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CN108472406A - 减少组织粘连的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents

减少组织粘连的方法、组合物和试剂盒 Download PDF

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CN108472406A
CN108472406A CN201780006110.0A CN201780006110A CN108472406A CN 108472406 A CN108472406 A CN 108472406A CN 201780006110 A CN201780006110 A CN 201780006110A CN 108472406 A CN108472406 A CN 108472406A
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Abstract

本发明提供了一种组合物，包含促凝血球蛋白原(因子V)和选自下组的至少一个因子：凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart‑Prower因子(因子X)，其中组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间，和其中至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间；其中所述组合物中的促凝血球蛋白原和所述至少一种因子的量通过使用以血浆构建的标准曲线的凝血酶原互补测定法推测在500mM NaCl的浓度下所观察到的所述组合物的活性来确定。

Description

减少组织粘连的方法、组合物和试剂盒
相关申请
本申请要求2016年1月7日提交的名称为“预防组织粘连的方法、组合物和试剂盒”的美国专利申请No.62/275,783；以及2016年4月8日提交的名称为“预防组织粘连的方法、组合物和试剂盒”的美国专利申请No.62/319,807的优先权，为任何目的将它们的全部内容引入本文作为参考。
技术领域
本文公开的是有效减少组织形成粘连的方法、组合物和试剂盒，例如：由外伤和手术引起的腹部粘连和其他组织粘连。
背景技术
腹部手术对腹膜腔构成重大的外伤事件。身体对外伤的自然反应是即刻的炎症应答，刺激几种类型细胞的活动，其中包括成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。不受任何特定理论的限制，这些细胞的过度活动产生大量胞外基质蛋白并启动结缔组织，其结果形成了腹膜粘连。术后粘连被认为在大多数腹内术后一周之内的患者中存在，而其后持续数年，有效变成与身体等同的一部分，可导致严重的医学后果，尤其包括疼痛、继发不育和小肠梗阻。尽管粘连在腹内手术中是普遍的，但在所有类型的手术中都会发生粘连。
附图说明
将结合附图进一步解释本发明，类似的结构在几个视图中以类似的数字表示。这些附图并不一定按照比例显示，反而通常重在说明本发明的原理。此外，一些特征可能被放大以显示特定部件的细节。
另外，图中所示的任何尺寸、规格等意在说明而非限制。因此，本文图中所示的具体结构和功能细节不应被解释为限制本发明，而应仅作为教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。
图1提供了本发明试剂盒和方法的实施例，显示在收集血浆之后使用该试剂盒制备根据本发明一些实施例的组合物所需的步骤。
图2A-2C是大鼠的腹腔照片，大鼠经历了盲肠擦伤和腹膜侧壁缺陷的手术操作，在处理后两周，用本发明组合物的一个实施例局部给药后与盐水对照相比的照片。
图3A-F显示了用本发明组合物的一些实施例处理后，分析大鼠粘连的定量实验结果。
图4A-C显示了用本发明组合物的一些实施例处理后，测量大鼠粘连的面积、等级或分数的定量实验结果。
图5显示了本发明试剂盒的实施例的照片。
图6、7和8显示了本发明试剂盒的实施例的图解。
图9A至9H显示了根据本发明组合物的一些实施例，凝血因子的校准曲线图：因子II(图9A和9B)、因子V(图9C)、因子VII(图9D)、因子X(图9E和9F)，和纤维蛋白原(图9G(对数曲线)和9H(线性拟合图))。
图10显示了针对本发明组合物的一些实施例的增加盐浓度的效果的实施例图解说明。
发明内容
在一些实施例中，本发明提供了纯化的组合物，包含：
促凝血球蛋白原(因子V)和选自下组的至少一个因子：凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart-Prower因子(因子X)。
其中所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间，和
其中所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间。
其中，所述组合物中的促凝血球蛋白原和所述至少一种因子的量是通过使用以血浆构建的标准曲线的凝血酶原互补测定法推测在500mM NaCl的浓度下所观察到的所述组合物的活性来确定。
在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原量的5％至95％。。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原量的25％至75％。在一些实施例中，用Clauss分析法检测所述组合物中纤维蛋白原的量。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物进一步包含：纤维蛋白稳定因子(因子XIII)，其中所述组合物中纤维蛋白稳定因子的量介于0.01IU/mL至100IU/mL之间。
在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于100％至600％之间。
在一些实施例中，所述组合物中凝血酶原的量与血浆中凝血酶原的量相比介于500％至2500％之间。
在一些实施例中，所述组合物中促凝血酶原激酶原的量与血浆中促凝血酶原激酶原的量相比介于500％至2500％之间。
在一些实施例中，所述组合物中Stuart-Prower因子的量与血浆中Stuart-Prower因子的量相比介于500％至2500％之间。
在一些实施例中，本发明提供了获得根据本发明一些实施例的组合物的方法，包括：
获得血浆样品，
通过将血浆样品填入阴离子交换柱以产生结合部分，和
通过用洗脱液洗脱结合部分以获得根据本发明一些实施例的组合物。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在用所述洗脱液洗脱结合馏分之前用洗液洗涤结合馏分的步骤。
在一些实施例中，所述血浆样品从选自下组的来源获得：进行手术的受试者、供体和商业上可获得的来源。在一些实施例中，所述血浆样品在5ml至500ml之间。
在一些实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至20mL。
在一些实施例中，在无菌条件下实施所述方法。
在一些实施例，本发明提供了一种给进行手术的受试者施用根据本发明一些实施例的组合物的方法。
在一些实施例中，所述组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少至少10％。
在一些实施例中，本发明提供了根据本发明一些实施例制备实施例组合物的试剂盒，包含：
(a)阴离子交换柱，
(b)多个注射器，其中每个注射器被构造为容纳洗液、洗脱液或洗脱物，
(c)洗脱物收集容器，
(d)所述洗液，
(e)所述洗脱液，和
(f)制备根据本发明一些实施例的组合物的说明书，
其中(a)至(e)是预先装配的。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的试剂盒进一步包含：
(g)血液收集容器，和
(h)血浆收集装置。
在一些实施例中，(a)是无菌的。
具体实施方式
为清楚公开而不限制本发明，本发明的详细说明书被分为下列几个部分描述或说明本发明的某些特征、实施例或应用。
本文提供的是有效减少或预防手术部位的组织粘连的方法、组合物和试剂盒。该方法、组合物和试剂盒是以本发明一些实施例的组合物为基础。不受任何理论的限制，由于受损组织中存在并暴露组织因子(TF)(本文也称作“凝血因子”)蛋白，因此这种组合物在出血和擦伤受损组织上快速活化。TF是凝血因子VII(FVII)的强力直接活化剂，也是俗称血液凝固的“外源性系统”的主要活化剂。
凝血因子包括但不限于：促凝血球蛋白原(因子V、FV)、凝血酶原(因子II、FII)、促凝血酶原激酶原(因子VII、FVII)、Stuart-Prower因子(因子X、FX)和纤维蛋白稳定因子(因子XIII、FXIII)。
定义
如本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非文中明确规定。在根据马库什组或其他替代分组来描述方面或实施例的情况下，本领域技术人员将认识到本发明由此也描述为基团的任何单独成员或成员亚基团。
如本文使用的术语“包含”、“包括”、“具有”及其语法变型将作为指定所述的特征、步骤或成分，但不排除添加一个或多个另外的特征、步骤、成分或基团。
当术语“大约”在数值之前时，术语“大约”是用来表示+/-10％。
如本文使用的“治疗受试者”是指给受试者施用一种物质以有效改善与某紊乱或疾病相关的症状，减轻紊乱或疾病的严重性，治疗紊乱或疾病，延缓紊乱或疾病进展或延迟紊乱或疾病发作。“治疗”是指治疗性处理和预防措施，其目的是预防紊乱，延迟紊乱发作或减轻紊乱的症状。需要治疗的人群包括已患有某疾病或病情，具有疾病或病情的倾向，和待预防疾病或病情的人群。本文公开的组合物在紊乱或症状发作之前给予，例如但不限于预防或减少组织粘连。
在(如通过缝合、钉、胶带等)将伤口的两个相对侧物理地强行合为一体的情况下，包括凝血因子(尤其是被因子例如但不限于因子VII、X、II和V直接或间接活化的那些凝血因子)在内的组合物的存在将增强该部位的凝血并促进更快愈合。因此本发明的方法、组合物和试剂盒的一些实施例可用于促进外伤(例如但不限于腹部手术，例如但不限于剖腹产手术)愈合。
如本文使用的“治疗有效量”是指某化合物或成分的量可有效实现改善受试者或其生理系统，包括但不限于消除症状、延迟紊乱发作、延缓症状进展和本领域技术人员酌情选择的其他指征。
如本文使用的术语“um”或“μm”是指微米，“g”是指克，“mg”是指毫克，“ml”是指毫升和“L”是指升。
如本文使用的，“血浆(plasma)”、“血浆(blood plasma)”和“血浆样品(bloodplasma sample)”可互换使用，是指血液的血浆部分，含有尤其是盐、酶和蛋白(包括免疫球蛋白(抗体)、凝血因子和白蛋白)，脂质和微泡以及纤维蛋白原，也可能含有血小板和血小板碎片。“血浆来源”可以但不限于来自自体的或单个供体血液的血浆、来自分馏的血浆、血浆池、低温贫乏血浆(cryo-poor plasma)、回收的血浆，以及血浆取出法收集的人血液的液体部分的血浆。
如本文使用的“血浆衍生的浓缩物”或“血浆衍生的浓缩组合物”是指已被处理从而保留包括凝血因子在内的某些血液蛋白的浓缩形式的血浆。不希望受任何理论的限制，本文公开的组合物可以在渗出和出血部位形成薄层、局部凝块而改善预防粘连活性。
如本文使用“除去纤维蛋白原的血浆衍生的浓缩物”或“除去纤维蛋白原的血浆衍生的组合物”或“外源性系统浓缩物”[“ESC”])是指已被处理而除去大多数纤维蛋白原并保留包括凝血因子的某些血液蛋白的浓缩形式血浆。“外源性系统浓缩物”(或“ESC”)是指大多数外源性系统凝血因子被保留在该组合物中的相同的组合物。不希望受到任何理论的限制，为了使受伤、外伤或出血部位仅释放内源性纤维蛋白原作为底物，从血浆中除去大部分纤维蛋白原(例如保留血浆纤维蛋白原总量的1-5％的纤维蛋白原)。可以使用几种方法获得除去纤维蛋白原的血浆。一种方法是在血液中使用生物相容聚合物，例如PEG、右旋糖酐、硫酸软骨素、肝素、透明质酸等，之后实施离心步骤以沉淀血液中的细胞成分和沉淀纤维蛋白原。由于仅可溶上层血浆层被收集进行进一步加工，因此沉淀的纤维蛋白原被除去。另一种方法包括利用基于阴离子交换的纯化步骤和从血浆中浓缩凝血因子的步骤。可改变任选的洗涤步骤来控制除去结合不紧密的纤维蛋白原的消耗水平，同时保留其他结合较紧密的凝血因子用于随后洗脱。已认识到有些条件下，保留一定量的纤维蛋白原可能是有利的。不希望受任何理论的限制，这些少量的纤维蛋白原可能充当有形成粘连倾向的部位发现的内源性纤维蛋白原的集结中心，但是它本身不足以形成能启动未受损部位形成粘连的纤维蛋白网。
如本文使用的“纯化的”是指受到至少一种物理或化学改进的组合物。一种改进的非限制性实例是过滤。
如本文使用的“实质上不含红细胞和白细胞”是指与初始材料相比，红细胞和/或白细胞低于0.5％，例如红细胞和/或白细胞低于0.1％。
如本文使用的“实质上不含颗粒”是指直径大于0.22微米或0.1微米的颗粒的含量低于0.5％，例如低于0.1％的水平。作为非限制性的实例，这种颗粒是指血液中任何来源的微泡(例如心肌细胞来源、血小板衍生、磷脂胶粒等等)。
尽管血液(血小板)中发现的最小细胞平均直径为3-5微米，但是有些微泡小于或等于200nm(0.2微米)。除去微泡的主要方法是实施过滤，因此滤器的孔径将决定将保留在制备品中的微泡的大小和相对量。已报道微泡的范围是100-500nm(Zubairova LD et al.，Sci Rep.20155：17611.)，和使用超速离心法已将TF包含的微泡表征为大小大致200-400nm(Ettelaie C et al.，J Extracell Vesicles.2014.Vol.3：23592.)。
如本文使用的表达“自体血液”是指一种组合物或体系或方法，其中使用单个供体的血液、组织和/或细胞，和其中从这个供体提取的血液、血浆、组织和/或细胞打算用于同一供体。“同种异体”的方法是使用来自一个或多个他人的血液、血浆、组织和/或细胞用于供体。自体产品可避免与使用他人的生物材料有关的一些风险。在无法收集自体血液的情况下，优选使用来自单个供体的血液。针对单个供体可筛查肝炎、艾滋病病毒、朊病毒、Creutzfeld-Jacob′s疾病等等的潜在污染。如果预处理以去除病毒和其他病原体，例如用有机溶剂-去污剂处理(例如但不限于可从Octapharma商业获得的)，可以使用同种异体的混合血浆。在使用单个供体血液或血浆的情况下，使用有机溶剂-去污剂处理的类似的病毒灭活步骤也可以使用非离子溶剂和洗涤剂现场进行实施。由于它们的非离子属性，这些洗涤剂不会与阴离子交换柱结合并可以通过洗涤去除(参见如非限制性实例Gebauer et al.，J Chromatogr A.1999；852(1)：83-6)。作为非限制性实例，可以从第三人的捐献品(收费和/或免费的)或收集物中获得供体血液或血浆，等等。
如本文使用的“组织粘连”是指组织和器官中间形成的异常纤维条，典型地发生在两种接近的受损组织/器官表面。损伤常常发生炎症和纤维蛋白沉淀在受损组织上。纤维蛋白作为止血剂封闭受损组织和细胞，例如巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞，尤其是渗入纤维蛋白凝块，并分泌胶原和其他基质形成永久性纤维粘连。尽管不是所有粘连都是有害的，但是有些粘连可转移到内部器官(例如卵巢或输卵管，引起继发性不育)，或形成围绕小肠环的粘连(引起病理性小肠梗阻)，或引起其他并发症。
