CN108484779A

CN108484779A - 一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白及应用

Info

Publication number: CN108484779A
Application number: CN201810334611.8A
Authority: CN
Inventors: 宋海鹏; 古; 古一; 王欢; 于建立; 黄琪; 李飞; 陈晓恒; 刘原源
Original assignee: Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Priority date: 2018-04-14
Filing date: 2018-04-14
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-04-14
Also published as: CN108484779B

Abstract

本发明公开了一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由纳米抗体或其可变区片段与人胎盘碱性磷酸酶报告基因蛋白串联而成，本发明还提供了所述融合蛋白在制备CEACAM5抗原免疫检测试剂盒中的应用。该融合蛋白用于免疫标记技术的免疫检测，保持了良好的酶和抗体的生物学活性，具有较高的检测效率。

Description

一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白及应用

技术领域

本发明公开了一种融合蛋白及其免疫学应用，属于多肽技术领域，更具体地，属于免疫球蛋白技术领域。

背景技术

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase或ALP)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。ALP每个单体由449个氨基酸组成，完整的ALP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。ALP被phoA基因编码，与很多分泌蛋白一样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，同源二聚体形成。这种酶能催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5'-P末端转换成5'-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5与ALP6六种同功酶，其中第1、2、6种均来自肝脏，第3种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。除来源于胎盘外所有哺乳动物的ALP同工酶都能被高精氨酸所抑制；除来源于肠和胎盘外所有的ALP同工酶都能被左旋咪唑所抑制；而除了来源于胎盘的ALP(PALP和SEAP)外，几乎所有的ALP都能在65℃2小时即被灭活。

碱性磷酸酶的测定方法有很多种，我国曾应用较广的为磷酸苯二钠比色法，但现在应用较多的是连续检测法。原理为以磷酸对硝基酚为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇或二乙醇胺为磷酸酰基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。ALP也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。与辣根过氧化物酶(HRP)相比，ALP用作标记酶的优点是，稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高，标记困难。

在研究中最常用的ALP包括细菌碱性磷酸酶(Bacterial alkaline phosphatase，来源于Escherichia coli C₄)、SAP(Shrimp alkaline phosphatase，来源于一种北极虾)、小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，CIAP)和胎盘碱性磷酸酶(Placental Alkaline Phosphatase，PLAP)四种。其中，由于SAP是四种碱性磷酸酶中最容易被灭活的，因此被常应用于分子生物学领域中，主要用作核酸的去磷酸化。因为DNA通常会在5'端结合磷酸基团，用SAP去磷酸化能防止DNA分子5'端与3'端连接，从而在后续步骤准备好之前让DNA分子抑制处于线性化状态。同样的原理，该酶还可通过去磷酸化用作放射标记示踪。除此之外，碱性磷酸酶还可被作为标记酶广泛应用于酶联免疫测定。以竞争法检测小分子抗原为例，抗体先与固相载体结合，然后让待测样品与事先经ALP标记过的该抗原竞争地与抗体结合，洗去未反应的过量ALP-抗原，加入显色底物，则可以通过与按梯度浓度变化的标准品绘出的标准曲线对比从而知道待测样品中抗原的浓度。目前，绝大部分使用的为小牛肠碱性磷酸酶，主要原因在于其比活性高。市售的CIAP的比活性根据制造商、品级的不同而多种多样。此外，基本骨架中包含1,2-二氧杂环丁烷或吖啶酮的CIAP可以使用各种高灵敏度发光基质，以提高免疫测定的灵敏度。

在传统的免疫标记技术中，辣根过氧化物酶标记在蛋白的赖氨酸残基位置。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。将纳米抗体用于传统的免疫学检测会极大提高检测效率，因此纳米抗体的检测应用具有极大地市场前景。

由于在纳米抗体的抗原结合区，赖氨酸一般出现在CDR区，是抗原的结合区域，因此标记辣根过氧化物酶后，可能阻断了纳米抗体与抗原的结合，导致不能显色或者显色不灵敏。且用辣根过氧化物酶标记传统抗体或者纳米抗体，标记率受多种化学试剂的影响，十分不稳定，且损失较大。

由于现有技术在标记技术上存在着标记效率低，酶和抗体的生物学活性因化学试剂标记的影响而有所下降的技术问题，且基于碱性磷酸酶以及纳米抗体在免疫测定方面所表现出的突出特性及广泛应用前景，研发出具有高稳定性、高灵敏度的抗体标记酶，成为了提高免疫检测及临床诊断效率的迫切需求。

本发明的目的就是提供一种酶和抗体的生物学活性不受化学试剂标记的影响，具有高度稳定性和灵敏度的抗体标记酶的融合蛋白和其应用方法。

发明内容

基于上述发明目的，发明人意欲采用基因重组表达的方式，表达纳米抗体和碱性磷酸酶的重组融合蛋白，从工程细胞的培养基上清或者破碎的工程细胞质中直接纯化纳米抗体和碱性磷酸酶的融合蛋白，获得酶标抗体，用于相关的免疫学检测。

因此，本发明首先提供了一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由纳米抗体或其可变区片段与人胎盘碱性磷酸酶报告基因蛋白串联而成。本发明所述的融合蛋白是在DNA水平上将编码抗体或者抗体可变区片段的基因和编码人胎盘碱性磷酸酶(去除膜结合区序列)的报告基因融合后，通过重组表达的方法，在如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中表达的重组融合蛋白。

