CN108342432A - 一种制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备玉米赤霉烯酮‑葡萄糖苷的方法，该方法包括如下步骤：以ZEN和UDP作为底物，HvUGT14077为催化酶，20‑40℃反应5～10分钟，甲醇或者乙腈终止反应，制备得到ZEN‑G。本发明首次建立了体外同时制备两种玉米赤霉烯酮‑葡萄糖苷(ZEN‑14G及ZEN‑16G)的方法；方法简单快捷，转化率为99.18％。

Description

一种制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的方法

技术领域

本发明涉及农产品和食品安全领域，具体地说涉及一种制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(Zearalenone-glucoside，ZEN-G)的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由镰孢属真菌产生的类雌激素毒素，严重危害人畜健康。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)调查研究显示，ZEN在以谷物小麦、大麦、玉米等为基础的食物和饲料中普遍存在。玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(zearalenone-glucoside，ZEN-G，包括ZEN-14G和ZEN-16G两种)是在植物脱毒过程中，ZEN在糖苷转移酶的作用下的葡萄糖苷化产物。

ZEN-G已被证明常与ZEN共存饲料及各种农产品中。近来研究发现ZEN-G可以在生物体的消化道内水解而释放出原型毒素ZEN从而产生毒性，对人畜健康具有较大的潜在风险。因此，ZEN-G的检测、代谢和毒理等研究已成为焦点和热点。

开展ZEN-G的相关研究，必须用到大量的标准品。但目前还未有商业化的ZEN-G标准品，严重制约了其各项研究。目前，ZEN-G的制备方法主要有化学合成法和生物转化法两种，但均费时费力且产量不高。因此，建立一种简单快捷的大量制备ZEN-G的方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备ZEN-G(ZEN-14G和ZEN-16G)的方法，该方法包括如下步骤：

以ZEN和大麦二磷酸尿苷葡萄糖(UDP)作为底物，大麦二磷酸尿苷葡萄糖(UDP)-糖基转移酶(HvUGT14077)为催化酶，30-40℃反应5～10分钟，甲醇或者乙腈终止反应，制备得到ZEN-G。

具体的说，该方法包括如下步骤：

配置反应液，其中ZEN的浓度为15-20μmol/L、HvUGT14077的浓度为0.5-1mg/mL、UDP的浓度为5-10mmol/L，30-40℃反应5-10min；

用甲醇或乙腈终止反应后，离心去除蛋白沉淀，即得ZEN-G；

然后利用LC-MS/MS检测ZEN-G的含量；同时运用基质加标进行实际玉米样品的检测。

其中HvUGT14077的合成方法为：

重组表达载体的构建：全基因合成大麦二磷酸尿苷葡萄糖-糖基转移酶HvUGT14077基因，克隆入pET22b-MBP，构建重组表达载体；

重组酶的表达纯化：载体转入大肠杆菌BL21，接种于LB培养基，25-40℃培养至OD600为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1～1mmol/L，10-30℃诱导表达10-30小时，利用Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化得到。其中HvUGT14077是作为制备ZEN-G的催化酶。

具体的说，HvUGT14077是通过如下方法制备得到的：

1)全基因合成获得大麦UDP-糖基转移酶HvUGT14077的基因序列，5’端引入酶切位点BamH1，3’端引入酶切位点EcoR1。通过酶切和连接，将HvUGT14077基因克隆入表达载体pET22b-MBP中，得到重组表达载体。将所得重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建含有重组表达载体的工程菌。

2)所得工程菌接种于LB培养基，37℃培养至OD600≈0.6-0.8，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1～1mmol/L，10-30℃诱导10-30小时后，离心收集菌体。所得菌体用10-100mL Tris-NaCl缓冲液重悬，利用超声破碎法破碎，离心收集上清液。

