CN108368537B - 用于分析核酸分子的改进的装置 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种用于分析核酸分子(M)的装置(1)，其包括：珠粒(20)，分子的一端可以锚定在其上；表面(520)，分子的另一端可以锚定在其上；致动器(30)，其适于使所述珠粒在一个方向上相对于所述表面移动；传感器(50)，其适于测量所述珠粒与所述表面之间的距离；所述装置还包括孔(11)，所述孔具有沿所述珠粒的运动方向延伸的轴(X‑X)和由所述表面形成的底部(110)，所述孔充满导电溶液(40)并接纳珠粒(20)；并且所述传感器适于测量所述孔的阻抗——其取决于所述珠粒与所述表面之间的距离——来确定所述珠粒与所述表面之间的距离。

Description

用于分析核酸分子的改进的装置

技术领域

本发明涉及一种用于分析分子的装置和方法。本发明特别应用于分析核酸分子如DNA或RNA。

背景技术

如果核酸分子连接到微米级珠粒上，则可以通过操作该珠粒并以高分辨率追踪其位置来推断关于该核酸结构的信息。在特定的实验条件下，实时追踪珠粒的位置可用于生成关于其上所连接的DNA或RNA分子的结构的有用信息。

这转而可以用于确定分子的整体组织结构，碱基序列，是否存在对核酸碱基的生物化学修饰，以及分子与蛋白质如聚合酶、解旋酶、拓扑异构酶的相互作用等。

文献US 2003/0027187中已描述了用于进行这种核酸分子分析的装置。该装置包括光学装置以确定连接到分子上的珠粒的位置。

更具体地，从上方照射珠粒，并通过在高清摄像机上捕获的图像通过显微镜物镜观察。通过从珠粒图像测量x和y坐标的跟踪算法来实时跟踪珠粒的位置，而确定z-位置，即由于围绕珠粒图像的光衍射图而确定了珠粒相对于分子所连接的表面的高度。

事实上，照射珠粒的光线从珠粒散射，并通过与直接照射的光线干涉而产生衍射图。为了使用该衍射图来推断珠粒的z位置，通过将珠粒保持在固定的位置同时精确移动物镜在距物镜焦点不同距离处获取一组衍射图图像。这些图像被独立地用来校准每个珠粒的系统。

此后，物镜被非常精确地保持在固定的位置，然后可以使用环形图通过对校准组的交叉参考来追踪珠粒从焦点沿着光学z轴距的距离。

这种用于珠粒位置确定的光学方法是有效的。然而，它有许多缺点，影响了该方法的成本和可扩展性。

实际上，为了进行核酸分子的分析，需要实现近乎单一碱基的分辨率，其在1纳米的珠粒移动的范围内，因为1纳米等于每次一个dsDNA碱基对以解聚形态打开时所增加的距离。这个距离是已经打开的两个互补碱基的ssDNA单核苷酸延伸的总和。RNA分子的情况与此类似。

利用上文公开的光学方法可以实现这种分辨率水平。然而，这样的系统需要非常复杂的机械光学设置，并且视野相对较小，这限制了系统可以同时分析的珠粒的数量。例如，30倍物镜的视野可以为约300乘300微米，这仅允许分析约1000个珠粒。

相反，同时进行非常多个分子的分析的特定应用是优选的；例如高达10⁹个分子。

此外，即使该光学方法允许同时分析约1000个珠粒，也需要为每个珠粒生成一组校准图像，这是耗时且计算密集的。因此，用相同的光学方法得到更高的通量是非常复杂的。

发明内容

本发明的一个目的是通过提供一种用于分析核酸分子的系统和方法来克服现有技术的上述缺点，其允许同时分析比现有技术数量更多的分子。

本发明的另一个目的是保持至少与现有技术相同的分辨率来进行分子的精确分析。

为此目的，公开了一种用于进行核酸分子分析的装置，其包括：

-珠粒，分子的一端可以锚定在其上，

-表面，分子的另一端可以锚定在其上，

-致动器，其适于使所述珠粒在一个运动方向上相对于所述表面移动，

-传感器，其适于测量所述珠粒与所述表面之间的距离，所述装置的特征在于，其还包括孔，所述孔具有沿所述珠粒的运动方向延伸的轴和由所述表面形成的底部，所述孔充满导电溶液，并且所述珠粒被接纳在所述孔中，并且在其中所述传感器适于测量所述孔的阻抗，所述阻抗取决于所述珠粒与所述表面之间的距离，从而根据所测量的阻抗来确定所述珠粒与所述表面之间的距离。