纳米抗体或者抗体片段和报告基因蛋白的融合方式，可以是在抗体片段的氨基端或者羧基端融合一个或几个报告基因蛋白，也可以在抗体片段的氨基端或者羧基端分别融合一个或几个报告基因蛋白，或者是在报告基因蛋白的氨基端或者羧基端分别融合一个或几个抗体片段的基因。在两端分别融合报告基因蛋白或者抗体片段的融合蛋白中，所述融合蛋白中的抗体片段可以是不同的抗体片段，分别针对同一抗原的不同抗原决定簇或不同的抗原分子。

在一个优选的实施方案中，所述人胎盘碱性磷酸酶报告基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

更为优选地，所述纳米抗体或其可变区片段与报告基因蛋白由连接肽(GGGGS)_n连接，其中n为1-6中的任一整数。

在一个优选的实施方案中，所述纳米抗体或其可变区片段位于融合蛋白的氨基端，所述报告基因位于融合蛋白的羧基端，

在另一个优选的实施方案中，，所述纳米抗体或其可变区片段位于融合蛋白的羧基端，所述报告基因位于融合蛋白的氨基端

更为优选地，连接肽(GGGGS)_n中，n＝3。

尤为优选地，所述纳米抗体为抗CEACAM5纳米抗体。

最为优选地，抗CEACAM5纳米抗体的可变区为SEQ ID NO:2所述。

最后，本发明公开了上述融合蛋白在制备CEACAM5抗原免疫检测试剂盒中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，其中可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3的抗CEACAM5纳米抗体(公开于CN106946989A中的抗体11C12)为一抗，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2所述的抗CEACAM5纳米抗体为二抗。

本发明提供的融合蛋白克服了辣根过氧化物酶标记位点阻碍抗原结合和标记效率不稳定这两个技术缺陷，特定的序列组合保证了纳米抗体和碱性磷酸酶形成各自的空间结构，使其最大程度发挥各自的生物活性。且该融合蛋白避免了用化学试剂标记方法的局限性和不稳定性。本发明的融合蛋白具有特定抗原识别和结合能力，而融合的人胎盘碱性磷酸酶可以以磷酸对硝基酚为底物显色，因此该融合蛋白可以作为针对特定某抗原的酶标抗体，用于该抗原定量的免疫检测；也可以作为针对该抗原抗体的竞争性抗体，用于体内药代动力学实验。本发明以CEACAM5抗原为例，将CEACAM5纳米抗体2D5分别融合小牛肠碱性磷酸酶、高耐热型碱性磷酸酶以及人胎盘碱性磷酸酶，对比检测三种融合蛋白的酶活性及稳定性。结果CEACAM5纳米抗体2D5融合人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白具有非常好的酶活性及稳定性。开创了膜结合型酶作为标记酶的新路径，且该融合蛋白无论是用于CEACAM5的标准品检测还是临床血清样品的ELISA检测，曲线R²均大于0.99，呈现了良好的线性。这一结果符合纳米抗体的技术效果预期，也充分证明了本发明融合蛋白在实际应用中的前景。

附图说明

图1.融合蛋白纯化结果

图2.碱性磷酸酶纯化结果

图3.三种融合蛋白酶活性分析结果；

图4.2D5-HAP融合蛋白亲和力热稳定性检测结果；

图5.2D5-HAP融合蛋白酶活性检测结果；

图6.CEACAM5标准品检测曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1制备实施例

1.1根据抗CEACAM5纳米抗体2D5的氨基酸序列SEQ ID NO:2和小牛肠碱性磷酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO:4、高耐热型碱性磷酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO:5以及人胎盘碱性磷酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1，优化获得在哺乳动物细胞中表达的纳米抗体2D5cDNA序列SEQ ID NO:6、小牛肠碱性磷酸酶(本发明命名为CAP)cDNA序列SEQ ID NO:7、高耐热型碱性磷酸酶(本发明命名为PAP)cDNA序列SEQ ID NO:8以及人胎盘碱性磷酸酶(本发明命名为HAP)cDNA序列SEQ ID NO:9。

1.2在纳米抗体2D5和三种碱性磷酸酶序列中分别添加柔性链接肽(GGGGS)₃，分别获得纳米抗体2D5与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白(2D5-CAP)cDNA序列SEQ ID NO:10、纳米抗体2D5与高耐热型碱性磷酸酶的融合蛋白(2D5-PAP)cDNA序列SEQ ID NO:11以及纳米抗体2D5与人胎盘碱性磷酸酶(2D5-HAP)cDNA序列SEQ ID NO:12。人工合成三种融合蛋白DNA序列及三种单独碱性磷酸酶的DNA序列。在三种所述融合蛋白的氨基端及三种单独碱性磷酸酶的氨基端，还加有通用信号肽氨基酸序列SEQ ID NO:13，利于蛋白的分泌表达。此外，在HAP蛋白的氨基端加有人胎盘碱性磷酸酶自身信号肽的氨基酸序列SEQ ID NO:14，构建自身信号肽HAP作为对照。