如本文使用的“屏障”或“粘连屏障”是指内部组织和器官愈合过程中用于分隔它们的药物组合物或医学植入物。
包含因子V的组合物
在一些实施例中，本发明提供了纯化的组合物，包含：
促凝血球蛋白原(因子V)和选自下组的至少一个因子：凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart-Prower因子(因子X)。
其中所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间，和
其中所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间。
其中，所述组合物中的促凝血球蛋白原和所述至少一种因子的量是通过使用以血浆构建的标准曲线的凝血酶原互补测定法推测在500mM NaCl的浓度下所观察到的所述组合物的活性来确定。
在一些实施例中，该组合物是血浆衍生的浓缩物。
在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原量的5％至95％。所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的25％至75％。实施例在一些实施例中，使用Clauss法检测所述组合物中纤维蛋白原的量。
在一些实施例中，该组合物是除去纤维蛋白原的血浆衍生的浓缩物。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物进一步包含：纤维蛋白稳定因子(因子XIII)，其中所述组合物中纤维蛋白稳定因子的量介于0.01IU/mL至100IU/mL之间。
在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于100％至600％之间。
在一些实施例中，所述组合物中凝血酶原的量与血浆中凝血酶原的量相比介于500％至2500％之间。
在一些实施例中，所述组合物中促凝血酶原激酶原的量与血浆中促凝血酶原激酶原的量相比介于500％至2500％之间。
在一些实施例中，所述组合物中Stuart-Prower因子的量与血浆中Stuart-Prower因子的量相比介于500％至2500％之间。
在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于150％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于225％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于300％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于375％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于450％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于525％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于600％至750％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于675％至750％之间。
在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至675％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至600％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至525％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至450％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至375％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至300％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至225％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至150％之间。
在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于100％至600％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于150％至675％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于225％至600％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于300％至525％之间。在一些实施例中，所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于375％至450％之间。
在一些实施例中，选自由凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart-Prower因子(因子X)组成的组中的所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于500％至3000％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于1000％至3000％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于1500％至3000％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于2000％至3000％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于2500％至3000％之间。
在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至2500％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至2000％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至1500％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至1000％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至500％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于500％至2500％之间。在一些实施例中，所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于1000％至2000％之间。
在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的10％至95％。所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的实施例20％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的30％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的40％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的50％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的60％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的70％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的80％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的90％至95％。
在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至905％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至80％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至70％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至60％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至50％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至40％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至30％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至20％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的5％至10％。
在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的10％至90％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的15％至85％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的25％至75％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的35％至65％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原的量的45％至55％。
在一些实施例中，使用Clauss分析法检测所述组合物中纤维蛋白原的量。
在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白稳定因子的浓度介于0.01IU/mL(国际单位/毫升)至100IU/mL(国际单位/毫升)之间。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白稳定因子的浓度在0.05IU/mL(国际单位/毫升)至25IU/mL(国际单位/毫升)之间。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白稳定因子的浓度在0.1IU/mL(国际单位/毫升)至10IU/mL(国际单位/毫升)之间。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白稳定因子的浓度在0.5IU/mL(国际单位/毫升)至5IU/mL(国际单位/毫升)之间。在一些实施例中，血液中纤维蛋白稳定因子的浓度为大约1IU/mL。
在一些实施例中，任意所述因子(例如但不限于纤维蛋白原、促凝血球蛋白原、凝血酶原、促凝血酶原激酶原、Steward-Power因子或纤维蛋白稳定因子，或其任何组合)的浓度通过使用凝血试验和绘制标准曲线推断组织因子的活性来确定。图9A-9H显示了纤维蛋白原、促凝血球蛋白原、凝血酶原、促凝血酶原激酶原和Steward-Prower因子的标准曲线实例。
在一些实施例中，任何一个所述因子的浓度增加引起该因子的活性增加。在非限制性实例中，在所述组合物中凝血酶原的浓度是血浆中凝血酶原浓度的250％，因而组合物中凝血酶原的活性是血浆中凝血酶原活性的2.5倍。
在一些实施例中，这个方法中使用的凝血因子的总浓度可以达到正常血液中所发现浓度的20∶1或更高。在一些实施例中，因子浓度可以达到大约1.5至20∶1。在一些实施例中，因子浓度保持在大约3∶1至10∶1，或大约4∶1至8∶1，或大约5∶1至6∶1。改动这个比率的主要考虑因素是：(i)所用阴离子交换树脂的类型和有效洗脱凝血因子所需的盐浓度；(ii)当使用自体血液时，可采的初始血液量来自患者并且将取决于患者的健康状况，和待实施的手术程序的性质，和(iii)考虑可获得用于加工的血浆量，覆盖手术区域所需的提取物总体积，例如单个血浆捐献品中发现的量。
最终组合物中因子V的水平与血浆中的初始水平相比是至少大约10％。不受任何理论的限制，因子V是加因子II转变为因子IIa(即凝血酶原转变为凝血酶)的辅因子。
在一些实施例中，最终所述组合物中因子VII的水平至少等于血浆中的初始水平。不受任何理论的限制，因子VII是外源途径其他因子(因子II，因子V和因子X)活化所需的关键因子，因为它被暴露的TF直接活化并接着直接转向活化因子X，启动外源性凝血级联反应。
本领域技术人员会认识到，在将根据本发明一些实施例的组合物的离子强度降低至接近生理水平之后，和在钙离子缓冲液，例如柠檬酸盐或乙二酸盐或EDTA或其他的存在下，可以预期这种组合物可在大约2-25℃的温度下稳定至少24小时直至接近30天的时间。可以冷冻该组合物并保存甚至更长时间(长达六个月)。如上文所述添加稳定剂将显著延长这个时间。也可以添加无害冷冻保存剂(例如甘露糖醇、蔗糖、PEG和本领域已知的其他物质)提高冻/融后凝血因子活性的恢复。因此，本文公开的组合物可以立即或预先准备用于手术的患者。
在一些实施例中，在应用之前，根据本发明一些实施例的组合物可以用含钙溶液预活化实施例。在一些实施例中，为了开始凝血因子激活级联，以及为了促进血小板活化和通常在血小板中发现的凝血因子V和生长因子的释放(在这些实施例中可以保留血小板)，添加含钙溶液(例如CaCl2)至终浓度大约5-100mM可能是有利的。在一些实施例中，CaCl2的最终浓度是大约10-80mM。在一些实施例中，CaCl2的最终浓度是大约20-40mM。这种溶液也可以添加到洗脱缓冲液或平衡缓冲液中，或在应用之前添加到组合物中。
在一些实施例中，用于预防或减少组织粘连的组合物可以包括一个或多个下列性质：在手术部位本身形成限于组织的屏障。这个屏障可以包含内源性纤维蛋白原，其被提取物活化，以致以不允许粘连形成细胞的方式聚合；是止血剂并因此减少纤维蛋白沉积；不留下明显的现存纤维蛋白水平，例如在手术部位或伤口部位与纤维蛋白粘合剂关联(例如由于纤维蛋白原减少)；和可以在护理站或在附近便利场所(例如医院的血库)进行制备。本发明的组合物提供了根据本发明一些实施例的组合物的这种屏障。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物包含内源性微泡和磷脂。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物包含因子V、内源性微泡、磷脂或其任何组合。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物包含血小板。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物实质上除去了红细胞(RBC)和白细胞(WBC)，并包含小于大约1％RBC和/或1％WBC。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物具有小于大约0.5％RBC和/或0.5％WBC。