在一些实施方案中，所述装置可以包括至少一个以下特征：

-所述传感器可以包括：

○主电极，其位于所述孔的顶部，与所述导电溶液接触，所述电极处于已知电位，

○位于所述孔底部的次电级，其携带分子可以锚定到其上的表面，以及

○电子电路，其适于测量电极之间的电流。

-所述电子电路可以包括：

○连接到次电级的电流到电压放大器，

○电压计，其适于测量电流到电压放大器的输出电压，以及

○计算电路，其适于由所测量的电压来计算所述孔的阻抗。

-横向于其轴的孔的横截面的面积可以自孔的底部至顶部严格地增加。

-孔底部的横截面的面积可以大于珠粒的最大横截面的面积。

-孔可以具有截头圆锥(truncated cone)的形状。

-孔的横截面的面积可以随着距孔底部的距离线性增长。

-孔的横截面例如可以在其底部处是圆形的，并且在垂直于孔轴的方向上随着距孔底部的距离而线性增长。

-所述致动器可以包括至少一个安装成沿着孔的轴的方向可移位的磁体，并且所述珠粒由顺磁性材料制备，并且被插入在孔底部和磁体之间。

-所述装置可以包括多个相同的珠粒和多个相同的孔，每个孔适于接纳一个珠粒。另外，在一个实施方案中，其中传感器包括主电极、次电极和电子电路，其适于测量电极之间的电流，所述传感器可以包括多个次电极，每个次电极设置在相应孔的底部并且形成相应珠粒锚定到其上的表面，并且然后电子电路可以包括多个电流到电压放大器，每个电流到电压放大器连接到相应的次电级，所述计算电路还适于同时测量所述电流到电压放大器的输出电压并计算相应孔的阻抗。

-所述装置可以包括其中形成有所述孔的电绝缘材料板，所有的孔在其顶部表面处开口，并且所述致动器还包括多个由磁性材料制成的棒，每个棒设置在顶部表面上并且在两个相邻的孔之间延伸。

-每个棒的长度可以小于10μm，并且每个珠粒的直径可以小于或等于1μm。

还公开了核酸分子的分析方法，所述方法由根据以上描述的装置实施，并且包括至少一个步骤：测量珠粒与孔底部之间的距离，每个测量步骤包括测量孔的阻抗以确定珠粒在孔中的位置。

在一个实施方案中，所述分析方法还可以包括将至少一个分子锚定到珠粒和孔底部的预备步骤，所述步骤包括：

-将至少一个其上锚定有分子的珠粒定位在充满孔的溶液中，

-在传感器的主电极和次电级之间施加第一电位差，以驱使珠粒与孔底部接触，以及

-反转电极之间的电位差。

根据本发明的装置使得能够分析一端连接微珠粒且另一端连接孔底部的分子。通过根据珠粒在孔中的位置来监测孔的阻抗变化，可以非常精确地测量其位置。

实际上，孔的整体电导与充满孔的溶液的电导相对应。当珠粒在孔内移动并占据后者的一部分时，它减小了充满导电溶液的孔的横截面，从而改变了孔的电导。

因此，通过确定孔的确切形状，特别是当孔的横截面面积随着距孔底部的距离而增加时，可以容易地确定珠粒在孔中的位置。

该装置可以多路复用从而能够同时分析大量的核酸分子，而不降低分辨率。实际上，当装置包括多个孔和相应的珠粒时，可以通过传感器来监测所有珠粒，对于每个孔，所述传感器包括次电级和电流到电压放大器，从而使得能够精确监测每个珠粒在其相应孔中的位置。

附图说明

本发明的特征和优点将从下面对本发明的某些实施方案的更详细的描述以及附图所阐述的内容中显而易见，其中：

-图1a示出了用于分析核酸分子的装置的示例性实施方案，

-图1b和图1c分别示出了装置的孔的可能形状的横截面图和透视图，

-图2示出了图1a的实施方案中，根据珠粒的位置的孔的电阻，

-图3示意性地示出了根据本发明一个实施方案的装置的电等效电路，

-图4a和4b是根据两个实施方案的分析装置的示意图，

-图5a和图5b示出了示例性分析装置中施加在珠粒上的磁场梯度，

-图6示出了根据本发明的一个实施方案的分析方法的主要步骤。

具体实施方案

用于分析分子的装置

装置的整体描述

参考图1a，示出了用于分析核酸分子的装置1。这些分子特别可以是DNA或RNA分子。优选地，如图所示，分子可以是发夹型双链分子。

发夹是指双链螺旋，其中一条链的5'端通过未配对的环物理性地连接到另一条链的3'端。该物理性连接可以是共价或非共价的，但优选是共价键。

因此发夹由双链茎和未配对的单链环组成。

装置1包括电绝缘材料板10。例如，所述板可以由硅、玻璃、不导电的聚合物或树脂制成。

板内制备有至少一个孔11，每个孔沿着主轴X-X延伸，主轴X-X垂直于板所延伸的平面。每个孔在板的顶部表面101处开口。

此外，每个孔11具有底部110，优选地垂直于所述轴X-X延伸。

孔即所谓的微孔，因为其尺寸(深度、横截面的最大长度)的数量级为约1μm或约0.1μm。例如，孔沿X-X轴的深度可以为几微米，例如包括1至10微米，例如等于8μm。