1.3分别将2D5-CAP、2D5-PAP、2D5-HAP以及自身信号肽HAP、通用信号肽HAP、CAP和PAP七种基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点中，获得相应表达载体。无内毒素大提质粒后利用状态处于对数生长的293细胞进行转染。获得转染的细胞培养至36h后将细胞培养液倒入50ml离心管中，12000g离心5min，收集上清，用0.22um滤膜过滤，利用阴离子交换层析柱对培养上清进行纯化。图1为SDS-PAGE检测2D5-CAP、2D5-PAP以及2D5-HAP的纯化结果(M为彩虹180广谱蛋白Marker；1-3分别为2D5-HAP、2D5-CAP以及2D5-PAP的纯化产物)。图2为SDS-PAGE检测通用信号肽HAP、CAP及PAP自身信号肽HAP的纯化结果(M为彩虹180广谱蛋白Marker；1-3分别是HAP在0.15M、0.2M和1M NaCl的洗脱液；4-5分别是自信号肽HAP在0.2M和1M NaCl的洗脱液；6-9分别是PAP在0.2M、0.2M、0.3M和1M NaCl的洗脱液；10-14分别是CAP在0.1M、0.2M、0.2M和1M NaCl的洗脱液)。由纯化结果看，单独表达碱性磷酸酶的表达量远远低于融合纳米抗体后的碱性磷酸酶融合蛋白，且融合蛋白纯化后的蛋白纯度可达95％以上。

实施例2融合蛋白与抗原的亲和活性测定

2.1芯片抗原偶联：将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH4.0)配制成20μg/mL的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。

2.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化：采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μL/分钟。进样条件均为120秒，30μL/分钟。再生条件均为30秒，30μL/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/mL，150μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，2μg/mL。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/mL分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。

2.3亲和力测试：按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μL/分钟；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μL/分钟)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。在具体实验中，将芯片上的纳米抗体俘获到适当的信号值，然后用系统运行缓冲液HBS-EP(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％P20)以30μL/分钟的流速注射到芯片上，获得融合蛋白与抗原相互作用的动态过程。分别使用该方法测试了纳米抗体2D5与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白(2D5-CAP)、纳米抗体2D5与高耐热型碱性磷酸酶的融合蛋白(2D5-PAP)以及纳米抗体2D5与人胎盘碱性磷酸酶(2D5-HAP)与抗原CEACAM5结合和解离的能力。

2.4结果分析：选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数。结果由表1可见，由纳米抗体2D5与人胎盘碱性磷酸酶组成的融合蛋白与抗原CEACAM5的亲和力最高，为2.675E-11，且三种融合蛋白和单独纳米抗体2D5与CEACAM5的亲和力2.652E-10相比，均有明显提高。这是由于碱性磷酸酶为同型二聚体蛋白酶，单体亚基的二聚体结构使融合蛋白的空间结构转化为一种类似抗体结构的形式，因此在氨基端具有两个抗原结合位点，因此该融合蛋白增加了原有纳米抗体与抗原的亲和力。

表1：纳米抗体2D5与碱性磷酸酶融合蛋白的亲和力数据

样品编号	结合常数	解离常数	亲和力
				2D5	9.302E+4	2.467E-5	2.652E-10
2D5-HAP	5.036E+5	1.347E-5	2.675E-11
				2D5-CAP	5.655E+5	3.107E-5	5.494E-11
2D5-PAP	6.634E+5	2.956E-5	4.456E-11

实施例3碱性磷酸酶酶活性及稳定性的检测

将融合蛋白在37℃和60℃分别保存1、3、7和14天。储存后再次测定每种融合蛋白的亲和力热稳定性，测定方法同实施例2。同时使用比色分析测试融合蛋白的碱性磷酸酶活性。将比例稀释的融合蛋白(50μL)加入到96孔微量培养板中，接着加入100μL含有3.8μMpNPP，0.1M甘氨酸，50mM MgCl₂和50mM ZnCl₂的AP缓冲液(pH10.4)。将平板混合并在37℃温育30分钟。用50μL/孔的4M NaOH终止反应。在微量滴定板读数器上测量405nm处的吸光度。图3为三种融合蛋白起始的酶活性分析结果，横坐标为融合蛋白的种类，纵坐标为酶活性单位(U/mg)。三种融合蛋白中，2D5-HAP的酶活性远远高于2D5-CAP和2D5-PAP。氨基端的纳米抗体可能破坏了CAP和PAP的酶活性中心结构，限制了其发挥生物学活性的功能。而HAP却没有受到融合纳米抗体的影响。由于PAP是耐热型碱性磷酸酶，其酶活性在70℃的条件下为最高，因此又测定了70℃条件下，2D5-PAP的酶活性，其结果依旧很低。图4为2D5-HAP亲和力热稳定性检测结果，横坐标为不同的温度条件，纵坐标为亲和力数值(×10^-11)。图5为2D5-HAP酶活性检测结果，横坐标为时间天数，纵坐标为酶活性单位(U/mg)。2D5-HAP在60℃条件下保存14天，其亲和力热稳定性没有发生明显降低，但其酶活性在在60℃条件下保存7天后，发生了明显降低，因此说明，持续的高温条件破坏了碱性磷酸酶的催化活性，但其纳米抗体与抗原结合的能力没有因此受到影响。

实施例4应用实施例

选取公开于CN106946989A(本发明通过引用，将该申请的公开内容引入到本申请的说明书内容中)中可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3的抗CEACAM5纳米抗体11C12与兔源FC片段的融合抗体作为捕获抗体，2D5-HAP为检测抗体进行双抗体夹心免疫法检测已知CEACAM5浓度的标准品以及血清样本中的CEACAM5抗原的含量，获得了优异的检测效果，具体过程如下:

使用无菌CBS稀释捕获抗体至终浓度为10μg/ml；按照每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃静置18h；弃上清后，每孔加入300μL洗涤液，水平震动3min，吸弃上清；重复洗板四次。每孔加入200μl 1％BSA，于37℃静置1h。重复洗板四次；每孔中加入50μL阳性对照、阴性对照或者标准品；随即每孔加入50μL新鲜稀释的2D5-HAP(工作浓度为2μg/ml)，置于摇床上摇动3～5s；37℃下温育1h。重复洗板四次；每孔加入100μL碱性磷酸酶化学发光显色液(BMChemiluminescence ELISA Substrate)，在摇床上摇动3～5s；室温避光孵育10min；测定各孔的Lum值并计算检测样品的CEACAM5值。图6为检测到的标准品浓度范围曲线，横坐标为CEACAM5的浓度，纵坐标为发光值(×10⁶)。测试线性范围从0.31ng/mL到640ng/mL。向阴性人血清样品中加入四种不同量的CEACAM5抗原，通过测定CEACAM5浓度计算回收率。如表2所示，不同添加浓度的CEACAM5抗原的平均回收率为91～109％，表明该方法准确且可重复。应用该方法检测32份来自长春肿瘤医院的血清样本，并将检测结果同长春肿瘤医院应用的化学发光微粒子免疫分析方法(CMIA)检测的结果想对比，见表3所示，检测的结果数据匹配率均超过90％，提示本发明提供的碱性磷酸酶与抗体片段的融合蛋白可适用于体外检测临床患者样品的CEACAM5抗原以进行相关肿瘤筛选。

表2向阴性血清中添加的CEACAM5回收率

表3对比本方法同CMIA检测的CEACAM5值

序列表

<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司

<120> 一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白及应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 484

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu

115 120 125

Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly

130 135 140

Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr

145 150 155 160

Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala

165 170 175

Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser

180 185 190

Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe

195 200 205

Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly

210 215 220

Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys

225 230 235 240

Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala

245 250 255

Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly

260 265 270

Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu

275 280 285

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290 295 300

Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His

305 310 315 320

Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp

325 330 335

Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser

340 345 350

Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro

355 360 365

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Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val

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Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser

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420 425 430

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435 440 445

Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe

450 455 460

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<210> 2

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<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 2

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20 25 30

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Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

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<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

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20 25 30

Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser

35 40 45

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50 55 60

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Thr Lys

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100 105 110

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115 120 125

<210> 4

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<212> PRT

<213> Bos sp.

<400> 4

Leu Ile Pro Val Glu Glu Glu Asp Pro Ala Phe Trp Asn Cys Gln Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Leu Asp Val Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile Gln Thr Ala

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Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr Lys Thr Ile Gly Val

100 105 110

Ser Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Thr Ser Gly Asn Glu

115 120 125

Val Thr Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ala Val Gly

130 135 140

Val Val Thr Thr Ser Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Ala Tyr

145 150 155 160

Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Leu Pro Ala

165 170 175

Asp Ala Gln Met Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Val Tyr

180 185 190

Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Met Tyr Met Phe

195 200 205

Pro Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Tyr Asp Val Asn Gln Thr

210 215 220

Gly Val Arg Lys Asp Lys Arg Asn Leu Val Gln Glu Trp Gln Ala Lys

225 230 235 240

His Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr Ala Leu Leu Gln Ala

245 250 255

Ala Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Ala

260 265 270

Asp Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr Lys Asp Pro Thr Leu

275 280 285

Gln Glu Met Thr Glu Val Ala Leu Arg Val Leu Ser Arg Asn Pro Arg

290 295 300

Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His

305 310 315 320

Glu Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Asp Thr Val Met Phe Asp Asn

325 330 335

Ala Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile

340 345 350

Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Thr

355 360 365

Leu Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Ser Lys Ala Leu Asp

370 375 380

Ser Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Ala

385 390 395 400

Leu Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Asp Ser Thr Ser Glu Asp

405 410 415

Pro Ser Tyr Gln Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ala Ser Glu Thr His

420 425 430

Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu

435 440 445

Val His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala His Ile Met Ala Phe

450 455 460

Ala Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn Leu Pro Ala Pro Thr

465 470 475 480

Thr Ala Thr Ser Ile Pro Asp Ala Ala His Leu Ala Ala Ser Pro Pro

485 490 495

Pro Leu Ala Leu Leu Ala Gly Ala Met Leu Leu Leu Leu Ala Pro Thr

500 505 510

Leu Tyr

<210> 5

<211> 354

<212> PRT

<213> ecotropic provirus

<400> 5

Ser Pro Ser Gly Val Arg Asn Val Ile Ile Leu Ile Gly Asp Gly Met

1 5 10 15

Gly Phe Ser Gln Leu Gln Leu Thr Lys Leu Val Tyr Gly His Leu Asn

20 25 30

Met Glu Asp Phe Pro Tyr Thr Gly Ile Glu Leu Thr Asp Ser Leu Ser

35 40 45

Gly Glu Val Thr Asp Ser Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ile Ala Thr Gly

50 55 60

Val Lys Thr Tyr Asn Arg Met Ile Ser Thr Thr Asn Val Thr Gly Lys

65 70 75 80

Leu Val Asn Leu Thr Thr Leu Leu Glu Ile Ala Gln Met Leu Gly Lys

85 90 95

Ala Thr Gly Leu Val Thr Thr Thr Arg Ile Thr His Ala Thr Pro Ala

100 105 110

Val Phe Ala Ser His Val Pro Asp Arg Asp Met Glu Glu Glu Ile Ala

115 120 125

Arg Gln Leu Ile Leu His Asn Val Thr Val Leu Met Gly Gly Gly Arg

130 135 140

Glu Lys Phe Ser Glu Glu Val Leu Lys Leu Ala Glu Asp Tyr Gly Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Val Tyr Thr Arg Glu Asp Leu Glu Lys Val Lys Asp Gly Lys

