CN108396056A - 一种单细胞分选用标签珠的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单细胞分选用标签珠的制备方法与应用，即通过特制带有荧光和特殊碱基序列的标签珠，通过流式细胞分选仪，实现将裂解出的单细胞内的mRNA进行标签标记的功能，从而使得单细胞测序所需的分选工作变得更加简洁高效，有效的解决了目前单细胞测序中分选困难标签困难的技术难题，同时适合进行大规模的单细胞测序实验。
Description
技术领域
本发明涉及材料科学和生物化学领域，特别是一种单细胞分选用标签珠的制备方法与应用。
背景技术
基因测序技术是一种对生物体内基因的排列序列进行检测的技术。自从上世纪90年代初，人类便开始涉足“人类基因组计划”，通过对人体内基因不同的碱基排序进行检测得到一长串序列，再通过生物信息学技术对排序进行分析，得到有意义的信息，最终帮助人们进行诊断、科研、疾病预测等多种重要功能。
基因测序技术也如同其他技术一样在日新月异的向着更快、更廉价、更精确的方向发展。随着测序技术的发展及测序成本的大幅度下降，破译来自单细胞的30亿碱基的基因组并逐个细胞比较序列正在变为现实，即是将生物实验的精确尺度推向单细胞级别，而非传统的用含有上百万细胞的组织进行实验。
目前，单细胞的研究已经在蛋白质组学、显微影像学等领域取得了初步的成果，研究发现单细胞的反应模式并非传统通过大块组织研究得到的“线性结果”，而是非0即1的数字化的结果。特别是在肿瘤研究领域，单细胞研究已逐渐发展为研究的重点领域。
虽然测序仪器的技术进步使得单细胞测序变为可能，但是单细胞研究仍旧面临着非常大的困难。即是如何标记单个细胞以及单个细胞中的各条mRNA序列。目前通用的方法是将单个细胞通过流式细胞仪分选到96孔板的单个孔中，再通过聚合酶链反应技术将特异序列的引物加在基因序列上，通过横竖排的多种序列来进行单细胞的定位，再进行测序。但是通过横竖排不同的序列来定位细胞的技术在加样过程中容易交叉污染导致可靠性不足，同时每次加样过程中都需要对横竖排分别加样导致耗时巨大效率低下，并且每横排和每竖排都需要使用特制的引物，极大的限制了大规模分选的使用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种携带有特定荧光序列和碱基序列的标签珠，该标签珠可以通过流式细胞分选仪对特定单细胞内mRNA进行标签标记，从而简化单细胞分选工作，本发明是这样实现的：
1、一种单细胞分选用标签珠的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）在珠子表面上合成荧光基团6-FAM；
2）将珠子等分成四份，分别在珠子表面合成单个的脱氧鸟苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸；合成完毕后，将四份珠子混合后再随机等分成四份，再次分别合成上述四种脱氧核苷酸，如此重复合成步骤，共合成12次，最终合成一段长12个脱氧核苷酸的各个珠子不相同的序列，即为A序列；
3）将四份珠子全部混合后加入含有脱氧鸟苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸的混合溶液中再次合成反应8次，最终合成一段长8个脱氧核苷酸的随机序列，即为B序列；
4）将珠子加入脱氧胸苷酸溶液中再次合成反应30次，形成C序列，即获得依次连接荧光基团6-FAM以及序列ABC的单细胞分选用标签珠。
优选的，本发明所述单细胞分选用标签珠的制备方法步骤1）中，所述珠子直径为10-50um。
如本发明制备的单细胞分选用标签珠在单细胞测序样本制备过程中的应用。
如本发明所述单细胞分选用标签珠在分选癌症组织与免疫细胞的单细胞中的应用。
本发明标签珠表面连接的荧光基团6-FAM是在通过流式细胞仪时可以使其被探测到。A序列的作用是使得每个标签珠上都有一串12个脱氧核苷酸都不同序列用于定位单细胞，概率上有412种可能。B序列的作用是使得单个标签珠上的每条相同的A序列之后衔接上一条完全个不相同的8个脱氧核苷酸的随机序列，这条序列用于定位单个细胞内部不同的mRNA。C序列则是用来链接细胞释放出来的mRNA上的polyA尾结构，使得mRNA与标签序列合为一体，达到标签的目的。
本发明通过化学反应在珠子表面合成制带有荧光和特殊碱基序列获得特定的标签珠，以通过流式细胞分选仪，实现将裂解出的单细胞内的mRNA进行标签标记的功能，从而使得单细胞测序所需的分选工作变得更加简洁高效，有效的解决了目前单细胞测序中分选困难标签困难的技术难题，同时适合进行大规模的单细胞测序实验。
具体实施方式
实施例1 标签珠的制备
具体制备步骤如下：
1、在珠子（直径为10-50um）表面上合成荧光基团6-FAM；
2、将步骤1获得的珠子等分成四份，分别在珠子表面合成单个的脱氧鸟苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸；
合成完毕后，将四份珠子混合后再随机等分成四份，再次分别合成上述四种脱氧核苷酸，如此重复合成步骤，共合成12次，最终合成一段长12个脱氧核苷酸的各个珠子不相同的序列；
3、将步骤2获得的四份珠子全部混合后加入含有脱氧鸟苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸的混合溶液中再次合成反应8次，最终合成一段长8个脱氧核苷酸的随机序列；
4、将珠子加入脱氧胸苷酸溶液中再次合成反应30次，即获得所述单细胞分选用标签珠。
上述具体实施方式及试验，其目的为对本发明作详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种单细胞分选用标签珠的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）在珠子表面上合成荧光基团6-FAM；
2）将珠子等分成四份，分别在珠子表面合成单个的脱氧鸟苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸；合成完毕后，将四份珠子混合后再随机等分成四份，再次分别合成上述四种脱氧核苷酸，如此重复共合成12次；
3）将四份珠子全部混合后加入含有脱氧鸟苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸的混合溶液中再次合成反应8次；
4）将珠子加入脱氧胸苷酸溶液中再次合成反应30次，即获得所述单细胞分选用标签珠。
2.如权利要求1所述单细胞分选用标签珠的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述珠子直径为10-50um。
3.如权利要求1或2制备的单细胞分选用标签珠在单细胞测序及分选中的应用。
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|---|---|
| CN (1) | CN108396056A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113025567A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-25 | 中国人民解放军陆军特色医学中心 | 一种椎间盘单细胞的分离方法 |
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2017
- 2017-02-04 CN CN201710064169.7A patent/CN108396056A/zh active Pending
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Application publication date: 20180814 |