3)5-10倍柱体积Tris-NaCl缓冲液平衡Ni-NTA Resin亲和层析柱后，将步骤2所得上清液上样至层析柱；用1-20倍柱体积Tris-NaCl缓冲液洗涤层析柱，5-500mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异性吸附蛋白，最后用100-1000mmol/L咪唑溶液洗脱重组HvUGT14077蛋白。

4)透析法去除咪唑离子，透析液为磷酸盐缓冲液，0-20℃透析1-10小时，重复2-4次。透析后所得蛋白样品，离心去除沉淀，SDS-PAGE进行鉴定，BCA法定量，-80℃保存备用。

本发明的有益效果主要体现在：

1)首次建立了体外同时制备两种玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(ZEN-14G及ZEN-16G)的方法；

2)与现有的化学合成或生物接种分离纯化法相比，该方法简单快捷，转化率为99.18％，

产量更高；

3)与现有的生物合成方法相比，运用市场上更为常见的工程菌(大肠杆菌BL21)表达糖基转移酶，首次可以同时获得两种高含量的玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷产物(ZEN-14G：ZEN-16G＝1.3:1，m/m)，有助于后续的分析方法的建立及标准物质制备工作的开展；

4)实验流程固定，可重复性高，一般实验人员经过简单培训即可完成，实用性强；

5)采用本研究制备的玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(ZEN-14G及ZEN-16G)，极大的降低了制备成本，可为开展玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的检测、代谢及毒性机制等研究提供标准品支持，可提升我国隐蔽型真菌毒素研究领域的科技创新能力，为饲料中玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的防控、保障饲料质量安全等提供理论基础和技术支撑，并有望为后期农业可持续发展、相关技术标准和限量标准制(修)订等提供科学依据和有效建议。

附图说明

图1：实施例一原核表达纯化所获得重组HvUGT14077蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图2：实施例一制备所得ZEN-14G及ZEN-16G的MRM质谱图：

其中图2A:ZEN标准品；图2B:制备所得ZEN-14G及ZEN-16G(ZEN-14G:ZEN-16G＝1.3:1)；图2C:阴性反应组。

图3：实施例一制备所得ZEN-14G及ZEN-16G在玉米基质中的MRM质谱图：

其中图3A为玉米基质空白样品；图3B为添加制备所得ZEN-14G及ZEN-16G的玉米基质样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例一

HvUGT14077基因工程菌的制备

从GenBank数据库获得水稻UDP-糖基转移酶HvUGT14077全基因序列(GU170356.1)，委托上海生工生物工程技术公司用化学合成法合成，分别在5’端加上酶切位点BamH1(5’-GGATCC-3’)，3’端加上酶切位点EcoR1(5’-GAATTC-3’)。

所得序列通过T4DNA连接酶(TaKaRa，日本)连接到经BamH1和EcoR1酶切的载体pET22b-MBP(淼灵生物科技，武汉)上(16℃，过夜)。通过pET22b-MBP表达出的重组蛋白在N端有一段麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)，C端有6个组氨酸(His)。MBP可以提高HvUGT14077的活性，组氨酸标签则可以与Ni离子螯合，从而有利于亲和层析纯化。

连接后的载体热转化入大肠杆菌BL21(DH5a)(生工生物工程，上海)，涂布于含有卡那霉素(Kanamycin，50mg/mL)(碧云天，上海)的固体LB培养基(Sigma，美国)上，37℃倒置过夜培养筛选重组子。筛选出的重组子接种于5mL液体LB培养基，37℃过夜培养后提取质粒，酶切鉴定是否含重组质粒，委托上海生工生物工程技术公司测序进行验证。

将测序正确的表达载体抽提出来热转化入大肠杆菌BL21(DE3)(生工生物工程，上海)，涂布于含有卡那霉素(Kanamycin，50mg/mL)的固体LB培养基上，37℃倒置过夜培养筛选。筛选出的重组子即为HvUGT14077基因工程菌。