165 170 175

Val Leu Gly Leu Phe Ala Glu Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Asp Arg

180 185 190

Ser Glu Glu Asp Val Ser Leu Leu Glu Met Thr Lys Lys Ala Ile Glu

195 200 205

Ile Leu Glu Lys Asn Pro Asn Gly Phe Phe Leu Met Ile Glu Gly Gly

210 215 220

Arg Ile Asp His Ala Cys His Ala Asn Asp Val Ala Ser Ile Val Ala

225 230 235 240

Glu Thr Lys Glu Phe Asp Asp Val Val Gly Tyr Val Leu Asp Tyr Ala

245 250 255

Arg Arg Arg Gly Asp Thr Leu Val Ile Val Leu Ala Asp His Glu Thr

260 265 270

Gly Gly Leu Gly Ile Gly Leu Asn Tyr Gly His Ser Val Asp Ile Asp

275 280 285

Ser Ile Arg Arg Ile Asp Ala Ser Ile Glu Glu Met Ser Lys Glu Ile

290 295 300

Lys Ser Gly Gly Asp Ile Arg Asp Val Ile Arg Arg His Thr Gly Leu

305 310 315 320

Glu Leu Thr Asp Glu Glu Val Lys Glu Ile Glu Glu Ala Lys Asn Ser

325 330 335

Thr Asn Lys Tyr Ala Leu Gly Asn Ile Ile Gly Glu Ile Ile Ser Lys

340 345 350

Lys Leu

<210> 6

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

caggtccaac tgcaggagtc cggaggagga ctggtgcaag ctggcggctc cctgagactc 60

agctgcgtcg ccagcggcag gacatttagc agccacccca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggaaagg aaagggagtt cgtcgccgga attagctggt ccggcggcag cacacactac 180