根据本发明一些实施例的制备组合物方法
在一些实施例中，本发明提供了根据本发明一些实施例的获得组合物的方法，包括：
获得血浆样品，
通过将血浆样品填入阴离子交换柱以产生结合部分，和
通过用洗脱液洗脱结合部分以获得根据本发明一些实施例的组合物。
在一些实施例中，所述血浆样品从选自下组的来源获得：进行手术的受试者、供体和商业上可获得的来源。在一些实施例中，所述血浆样品在5mL至500mL之间。
在一些实施例中，所述组合物包含促凝血球蛋白原(因子V)和选自下组的至少一个因子：凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart-Prower因子(因子X)。
其中所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间，和
其中所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间。
其中，所述组合物中的促凝血球蛋白原和所述至少一种因子的量通过使用以血浆构建的标准曲线的凝血酶原互补测定法推测在500mM NaCl的浓度下所观察到的所述组合物的活性来确定。。
在一些实施例中，所述组合物进一步包含纤维蛋白稳定因子(因子XIII)，其中所述组合物中纤维蛋白稳定因子的浓度介于0.01IU/mL至100IU/mL之间。
在一些实施例中，从阴离子交换柱洗脱获得的组合物是血浆衍生的浓缩物。
在一些实施例中，从阴离子交换柱洗脱获得的组合物是除去纤维蛋白原的血浆衍生的浓缩物。
在一些实施例中，在无菌条件下实施该方法。
在一些实施例中，所述阴离子交换柱是无菌的。
在一些实施例中，所述洗脱液是无菌的。
在一些实施例中，该方法进一步包括在用洗脱液洗脱结合馏分前用洗液洗涤结合馏分的步骤。
在一些实施例中，所述洗液是无菌的。
在一些实施例中，所述血浆样品从选自下组的来源获得：进行手术的受试者、供体和商业上可获得的来源。
在一些实施例中，所述血浆样品在5mL至500mL之间。
在一些实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至20mL。
在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为1mL至20mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为5mL至20mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为10mL至20mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为15mL至20mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至15mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至10mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至5mL。
在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至5mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为1mL至5mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为2mL至5mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为3mL至5mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为4mL至5mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至4mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至3mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至2mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为0.5mL至1mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为1mL至4mL。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的柱床体积范围为2mL至3mL。
在一些实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在1∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在5∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在10∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在15∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在20∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在25∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在30∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在35∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在40∶1至50∶1之间。在一个实施例中，所述阴离子交换柱的树脂的量为血浆：树脂在45∶1至50∶1之间。
在一些实施例中，所述血浆样品包含1至50柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含1至40柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含1至30柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含1至20柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含1至10柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含10至50柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含20至50柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含30至50柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含40至50柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含10至40柱体积。在一些实施例中，所述血浆样品包含20至30柱体积。
在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与1至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与2至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与3至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与4至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与5至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与6至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与7至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与8至10柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与9至10柱体积的高盐缓冲液接触。
在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至9柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至8柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分分与0.5至7柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至6柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至5柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.4至4柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至3柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至2柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与0.5至1柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与1至9柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与2至8柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与3至7柱体积的高盐缓冲液接触。在一些实施例中，所述洗脱包括将结合部分与4至6柱体积的高盐缓冲液接触。
在一些实施例中，所述高盐缓冲液包括500mM至1000mM盐溶液(例如但不限于NaCl、KCl等)。在一些实施例中，所述盐溶液是500至1000mM NaCl(例如但不限于500mMNaCl、750mM NaCl、1000mM NaCl等)。
在一些实施例中，该方法任选包括洗涤步骤，其中用0.3至20柱体积的低盐溶液洗涤结合部分。在一些实施例中，所述低盐缓冲液是0mM至200mM的盐溶液(例如但不限于NaCl、KCl等)。在一些实施例中，低盐溶液是0至100mM NaCl(例如但不限于0mM NaCl、25mMNaCl、50mM NaCl、75mM NaCl等)。
在一些实施例中，用1至20柱体积低盐溶液洗涤结合馏分。在一些实施例中、用5至20柱体积低盐溶液洗涤结合馏分。在一些实施例中、用10至20柱体积低盐溶液洗涤结合馏分。在一些实施例中，用15至20柱体积低盐溶液洗涤结合馏分。在一些实施例中，用1至15柱体积低盐溶液洗涤结合部分。在一些实施例中，用1至10柱体积低盐溶液洗涤结合馏分。在一些实施例中，用1至5柱体积低盐溶液洗涤结合部分。在一些实施例中，用5至15柱体积低盐溶液洗涤结合部分。在一些实施例中，用5至10柱体积低盐溶液洗涤结合部分。在一些实施例中，用10至15柱体积低盐溶液洗涤结合部分。
在一些实施例中，以与之前(填料)步骤相同的方向从柱中洗掉结合弱或非特异性蛋白。因此，可使用大约0-500mM离子强度，典型地大约50-250mM的缓冲液或无缓冲盐溶液来洗柱，通过其连接含洗液的注射器，并压下活塞推动溶液通过柱，或利用自动化方案。洗涤方向通常地与血浆的洗涤方向相同。典型的缓冲液是基于柠檬酸盐或乙二酸盐的缓冲液，但可以使用其他生理缓冲液(例如磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐)pH典型地是大约pH 5.0-8.5、大约pH 6-8，或大约pH 6.5-7.5。
在一些实施例中，在使用自体或单个供体(例如一个家族成员或其他供体)血浆的情况下，第一步是收集血液和分离血浆馏分。来自手术受试者或供体的血液收集在含抗凝溶液的容器中。例如，这是含柠檬酸盐的真空采血管(例如标准血液收集管)，或包含柠檬酸盐缓冲液，例如柠檬酸盐磷酸葡萄糖腺嘌呤(CPD-A)的标准收集袋。在真空器中含柠檬酸盐的溶液可以包含其他赋形剂，例如典型地用于收集富含血小板血浆的那些赋形剂(例如枸橼酸盐葡萄糖抗凝溶液，溶液A(“ACD-A”)或枸橼酸盐葡萄糖抗凝溶液，溶液B(“ACD-B”)，也含有葡萄糖和腺苷；由例如但不限于Citra Labs供应)。也可以使用其他抗凝溶液(例如但不限于其他基于柠檬酸盐的溶液，例如CPD-A或其他的、基于乙二酸盐的溶液、EDTA-溶液、肝素溶液、肝素化真空器等等)。根据本发明一些实施例的组合物中某组分的最终浓度应采用血浆中该成分浓度的大约2至10倍，例如但不限于4至6倍。大约50％的血容量由细胞部分组成，主要是红细胞，收集血容量分别应是最终体积的至少4倍到至多20倍。相应地，为制备大约10至20ml根据本发明一些实施例的组合物，收集大约100至200ml的血液。这些容量的血液根据实施者的方便收集在任意数量和大小的真空器或容器中。无菌血液收集的标准设备可以用于收集血液，和市场上可买到用于此目的的很多血液收集设备、袋和各种类型真空管。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物来源于自体血液。利用自体血浆可消除与使用商业上可获得的血液制品有关的风险。在很多情况下，不论是由于手术受试者可能不能给出血液，或医院可能没有配备收集和维持自体血液或血浆的设备，也都可以使用来自已经筛查过病原体的单个供体的血浆单位。另一个有效的安全血浆来源是商业上可获得的病毒灭活的人血浆。然而血液或血浆来源不需要分血型，因为根据本发明一些实施例的组合物中发现了很少或不含A、B或Rh抗原的红细胞，或者白细胞。这允许使用不相容血型，使任何个体都可以献血，例如已经筛查过危险病原体的家族成员或第三人。
自体血液衍生的产品还具有消除了传染病(主要通过血液生存的病毒和/或朊病毒疾病)风险的优点。任选在本发明方法的一些实施例中，可以使用来自单个供体的筛查过的血液捐献品，例如用于医院输注的任何标准单位血浆、冻干血浆(LyoplasN，DRK-Blutspendedienst West)。为了降低与同种异体血液有关的潜在风险，可以用非离子有机溶剂-去污剂处理供体血浆除去病毒(例如Triton X-100、土温80、TNBP和其他类似特性的物质)并使用所述方法和试剂盒。也可以利用商业上可获得的合并血浆，它们已用有机溶剂-去污剂预处理，或已经过本领域已知的任何其他类型病毒灭活程序(例如但不限于Octapharma)。