孔在垂直于X-X轴的平面的横截面的最大长度的范围可以为几百纳米至几微米，例如约4或5μm，如图1所示。

现有技术能够产生这样的孔，例如被称为轨道蚀刻技术的技术，其包括用重离子照射以形成潜径迹(latent track)的步骤以及化学蚀刻的步骤。关于生产这些孔的技术的更多细节，可以参考例如Siwy研究实验室(实验室的网站：http://www.phvsics.uci.edu/～zsiwy/fab.html)的工作内容或者出版物M.Davenport,K.Healy,M.Pevarnik,N.Teslich,S.Cabrini,A.P.Morrison,Z.S.Siwy and S.E.Létant,"The Role of PoreGeometry in Single Nanoparticle Detection",in ACSNANO,vol.6,n°.9,8366-8380,2012。

所述装置还包括至少一个珠粒20。优选地，所述装置包括多个珠粒20，其数量与孔的数量相等。

孔和珠粒的数量可以优选地大于1000，例如大于10000，例如约100000或1000000。

每个珠粒均是球形的并且直径不大于5μm。例如，珠粒20的直径可以为约1.5μm或1μm。优选地，珠粒可以更小并且直径小于1μm，例如为0.3μm。

作为非限制性实例，可以使用以下珠粒的参考：

-MyOne，由Invitrogen生产，其直径为1.04μm

-M270，由Invitrogen生产，其直径为2.8μm，

-M450，由Invitrogen生产，其直径为5.5μm，

-Ademtech 500，由Ademtech生产，其直径为0.5μm，

-Ademtech 300，由Ademtech生产，其直径为0.5μm，

为了进行核酸分子的分析，一个分子M的一端被锚定到珠粒20，并且其另一端被锚定到孔110的底部的表面。

为了实现将分子锚定在珠粒和孔底部表面，珠粒和表面可以用适于与分子末端结合的特定材料包被。

例如，DNA或RNA分子的一端可以用生物素标记，另一端用地高辛标记，并且珠粒可以用链霉亲和素包被从而与DNA/RNA发夹分子的标记(例如生物素)端结合，并且孔110的底部可以进一步用抗Dig抗体包被从而与DNA/RNA分子的Dig标记端结合，参见例如HunterMM,Margolies MN,Ju A,Haber E,"High-affinity monoclonal antibodies to thecardiac glycoside,digoxin,Journal of Immunology,1982Sep；129(3):1 165-1 172。

因此，珠粒通过分子连接到孔11的底部110。

此外，珠粒20相对于孔11的底部110自由移动。特别地，珠粒20可以沿着X-X轴的方向移动。为了控制珠粒20沿着该轴的运动，装置1还包括致动器30，其适于使珠粒20沿着所述轴平行移动。

根据一个优选的实施方案，对珠粒的运动的控制可以依赖于由致动器30施加在珠粒20上的磁力。在这种情况下，珠粒由顺磁性材料制成，例如超顺磁性材料。例如，珠粒可以用掺入了铁氧体的胶乳制成，并包被链霉亲和素来锚定分子M。

致动器30可以包括至少一个永磁体31，其可以被控制为沿着X-X轴平行移动。优选地，如图1所示，致动器30可以包括两个永磁体31，它们位于X-X轴的相等距离处，并且其磁极垂直于X-X轴对齐排列，一个磁体的北极面向另一个的南极。

珠粒20位于孔11的底部110和磁体31之间。

这些磁体使得能够在珠粒上施加力，并且因此在其所锚定的分子上施加力。通过使磁体在X-X轴的方向上靠近或远离珠粒20移动，可以改变磁场，从而控制施加于珠粒上的力的大小，从而控制样品在X-X轴方向上的伸长。

致动器30的另一个实施方案可以包括永磁体和条带(strip)，所述条带被可磁化材料覆盖，定位在相对于孔11约为几微米处的固定位置。通过使永磁体更接近或远离被可磁化材料覆盖的条带，可以改变由所述条带施加在珠粒上的磁场(也参见在下面配置多个孔部分中所公开的实施方案)。

可以使用其他方法控制珠粒20的运动，例如光学或者声学镊子(acoustictweezer)，后者意味着在珠粒上施加声波，参见例如G.Sitters,D.Kamsma,G.Thalhammer,M.Ritsch-Marte,E.J.G.Peterman and G.L.J.Wuite,"Acoustic Force spectroscopy",in Nature Methods,Vol.12,N°1,Jan.2015或者X.Ding,Z.S.Lin,B.Kiraly,H.Yue,S.Li,I.Chiang,J.Shi,S.J.Benkovic and T.J.Huang,"On-Chip Manipulation of singlemicroparticles,cells,and organisms using surface acoustic waves",PNAS,July10,2012,vol.109,n°.28,11 105-11 109。