gccgattccg tgaagggcag attcaccatc tccagggaca ccgccaagaa cacagtctac 240

ctccagatga actccctcaa gcctgaggac acagccgtgt actactgcaa cgctgctctg 300

tccgagagga cacctatcgc caccatgccc agccagtacg actactgggg ccagggcacc 360

caggtcaccg tgtcctcc 378

<210> 7

<211> 1542

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

ctcatccccg tggaagagga agaccccgcc ttttggaact gccaggccgc tcaagccctg 60

gacgtggcta aaaagttaca acccattcag acagccgcca agaacgtcat tctgtttctg 120

ggcgacggca tgggagtgcc cacagtgaca gccacaagaa tcctcaaggg ccaaatgaac 180

ggaaaactgg gacccgagac ccccctggcc atggatcagt ttccctacgt ggccctcagc 240

aaaacataca atgtcgacag gcaggtccct gactccgccg gaacagctac cgcctacctg 300

tgcggagtca agggcaacta caaaaccatc ggcgtgtccg ccgctgccag atacaatcag 360

tgcaacacca ccagcggaaa tgaggtgaca tccgtcatga acagggccaa gaaagccggc 420

aaggctgtgg gcgttgttac tacaagcaga gtgcagcacg cttcccctgc tggagcctat 480

gcccacacag tgaacaggaa ttggtacagc gatgccgacc tgcctgccga cgcccagatg 540

aatggatgcc aggatatcgc tacccagctg gtgtacaaca tggacatcga tgtgatcctg 600

ggaggcggaa ggatgtacat gttccccgag ggaacccctg atcccgagta cccttacgac 660

gtgaaccaga ccggcgtgag gaaggataag aggaacctcg tccaggagtg gcaagccaaa 720

caccagggcg cccaatatgt gtggaacagg accgccctct tacaagctgc cgacgatagc 780

agcgtgaccc acctgatggg cctgttcgaa cccgctgaca tgaagtacaa cgtgcagcag 840

gaccatacaa aggaccctac cttacaagaa atgacagagg tggccctgag ggtgctgagc 900

agaaacccca gaggctttta cctcttcgtg gagggcggca ggatcgacca cggacatcac 960

gagggaaaag cctacatggc cctgacagac acagtcatgt tcgacaacgc catcgccaaa 1020

gccaacgaac tcacctccga gctggataca ctcatcctgg tgacagccga tcactcccac 1080

gtgtttagct tcggcggata caccctgaga ggaaccagca ttttcggcct ggcccctagc 1140

aaggccctgg acagcaagag ctacacaagc atcctgtacg gaaatggccc cggatacgcc 1200

ctgggaggag gaagcaggcc cgacgtgaat gactccacca gcgaggaccc tagctaccag 1260

caacaggccg ccgtgcccct ggcctccgaa acccatggag gcgaagatgt ggctgtgttc 1320

gccaggggcc ctcaggctca cctggtgcat ggcgtgcagg aggagacatt cgtggcccac 1380

atcatggcct tcgccggatg tgtggagccc tacacagact gcaatctgcc cgcccctaca 1440

accgccacct ccatccctga tgccgctcat ctggctgctt ccccccctcc tctggccctg 1500

ctggccggcg ctatgctgct gctgctggct cccacactgt ac 1542

<210> 8

<211> 1410

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

agcccctccg gagtgagaaa cgtcatcatc ctgatcggcg acggaatggg atttagccag 60

ttacaactga ccaagctcgt ctacggccat ctcaacatgg aggatttccc ctacaccggc 120

attgaactga ccgactccct gtccggagaa gtgacagact ccgccgccgc cggaaccgct 180

atcgctaccg gcgtgaagac ctacaacagg atgatcagca ccaccaacgt gacaggaaag 240

ctggtcaacc tgaccaccct gctcgagatc gcccagatgc tgggaaaagc caccggcctc 300

gtcaccacca ccagaatcac ccacgccacc cccgctgtgt ttgcctccca tgtgcccgac 360

agggatatgg aggaggagat cgccaggcag ctgattctcc ataacgtcac cgtgctgatg 420

ggcggcggaa gggagaagtt ctccgaggag gtgctgaagc tcgccgagga ctatggctac 480

agcatcgtct acaccaggga ggacctggag aaagtcaagg acggaaaggt cctgggcctg 540

ttcgccgagg gccatctgcc ttacgtcctc gacagaagcg aggaagatgt cagcctgctg 600

gagatgacca agaaggctat cgagatcctg gaaaagaatc ccaatggctt ttttctgatg 660

attgagggcg gcaggattga ccacgcctgc cacgccaatg acgtcgcctc cattgtggcc 720

gaaaccaagg agttcgacga cgtggtcggc tacgtgctgg attatgccag gaggagaggc 780

gacacactgg tgatcgtgct ggccgaccat gaaaccggcg gactcggcat cggactgaac 840

tacggccatt ccgtggacat cgattccatt aggaggatcg acgccagcat cgaggagatg 900

agcaaagaga tcaagagcgg cggcgacatc agagacgtca tcaggaggca cacaggcctg 960

gagctgaccg atgaggaggt gaaggagatc gaggaggcca agaactccac caacaaatat 1020

gccctgggaa acatcatcgg cgagattatc agcaaaaagc tcggcgtggg cttcgtcagc 1080

cacaaacata caggcgaacc cgtgcctctg ctggcctacg gccccggcgc tgagaacttt 1140

gtgggcttta agcaccacgt cgacaccgct aaggtgatcg ccaagctgat gatcttcgga 1200

gacaggtcca tctccttcac catcaagggc gtcagcaaga ttaaaggcga cgtgacaggc 1260

gactacaggg tggacgaaag agacgcttac gccacactga tgctgctgct gggcgacctc 1320

gtggataccg aactggagaa cattgccgac atggataaca acggcatcat cgacctcctc 1380

gatgtgatgg ccatcttaca agctagctcc 1410

<210> 9

<211> 1452

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

atcatccctg tggaagagga gaaccccgac ttttggaaca gggaagccgc tgaagccctg 60

ggcgctgcta agaagctaca gcccgcccag accgctgcta aaaacctgat catctttctg 120

ggcgatggca tgggcgtctc caccgtgacc gctgccagga tcctgaaagg ccagaagaag 180