在一些实施例中，使用同种异体血浆(例如来自相容供体给予受试者的血浆)。同种异体血浆是可以但不限于献血获得的血液制品。
在一些实施例中，由于血浆在冷藏时可以稳定数日，或冷冻时可以稳定数月，因此在手术前实施自体血液收集也是可行的，例如预先计划手术的情况下(例如在证实怀孕的情况下进行剖宫产手术)。
在一些实施例中，血浆可以保存达到大约24小时。在一些实施例中，血浆可以在大约4摄氏度(例如在标准冷库中)保存达到六天。在一些实施例中，血浆可以冷冻保存长达三至六个月(例如在达到大约-18℃至-30℃的冷冻温度的标准冰箱中)。在一些实施例中，血浆是上面命名的任何来源的同种异体血浆(例如但不限于匿名供体、商业获得的病毒灭活血浆，或其组合)。
在一些实施例中，为了减轻患者或供体的压力，也可能抽出血浆同时将红细胞返回体内，例如但不限于使用血浆取出法。这种技术是本领域熟知的并是生产商业目的血浆的标准方法(参见例如Octapharma中关于血浆收集的信息：http://octapharmaplasma.com/donor/)。
在一些实施例中，血液收集因而可以在护理站(例如手术室(OR))，或者配备有必要的静脉切开术和血浆分离的标准设备的隔离设施(例如医院血库或血浆收集中心)中实施。
在使用不记名捐献(例如但不限于血库血浆)或商业可获得的病毒灭活血浆(例如但不限于的情况下，在一些实施例中，第一步是使用标准技术解冻血浆。
任选地，在尚未灭活病毒的非自体血浆的一些实施例中，可以实施有机溶剂-去污剂处理(SD处理)。这包括血浆内混入0.5至3％v/v体积的非离子有机溶剂-去污剂。这种原料的非限制性实例是吐温80、NP-40、Triton X-100(TX-100)，及其他。有机溶剂-去污剂和血浆充分混合并允许培养至少30分钟以溶解病毒膜。在实施SD处理的情况下，将阴离子交换剂填料后需要另外的洗涤步骤以去除有机溶剂-去污剂。在一些实施例中，在用低盐溶液洗涤步骤前，使用含或不含盐的缓冲液对SD处理血浆进行至少5柱体积，例如至少10柱体积的另外的洗涤步骤。
在一些实施例中，通过优化洗液和洗脱液实施除去纤维蛋白原，使得从阴离子交换柱或其他类型歧管中去除大多数结合相对不紧密的纤维蛋白原(与其他凝血因子相比)，同时保留其他凝血因子。在一些实施例中，在血浆填入阴离子交换柱或含阴离子交换基质的其他类型歧管之前，通过使用生物相容聚合物或生物相容聚合物的混合物从血浆中沉淀来除去血浆中的纤维蛋白原，。在一些实施例中，去除纤维蛋白原是通过提取物的阴离子交换纯化期间的洗涤步骤完成的。除去纤维蛋白原的血浆是指含有不超过大约0.3g/升，大约0.1g/升或大约0.05g/升纤维蛋白原的血浆。
任选，在一些实施例中，为了从血浆除去纤维蛋白原以产生根据本发明一些实施例的组合物，生物相容聚合物的聚合溶液或固体粉末可以用注射器加入真空器采血管中，或在收集袋/容器(例如但不限于含柠檬酸缓冲液(例如但不限于CPD-A)以的标准收集袋/容器提供的标准血浆袋含柠檬酸缓冲液(例如但不限于CPD-A)的标准血浆袋)中提供。在一些实施例中，使用阴离子交换(AEX)柱除去根据本发明一些实施例的组合物中的纤维蛋白原。在一些实施例中，在血浆去纤维蛋白原过程中可以使用聚合物例如聚乙二醇(PEG)(例如Li et al.Thromb Res.1995 79(4)：395-403.)。在血浆去纤维蛋白原过程中也可以使用其他聚合物(右旋糖酐，透明质酸，硫酸软骨素，聚赖氨酸，或任何其他生物相容性聚合物(Iverius PH and Laurent TC.Biochim Biophys Acta.1967 133(2)：371-3)。添加聚合物也可以减少红细胞(RBC)裂解(Kameneva，et al.，ASAIO J.2003 49(5)：537-42.)。由于可获得的生物相容聚合物(例如但不限于右旋糖酐和PEG)和生物聚合物(生物来源的聚合物，例如肝素、透明质酸和硫酸软骨素)，和可获得的分子量范围多种多样，这个步骤可能需要根据所选择的聚合物进行优化。在一些实施例中，所述管也包含高分子量生物相容聚合物以促进纤维蛋白原沉淀。在一些实施例中，在管中加入生物相容的聚合物。在一些实施例中，所述生物相容聚合物选自PEG、右旋糖酐、硫酸软骨素、肝素或透明质酸。利用很多制造商提供无菌的并且内部维持固有水平负压(真空)的真空管，通过注射通过橡皮帽或塞子允许容易地添加少量聚合物溶液。可以根据实施者(例如但不限于医师)的方便使用其他技术。
本文描述的组合物是从哺乳动物血液(临床应用的人血液，或动物血液例如兽医应用)产生的，例如自体血液，或已经筛查过病原体的供体血液。而且，接触血浆的设备没有被再使用，因此不需要没有毒性物质或缓冲液(例如典型地用于多次运行之间进行洗柱的NaOH)。此外，该方法不要求凝血因子与其他血液蛋白和成分完全纯化和分离。因此本文描述的方法一个主要优点是需要增加凝血因子的相对和绝对浓度，但仅要求部分纯化即可。这与任何已知的标准血浆衍生商品形成鲜明对比。
在一些实施例中，本方法去掉了工艺要求，例如恒定且可控流动，监视各种参数例如流速、压力、UV吸光率、pH、传导率，等等，由此消除了专用设备和维护和监控这些参数人员的需要。本文描述的方法的另外的进一步涉及在柱上使用入口和出口过滤器。人们会认识到保留小颗粒(例如通常3-5um宽的微泡、血小板碎片和完整血小板)可能是有利的，因为这些颗粒利于内源性血液凝固，携带高水平因子V，以及用于装配凝血因子复合物的磷脂源。然而，去除较大的成分可能是有利的，例如红细胞和免疫(白细胞)细胞，它们可能堵塞阴离子交换柱，发生裂解而释放炎性分子或者反之增强炎症，因为血浆收集过程中可能无意地升高这些细胞。
血浆与红细胞和白细胞分离的步骤可以使用本领域已知的方法实施。在一些实施例中，通过离心进行分离。在一些实施例中，使用惰性凝胶组合物将血浆和血小板与红细胞和白细胞分开，例如本领域已知的富血小板血浆(PRP)分离剂(商业产品的非限制性实例包括 THT[例如http://sportsmedicine.stryker.com/Product/RegenKit-THT/73/RegenKit-THT-Autologous-Platelet-Rich-Plasma-Brochure；PLATELET http://www.cabru.com/public/001BC7006T.pdf]；和其他的)。
在一些实施例中，通过离心进行分离，由此在离心前将生物相容聚合物(例如可用于从血液中沉淀纤维蛋白原的聚合物)加入血液，从而产生除去纤维蛋白原的血浆。该物相容聚合物可以在收集血液时或收集后加入血液中。除去纤维蛋白原的血浆可以通过例如离心血液而制备。通过这种方式可以获得至少部分除去纤维蛋白原和RBC和WBC的根据本发明一些实施例的组合物。
在一些实施例中，本发明的方法包括将血浆填入AEX柱，要求方向如上文所述保留颗粒。将含血浆的注射器直接或通过接头与柱连接来实施这个步骤。在一些实施例中，通过Luer锁紧机构，通过软管或通过任何其他机构连接注射器。
在一些实施例中，压下注射器的活塞推动所述血浆通过所述阴离子交换柱。外源性系统的主要凝血因子(例如因子II、VII和X)和与其相关的因子(例如因子V)通过它们的gla-结构域与树脂内部的阴离子交换官能团相互作用，或通过它们与gla-结构域承载蛋白而与柱紧密结合。
在一些实施例中，下一步，从柱中洗脱有或没有微泡、血小板及其碎片和磷脂的凝血因子和相关因子，有或没有微泡、血小板及其碎片和磷脂。在一个实施例中，洗脱物洗脱(根据本发明一些实施例的组合物)被收集在洗脱物洗脱收集容器中，例如瓶子、注射器等等。在一些实施例中，洗脱物洗脱收集容器含有稀释剂，例如以减少洗脱盐浓度(包括但不限于水和/或任何药物可接受的缓冲液或溶液)。根据本发明一些实施例的组合物的洗脱是通过用包括高盐浓度盐的洗脱缓冲液洗脱而实现的。不受任何理论的限制，带负电荷的盐离子与结合分子上的负电荷产生竞争。典型的盐及浓度是例如包含大约100-2000mM NaCl或大约250-1000mM或大约500-800mM NaCl的柠檬酸盐缓冲液。钙盐，例如大约5-100mM或大约10-40mM的CaCl2可以加入洗脱缓冲液中。不受任何理论的限制，一些凝血因子被游离钙离子活化。另外，血小板被钙离子活化，由此增加有效相互作用表面并释放凝血因子，例如凝血因子V，作为凝血因子V的另外来源。
在一些实施例中，可以用几种方法进行洗脱，例如洗脱物进入安装在柱另一端的低置低的容器或第二个注射器。推动洗脱注射器活塞将迫使洗脱液通过柱并进入第二个注射器。为了使柱接触几次高离子浓度，从而提高洗脱效率，溶液可以通过该柱返回至洗脱注射器，和再返回。该容器可以是任何其他合适的容器，例如无菌喷雾瓶。
在一些实施例中，调节洗脱缓冲液中的高盐。血液的生理盐浓度相当于大约290-320mOsm，由大约145-160mM浓度的NaCl来提供。在一些实施例中，所述盐浓度调节至大约100至750mM。在一些实施例中，所述盐浓度调节至大约150至350mM。在一些实施例中，所述盐浓度调节至大约150至275mM。优选降低盐浓度以避免高渗终产品，以及减少盐不稳定因子V和/或其他盐不稳定因子降解。另外，在这个步骤中确定调节提取物最终浓度的比率。盐调节可以通过以下方式进行，通过添加水或无盐或低盐缓冲液，或通过实施洗脱步骤进入已含有量被预先测定的水或缓冲液的容器，例如喷雾瓶、注射器或其他容器。
已知的粘合剂、凝血因子浓缩物和屏障的缺点和危险是多重的。
为了商业目的，PPSB馏分产品(简称：凝血酶原[因子II]、促凝血酶原激酶原[因子VII]、Stuart因子[因子X]，和抗血友病因子B[因子IX])已被描述为制备其他血浆蛋白(例如凝血酶)的中间体，或描述为抗凝疗法的解毒剂(以凝血酶原复合浓缩物(“PCC”)形式)。然而这些方法主要与分离这四种因子有关。血液中与PPSB因子正常有关的另外因子，例如促凝血球蛋白原(因子V、FV)和磷脂，不能持续存在于工业已知的制备过程。因子VII(FVII)是另一个不稳定因子，在商业PCCs中通常发生降解。根据缺少或存在(以可变量)因子VII，PCCs通常被描述为3-因子或4-因子PCCs。相应地PCC浓度通常根据较稳定的凝血因子IX(FIX)的相对浓度来计算。
另外，PPSB馏分的商业制备依赖于很多零件的机械、冗长和复杂加工过程(例如缓冲液和血浆储存罐、大柱、专用离心机例如连续流动离心机、色谱仪、各种监视仪和计量器、冷冻干燥、灌注机器等等)，大量专职人员，以及处理来自大量供体池的大容量血液以产生血浆池。这些是可行的商业过程方法的处理量和要求的结果，适用于生产许多剂量的药物。相比之下，本文描述的方法针对每位患者，从少量血浆(通常单个血浆单位重量小于0.5公斤)实施，因此可以在护理站或附近实施，是快速的——在单次手术时间内，以及按需实施——需要不超过一个操作者。
生产血液制品例如PCCs的另外复杂因素是要依赖大量同源献血者的血浆库。这要求两个病毒去除步骤，多数管理机构(例如但不限于血浆衍生的医学制品的EMA指南8.1.1.节
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/07/WC500109627.pdf)规定的必要条件，需要更多的时间和加工过程。因此，加工所需的最少时间是数小时至数天。因此，现有方法和本文描述的方法的根本差异是这个方法适用于针对单个患者在护理站(例如但不限于手术室)，在手术过程中需要使用一段时间进行实施。
此外，工业上使用的大多数病毒灭活步骤，例如有机溶剂-去污剂处理或纳米过滤，将完全去除脂质成分(例如微粒、血小板和血小板碎片和磷脂)。
已知方法的另一个缺点是为储存和运输，产品无疑应是稳定的，典型地通过添加赋形剂和稳定剂，和典型的冗长和昂贵的冻干程序，进一步需要另外的专用设备和设施。本方法根据要求实施并产生可立即使用的提取物，省去这个步骤。
因此，在一些实施例中，本发明是一种无需使用笨重设备(例如贮罐、泵、各种监视仪、缓冲液储存器、连续离心机、灌注管线等等)从最小体积(5ml至500ml)全血中快速制备少量凝血因子的方法，包括PPSB和相关的辅因子(例如因子V、磷脂等等)。
人们会认识到本文详述的不同程序中流动的方向性(填料、洗涤和从柱中洗脱)对于加工过程中保留的颗粒类型具有重要性。
在一些实施例中，本发明组合物可能具有数量减少的病毒和/或细菌群，以前在医院环境中例行实施的血浆筛查中没有发现这点。
根据本发明一些实施例的组合物的给药方法
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，包括给进行手术的受试者施用根据本发明一些实施例的组合物。
在一些实施例中，本发明的组合物在给药之前稀释1至5倍，例如但不限于1∶1稀释、1∶2稀释、1∶3稀释、1∶4稀释，或1∶5稀释。稀释可以用生理溶液，例如盐水。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少至少10％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少至少15％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少至少20％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少至少25％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少10％至25％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少15％至25％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少20％至25％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少10％至20％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少10％至15％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少15％至20％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少至少10％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少至少15％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少至少20％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少至少25％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少10％至25％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少15％至25％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少20％至25％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少10％至20％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少10％至15％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连量(即大量粘连)的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连量相比减少15％至20％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少至少10％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少至少15％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少至少20％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少至少25％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少10％至25％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少15％至25％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少20％至25％。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少10％至20％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少10％至15％。在一些实施例中，根据本发明一些实施例的组合物以足以减少手术部位粘连面积的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连面积相比减少15％至20％。