孔阻抗随珠粒位置的变化

最后，通过监测孔的阻抗，特别是电阻(或电导)，装置1能够确定珠粒20与相应孔11的底部110之间的距离，其对应于锚定到珠粒和孔底部110的分子的长度。

为此，每个孔10充满导电溶液40。

导电溶液40的电导率优选在10^-7S/cm和10¹之间，优选在10^-3和10^-2S/cm之间。

例如，溶液40可以是浓度为100mmol/m³(100mM)的氯化钠水溶液。或者，溶液40可以包含与DNA分子的保存兼容的缓冲液，例如含有10mM Tris HCl和0.1mM EDTA和100mM氯化钠的缓冲水溶液。缓冲液还可以含有与酶活性兼容的二价阳离子，例如10mM MgCl₂。在一些实施方案中，缓冲液应该支持电泳(例如Tris硼酸盐EDTA缓冲液)。

如图1a中所见，导电溶液40完全充满每个孔11并覆盖板的顶部表面101。

珠粒20必须具有与溶液的电导率不同的电导率。珠粒优选是电绝缘的。

此外，孔11的横截面随z变化，z是从孔底部沿着X-X轴的距离。该距离可以从珠粒到孔底部的最近点测量，或者从珠粒的中心测量。

优选地，横向于X-X轴的孔11的横截面的面积严格地随距离孔底部的距离z增加(z轴示于图1a至1c中，轴的原点位于孔底部的中心)。

因此，由于珠粒20的尺寸恒定，它占据孔的内部体积的不同比例。

例如，如果珠粒非常靠近孔的底部，则它占据围绕珠粒延伸的孔的部分P的主要部分。部分P被定义为在由珠粒的最低点和最高点所占据的横截面之间延伸的孔的体积。因此，这部分的电阻急剧增加，因为留给导电溶液的剩余空间非常小。由于孔的整体电阻是电阻沿孔(沿X-X轴)的整个深度的积分，所以整体电阻也急剧增加。

相反地，如果珠粒靠近孔的顶部表面，则它占据围绕珠粒延伸的孔的部分P的一小部分。因此这部分的电阻较前面实例中的电阻增加的慢，并且孔的整体电阻较前面实例的电阻小。

因此，例如在图2中所示，可以生成这样的曲线，该曲线示出了孔的电阻作为珠粒距孔底部的距离的函数，其中每个电阻值对应于珠粒与孔底部之间的单一距离值。因此，通过测量孔的电阻值，可以以良好的精度推断珠粒距孔底部的相应距离。

为了在确定珠粒20在孔11内的位置时得到良好的精度，孔的最小横截面优选大于珠粒的最大横截面。特别地，在优选的情况下，其中横向于其轴的孔的横截面的面积严格地随距底部的距离而增加，最小的横截面位于孔的底部110处。此横截面大于珠粒的事实使得珠粒能够到达孔底部，并因此能够测量珠粒在孔中的所有位置，包括珠粒与孔之间的距离是零的位置。

孔可以有各种不同的形状。首先，孔可以围绕X-X轴旋转对称。

例如，如图1b所示，孔可以具有截头圆锥的形状，其最小部分对应于其底部110。

或者，在图1a中，孔壁的半径r根据距底部的距离z通过以下公式限定：

z＝I₀ tanh 2(r-r₀)

其中，I₀是孔的高度，r₀是孔的底部半径。该孔形状给出了图2的电阻曲线。

根据另一个不同的实施方案，优选地，孔的横截面的面积随距孔底部的距离而线性增加。因此，孔的横截面面积与珠粒的横截面面积之间的差异与珠粒到孔底部的距离成比例。

因此，孔的电阻随着珠粒与孔底部之间距离的增加而线性减小。

例如，如图1c所示，孔可以具有椭圆形横截面，其在孔底部110处由圆形横截面形成，其沿着垂直于孔X-X轴的方向随着z线性增加。

因此，从孔的阻抗的测量来推断珠粒的位置甚至更容易。特别地，图2中示出的曲线——其根据孔中珠粒的位置(几何形状示于图1a)呈现孔的电阻——成为直线。

阻抗传感器

参照图3，装置1还包括传感器50，其适于测量孔11的阻抗，并且根据该测量推断出珠粒20与孔11的底面110之间的距离z。

传感器50包括主电极51，其能够将导电溶液40设定为参考电压V₀。如图1a所示，主电极51与导电溶液40接触。优选地，主电极51可以位于板10的顶部表面上。由于导电溶液延伸超过所述顶部表面，所以它与主电极51接触。主电极51当然与电压源(未示出)连接，优选为直流电压源。