gacaagctgg gccccgagat ccctctggcc atggacaggt tcccttacgt ggctctgagc 240

aagacctaca acgtggacaa gcatgtccct gatagcggcg ccaccgctac agcttacctg 300

tgcggcgtca aaggcaattt ccagaccatc ggcctgagcg ccgccgctag gttcaaccag 360

tgcaacacca cccggggaaa cgaggtgatt agcgtcatga accgggccaa gaaggccggc 420

aagagcgtgg gagtcgtgac caccacaagg gtgcagcatg ctagccctgc cggcacatac 480

gcccataccg tcaatcggaa ctggtactcc gatgccgacg tccctgcttc cgccaggcag 540

gaaggatgtc aggacattgc cacccagctg atctccaaca tggacatcga cgtgatcctg 600

ggcggcggca ggaagtacat gttcaggatg ggaacccccg accccgagta ccctgatgat 660

tattcccagg gcggcacccg gctggatggc aagaatctgg tgcaggagtg gctggccaag 720

aggcagggag ctcggtacgt gtggaaccgg accgagctga tgcaggccag cctggatccc 780

agcgtgaccc atctgatggg cctgttcgag cccggcgata tgaagtacga gatccatcgg 840

gacagcacac tcgacccttc cctgatggag atgaccgaag ctgctctgag gctgctgtcc 900

cggaatccca ggggcttctt tctgttcgtg gagggcggcc ggattgatca cggacaccac 960

gagtccaggg cctacagggc cctgaccgaa accatcatgt ttgacgacgc catcgagagg 1020

gctggccagc tgaccagcga agaagacacc ctgtccctcg tgaccgccga tcactcccac 1080

gtgttctcct tcggaggcta tcccctgcgg ggctccagca tctttggact ggctcctggc 1140

aaggccaggg accggaaggc ctataccgtg ctgctgtacg gcaacggccc cggctacgtg 1200

ctgaaggatg gcgctcggcc tgatgtgacc gagagcgaga gcggctcccc cgaatacagg 1260

cagcagagcg ccgtgcccct cgatgaggag acccatgccg gcgaggatgt cgctgtcttt 1320

gcccggggac ctcaggccca tctggtgcat ggcgtgcagg aacagacctt tatcgctcac 1380

gtgatggctt tcgccgcttg cctcgagcct tataccgcct gtgacctggc ccctcctgct 1440

ggaacaacag ac 1452

<210> 10

<211> 1968

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

caggtgcaac tgcaagagtc cggaggaggc ctggtgcagg ctggaggaag cctgagactg 60

agctgcgtgg ctagcggcag aacctttagc tcccatccca tgggctggtt caggcaggcc 120

cctggaaagg agagagaatt tgtggccggc atctcctgga gcggaggaag cacccactac 180

gccgactccg tgaagggcag gtttaccatc agcagggaca ccgctaagaa cacagtgtac 240

ttacaaatga actctctgaa gcccgaggac acagccgtct attactgcaa tgccgctctc 300

agcgagagaa cccccatcgc caccatgccc agccagtacg actactgggg ccagggcacc 360

caggtcaccg tgtccagcag cggaggcggc ggaagcggcg gcggcggcag cggcggcgga 420

ggcagcctca tccccgtgga agaggaagac cccgcctttt ggaactgcca ggccgctcaa 480

gccctggacg tggctaaaaa gttacaaccc attcagacag ccgccaagaa cgtcattctg 540

tttctgggcg acggcatggg agtgcccaca gtgacagcca caagaatcct caagggccaa 600

atgaacggaa aactgggacc cgagaccccc ctggccatgg atcagtttcc ctacgtggcc 660

ctcagcaaaa catacaatgt cgacaggcag gtccctgact ccgccggaac agctaccgcc 720

tacctgtgcg gagtcaaggg caactacaaa accatcggcg tgtccgccgc tgccagatac 780

aatcagtgca acaccaccag cggaaatgag gtgacatccg tcatgaacag ggccaagaaa 840

gccggcaagg ctgtgggcgt tgttactaca agcagagtgc agcacgcttc ccctgctgga 900

gcctatgccc acacagtgaa caggaattgg tacagcgatg ccgacctgcc tgccgacgcc 960

cagatgaatg gatgccagga tatcgctacc cagctggtgt acaacatgga catcgatgtg 1020

atcctgggag gcggaaggat gtacatgttc cccgagggaa cccctgatcc cgagtaccct 1080

tacgacgtga accagaccgg cgtgaggaag gataagagga acctcgtcca ggagtggcaa 1140

gccaaacacc agggcgccca atatgtgtgg aacaggaccg ccctcttaca agctgccgac 1200

gatagcagcg tgacccacct gatgggcctg ttcgaacccg ctgacatgaa gtacaacgtg 1260

cagcaggacc atacaaagga ccctacctta caagaaatga cagaggtggc cctgagggtg 1320

ctgagcagaa accccagagg cttttacctc ttcgtggagg gcggcaggat cgaccacgga 1380

catcacgagg gaaaagccta catggccctg acagacacag tcatgttcga caacgccatc 1440

gccaaagcca acgaactcac ctccgagctg gatacactca tcctggtgac agccgatcac 1500

tcccacgtgt ttagcttcgg cggatacacc ctgagaggaa ccagcatttt cggcctggcc 1560

cctagcaagg ccctggacag caagagctac acaagcatcc tgtacggaaa tggccccgga 1620

tacgccctgg gaggaggaag caggcccgac gtgaatgact ccaccagcga ggaccctagc 1680

taccagcaac aggccgccgt gcccctggcc tccgaaaccc atggaggcga agatgtggct 1740

gtgttcgcca ggggccctca ggctcacctg gtgcatggcg tgcaggagga gacattcgtg 1800

gcccacatca tggccttcgc cggatgtgtg gagccctaca cagactgcaa tctgcccgcc 1860

cctacaaccg ccacctccat ccctgatgcc gctcatctgg ctgcttcccc ccctcctctg 1920

gccctgctgg ccggcgctat gctgctgctg ctggctccca cactgtac 1968

<210> 11

<211> 1836

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

caggtccaac tgcaggagtc cggaggagga ctggtgcaag ctggcggctc cctgagactc 60

agctgcgtcg ccagcggcag gacatttagc agccacccca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggaaagg aaagggagtt cgtcgccgga attagctggt ccggcggcag cacacactac 180