在一些实施例中，所述组合物包含促凝血球蛋白原(因子V)和选自下组的至少一个因子：凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart-Prower因子(因子X)，
其中所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间，和
其中所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间；
其中，所述组合物中的促凝血球蛋白原和所述至少一种因子的量通过使用以血浆构建的标准曲线的凝血酶原互补测定法推测在500mM NaCl的浓度下所观察到的所述组合物的活性来确定。
在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原量的5％至95％。在一些实施例中，所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原量的25％至75％。在一些实施例中，使用Clauss法检测所述组合物中纤维蛋白原的量。
在一些实施例中，所述组合物进一步包含纤维蛋白稳定因子(因子XIII)，其中所述组合物中纤维蛋白稳定因子的浓度介于0.01IU/mL至100IU/mL之间。
在一些实施例中，使用标准分级量表测定粘连严重性。在一个实施例中，标准分级量表是：
在一些实施例中，通过喷雾实施给药。在一个实施例中，可在腹膜的全部面积上或腹膜的一部分面积上喷雾。在一些实施例中，给药是预防性的。
在一些实施例中，该方法包括将根据本发明一些实施例的组合物应用于手术区域，其中该组合物是液体。该组合物可以喷射(直接应用)于整个手术区域或根据本领域技术人员(例如外科医生)酌情决定靶向的区域。这可以用任何标准方法进行(例如但不限于，使用喷雾瓶、压缩气雾装置例如用于纤维蛋白粘合剂的装置、与注射器连接的喷嘴调节装置等等)。如果以本文描述的方式实施，施用这种提取物将有助于活性部位的快速凝固，其中轻微出血仍可能普遍存在，由此减少进一步出血，并产生薄且稠密的纤维蛋白覆盖层。在缺乏激化蛋白例如TF的情况下，不出血的、最初的、天然的和/或未受损的组织不会对凝血因子提取物产生影响。这个方法的最终结果是减少腹部或其他手术后粘连形成的可能性，例如减少粘连量、减少粘连严重性、减少粘连面积，或其任何组合。
在一些实施例中，提供了根据本发明一些实施例的组合物用于预防或减少组织粘连。在一些实施例中，提供了治疗有效量的根据本发明一些实施例的组合物在制备用于预防或减少组织粘连的药物中的用途。该组合物包含治疗有效量的根据本发明一些实施例的组合物，和任选的药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，手术包括腹部手术。手术可以是腹腔镜手术。在一些实施例中，手术包括脊椎手术、盆腔手术、肌腱手术、心脏手术、附器手术包括腕管手术等等。就腹部手术而言，例如通过喷雾将组合物给予腹腔以预防或减少腹膜组织形成粘连。
不受任何理论的限制，根据本发明一些实施例的组合物，当与血液或渗出的纤维蛋白原接触时，可以形成薄且稠密的纤维蛋白层，但是仅在渗漏的脉管或受损组织上，它能够起到止血层和形成粘连屏障的作用。纤维蛋白层的形成可能是由于存在组织因子(TF)。TF由正常情况下不暴露于流动血液的细胞表达，例如亚内皮细胞(例如平滑肌细胞)包绕脉管的细胞(例如成纤维细胞)。对血管的损伤，例如手术期间，使这个蛋白暴露而与该组合物和内源性纤维蛋白原相互作用。以这种方式形成的纤维蛋白层会对纤溶酶裂解敏感，这是从愈合组织除去血纤维蛋白的自然过程。不受任何理论的限制，组合物任意过度接触无损伤的器官、组织或脉管是无害的，因为根据本发明一些实施例的组合物在缺乏某些凝血因子的情况下的凝固能力有限，例如大大促进和加速血液凝固的组织因子。手术或伤口部位缺少额外的基于纤维蛋白的凝固大大减少粘连形成的风险。
在本方法、组合物或用途的一些实施例中，受试者是哺乳动物，例如人类。兽医方法也进一步包括在本发明中。
试剂盒
在实施例中，本发明提供了制备根据本发明一些实施例的组合物的试剂盒，包含：
(a)阴离子交换柱，
(b)多个注射器，其中每个注射器被构造为容纳洗液、洗脱液或洗脱物，
(c)洗脱物收集容器，
(d)洗液，
(e)洗脱液，和
(f)制备根据本发明一些实施例的组合物的说明书，
其中(a)至(e)是预先装配的。
在一些实施例中，根据本发明一些实施例的试剂盒进一步包含：
(g)血液收集容器，和
(h)血浆收集装置。
在一些实施例中，(a)是无菌的。
在一些实施例中，所述组合物包含促凝血球蛋白原(因子V)和选自下组的至少一个因子：凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart-Prower因子(因子X)。
其中所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间，和
其中所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间；
其中，所述组合物中的促凝血球蛋白原和所述至少一种因子的量通过使用用血浆构建的标准曲线的凝血酶原互补测定法推测在500mM NaCl的浓度下所观察到的所述组合物的活性来确定。
在一些实施例中，所述组合物进一步包含纤维蛋白稳定因子(因子XIII)，其中所述组合物中纤维蛋白稳定因子的浓度介于0.01IU/mL至100IU/mL之间。
在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括用于收集血液和制备血浆的部件。因此，本文提供了一种由自体或单个供体制备根据本发明一些实施例的组合物的试剂盒，包含
a.血液收集器；
b.血浆收集装置；
c.洗涤缓冲液和洗涤缓冲液用品；
d.洗脱缓冲液和洗脱缓冲液用品；
e.阴离子交换柱或歧管；
f.任选包含稀释缓冲液的洗脱物收集容器，；和
g.制备根据本发明一些实施例的组合物的说明书。
在一些实施例中，所述试剂盒是无菌的。在一些实施例中，所述阴离子交换柱是无菌的。
在一些实施例，洗涤缓冲液用品是用于将洗涤缓冲液施加于柱中的装置，和洗脱缓冲液用品是用于将洗脱缓冲液施加于柱中的装置。在一些实施例中，洗涤缓冲液用品和洗脱缓冲液用品是独立的注射器。
在一些实施例中，本发明的试剂盒在图5中示出。
在一些实施例中，通过使用小的手持式预填充的色谱离子交换柱(例如但不限于GE的HiTrap柱)或过滤器(例如但不限于Natrix Separations Inc.的 HD-QMembrane Adsorbers)或速装微型柱，其可以与无菌预平衡树脂组合以快速形成这样的柱，来制备足够进行单个手术的量的来自血浆的浓缩物(即凝血提取物)。使用简单的缓冲液和聚合物、塑料或玻璃注射器和小瓶，无需笨重的装置或生物学或药学试剂。除了一些实施例需要离心机之外，无需实验室机器。可以加入简单的注射泵和阀门以利于自动或半自动制备。试剂盒可以无菌递送，并设计使整个过程保持手术室要求的无菌。不要求终末杀菌。当利用无需有机溶剂-去污剂处理的自体血浆或单个供体血浆时，在这个过程中不破坏血浆的脂质成分例如磷脂、血小板或血小板碎片，和微泡。由于处理快速，保留有足够浓度的不稳定因子V(因子V)，在制成凝血因子复合物时可立即直接滴定盐浓度。整个过程快速，1-2小时内完成，并可以术前或术中在床边、在手术室，或者在附近设施(例如医院血库)中实施。
在一些实施例中，所述色谱离子交换柱是阴离子交换柱。所述阴离子交换柱可以是强的(例如但不限于Q阴离子交换部分)或弱的(例如但不限于二乙氨乙基(“DEAE”)部分)。Q或DEAE部分的交联剂可以包括任何商业上可获得的交联剂。另外，树脂基质(例如但不限于丙烯酸、琼脂糖、右旋糖酐等)可以是任何商业上可获得的树脂基质。
在一些实施例中，所述色谱离子交换柱是灭菌的。在一些实施例中，使用WO2015109246中公开的方法对所述色谱法离子交换柱进行灭菌。在一些实施例中，使用J.S.Moore et al.(1996)，“Protection of Protein A-Sepharose Columns Irradiatedto Sterilization Doses”Radiat.Phys.Chem.(47)：1，pages 161-165中公开的方法对色谱离子交换柱进行灭菌。
在一些实施例中，血浆袋(例如软质容器)与一个系统连接，该系统含有从袋中经导管抽出血浆的注射泵，例如但不限于标准输液装置、针或其他可接受类型的导管。
柱内部的分离基质(例如树脂或凝胶)被设计用来结合和保留阴离子蛋白和化合物的化学基团功能化。典型的基团是“Q”和“QAE”和“DEAE”。本领域技术人员知晓这些全部都是阴离子交换剂。典型的这样的柱是由厂商制造的，例如但不限于GE、NatrixSeparations Inc.、TOSOH-HAAS和其他公司，或者定制。也可以使用速装柱，例如空柱结合无菌预平衡树脂从而可以快速组装。功能化基质的性质和类型因不同的厂商而不同，并可以包括但不限于SephadexTM、琼脂糖、基于聚丙烯酰胺的凝胶、基于甲基丙烯酸酯的树脂和其他聚合物和结构。
在一些实施例中，所述注射器接着可以与阴离子交换歧管连接，例如含有被正电荷基团功能化的分离基质的柱。树脂的量可以根据血浆量决定，例如血浆：树脂为大约1∶1至50∶1。
在一些实施例中，所述注射器与预先连接的试剂盒预先相连，其中试剂盒包含：(a)无菌阴离子交换柱，(b)多个无菌注射器，其中每个无菌注射器被配置容纳无菌洗液、无菌洗脱液或洗脱物，(c)无菌洗脱物收集容器、(d)无菌洗液，和(e)无菌洗脱液。
大型色谱装置(例如柱)被设计为使用泵和分离机械设备(例如FPLC)驱动，而小型预填充柱、过滤器或其他类似的歧管可以通过人手施加力量来驱动。在一些实施例中，手工实施本发明组合物的制备方法。在一些实施例中，制造本发明组合物的方法是自动化的。在一些实施例中，自动方法可以比手动方法提供更高产量，例如但不限于促凝血球蛋白原(因子V)、凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)，或其任何组合的产量，例如但不限于产量高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，自动方法可以比手动方法进一步提供更高产量，例如但不限于Stuart-prower因子(因子X)、纤维蛋白稳定因子(因子XIII)或其任何组合的产量，例如但不限于产量高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
在一些实施例中，可以使用机械手，例如但不限于专用注射器和/或泵。
在一些实施例中，AEX歧管通过单向阀门连接，其允许注射泵将血浆从软质容器例如血浆袋中抽出，然后推动它通过另一个单向阀门，排空注射器进入AEX歧管或柱中。
在一些实施例中，AEX歧管通过三通旋塞阀连接，通过这样的方式允许从注射器抽回溶液进入置于注射泵中的工作注射器，然后使用注射泵的动力驱动内容物通过阴离子交换歧管。
在一些实施例中，三通旋塞阀门的三个入口连接1)注射泵中的工作注射器，2)注射器，其包含血浆、洗液、洗脱液和任何其他所需溶液，并在这些溶液导入工作注射器之后去除，3)阴离子交换歧管。操纵阀门，工作注射器活塞被注射泵的动力拉下，从而允许含交换溶液的注射器向工作注射器的流动。一旦足量的血浆或溶液被加入工作注射器，则再次操纵阀门，通过注射器泵的动力推动工作注射器活塞，从而允许流体从工作注射器向阴离子交换歧管的流动。为了收集废物(例如已经通过阴离子交换歧管的血浆和洗液)或收集洗脱物，另一个注射器、废物袋或容器可以与阴离子交换歧管出口相连。这样的系统允许几乎免手动，自动或半自动地执行试剂盒和方法。这种系统的另一个优点是它很少或几乎不需要手工操作阴离子交换歧管，除了注射器的连接或拆除，这可以握住注射器壳体实施且与入口和出口没有任何物理接触。预先装配的试剂盒将几乎不需要或事实上不需要手工操作注射器或AEX歧管或柱，因而减少试剂盒部件的破坏和/或减少污染，和/或减少所需劳力或手术过程中实施很多操作的典型地大量占用的人员。
除去较大的细胞同时保留较小的血小板、碎片和微泡可以使用过滤器实现。在一个实施例中，大约1-20um(例如5-10um)的过滤器设置于，例如但不限于活塞和用于吸出血浆的注射器之间的三通旋塞阀。已经设计出各种过滤器与注射器或luer附件一起使用且商业上可获得(例如带有包埋5um过滤器的血液吸出针；商业上可获得的不同材质的具有固定孔径的luer附件过滤器，例如PVDF、醋酸纤维素、PES和其他材料；和其他过滤方案)。这种过滤器将除去较大细胞成分(RBCs、WBCs)同时允许较小成分(例如血小板、微泡)进入。另一个可能性是使用这种过滤器作为柱的入口过滤器。可以连接第二过滤器以将这些颗粒保留在柱内部。第二过滤器可以与柱的出口相连且孔径通常低于或等于1um。商业过滤器存在适合这个类项的不同大小，例如但不限于1um、0.8um、0.65um、0.45um、0.22um和0.1um。所述过滤器也可以是柱的出口滤器。本领域技术人员会认识到柱内部使用典型大小的树脂(例如但不限于大约10-200um，通常大约40-100um)，即使填充(压缩)树脂层会给微米大小的颗粒例如血小板或微粒留出足够的空间嵌入柱中，并由此与血浆一起洗脱。为了获得微粒成分(例如血小板和微泡)，以这种方式排列柱子，从较小孔径过滤器(即第二滤器)的方向洗脱，与填料和洗涤方向相反，由此驱动洗脱物返回通过较大孔径过滤器(即第一个滤器)。作为选择，过滤器可以拆除用于洗脱。