电压V₀优选为恒定电压。为了避免孔内的电解现象，优选低于0.5V。优选地，电压V₀包括10至500mV之间，甚至优选包括50至300mV之间。例如，电压V₀可以等于0.25V。

此外，传感器50包括至少一个次电级52。更具体地，传感器50包括数量与孔11的数量相等的次电级52，也是珠粒20的数量。每个次电级52可以是金或铂电极。

次电级52形成孔的底部110并具有表面520，所述表面520形成了分子所锚定的表面。

在图3中，具有可变位置的相应珠粒的导电溶液40的圆柱形成等于电阻器R1、R2、R3的电阻。每个电阻器均具有与主电极51接触的一个极，以及与孔底部的次电级52接触的另一个极。

传感器50还包括电子电路53，其通过测量通过孔的电流来测量孔的电阻。为此，根据一个实施方案，电子器件可以包括与次级阻抗串联连接的确定的电阻。可以测量电阻电极处的电位差以推断通过电阻的电流。

然而，由于每个孔中的电流非常低，所以该实施方案可能不精确。因此，电子电路53优选在孔中包括电流放大器。

为此目的，电子电路53优选包括用于每个次电级的电流到电压放大器530。

该电流到电压放大器包括运算放大器，其反相输入端连接到次电级52，非反相输入端连接到地面，并且输出端通过已知值的反馈电阻连接到反相输入端。

主电极51和一个次电级52之间的电流i₁由下面的方程式给出：

其中V-是运算放大器反相输入端的电位，R_i是第i个孔的电阻值。

由于两个输入端在理论上处于相同的电位：V_-＝0V，因此：

此外，在反馈回路中，电流i_l可以用以下方程式表示：

其中R_l是反馈回路的电阻值，V_i是电流到电压放大器530的输出电势。

因此，通过测量电势V_i，可以通过以下方程式得到第i个孔内的电流ii的值：

此外，然后可以得到孔的电阻值：

因此，电子电路53还包括适于测量电位V_i的装置531，例如电压计，以及计算电路532，包括例如处理器，其控制装置531的采集测量，以及从所测量的电位推断电阻值。处理器优选适于运行包括一组指令的专用程序用于控制传感器(特别是测量装置531)，推断每个孔的电阻的值以及每个珠粒距相应孔底部的对应距离。

优选地，测量在整个装置上以约50Hz的测量采样速率实现(在该装置的所有孔上以采样速率并行进行的测量)。所测量的电位应在两次测量之间进行积分或平均以减少噪音或抑制寄生虫信号(parasite signal)。在这方面，采样速率可以是主电力频率的倍数。

具体实施例

参考附图详细描述了一个实施实例。图1a示出了单一微孔11的情况，其曲线由以下方程式描述：

z＝I₀ tanh 2(r-r₀)

其中I₀＝8μm，是孔的高度，r₀＝2μm，是孔的底部半径。该孔被直径d＝1.5μm的珠粒部分封闭。

该孔充满浓度为100mol/m³的氯化钠水溶液，对应于电导率σ＝10^-2S/cm。

对于孔V两端的电压，孔中的电流是I＝V/R，其中R是充满溶液40并被珠粒部分封闭的孔的等效电阻。所述电阻示于图2中，作为珠粒中心距孔底部的距离的函数。可以看出，通过测量孔的电阻，可以通过报告该曲线上的电阻值并确定相应的距离来推断出珠粒的位置。

在带宽Δf上测量的电子电流噪声可能归因于两个来源：

-约翰逊噪声，也称为热噪声，是由电子的热搅动产生的电子噪声，该噪声由以下方程式表示：

其中T是环境温度，kB是玻尔兹曼常数，以及

-散粒噪声(与基本电子电荷的随机流量有关，其由以下方程式表示：

其中I是孔中的信号电流，e是电子携带的基本电荷(绝对值)。

可以看出，对于高于2k_bT/e的电压V，即在约293K的环境温度下约为50mV，约翰逊噪声被与信号电流相关的散粒噪声主导。此外，所述散粒噪声随着孔的电阻而增加。因此，为了保持尽可能高的信噪比，孔的大小可能不会太小；例如尺寸为1nm数量级的孔(“纳米孔”)提供的结果噪声太大而不能被利用。

回到这个实例，由主电极51施加的电压等于0.25V。根据图2，对于该实例的电解质溶液，孔的最大电阻约为2500kΩ。对于这样的电压，电流是I＝V/R＝100nA，并且电流噪声为

(对于带宽Δf＝100Hz)。

阻抗△R在距离δI＝5μm上的变化约为300kΩ，这意味着为了解决约1nm(其对应于2500碱基对的双链DNA分子中的单一碱基对)的距离的变化，必须能够解决δR＝0.06kΩ的阻抗变化。这对应于电流δ1＝I的变化。δR/R＝2.5pA，这对应于约为1的信噪比。

