/db组比较，db/m组、均匀设计配伍1组、均匀设计配伍2组、小檗皮组、小檗胺-小檗碱组等5组的共同差异代谢标志物为Ornithine(P＜0.05)。

Xanthosine(黄嘌呤核苷)：黄嘌呤核苷是机体正常代谢的产物，一般在体内还可进一步分解为黄嘌呤，最后氧化形成尿酸(uric acid，UA)随尿液排出体外。在STZ诱导糖尿病大鼠模型的研究中，与空白组比较，模型组的血清尿酸水平(UA)极显著性升高(P＜0.01)；与模型组比较，均匀设计配伍1组的UA显著性下降(P＜0.05)。在db/db糖尿病小鼠模型的研究中，与db/m组比较，db/db组的血清尿酸水平(UA)极显著性升高(P＜0.01)；与db/db组比较，低剂量组、中剂量组、小檗碱组的UA显著性下降(P＜0.05)。说明黄嘌呤核苷作为显著性差异代谢物具有药理学意义及临床价值。

Ornithine(鸟氨酸)：鸟氨酸循环(尿素循环)，尿素是大多数陆生脊椎动物体内排出氨的方式，尿素循环的任何一个步骤出问题都有可能产生疾病。人体内的大部分氨在肝内通过鸟氨酸循环合成尿素。一部分被用于酮酸的氨基化，合成谷氨酰胺，由肾脏肾小管上皮细胞产生，在肾内形成胺盐，从尿中排出，尿氨尿中氨主要以铵盐形式排除体外，是调节电解质平衡的重要功能之一。尿素氮在诊断糖尿病酮症酸中毒、肝功能障碍等病中占重要地位。在STZ诱导糖尿病大鼠模型的研究中，与空白组比较，模型组的血尿素氮水平(BUN)极显著性升高(P＜0.01)；与模型组比较，均匀设计配伍1组、均匀设计配伍2组、小檗皮组的BUN显著性下降(P＜0.05)。在db/db糖尿病小鼠模型的研究中，与db/m组比较，db/db组的血尿素氮水平(BUN)极显著性升高(P＜0.01)；与db/db组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、小檗碱组的BUN极显著性下降(P＜0.01)。说明鸟氨酸作为显著性差异代谢物具有药理学意义及临床价值。

由上述实验数据可知，相较于实施例1中的1组～8组，本发明计量配比为姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝3：10：3：6的各项指标更为接近空白组，而更为远离模型组，说明本发明中姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝3：10：3：6的计量配比对DN的各项指标的改善最显著，其用于治疗糖尿病肾病的效果最优。

实验例3本发明药物组合物的制法参数研究

按照四味姜黄汤散药品标准及藏医用药的传统经验中，其剂型为煮散，采用加水煎煮的方法进行提取，加水量、提取时间、提取次数等制法参数均不明确。本发明以没食子酸、小檗碱、姜黄素、出膏率为考察指标，采用均匀设计法优化水煎煮法提取工艺。

四味姜黄胶囊制备工艺为：本品四味，姜黄粉碎成粗粉，用10倍量70％乙醇作溶剂，浸渍12小时，缓缓渗漉，收集渗漉液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，加入预胶化淀粉适量，减压干燥，粉碎成细粉；小檗皮碎成粗粉，第一次和第二次分别加14倍量75％乙醇，回流提取2小时，第三次加12倍量75％乙醇，回流提取1小时，合并滤液，滤过，收集滤液；余甘子和蒺藜粉碎成粗粉，第一次加14倍量90％乙醇，回流提取2小时，第二次加12倍量70％乙醇，回流提取1小时，合并滤液，滤过，收集滤液，将上述两种提取液合并，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，减压干燥，粉碎成细粉。将上述细粉混合，按(浸膏粉：微晶纤维素＝13:2)比例混匀，加80％乙醇溶液制成颗粒，加入硬脂酸镁适量，混匀，60℃干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。

综上，本发明通过观察四味姜黄汤不同配伍剂量对糖尿病肾病大鼠的药效结果并结合主成分分析法挖掘能够有效干预早期糖尿病肾病的四味姜黄汤最佳量效配伍，促进其临床应用及新药开发。特别地，本发明计量配比为姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝3：10：3：6的各项指标更为接近空白组，而更为远离模型组，说明本发明中姜黄：小檗皮：余甘子：蒺藜＝3：10：3：6的计量配比对DN的各项指标的改善最显著，接近于空白组。

Claims

1.一种防治糖尿病肾病的药物组合物，其特征是：它是由下述重量配比的原料药制备而成：姜黄1～15份、小檗皮1～8份、余甘子1～15份、蒺藜1～8份。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征是：它是由下述重量配比的原料药制备而成：姜黄1～2份、小檗皮3～7份、余甘子1～7份、蒺藜2～8份。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征是：它是由下述重量配比的原料药制备而成：姜黄3份、小檗皮10份、余甘子3份、蒺藜6份。

4.如权利要求1～3任意一项所述的药物组合物，其特征是：它是由各重量配比原料药的原生药粉、水或有机溶剂的提取物，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征是：所述的制剂为口服制剂；优选的，所述的制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、汤剂或合剂。

6.一种权利要求1～5任意一项所述药物组合物的制备方法，其特征是：包括如下步骤：取各重量配比的原料药，直接打粉，或者加入水或有机溶剂提取，再加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，即得；

优选的，所述的水提方法为：取各重量配比的原料药，加水提取三次，第一次加水12倍量，浸泡1小时，煎煮1小时，滤过，加水再煎煮2次，每次加水10倍量，每次1小时，合并滤液，浓缩，即得。

7.权利要求1～5任意一项所述药物组合物在制备治疗和/或预防糖尿病肾病的药物中的用途。

8.一种权利要求1～5任意一项所述药物组合物的质量控制方法，其特征是：所述方法测定没食子酸，鞣花酸，木兰花碱，盐酸小檗碱，盐酸药根碱，盐酸巴马汀和姜黄素7种成分的含量；

优选的，所述成分的含量为：没食子酸30.64mg·g^-1，鞣花酸48.60mg·g^-1，木兰花碱49.32mg·g^-1，盐酸小檗碱39.47mg·g^-1，盐酸药根碱42.24mg·g^-1，盐酸巴马汀47.66mg·g^-1，姜黄素62.73mg·g^-1。

9.一种权利要求1～5任意一项所述药物组合物的高效液相检测方法，其特征是：色谱条件为：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液。

10.如权利要求9所述的高效液相检测方法，其特征是：所述的固定相为Capcell PakC18-MGⅡ色谱柱；色谱柱规格：柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；

和/或，流速为0.8mL·min-1；

和/或，进样量10μL；

和/或，柱温30℃；

和/或，0～60min检测波长为270nm，60～70min检测波长为430nm；

和/或，流动相梯度洗脱条件为：0→8min，3％→3％A；8→15min，3％→17％A；15→20min，17％→17％A；20→33min，17％→20％A；33→38min，20％→25％A；38→48min，25％→25％A；48→70min，25％A～80％A。