在一些实施例中，使用本文的方法，采用与填料和洗涤相同的方向进行洗脱，由此迫使洗脱物通过小孔径过滤器(即第二滤器)，也可能获得实质上无颗粒的提取物，这在一些情况下是有利的。用很多其他方法也可能实现这点，例如使用小孔径过滤器(＜＝1um)提升血浆，或过滤器反向排列在柱中(即＜＝1um小孔径过滤器作为入口滤器)，或兼用二者，或简单地从另一侧填入柱，或在施加材料之前使用小孔径滤器进行另外的终过滤步骤。
在一些实施例中，所述洗脱容器是喷雾瓶。在一些实施例中，所述洗脱容器是注射器和借助喷雾附属装置实现喷雾。在一些实施例中，带有或不带有流入压缩气体以释放雾气这一选项的附属装置，例如喷头，与注射器连接以使混合物的递送表面最佳化。因此洗脱注射器可以以直接收集用于发放的混合物所需的方向与柱出口相连。
在一些实施例中，所述洗脱容器含有一组(事先被加入)的稳定剂：一组凝血因子抑制剂例如肝素(小于0.1IU/ml)、精氨酸或赖氨酸(例如大约1-100mM、大约5-80mM、大约10-40mM)(Stief，TW Clin Appl Thromb Hemost 2007.13：2，146-153)，或任何其他抑制剂(例如苄脒)。不希望受任何理论的限制，少量抑制剂通过抑制这些酶原的低水平活化或活性足以防止凝血复合物过早活化，但是不足以防止凝血因子协同活化(例如通过添加钙或与组织因子接触)。而且，这些少量的抑制剂在血液中将被稀释至边缘水平。也可以使用直接凝血酶抑制剂，例如临床使用的Dabigatran，或因子Xa抑制剂例如Edoxaban。
在一些实施例中，洗脱溶液通常是与洗液相似的溶液，除了离子浓度(例如NaCl离子)显著更高。典型的洗脱液“强度”是大约150-2000mM NaCl、典型地大约200-1000mMNaCl，更典型地大约250-800mM NaCl。所需洗脱强度取决于阴离子交换部分和载体颗粒类型。
在一些实施例中，洗脱液的体积可以是大约0.5-3柱体积，典型地大约0.75-2.5柱体积，例如大约1-2柱体积。
在一些实施例中，在使用之前提供试剂盒部件的一个或多个包装可以包括无菌部件和/或密封容器。该包装有标签，标签上可以带有政府机构规定的通告，例如国家食品与药物管理局(FDA)，通告反映联邦法院下的机构批准制造、使用或销售用于人类使用的包装。不同国家的规定有差异，但是各个程序是本领域技术人员熟知的，本文提供的组合物和方法相应遵守。
在一些实施例中，所述组合物是局部给药的含水的组合物，例如被包装用作喷雾剂。所述容器可以使喷雾瓶，例如，带有一个广口喷嘴以喷射大面积，或可选择定位喷雾的套管。喷嘴、套管和/或喷雾液滴的大小可以根据应用进行调整。
这种试剂盒可用于在提供血浆的情况下，例如商业上可获得的来源，制备根据本发明一些实施例的组合物。尽管公开的全部试剂盒中可以存在分开的洗涤缓冲液用品和洗脱缓冲液用品，但是也可以一个或多个试剂盒中提供单个装置且所述装置将用作洗涤缓冲液和洗脱缓冲液用品。
在一些实施例中，试剂盒被改进用于从供体制备根据本发明一些实施例的组合物，包含：
a)血液收集容器(例如管)；
b)血浆收集装置；
c)洗涤缓冲液和洗涤缓冲液用品；
d)洗脱缓冲液和洗脱缓冲液用品；
e)阴离子交换柱或歧管；
f)洗脱物收集容器，任选包含稀释缓冲液；和
g)制备根据一些实施例的组合物的说明书。
在本发明的试剂盒的一些实施例中，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液用品可以独立地是能够与该系统相互连接的注射器或容器。
在一些实施例中，试剂盒可以被包装在单个包装中，或者可以以多个零件提供。
通过下列实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。
实施例
实施例1：制备包含至少一个凝血因子的组合物
概述：
首先使哺乳动物(例如但不限于奶牛、猪、马等)放血，收集1000-2000ml血液，为纯化和浓缩根据本发明一些实施例的组合物做准备。血液以3000RPM(大致1700RCF)离心10至15分钟制备血浆。血浆被收集、过滤，并通过AEX柱或其他歧管以浓缩带负电荷的血液因子。对剩余水平的因子II、VII、X和相关辅因子促凝血球蛋白原(V)进行功能测试。
在另一个实施例中，使用人源血浆制备至少包含因子V的组合物。
在另一个实施例中，通过改变洗涤和洗脱缓冲液和/或在离心步骤中包含一种或多种生物相容聚合物来制备除去纤维蛋白原的ESC。
下面提供具体的实施例。
实验1：离心步骤中使用PEG除去纤维蛋白原。
两头猪放血并将血液收集在ACD-A抗凝溶液中(每头猪1升)。
血液在50毫升管中离心以分离细胞相和血浆相，并收集血浆。血浆在使用前进行冷冻保存(-20℃大约一个月)。然后融化血浆，并在相同条件下，用不同浓度不同平均分子量(MW)PEG聚合物溶液再次离心。实施Clauss法分析血浆中保留水平的纤维蛋白原，与无PEG离心的血浆产生的标准曲线相比(参见例如Clauss方法(Morse，E.E.and Viswanathan，U.“Determination of Fibrinogen in Plasma，”Annals of Clinical and LaboratoryScience，1978，8∶438-441和参考文献：Clauss A，″Rapid Physiological CoagulationMethod for the Determination of Fibrinogen，″Acta Haematol，1957，17：237-46中描述了“凝血酶凝固时间方法”)。
表1显示了获得的结果。低MW PEG(例如5％PEG 1450)或低浓度高MW PEG(例如1％PEG 6000)除去纤维蛋白原的效率低。然而通过变换PEG的MW和浓度，都实现了部分和实质上完全除去纤维蛋白原(使用Clauss法检测不到纤维蛋白原水平)(例如5％PEG 3350、2.5％PEG 6000和5％PEG 6000)。
表1：PEG沉淀后血浆纤维蛋白原的平均相对水平
PEG处理 剩余纤维蛋白原
5％PEG 1450 109％*
5％PEG 3350 41％
1％PEG 6000 106％*
2.5％PEG 6000 63％
5％PEG 6000 0％
*推断的纤维蛋白原水平高于对照血浆的100％是由于试验的精确水平有限。
实验2：从猪血浆制备包含至少一个凝血因子的组合物。
准备HiTrap Q FF 1ml柱，手动将猪血浆(15-20ml)通过该柱(使用连接的注射器)。用低盐柠檬酸盐缓冲液洗涤该柱，接着用高盐缓冲液(500-750mM)洗脱。测试三个不同的洗脱条件，并使用改良PT(凝血酶原)试验检测除去了各个因子的血浆中凝血因子II、V、VII和X水平。用柠檬酸盐缓冲液稀释后制备最终量4ml的提取物。
表2列出了使用预填充柱从猪血浆手动制备包含至少一个凝血因子的组合物后，实施三个独立实验检测的凝血因子II(FII)、凝血因子V(FV)、凝血因子VII(FVII)和凝血因子X(FX)的相对产量。
表2：
洗脱强度 FII FV FVII FX
500mM 71％ 99％ 未检测 未检测
600mM 116％* 11％ 106％* 80％
750mM 105％* 14％ 102％* 84％
表3列出了上面详述实验中使用预填充柱从猪血浆手工制备得到的组合物的有作用浓度(即凝血因子活性)。洗脱强度较高得到的产量较高。使用20毫升的输入血浆，凝血因子可以浓缩至血浆中发现的它们的内源性水平的4-5倍。对于不稳定因子：凝血因子V，所有运行中被回收大于9％，和凝血因子VII被完全回收。
表3：
洗脱强度 因子II 因子V 因子VII 因子X
500mM 267％ 35％ 未检测 未检测
600mM 578％ 53％ 531％ 400％
750mM 523％ 71％ 509％ 420％
*推断的凝血因子水平高于输入血浆的100％是由于试验的精确水平有限。
实验3：从人血浆制备包含至少一个凝血因子的组合物。
人源血浆使用相同的柱，并填料，如上实施例所述。各种参数(洗涤、洗脱、填料量)不同实验可以不同。表4、5和6列出了所检测的不同条件及其结果。
表4详述了实验(运行4、运行5、运行6、运行7、运行8和运行9中使用的检测参数(填料体积、洗涤强度、洗脱强度、最终体积、任选添加2mm MgCl2或有机溶剂-去污剂(SD)处理)。
表4：
*填充SD处理的血浆后使用10柱体积(10ml)的不添加盐缓冲液洗涤该柱。
表5详述了从包含至少一个凝血因子的组合物回收的凝血因子，该组合物使用预填充柱手动获得。
表5：
表6详述了从包含至少一个凝血因子的人组合物回收的纤维蛋白原，该组合物使用预填充柱手动获得。
表6：
运行4 运行6 运行7 运行9
与输入血浆相比 7.2％ 7.3％ 6.0％ 38％
纤维蛋白原回收率 1.4％ 1.5％ 1.8％ 8％
SD处理(通过添加1％TX-100和1％NP-40实施)后因子V水平处于4％或以上回收率，或与输入血浆水平相比提取物中功能性因子V水平有15％。其他因子以高于90％的效率回收，表明在这个方法和试剂盒中可以使用SD处理的血浆。
除了降低洗脱强度时，其他情况下酶因子的回收率处于67％或以上，和在一些实验中，在80％以上，包括不稳定因子VII。
PPSB凝血因子的浓度系数的选择与未经处理的血浆中发现的水平相比介于大约3至5倍之间，尽管改变最终体积和/或输入血浆的填充体积这个系数可能会变化。例如，如果洗脱体积减少一半，凝血因子水平与未经处理的血浆中发现的水平相比将在6至10倍之间。
当进行盐洗涤步骤时，纤维蛋白原的除去高于98％，但用无盐缓冲液洗涤时仅仅大约92％。因此，简单地通过实施低盐洗涤步骤有可能至除去大多数纤维蛋白原，或反之则保留其显著高的浓度。低盐洗涤缓冲液可以包括但不限于50mM至150mM NaCl。
这些数据是使用带注射器的预填充柱，使用人手力量手动驱动获得的。
实施例2：包含至少一个凝血因子的组合物的体内试验
概述：
在大鼠中实施体内实验。然而小尺寸的大鼠不可能抽出以本文提出的试剂盒操作的足量血液(需要取出＞20％的血容量)。因此，人血浆被处理以用于5-10只大鼠(每只大鼠大约1ml，对于所有大鼠相当于大约50-100毫升的初始血液)。
麻醉大鼠并暴露大鼠腹膜进行实验。在大鼠中实施粘连形成操作(盲肠擦伤)。实施盲肠擦伤后，将根据本发明一些实施例的组合物应用于擦伤部位和周围。对照大鼠用盐水处理。其后两周，处死动物并对粘连分数进行全盲分级。选取代表性的图片进行比较。
动物实验：
麻醉六(6)只成年白色Wistar大鼠并进行中线切开，之后使用手套，用湿纱布托着取出盲肠，为了刺激轻度的粘连形成，用湿纱布轻轻擦伤15次，(根据AFS标准记分为1-2级)。缝合四只对照动物，用1ml测试组合物处理两只测试动物，该组合物是从人血浆制备的，大约5X浓度的凝血因子II、VII和X，和15％因子V(与输入血浆相比)。从输入血浆中除去超过95％的纤维蛋白原。使用带33G针的1ml注射器喷雾应用组合物。接着用与对照动物相同的方法缝合测试动物。两周后，动物被末次麻醉并沿着切口瘢痕打开，进行粘连分级。四(4)只对照动物中有三(3)只显示1-2级粘连。没有测试动物显示出任何粘连形成的迹象。因此包含至少一个凝血因子的组合物显示出预防手术粘连形成的能力。表7列出了这个盲肠擦伤大鼠模型的实验结果。
表7：
图2A-2C显示了代表性的图片。
对着照相机用钳子握持粘连(存在的情况下)：图2A显示出IV级粘连[盲肠至腹膜]的动物1(对照)；图2B显示出用新鲜血浆衍生的浓缩物处理的动物中的I级粘连。粘连在脂肪组织和腹膜壁之间，但是盲肠无粘连；图2C显示了如图2B(测试)相同的动物。为了更好地说明盲肠没有任何粘连，将它从腹腔中拉出来。
该结果表明ESC有效减少粘连分级和数量。
实施例3：抗粘连技术的评价
实施以下实验来评价腹膜侧壁有缺陷的盲肠擦伤诱导模型后预防手术粘连形成
研究终点：
粘连诱导程序后13-17天终止实验并用不同种类的处理品进行处理，包含新鲜和冻/融材料，和添加活化剂(CaCl2)的材料，和阳性对照血纤蛋白粘合剂组。处死动物并根据标准美国生育协会(AFS)分级方案进行粘连严重性分级。
实验设计原理/材料和制备方法
试验原理
盲肠擦伤诱导粘连形成并在擦伤盲肠邻近处产生2x1cm的腹膜侧壁缺陷。测试材料施用至擦伤后的盲肠，以及腹膜侧壁缺陷。事后根据它们的外观和韧性按照标准AFS评分量表进行粘连分级。
最初的考虑
考虑了测试项目的所有可获得信息，例如以前类似材料(例如血纤蛋白粘合剂)的功效数据。测试项目是血液衍生的浓缩提取物，不含其他化学活性成分并因此不大可能引起任何疼痛和痛苦，或具有任何侵蚀性或刺激性作用。
选择测试系统的理由
选择的啮齿动物物种是大鼠。使用实验室品系通常使用的健康年轻成年动物。这个大鼠模型是提供本组合物预防粘连功效的最早信息的起始步骤。
测试组规模的理由
进行两组实验。每组实验使用三组总共16只大鼠。每组实验由只接受盐水的对照组(5-6只动物)和两个实验组组成。在实验1中，这些是新鲜的或冻/融材料。在实验2中，这些是含CaCl2活化剂(25mM CaCl2，在应用前5-10分钟添加)和血纤蛋白粘合剂(FS；Evicel)的新鲜材料。每个测试组包括5-6只动物。动物总数是根据以前的研究，证明了这是产生有意义信息的每组动物的最少数量。个体动物之间的粘附严重程度是可变的。
给药途径的理由
明显腹膜外伤后手术粘连形成，例如可通过打开腹腔并盲肠擦伤连同毗连腹膜切除(1x2cm正方形)来诱导。然后通过类似真实手术所用方式从高规(31)胰岛素注射器滴下或喷雾出测试材料，将其施用于擦伤部位及其紧邻的环境。
材料和制备方法
实验1
表8提供了实验1中使用的处理的描述。
表8：
*提取物是从人血浆经由AEX通过减少体积达到要求的浓度而制备的
实验2
表9提供了实验2使用的处理说明。
表9：
*提取物是从人血浆经由AEX达到要求的浓度而制备的
实验模型-动物
以下实施例使用雄性Lewis大鼠(得自Harlan Laboratories，以色列)。研究开始时大鼠的体重是200-250gr。每组的最低和最高体重是组平均重量±10％。驯化周期是5天。使用永久性标记(达到24小时实验)和笼卡片识别大鼠。
根据国立卫生研究所(NIH)以及评价和认证实验动物管理协会(AAALAC)进行动物处理。动物放在聚砜(PSU)笼中(4-6只/笼)，带有颗粒饲料和透亮聚碳酸酯瓶装饮用水设备的不锈钢顶架；卧具：使用蒸汽杀菌的清洁稻壳，和垫底材料与笼子至少每周两次更换。
动物不限量采食商业啮齿动物饮食。动物可以自由获取从市政供应中获得的高压灭菌饮料水。动物居住于具有足够的新鲜空气供给的标准实验室条件下。动物保持在气候受控环境中。温度范围在20-24℃之间和相对湿度(RH)在30-70％之间，12小时光和12小时黑暗周期。
为了适应该研究，到货就检查动物。手术后，24小时后检查动物以确保它们已经恢复。为了启动粘连发生，动物维持到处理后13-17天，然后处死。进行常规检查和动物管理。“以色列动物实验委员会”批准后并按照“以色列动物福利法案”实施这项研究。
测试程序
所有测试动物随机分配进行各个处理。
实验设和条件：给药途径、剂量水平和体积
测试组的构成
表10显示了本实验使用的测试组的构成、动物数量、体积和给药途径。全部溶液在室温下使用。
表10：
实验之前3天或当天，在给予测试剂之前测量每只大鼠的体重。
测试材料从高规针滴下或喷雾至手术诱导粘连部位(擦伤的盲肠)而处理大鼠。使用两个注射器将血纤蛋白粘合剂应用于相同部位，模拟血纤蛋白粘合剂实际应用程序。