在△f＝1Hz以上的平均使得能够产生具有适宜信噪比10的单一碱基对检测。

配置多个孔

如上所述，上文公开的装置1优选包括多个孔11和相同数量的珠粒20，这些孔以高密度包装在芯片上，例如密度在10⁵至10⁸孔/cm²之间，例如如果每个微孔装置的最大横截面(在板的顶部表面处)为5×5微米，则每平方厘米应当得到约4.10⁶个孔。

在这种情况下，通过提供相等数量的次电级52和电流到电压放大器530，传感器50容易多路复用，从而能够以类似于包括多个像素的CMOS相机的方式平行测量孔的电导率。

然而，计算单元532对于所有孔11是公共的。

为了使计算单元532的计算要求尽可能低，所有的珠粒和所有的孔优选是相同的，可以有制造工艺带来的容差。另外，由于单一主电极51与充满所有孔并且延伸超过板10的顶部表面101的导电溶液40接触，因此单一主电极51对于所有的孔11是公共的，并且对所有孔施加相同的电压V₀。

另外，在多个孔11布置在公共板10中的情况下，致动器30可以优选包括一对主宏观永磁体31，其可以沿着X-X轴平行移动，并且基本上覆盖板10的所有表面，以便产生均匀的磁场。

致动器30还包括多个由磁性材料(例如，铁和镍的合金，已知商品名为

)制成的棒32，其固定在板10上。

如图4a和4b所示，每个棒32位于板10上，位于其顶部表面101上。每个棒32在两个相邻的孔之间延伸，以便使棒32的极端320与孔的边缘齐平。因此，棒32非常靠近珠粒20。应理解的是，当孔以高密度包装在板10中时，两个相邻孔之间的距离是几μm或几十μm的数量级。因此，磁棒32具有相同数量级的长度。

根据图5a中所示的实例，例如磁棒32的长度为8μm，宽度为1μm并且以2μm的距离间隔开。

每个磁性材料棒32在主磁体31所产生的磁场的影响下被磁化。因此，放置主磁体31使它们靠近或远离板10会增加或减小棒之间的磁场密度，这转而会增加或减小施加在珠粒上的力。

该实施方案是特别优选的，因为磁化棒32比主磁体31小并且更靠近珠粒20。通过减小磁体的尺寸，珠粒20附近的磁场梯度增加，因此施加在珠粒上的磁力增加。

实际上，图5a和5b中的仿真重现已经示出，当磁性材料棒32暴露于由主磁体31产生的0.088T的均匀磁场时，棒32之间的磁场增强，这沿X-X轴产生显著的磁场梯度。如在图5b中所见，该磁场梯度的最大值为约0.09T/μm，也就是说90.10³T/m。

施加于珠粒的磁力取决于该磁场梯度。特别地，可应用于珠粒上的最大磁力(单位为N)可以表示如下：

其中m_s是珠粒磁矩的饱和值，单位为A.m²，dB/dz是磁场的梯度，单位为T/m。

这里是根据以上给出的实例的珠粒的磁矩的饱和值：

-Invitrogen的MyOne：13,2.10-15A.m2

-Invitrogen的M270：57,5.10-15A.m2

-Invitrogen的M450：238,5.10-15A.m2

-Ademtech 500：4,7.10-15A.m2

-Ademtech 500：1,017.10^-15A.m²

因此，对于MyOne型珠粒，其结构如图5所示，施加在珠粒上的磁力可以例如超过1000pN。

相反地，在板10和主磁体31之间没有插入磁化棒32的情况下，由磁体产生的最大磁场梯度约为1,66.10³T/m。对于MyOne型珠粒，这个最大磁场梯度给出施加在珠粒上的最大力为约22pN。因此，磁化棒的存在使得能够在珠粒上得到较没有磁化棒32时约55倍的磁力。

这种施加到珠粒20上的磁力的增加使得可以减小珠粒的尺寸，同时保持至少等于，或甚至高于图1a所示的由磁体施加到珠粒上的力。

珠粒尺寸的减小又使得能够减小孔的尺寸，因此能够增加孔的密度和装置的吞吐量。因此，可以同时分析的分子数量可以达到5×10⁷个分子/cm2(假设珠粒直径为300纳米)。

如图4a和4b所示，孔可以根据不同构型堆积在板10中以达到不同密度。例如，在图4a中，示出了比图4b中密度更低的孔。在后者中，孔11在垂直于X-X轴的一个维度上延伸，这使得电导率与珠粒的位置更呈线性并且还使得能够减小整体单元尺寸，因为孔的横截面仅在一个方向增长。