gccgattccg tgaagggcag attcaccatc tccagggaca ccgccaagaa cacagtctac 240

ctccagatga actccctcaa gcctgaggac acagccgtgt actactgcaa cgctgctctg 300

tccgagagga cacctatcgc caccatgccc agccagtacg actactgggg ccagggcacc 360

caggtcaccg tctccagctc cggaggcgga ggaagcggag gcggaggctc cggcggaggc 420

ggcagcagcc cctccggagt gagaaacgtc atcatcctga tcggcgacgg aatgggattt 480

agccagttac aactgaccaa gctcgtctac ggccatctca acatggagga tttcccctac 540

accggcattg aactgaccga ctccctgtcc ggagaagtga cagactccgc cgccgccgga 600

accgctatcg ctaccggcgt gaagacctac aacaggatga tcagcaccac caacgtgaca 660

ggaaagctgg tcaacctgac caccctgctc gagatcgccc agatgctggg aaaagccacc 720

ggcctcgtca ccaccaccag aatcacccac gccacccccg ctgtgtttgc ctcccatgtg 780

cccgacaggg atatggagga ggagatcgcc aggcagctga ttctccataa cgtcaccgtg 840

ctgatgggcg gcggaaggga gaagttctcc gaggaggtgc tgaagctcgc cgaggactat 900

ggctacagca tcgtctacac cagggaggac ctggagaaag tcaaggacgg aaaggtcctg 960

ggcctgttcg ccgagggcca tctgccttac gtcctcgaca gaagcgagga agatgtcagc 1020

ctgctggaga tgaccaagaa ggctatcgag atcctggaaa agaatcccaa tggctttttt 1080

ctgatgattg agggcggcag gattgaccac gcctgccacg ccaatgacgt cgcctccatt 1140

gtggccgaaa ccaaggagtt cgacgacgtg gtcggctacg tgctggatta tgccaggagg 1200

agaggcgaca cactggtgat cgtgctggcc gaccatgaaa ccggcggact cggcatcgga 1260

ctgaactacg gccattccgt ggacatcgat tccattagga ggatcgacgc cagcatcgag 1320

gagatgagca aagagatcaa gagcggcggc gacatcagag acgtcatcag gaggcacaca 1380

ggcctggagc tgaccgatga ggaggtgaag gagatcgagg aggccaagaa ctccaccaac 1440

aaatatgccc tgggaaacat catcggcgag attatcagca aaaagctcgg cgtgggcttc 1500

gtcagccaca aacatacagg cgaacccgtg cctctgctgg cctacggccc cggcgctgag 1560

aactttgtgg gctttaagca ccacgtcgac accgctaagg tgatcgccaa gctgatgatc 1620

ttcggagaca ggtccatctc cttcaccatc aagggcgtca gcaagattaa aggcgacgtg 1680

acaggcgact acagggtgga cgaaagagac gcttacgcca cactgatgct gctgctgggc 1740

gacctcgtgg ataccgaact ggagaacatt gccgacatgg ataacaacgg catcatcgac 1800

ctcctcgatg tgatggccat cttacaagct agctcc 1836

<210> 12

<211> 1878

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

caggtccaac tgcaggagtc cggaggagga ctggtgcaag ctggcggctc cctgagactc 60

agctgcgtcg ccagcggcag gacatttagc agccacccca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggaaagg aaagggagtt cgtcgccgga attagctggt ccggcggcag cacacactac 180

gccgattccg tgaagggcag attcaccatc tccagggaca ccgccaagaa cacagtctac 240

ctccagatga actccctcaa gcctgaggac acagccgtgt actactgcaa cgctgctctg 300

tccgagagga cacctatcgc caccatgccc agccagtacg actactgggg ccagggcacc 360

caggtcaccg tgtcctcctc aggtggtggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420

ggatcgatca tccctgtgga agaggagaac cccgactttt ggaacaggga agccgctgaa 480

gccctgggcg ctgctaagaa gctacagccc gcccagaccg ctgctaaaaa cctgatcatc 540

tttctgggcg atggcatggg cgtctccacc gtgaccgctg ccaggatcct gaaaggccag 600

aagaaggaca agctgggccc cgagatccct ctggccatgg acaggttccc ttacgtggct 660

ctgagcaaga cctacaacgt ggacaagcat gtccctgata gcggcgccac cgctacagct 720

tacctgtgcg gcgtcaaagg caatttccag accatcggcc tgagcgccgc cgctaggttc 780

aaccagtgca acaccacccg gggaaacgag gtgattagcg tcatgaaccg ggccaagaag 840

gccggcaaga gcgtgggagt cgtgaccacc acaagggtgc agcatgctag ccctgccggc 900

acatacgccc ataccgtcaa tcggaactgg tactccgatg ccgacgtccc tgcttccgcc 960

aggcaggaag gatgtcagga cattgccacc cagctgatct ccaacatgga catcgacgtg 1020

atcctgggcg gcggcaggaa gtacatgttc aggatgggaa cccccgaccc cgagtaccct 1080

gatgattatt cccagggcgg cacccggctg gatggcaaga atctggtgca ggagtggctg 1140

gccaagaggc agggagctcg gtacgtgtgg aaccggaccg agctgatgca ggccagcctg 1200

gatcccagcg tgacccatct gatgggcctg ttcgagcccg gcgatatgaa gtacgagatc 1260

catcgggaca gcacactcga cccttccctg atggagatga ccgaagctgc tctgaggctg 1320

ctgtcccgga atcccagggg cttctttctg ttcgtggagg gcggccggat tgatcacgga 1380

caccacgagt ccagggccta cagggccctg accgaaacca tcatgtttga cgacgccatc 1440

gagagggctg gccagctgac cagcgaagaa gacaccctgt ccctcgtgac cgccgatcac 1500

tcccacgtgt tctccttcgg aggctatccc ctgcggggct ccagcatctt tggactggct 1560

cctggcaagg ccagggaccg gaaggcctat accgtgctgc tgtacggcaa cggccccggc 1620

tacgtgctga aggatggcgc tcggcctgat gtgaccgaga gcgagagcgg ctcccccgaa 1680

tacaggcagc agagcgccgt gcccctcgat gaggagaccc atgccggcga ggatgtcgct 1740

gtctttgccc ggggacctca ggcccatctg gtgcatggcg tgcaggaaca gacctttatc 1800

gctcacgtga tggctttcgc cgcttgcctc gagccttata ccgcctgtga cctggcccct 1860

cctgctggaa caacagac 1878

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Glu Ser Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Gln Ala

20

<210> 14

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ser Leu Gly

Claims

1.一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由纳米抗体或其可变区片段与人胎盘碱性磷酸酶报告基因蛋白串联而成。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述人胎盘碱性磷酸酶报告基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，所述纳米抗体或其可变区片段与报告基因蛋白由连接肽(GGGGS)_n连接，其中n为1-6中的任一整数。

4.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述纳米抗体或其可变区片段位于融合蛋白的氨基端，所述报告基因位于融合蛋白的羧基端。

5.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述纳米抗体或其可变区片段位于融合蛋白的羧基端，所述报告基因位于融合蛋白的氨基端。

6.根据权利要求4或5所述的蛋白，其特征在于，其中n＝3。

7.根据权利要求6所述的蛋白，其特征在于，所述纳米抗体为抗CEACAM5纳米抗体。

8.根据权利要求7所述的蛋白，其特征在于，抗CEACAM5纳米抗体的可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2所述。

9.权利要求8所述融合蛋白在制备CEACAM5抗原免疫检测试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，其中可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3的纳米抗体为一抗，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2所述的抗CEACAM5纳米抗体为二抗。