程序如下：(1)给予测试品后13-17天戊巴比妥末次麻醉动物。(2)打开腹部并暴露腹膜和盲肠。(3)根据标准AFS记分，根据0(无粘连)至4(不损害其下器官便无法除去的持久粘连)的标准分级尺度进行粘连分级。(4)记录暴露的腹膜或盲肠，以及任何粘连的图片。
结果
本研究过程中没有报道有害作用。对照和测试组的全部动物正常增加体重。记录无发烧、冷淡行为、缺少食欲、社会隔离行为或死亡。表11显示了对所有实验组(实验1和实验2)的全部动物记录的体重增加。全部动物正常地增加重量，且没有一只动物体重减轻。平均重量增加31.14gr/周(+/-0.36gr)。具体而言，对于实验1，处理前测定(体重以克测定)日期是4/17/2016，而处理后测定(体重以克测定)日期是4/24/2016和5/5/2016。对于实验2，处理前测定(体重以克测定)日期是5/15/2016，而处理后测定(体重以克测定)日期是5/21/2016和5/29/2016。
表11：
表11显示了实验过程中记录的动物体重结果。全部动物正常增加重量。
在第一个实验中，对照组(对照)接受盐水，处理组(新鲜)接受新鲜测试材料和冷冻试验组(冷冻)接受冷冻试验材料。在第二个实验中，对照组(对照)接受盐水，钙活化剂组(新鲜+CaCl2)接受含CaCl2活化剂的新鲜材料和血纤蛋白粘合剂(FS)组接受血纤蛋白粘合剂。
图3A-F显示了第一个实验的结果。图3A-C显示了针对各个动物绘制的数据。图3D-F显示了95％置信区间的平均数据。
图4A-C显示了实验1和2混合测试组与血纤蛋白粘合剂组和对照组的平均数据。
在第一个实验中，对照动物显示粘连可能性最高的大量粘连，而新鲜和冷冻测试组同样有效地减少了粘连严重性(分级和面积)。第一个实验的数据表明对照和测试组之间清晰的具有统计学显著意义的差异，各测试组之间没有显著性差异(图4A-C)。实验2用于重复第一个实验，但增加了引起粘连严重性减少的生化途径信息。为此用与实验1相同的方法制备测试材料(不同因子的活性水平差异＜10％，未显示)，但是在施用之前5-10分钟添加CaCl2。
钙是凝血内在途径的活化剂。为了测试我们关于外来途径的活化作用方式的假设，实施这个预活化。粘连预防途径之间的主要差异是外来途径对组织损伤(通过与组织因子相互作用)的响应，而内在途径可以被动地使用钙活化。这个含义是外来途径活化仅在最倾向于形成粘连的部位发生，而内在途径活化对材料作用部位的特异性较低。因此添加钙改善测试材料粘连预防活性表明内在途径包含在引起粘连预防的生化途径中。
也测试了用不同生化作用方式的另一个实验组，其应用血纤蛋白粘合剂。血纤蛋白粘合剂是具有止血活性的血浆制品。血纤蛋白粘合剂在施用之处延展产生厚且高度交联的血纤维蛋白层，因而潜在减少启动粘连过程的成纤维细胞渗透。
该结果表明用CaCl2预活化的测试材料与第一个实验中的新鲜和冷冻试验材料得到了类似的结果(CaCl2活化组的粘连面积和分级都在实验1中新鲜和冷冻材料获得的值之间，未显示)。因此合并三个测试组进行更多分析(两个实验的对照组也合并)，图4A-C。血纤蛋白粘合剂(FS)组的作用比测试材料较少提及，与对照组相比，严重性(分级)或粘连面积都不具有统计学显著性差异，这与本方法和试剂盒制备的测试材料不同(尽管看到血纤蛋白粘合剂组的所有测试参数倾向于减少粘连严重性)。
表12显示了实验1中测试的所有动物的各个数据(粘连面积、粘连面积分级、分级尺度和说明)。
表12：
表13显示了实验2中测试的所有动物的各个数据(粘连面积、粘连面积分级、分级尺度和说明)。
表13：
动物编号 面积(mm2) 记分(分级X面积) 分级 说明
1 53 156 3 新鲜+CaCl2
2 103 303 3 新鲜+CaCl2
3 2 2 1 新鲜+CaCl2
4 163 476 3 新鲜+CaCl2
5 0.04 0.04 1 新鲜+CaCl2
6 8 8 1 FS
7 105 205 2 FS
8 73 193 3 FS
9 166 486 3 FS
10 26 78 3 FS
11 131 491 4 FS
12 152 602 4 对照
13 45 130 3 对照
14 200 800 4 对照
15 220 820 4 对照
16 0.1 0.1 1 对照
实验所分析大鼠的各个数据的检查结果支持上述分析结论(参见例如表12和13)。第一，粘连诱导方案产生手术粘连：8/11(72％)对照动物显示出最大的粘连分级(4)，和2/11(18％)显示出3级粘连。两个实验中仅一只对照动物显示出1级粘连(9％)。第二，测试材料无论新鲜的，冷冻的，有或没有活化的，都能预防手术粘连形成。60％的处理动物显示出仅1级/2级粘连，和仅1/15(6.7％)显示出4级粘连。第三，血纤蛋白粘合剂(FS)比测试材料有效性低，因为FS处理动物的2/6(33％)显示出1级/2级粘连，其余的显示出3级和4级粘连。FS减少手术后粘连总面积方面有效性也较低。
结论
总之，本文描述的试剂盒制备的材料减少手术粘连。
本发明的组合物在冷冻之后，用或不用CaCl2预活化都减少粘连的量。而且，血纤蛋白粘合剂比在此提出的试剂盒的有效性低。
这些结果支持本发明的组合物采用新的生化机制预防和减少手术粘连严重性。
这项研究所使用材料的生化活性
表14显示了实验1和2中使用的ESC中不同因子的生化活性。使用2.5倍稀释的ESC进行这些实验。
表14：
酶因子(例如因子II、因子VII和因子X)的绝对浓度是大约5倍，因子V的绝对浓度在30-40％之间。实验1和2的材料是同源的，酶因子水平的差异小于10％，和对于辅因子V，差异小于20％。浓缩材料中纤维蛋白原水平除去至输入血浆水平的大约20％。
实施例4：轻度诱导盲肠擦伤模型
以下研究旨在测试处理方式预防轻度诱导无腹膜侧壁缺损的盲肠擦伤模型的手术粘连治疗的能力。
研究终点：
本研究在粘连诱导方案后15天停止并用处理品来处理(新鲜制备的)。处死动物并对粘连严重性进行分级。
实验设计原理/材料和制备方法
相对轻度的粘连形成通过盲肠擦伤诱导，但不存在腹膜侧壁缺陷。测试材料施用于擦伤后的盲肠，并在缝合动物之前施用于覆盖在盲肠上的腹膜。事后根据它们的外观和韧性对粘连进行分级。
本组合物以前在一项研究中被用于评价它对具有腹膜侧壁缺陷的盲肠擦伤模型的有效性和安全性。本模型侵袭性低，因为它与以前的模型等同，但不具有侧壁缺陷。本研究的目的是评价本组合物在侵袭性较低的模型中预防轻度粘连的能力。实施这项测试来评价轻度手术干预的不同潜在临床设置。
选择一个小规模组(共6只动物：3只对照和3只测试动物)以使动物痛苦减到最小。
与以前的实验相似，模拟真实手术中使用的方法，从高规(31)胰岛素注射器滴下或喷雾使测试材料施用于擦伤部位和它紧邻的环境。
材料和制备方法
表15概述了以下实验中大鼠的处理方式。
表15：
*提取物是从人血浆经由AEX通过减少体积达到要求的浓度而制备的
以下实施例使用雄性Lewis大鼠(得自Harlan Laboratories，以色列)。研究开始时大鼠的体重是200-250gr。组的最低和最高体重在组平均体重±10％的范围之内。驯化周期是5天。使用永久性标记(达到24小时实验)和笼子卡片识别大鼠。
根据国立卫生研究所(NIH)以及评价和认证实验动物管理协会(AAALAC)进行动物处理。动物放在聚砜(PSU)笼中(4-6只/笼)，带有颗粒饲料和透亮聚碳酸酯瓶装饮用水设备的不锈钢顶架；卧具：使用蒸汽杀菌的清洁稻壳，和垫底材料与笼子至少每周两次更换。
动物不限量采食商业啮齿动物饮食。动物可以自由获取从市政供应中获得的高压灭菌饮料水。
动物居住于具有足够的新鲜空气供给的标准实验室条件下。动物保持在气候受控环境。温度范围在20-24℃之间和相对湿度(RH)在30-70％之间，12小时光和12小时黑暗周期。
为了适应该研究，到货即检查动物。手术后，24小时后检查动物以确保它们已经恢复。为了启动粘连发生，动物维持到处理后13-17天，然后处死。进行常规检查和动物管理。“以色列动物实验委员会”批准后并按照“以色列动物福利法案”实施这项研究。
测试程序
所有测试动物随机分配进行各个处理。
实验设计和条件
表16显示了测试组构成、动物数量、测试材料、体积和给药途径。所有溶液(对照v.新鲜)在室温下使用。
实验之前3天或当天，在给予测试剂之前测量体重。
表16：
测试程序：测试材料从高规针滴下或喷雾至手术诱导粘连部位(擦伤的盲肠)而处理大鼠。
程序：
测试品给予后15天，用戊巴比妥末次麻醉动物。打开动物腹部并暴露腹膜和盲肠。根据标准记分，根据0(无粘连)至4(不损害其下器官便无法除去的持久粘连)的标准分级尺度进行粘连分级。拍摄并记录暴露的腹膜或盲肠，以及任何粘连的照片。收集样品。
结果和数据
本研究过程中没有报道有害作用。对照和测试组的全部动物正常增加体重。记录无发烧、冷淡行为、缺少食欲、社会隔离行为或死亡。表17显示了记录的实验组中所有动物的体重增加。全部动物正常增加重量，且没有一只动物体重减轻。平均重量增加37.5gr/周(+/-1.9gr)。
表17：表17显示了动物体重，其中21/6/2016记录手术前体重，28/6/2016和6/7/2016记录手术后体重。对照组(对照)，接受盐水，处理(测试)接受新鲜测试材料。
表17：
体重(gr)
表18显示了本研究分析的所有粘连的说明。
表18：
表19显示了实验结果的概况。
表19：
粘连的总数量 粘连动物％
对照 4 100％
测试 1 33％
表18和19显示了实验结果。在全部对照动物中，无腹膜侧壁缺陷的盲肠擦伤模型产生粘连(包括动物编号1的2种粘连；参见表18)。然而，这些是轻度1级粘连，全部都是薄膜或轻薄的。不可能计算这些粘连的面积，因为它呈现为轻薄的组织“条带”，而不是可占据覆盖内部器官和/或腹膜的区域的更显著粘连。仍然清楚地看到测试材料的作用，仅检测到一个粘连，用测试品处理的三只动物仅有一只(表19)。
结论
总之，用本发明试剂盒制备的组合物能够减少和几乎完全预防用轻度刺激方案产生的轻度粘连。
本文使用的本测试模型模拟很多开放的手术程序，该程序可以产生对内部器官的一些损害，但是没有对腹膜进行故意损害。这些程序产生临床上有意义的手术粘连。随着时间的推移，这些粘连可以进展产生显著的副作用。的确，三只对照动物全部显示出粘连(一只动物显示出两种粘连)。在这个背景下，给予本试剂盒制备的测试材料提供了没有任何粘连的两只动物，仅一只动物具有单一粘连。因而，使用本试剂盒的方法在较小以及较大手术程序中有效，并在不同严重程度的模型中很好地测试过。这些结果与以前的实验结果一致。
表20显示了本实验所用测试材料的不同因子的生化活性因子。
表20：
因子 因子II 因子V 因子VII 因子X 纤维蛋白原
相对于输入血浆的水平 506％ 52％ 391％ 454％ 13％
所有酶因子(II、VII和X)的绝对浓度是大约4-5倍，因子V是大约50％。浓缩物材料中的纤维蛋白原水平是输入血浆中水平的大约13％。
实施例5：确定凝血因子浓度的凝血试验
测定了每种凝血因子的回收率和相关凝血时间，下列附图是呈现这些研究结果的图片：因子II(图9A和9B)、因子V(图9C)、因子VII(图9D)、因子X(图9E和9F)和纤维蛋白原((图9G(对数曲线)和9H(线性调整图))。一旦获得凝血时间，就计算每个凝血因子的量。
方法：
使用本文的方法处理人新鲜冰冻血浆(FFP)。使用自动FPLC装置将150ml血浆浓缩为9mls的体积。这个装置尽管不适用于OR环境，但是仍然可以模拟自动方法。使用补充缺陷血浆的改良前凝血酶时间试验分析外源性系统因子(II、V、VII和X)的水平。使用Clauss法分析纤维蛋白原水平。
使用下列参数从本试剂盒获得洗脱物(包含例如因子II、因子V、因子X或其任何组合)：以3mL/min的速度填入AEX柱；用低盐溶液(75mM NaCl)以5mL/min的速度洗涤该柱，使用高盐溶液(750mM)以1mL/min的速度洗脱。
凝血因子回收浓度如下：
表21：
表22显示了使用由输入血浆获得的标准曲线得到的凝血时间结果。
表22：
表23和24显示了比照基于输入血浆的凝血时间产生的5点和6点标准曲线计算，使用不同稀释度的回收因子II的凝血时间结果(参见表22)。如表23和24所示，洗液显示出最长的凝血时间，因为洗液不含可测量水平的凝血因子II。然而，洗脱的因子II的稀释物显示凝血时间在15.6和34秒之间，取决于稀释系数。
表23：
稀释 时间(秒) 未稀释的提取物中 凝血因子II回收率％
洗液 1∶10 1000 0％ 0％
洗脱 1∶40 15.6 1160％ 70％
洗脱 1∶80 19.7 1660％ 100％
洗脱 1∶160 26.8 1858％ 111％
洗脱 1∶320 34 2063％ 124％
平均 101％
表24：
稀释 时间(秒) 未稀释的提取物中 凝血因子II回收率％
洗液 1∶10 1000 0％ 0％
洗脱 1∶40 15.6 875％ 52％
洗脱 1∶80 19.7 1300％ 78％
洗脱 1∶160 26.8 1557％ 93％
洗脱 1∶320 34 1850％ 111％
平均 84％
从浓缩材料制备的治疗提取物中凝血酶原(FII)的水平因此是输入血浆中浓度的5.6至6.7倍(基于估计量，例如表23或24)。这是基于减少洗脱液中NaCl浓度(750mM)至接近生理盐水(300mM-2.5倍稀释)中浓度的两倍的要求。
图9A和9B进一步说明表23和24显示的结果。
表25显示了因子V活性的标准曲线，是基于输入血浆产生的因子V缺陷血浆的PT补充试验。图9c显示了表25的图解结果。0.5至0.015625的稀释度范围的洗脱输入血浆显示出17.4至52.7秒的凝血时间。
表25：
表26显示了以同样的因子V补充试验，使用不同稀释度洗脱物的凝血时间结果，和从本文公开的试剂盒因子V的回收率％。
表26：
稀释 时间(秒) 未稀释的提取物中 因子V回收率％
洗液 1∶10 52.6 14％ 1％
洗脱 1∶10 18.7 418％ 25％
洗脱 1∶20 23.1 470％ 28％
洗脱 1∶40 29.5 408％ 24％
洗脱 1∶80 38.8 242％ 15％
平均 432％ 26％
表27显示了因子VII补充试验中，使用不同稀释度输入血浆的标准曲线得到的凝血时间。图9D进一步以图表形式显示结果(不包括稀释度0.015625)。稀释度范围0.5至0.015625的洗脱输入血浆得到17.8至48.5秒的凝血时间。
表27：
表28显示了在这个试验中使用不同稀释度的洗脱物得到的凝血时间结果。
表28：
稀释 时间(秒) 未稀释的提取物中 因子VII回收率％
洗液 1∶10 64.7 7％ 1％
洗脱 1∶40 20.4 1389％ 83％
洗脱 1∶80 21.1 2613％ 157％
洗脱 1∶160 33.7 1732％ 104％
洗脱 1∶320 43.8 1430％ 86％
平均 1791％ 107％
表29显示了使用凝血因子X的活性补充试验，由输入血浆得到的标准曲线得到的结果。图9E显示了表28所示结果的图。具体而言，稀释度范围0.32至0.02得到18.7至64.5的凝血时间。图9F显示了相同结果，没有0.02稀释度的点。
表29：
表30和31显示了提取物中因子X的推断活性，分别基于5点或4点标准曲线。
表30：
稀释 时间(秒) 未稀释的提取物中 因子V回收率％
洗液 1∶10 1000 0％ 0％
洗脱 1∶40 16.3 1167％ 70％
洗脱 1∶80 22.6 1570％ 94％
洗脱 1∶160 30.4 1921％ 115％
洗脱 1∶320 39.6 2151％ 129％
平均 1702％ 102％
表31：