用于分析核酸分子的方法

参考图6，示出了用于分析核酸分子如DNA或RNA分子的方法的主要步骤。所述分析例如包括确定核酸序列，即破译核酸中实际的碱基序列，还有确定核酸序列上的其他信息片段，例如检测核酸分子中的特定序列、检测两种不同核酸分子的序列之间的差异、或蛋白质与特定序列的结合，参见例如WO 2011/147931；WO 2011/1147929；WO 2013/093005。

如前所述，所分析的分子M是发夹型的。在发夹分子中，未与环接合的两条链的末端分别连接到珠粒和孔的底部，因此可以在珠粒运动时被拉开。甚至有可能通过用确定的力拉动分子的每个末端来完全打开发夹双链核酸分子。

所述方法将针对单一孔中的单一珠粒来进行描述，但其可应用于任意数量的孔。

该方法包括第一步骤100：通过核酸分子M将珠粒锚定到孔的底部，即得到分子M的第一末端锚定到珠粒20，分子的第二末端锚定到孔11的底部。

根据优选实施方案，所述装置的上述结构使得能够进行该步骤，特别是当所述装置包括大量以高密度堆积在板中的孔时。根据该实施方案，步骤100包括第一子步骤110：将其上连接有核酸分子的珠粒放置在装置中，置于孔11之上的溶液40中。

然后第二子步骤120包括在主电极51和次电极之间施加电位差，从而通过电泳驱使珠粒朝着孔底部的电极52移动。施加在电极之间的电位差约为几V/cm。关于珠粒的电泳迁移率的更多信息，参见B.Xiong,A.Pallandre,I.le Potier,P.Audebert,E.Fattal,N.Tsapis,G.Barratt and M.Tavema,"Electrophoretic mobility measurement bylaser Doppler velocimetry and capillary electrophoresis of micrometricfluorescent polystyrene beads",in Analytical.Methods,2012,4,183。

当接触孔底部时，至少有一个珠粒与后者结合。优选地，每个孔被这样设计以使得只有一个珠粒能够与其底部结合，即，孔底部的横截面小于珠粒横截面的两倍。

然后，锚定步骤100包括第三子步骤130：反转电极之间的电压。由此，所有未结合的珠粒被排出孔外。

可以重复进行这些子步骤120和130，以最大化孔的整体装载效率。

最后，可以实施子步骤140：测量至少一个孔的电导率，以确定孔中是否存在有结合的珠粒。

然后该方法包括至少一个步骤200：通过致动器30致动珠粒20从而改变珠粒20与孔11的底部110之间的距离，由此在分子的两端施加张力，以及至少一个步骤300：测量珠粒与孔底部之间距离。该距离通过测量孔11的电阻来测量。如已经参考图3详细描述的，该测量本身是通过测量电流到电压放大器530的输出电压来进行的。

所述方法可以以多种不同的方式来实施，但是其优选包括一系列的多个步骤200：致动距孔底部不同距离处的珠粒。

如图6所示，在那一情况下，步骤300：测量珠粒20与孔11的底部110之间的距离，优选在所有一系列致动步骤200期间连续地实施。

或者，测量步骤300可以与每个致动步骤同时进行。

作为非限制性示例，例如可以根据文献EP2390351中公开的顺序进行所述方法，关于顺序实施的更多细节可以该参考文献。该顺序包括：

-第一对步骤200和300，在此期间，致动珠粒从而通过在分子上施加约15pN或更大的张力，例如等于18pN，来分离发夹分子M的两条链。测量珠粒与孔11的底部110之间的距离，其对应于打开的发夹分子的总长度。

-步骤400：将一个单链核酸分子片段与分子M的一条链杂交，

-第二对步骤200和300，其致动步骤200使珠粒释放施加于分子的张力。

然后，核酸分子M重新压缩以重新形成发夹。

然而，在步骤400中与核酸链中的一条杂交的单链核酸分子的存在导致发夹在重新杂交(或重新压缩)时停顿。检测到这种停顿表明单链核酸分子包含与发夹分子M的一部分互补的序列。此外，发夹重新杂交期间内分子长度的连续测量，包括当发夹分子部分重新杂交时暂停期间内分子长度的测量使得能够确定所述序列在分子中的位置。事实上，停顿处分子的长度与分子的总长度之间的比较使得能够推断出杂交核酸分子的确切位置，由此可以推断出所述位置处的分子M的序列。

根据另一个非限制性实施方案，可以根据文献EP 2 390 350中公开的顺序来进行所述方法，更多实施细节可以参考该文献。

以上公开的装置和方法示出了关于现有技术中已知的光学检测系统的关键改进。

首先，从简单孔结构的阻抗变化直接推导出每个珠粒的位置。这就避免了对复杂光学元件的需求。

其次，如前所述，珠粒以及孔的尺寸可以减小。因此，孔可以以高密度包装在单一芯片上，然后平行读取孔的阻抗。

由于孔中电流与珠粒位置之间的关系需要很少的计算来计算，所以上述装置也降低了计算要求。

最后，参考图4a和4b所示，现在可以将能够致动珠粒的磁性材料直接合并到板上。这导致施加在珠粒上的力更大，并因此可以减小珠粒和孔的尺寸。

Claims (16)

1.一种用于分析核酸分子的装置(1)，其包括：

-珠粒(20)，分子的一端可以锚定在其上，

-表面(520)，分子的另一端可以锚定在其上，

-致动器(30)，其适于使所述珠粒(20)在一个运动方向上相对于所述表面移动，

-传感器(50)，其适于测量所述珠粒与所述表面之间的距离，

所述装置的特征在于，其还包括孔(11)，所述孔具有沿所述珠粒的运动方向延伸的轴(X-X)和由所述表面形成的底部(110)，所述孔(11)充满导电溶液(40)，并且所述珠粒(20)被接纳在所述孔中，并且在其中所述传感器(50)适于测量所述孔(11)的阻抗，所述阻抗取决于所述珠粒(20)与所述表面(520)之间的距离，并且所述传感器(50)适于根据所测量的阻抗来确定所述珠粒与所述表面之间的距离。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述传感器(50)包括：

-主电极(51)，其位于所述孔的顶部，与所述导电溶液(40)接触，所述电极处于已知电位；

-位于所述孔(11)的底部(110)的次电级(52)，其携带分子可以锚定到其上的表面(520)，以及

-电子电路(53)，其适于测量电极之间的电流。

3.根据权利要求2所述的装置，其中所述电子电路(53)包括：

-连接到次电级(52)的电流到电压放大器(530)，

-电压计(531)，其适于测量电流到电压放大器(530)的输出电压，以及

-计算电路(532)，其适于由所测量的电压来计算所述孔的阻抗。

4.根据权利要求1-3任一项所述的装置(1)，其中横向于其轴(X-X)的孔(11)的横截面的面积自孔的底部(110)至顶部严格地增加。

5.根据权利要求4所述的装置(1)，其中所述孔(11)的底部的横截面的面积大于所述珠粒(20)的最大横截面的面积。

6.根据权利要求4所述的装置(1)，其中所述孔(11)具有截头圆锥的形状。

7.根据权利要求4所述的装置(1)，其中所述孔(11)的横截面的面积随着距孔底部(110)的距离线性增长。

8.根据权利要求7所述的装置(1)，其中所述孔(11)的横截面在其底部(110)处是圆形的，并且在垂直于孔(11)的轴(X-X)的方向上随着距孔底部的距离而线性增长。

9.根据权利要求1-3任一项所述的装置(1)，其中所述致动器包括至少一个安装成沿着孔的轴(X-X)的方向可移位的磁体(31)，并且所述珠粒(20)由顺磁性材料制备，并且被插入在孔底部(110)和磁体(31)之间。

10.根据权利要求2所述的装置(1)，其包括多个相同的珠粒(20)和多个相同的孔(11)，每个孔适于接纳一个珠粒。

11.根据权利要求9所述的装置，其包括多个相同的珠粒(20)和多个相同的孔(11)，每个孔适于接纳一个珠粒。

12.根据权利要求10所述的装置，其包括多个次电极(52)，每个次电极设置在相应孔的底部并且形成相应珠粒锚定到其上的表面，

并且其中所述电子电路包括多个电流到电压放大器(530)，每个电流到电压放大器连接到相应的次电级，并且所述计算电路(532)还适于同时测量所述电流到电压放大器的输出电压并计算相应孔的阻抗。

13.根据权利要求11所述的装置(1)，其包括其中形成所述孔的电绝缘材料板(10)，所有的孔在其顶部表面(101)处开口，并且所述致动器(30)还包括多个由磁性材料制成的棒(32)，每个棒设置在顶部表面(101)上并且在两个相邻的孔(11)之间延伸。

14.根据权利要求13所述的装置(1)，其中每个棒(32)的长度小于10μm，并且每个珠粒(20)的直径小于或等于1μm。

15.一种用于非诊断目的的核酸分子的分析方法，所述方法由根据前述权利要求中的一个装置实施，并且包括至少一个步骤：测量珠粒与孔底部之间的距离，所述测量步骤包括测量孔的阻抗并根据孔的阻抗确定孔中珠粒的位置。

16.根据权利要求15所述的分析方法，所述方法由根据权利要求2的装置实施，其还包括将至少一个分子锚定到珠粒和孔底部的预备步骤，所述步骤包括：

将至少一个其上锚定有分子的珠粒定位在溶液(40)中；

在主电极和次电级(51，52)之间施加第一电位差，以驱使珠粒与孔底部接触；并且

反转电极之间的电位差。

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