稀释 时间(秒) 未稀释的提取物中 凝血因子V回收率％
洗液 1∶10 1000 0％ 0％
洗脱 1∶40 16.3 1256％ 75％
洗脱 1∶80 22.6 1554％ 93％
洗脱 1∶160 30.4 1714％ 103％
洗脱 1∶320 39.6 1700％ 102％
平均 1556％ 93％
表32显示了Clauss法的凝血时间结果，使用不同稀释度纤维蛋白原的标准曲线。图9F显示了从表32中的信息得到的图。具体而言，稀释度范围0.1至0.2的输入血浆洗脱物的相关凝血时间是8.2至11秒。
表32：
表33显示了计算的洗脱物中纤维蛋白原的量，包括浓缩的9mls产生的纤维蛋白原，以及稀释至300mM NaCl浓度(如这个实施例中对于凝血酶原[FII]讨论的)的材料中的纤维蛋白原。
表33：
结论：使用本文描述方法可以获得高回收率的外源性系统凝血因子。这些结果起初是在高度浓缩水平可获得，后来稀释至NaCl也降低的工作浓度也可以依照要求获得。
实施例6：歧管和试剂盒
试剂盒概述
本装置和相关试剂盒用于处理用于输注的大约150ml血浆，通过使其通过一次性的预先γ射线灭菌的试剂盒。该试剂盒的作用是从这种血浆中提取出浓缩蛋白，该蛋白将在手术中使用以预防手术粘连形成。
提取物通过就地进行生物处理而产生。首先血浆通过阴离子交换(AEX)5ml微型柱，该柱结合了血浆中发现的蛋白混合物中选择的这些蛋白。接下来，用大约15ml洗涤缓冲液洗涤AEX微型柱，清除截留在柱死容积内部的血浆，也除去与柱内部的AEX基质结合选择性较差的蛋白。这前两个步骤的液体收集在注射器或其他容器中，作为生物废料用于随后处理。下一步，大约10毫升包含高浓度氯阴离子的洗脱缓冲液通过该柱。氯离子足以通过竞争结合部位而除去蛋白，致使洗脱液携带着蛋白通过位于该柱出口的阀门流出该柱进入施用注射器。施用注射器包含稀释缓冲液(大约15毫升)以减少盐离子浓度。最后，施用器(例如喷头或其他装置)被紧扣在施用注射器上，得到试剂盒终产品：装有大约25ml最终活性提取物的施用注射器，该提取物将在手术结束之前和/或手术过程中被喷至手术患者的腹腔。
该试剂盒包含：(i)包含洗涤和洗脱溶液/缓冲液的注射器，(ii)接受血浆的无菌注射器、生物废品，和最终产品，(iii)阴离子交换(AEX)微型柱，例如但不限于GE HiTrap QFF 5ml微型柱，(iv)控制不同液体的流向的阀门，和(v)独立包装的喷头或其他溶液，其待与包含最终产品的注射器连接，用于提取物的有效播散。
AEX柱被预先洗涤和平衡，用2-5CVs(柱体积约5ml)的洗液洗涤，用2-5CVs洗脱液洗涤，和2-5CVs洗液洗涤。
装置说明
该装置作为操作歧管，由注射器、缓冲液和含装配试剂盒的柱组合而成，可以包括下列两种宽泛设计：(1)用于三种溶液，(1.血浆，2.洗液和3.洗脱液)的三个注射泵(参见设计1和2，图6和7)和(2)注射泵、注射器，和阀门-液体可以被通过三个分离的注射器通过歧管，引导液体通过阀门吸取进入该柱(参见设计3，图8)。图6、7和8显示了设计1、2和3。
设计1、2和3可以包含控制单元和任何另外需要的硬件，允许注射泵顺序活化、自动设置阀门在系统中的位置，以确保不同溶液以所需速率、预先制定的路线泵出，通过一次性试剂盒。
设计1、2和3可以包含塑料(或任何其他材料的)箱和/或配件和/或台架以允许用户插入一次性无菌试剂盒。
设计1、2和3可以进一步包含使用户能够在下列方式之间移动的用户界面：
a.准备-试剂盒轻松插入歧管，包含血浆或含血浆注射器。这可以通过例如抽出装置和开启注射泵而实现。
b.运行-自动驱动注射泵和阀门，使得事件以预定顺序进行，固定体积的溶液流过微型柱并进入合适的容器(例如废料注射器、施用注射器)，将蛋白提取物递送进入施用注射器。
c.紧急停止-这个按钮使系统停止运行，可将注射器从注射泵拆除(通常通过抬起锁定杆来固定注射器到位)，并收回注射泵，完全不推进或抽出溶液。这个按钮使操作者能够安全除去一次性试剂盒并实施任何所需的清洁程序，作为非限制性实例，在万一泄露的情况下。
用户界面可以提供这种信息，例如距离方法结束剩余的时间和当前运行的状态(例如但不限于血浆填料、洗涤、洗脱……)。可以任选增加高级的自动防故障装置例如液体溢出传感器(例如阀门和连接管下面积聚了液体，通过短路)，或允许压力调节流动的压力传感器。
试剂盒(设计1、图6)
该试剂盒可以包含连接件，其将来自注射泵的注射器输出物加入微型柱。在这个设计中，(1)使用注射器从血浆袋获取血浆，然后与连接管相连，或设计(2)(图7)如所述的但包含一个在血浆注射器入口连接到连接管的阀门件，上面连接有针(带有塑料盖，如典型地售卖的那样)。然后使用这个针刺穿血浆袋并开放液体通道进入连接片和试剂盒剩余部分(设计2)。因此在设计2中，血浆变为与试剂盒相连。因此为了注射器充满来自袋子的血浆，支持血浆注射器的注射泵将抽出注射器，和利用阀门指导这个流动。一旦已从袋中抽出150ml，阀门将转换位置，将血浆注射器置于指导液体在连接管和其他注射器之间流动的位置。图7显示了设计2。
试剂盒(设计3)
图8显示了设计3。不同的注射器可以通过歧管连接，歧管至少包括：(i)开关阀端口，接入注射泵和工作注射器，(ii)洗涤缓冲液注射端口，(iii)洗脱缓冲液注射端口，和(iv)含血浆的注射器的端口或用于刺穿血浆袋的针(如设计1(图6)和2(图7)描述)。图8示出了图6-8的插图说明。
对于设计3(图8)，三通阀门可以将这些歧管加入微型柱，工作注射器位于注射泵内部。因此，安装该阀门以开放注射泵和歧管之间的液体流通通道，使注射泵抽取工作注射器，从而使其充满通过集合管上安装的阀门位置而选择的溶液。将三通阀设置为关闭此通道，而是打开注射器泵中的工作注射器和微型柱之间的通道，，将允许注射泵接着推动这种溶液进入微型柱。设计3进一步包括微型柱，以及与微型柱出口连接的3向或4向阀门，其中至少一个端口连接到柱出口，一个端口指向用于处理血浆和包含生物废料的洗液的注射器或其他容器，，和直接连接施用注射器的一个端口。任选，设计3可以包括直接连接注射器或其他容器的一个端口，用于处理不含生物制品的洗液(需要四通阀门)。最后，已产生提取物之后，设计3可以包与含施用注射器连接的喷头。
血浆注射器独立包装(例如设计1)，或预先连接(例如设计2)。设计3可以同时利用两种选择。设计1、2和3中包括含足量洗液(大约50ml)的洗液注射器，其与连接件、阀门或歧管预先连接。设计1和3进一步包括含足量洗脱液(大约50ml)洗脱液注射器，其预先与连接管连接。设计1、2和3包含洗液的注射器或其他容器，其预先与微型柱的出口阀门连接。最后，设计1、2和3都包括用于生物废液(血浆和血浆洗涤)的注射器或其他容器，其预先与微型柱的出口阀门相连，和包含大约15ml稀释缓冲液、大约2-5ml空气(用于混合)的施用注射器，预先与微型柱的出口阀门连接。图5显示了一次性试剂盒的设计样品。
实施例：阴离子交换柱测试
测试5ml HiTrap Q FF柱(GE)产生工作ESC的能力。
以50-80kGrey钴源照射HiTrap Q FF柱(以色列Sorvan服务供应商保证最小-最大的实际辐射值)。照射之后，一个柱与FPLC仪器(AKTA Start，GE)连接，自动填充下列溶液：
1 3CVs(15ml)洗涤/平衡液[10mM精氨酸，10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH 7.4]。
2. 4CVs(20ml)清洁/洗脱液[10mM精氨酸，10mM柠檬酸钠，750mM NaCl，pH 7.4]。.
3. 3CVs(15ml)洗涤/平衡液[10mM精氨酸，10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH 7.4]。
4.然后用150ml血浆池填充柱。
5.接着是使用洗涤/平衡溶液(3CVs；15ml)的洗涤步骤。
6.然后实施洗脱步骤，使用清洁/洗脱液(1.8CVs，8ml)。
这个程序之后，测试洗脱部分的不同因子的活性。表34记录了以下水平。
表34：
因子 因子与输入血浆相比％
FII 1065％
FV 47％
FVII 1387％
FX 1548％
纤维蛋白原(FI) 25％
测试γ照射对HiTrap QFF 5ml柱压力耐受的作用。
以50-80kGrey钴源照射HiTrap Q FF柱(以色列Sorvan服务供应商保证最小-最大的实际辐射值)。照射之后，将柱子连接到设计成长时间维持柱内压力的设备。压力设置为大约2bar，比ESC制备方案中实现的最大压力高10倍(参见上面)。
压力持续大约10-15′，在这个时间内没有减压表明没有观察到渗漏，和明显的液体泄露。典型地，用于灭菌的剂量是25kgrey且不超过40kgrey。
测试装置包括驱动充满水且与柱连接的10cc注射器的注射泵。柱的另一端与具有整数压力计的血管机械装置连接。注射泵驱动注射器的柱体直到阻力产生血管机械装置中的压力计记录大约2bar的压力。停止注射泵并保持封闭系统内部的压力。
实施例7：使用自动方案测试凝血因子V(促凝血球蛋白原)回收率
使用FPLC实施自动方案。简言之，150ml新鲜冰冻血浆(FFP)填充5ml HiTrap QFast Flow柱(GE)。使用补充有500、600和750mM NaCl的10ml洗脱体积的柠檬酸盐缓冲液(pH7.4)从柱中回收ESC因子。用因子V缺陷血浆实施的PT补充试验用于测定提取物中因子V活性水平，比照输入血浆产生的标准曲线。提取程序完成2小时内测定凝血因子V活性水平。表35和图10显示这个实验结果。
表35：
讨论
因子V的活性作为NaCl浓度的函数降低，高于500mM。这一点令人惊讶，因为从阴离子交换柱洗脱蛋白通常随盐浓度增加而增加。然而，因子V明显具有盐-不稳定性，并且较高浓度盐会降低这个实验中测定的促进凝血活性。
这是完全预料不到的结果，因为它表明媒介NaCl浓度(相对于工业过程而言)对提取物中凝血因子V稳定性的快速影响(例如，相对于工业过程中血浆蛋白生产的持续时间)。凝血因子V对NaCl浓度的特异敏感性是未知的。
因子V活性减少迅速在工业中使用的通常稳定方法中可能很关键，例如冷冻干燥(冻干)。冷冻干燥是耗时数小时至数天的方法。冷冻干燥过程中，药物混合物中的液体(典型地是水)被蒸发。然而，在水几乎被完全除去之前，盐浓度的逐渐增加可能对这种组合物(例如PCC组合物)中发现的任何凝血因子V具有不利影响。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容引入本说明书作为参考，达到如同具体、单独地指出每个出版物、专利或专利申请引入本文作为参考的程度。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，不应将其解释为限制。
尽管已经描述了本发明的许多实施例，但是应理解这些实施例仅仅是说明性而非限制性的，而且对于本领域技术人员来说很多改进将变得显而易见。

Claims (20)

1.一种纯化的组合物，包含：
促凝血球蛋白原(因子V)和选自下组的至少一个因子：凝血酶原(因子II)、促凝血酶原激酶原(因子VII)和Stuart-Prower因子(因子X)，
其中所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于75％至750％之间，和
其中所述至少一个因子的量与血浆中所述至少一个因子的量相比介于150％至3000％之间；
其中，所述组合物中的促凝血球蛋白原和所述至少一种因子的量是通过使用以血浆构建的标准曲线的凝血酶原互补测定法推测在500mM NaCl的浓度下所观察到的所述组合物的活性来确定。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原量的5％至95％。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物中纤维蛋白原的量减少了血浆中纤维蛋白原量的25％至75％。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中使用Clauss分析法检测组合物中纤维蛋白原的量。
5.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含：
纤维蛋白稳定因子(因子XIII)，
其中所述组合物中纤维蛋白稳定因子的量介于0.01IU/mL至100IU/mL之间。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中促凝血球蛋白原的量与血浆中促凝血球蛋白原的量相比介于100％至600％之间。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中凝血酶原的量与血浆中凝血酶原的量相比介于500％至2500％之间。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中促凝血酶原激酶原的量与血浆中促凝血酶原激酶原的量相比介于500％至2500％之间。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中Stuart-Prower因子的量与血浆中Stuart-Prower因子的量相比介于500％至2500％之间。
10.一种获得权利要求1的组合物的方法，包括：
获得血浆样品，
通过将血浆样品填入阴离子交换柱以产生结合部分，和
通过用洗脱液洗脱结合部分以获得权利要求1的组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括在用所述洗脱液洗脱结合部分之前用洗液洗涤结合部分的步骤。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述血浆样品从选自下组的来源获得：进行手术的受试者、供体和商业上可获得的来源。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述血浆样品在5mL至500mL之间。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述阴离子交换柱具有0.5mL至20mL的柱床体积范围。
15.根据权利要求10所述的方法，其中在无菌条件下实施所述方法。
16.一种方法，包括：给进行手术的受试者施用权利要求1的组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物以足以减少手术部位粘连严重性的量施用于进行手术的受试者的手术部位，与未经处理的进行手术的受试者的手术部位粘连严重性相比减少至少10％。
18.一种制备权利要求1的组合物的试剂盒，包含：
(a)阴离子交换柱，
(b)多个注射器，其中每个注射器被构造为容纳洗液、洗脱液或洗脱物，
(c)洗脱物收集容器，
(d)洗液，
(e)洗脱液，和
(f)制备根据本发明一些实施例的组合物的说明书，
其中(a)至(e)是被预先装配的。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，进一步包含：
(g)血液收集容器，和
(h)血浆收集装置。
20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中(a)是无菌的。
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