重组HvUGT14077蛋白的表达纯化

将构建好的HvUGT14077基因工程菌接种于10mL LB液体培养基中，37℃220rpm过夜振荡培养。按照1:100的比例将过夜培养物接入1L的LB液体培养基中，220rpm振荡培养至OD600为0.7，加入终浓度0.3mmol/L的IPTG(Sigma，美国)，16℃诱导表达20小时后，4℃，4500rpm离心20min，收集菌体。加入50mL Tris-NaCl缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，PH＝7.8)重悬菌体，超声波破碎仪破碎(功率：120w，间歇时间：10秒，工作时间：3秒，次数：50次)，12000rpm，4℃，20min离心收集上清。

所得上清液过Ni-NTA Resin亲和层析柱(全式金，北京)纯化重组HvUGT14077蛋白：

1)10倍柱体积Tris-NaCl缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，PH＝7.8)平衡Ni-NTA Resin亲和层析柱。

2)上清液缓慢上样至层析柱，完毕后，用5-10倍柱体积Tris-NaCl缓冲液洗涤层析柱去除未结合杂蛋白。

3)选择梯度咪唑洗脱缓冲液(25/50/75/100mmol/L Imidazole，20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，PH＝7.8)依次冲洗层析柱5倍体积，以去除非特异性结合杂蛋白。

4)500mmol/L咪唑洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，PH7.8)约10mL洗脱重组HvUGT14077蛋白。

5)加入1至2柱体积的0.1M EDTA(PH＝8.0)冲洗层析柱除去Ni离子，然后依次用去离子水和20％乙醇冲洗层析柱，20％乙醇封存胶质。

6)纯化所得重组蛋白在4℃、100mmol/L Tris/HCl(pH 7.5)中透析4小时，重复3次。透析后所得蛋白样品，离心去除沉淀，SDS-PAGE进行鉴定，如图1，纯度可达80％以上。BCA法定量，-80℃保存备用。

ZEN-G的制备：

1)酶催化反应：

催化反应起始反应物浓度为20μmol/L ZEN，1mg/mL HvUGT14077，10mmol/L UDP，反应体积1mL，反应条件为37℃、PH 7.0。反应5分钟后，9mL甲醇稀释终止反应，4℃，12000rpm离心5min去除蛋白沉淀。

2)液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)分析

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)(Thermo FisherScientific，美国)；流动相A为5mmol/L醋酸铵溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～1min，10％B；1～6min，80％～90％B；6～6.7min，10％～15％B；6.7～8min，10％～15％B；流速0.2mL/min；进样量5μL；柱温40℃。

质谱条件：采用电喷雾电离源(ESI)正负离子模式同时扫描；扫描模式：多反应监测模式；雾化气压力为0.175MPa；干燥气流速15.0L/min；干燥器温度350℃；毛细管电压3500V；碰撞能量15V；离子源温度400℃。ZEN和ZEN-G的母离子、子离子、碰撞电压等参数见下表1。

表1ZEN和ZEN-G的质谱参数

标准品、阳性反应组和阴性反应组(未加HvUGT14077)的MRM质谱图如图2，反应后ZEN已基本全部转化为ZEN-G，转化率为99.18％，且两种糖苷化产物ZEN-14G和ZEN-16G的比例约为1.3:1。

实际玉米样品检测：

取2g玉米样品(上海市售随机样本)置于50mL离心管，向玉米样品中添加制备所得的ZEN-14G(5.4μg)和ZEN-16G(4.1μg)，加10mL乙腈水溶液(84/16，v/v)超声提取1h，取5mL提取液氮气吹至近干，加入1mL的乙腈水溶液(8/2，v/v)含5mmol·L^-1的乙酸铵，涡旋30s，超声1min，过膜后进LC-MS/MS分析。以不加标样本为对照组，平行三份实验。同样的实验连续开展5天。玉米基质中ZEN-14G及ZEN-16G的MRM如图3所示，ZEN-14G及ZEN-16G回收率约为80.8-104.1％，日内和日间精密度均低于20％。

综上可见，本发明的一种制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(ZEN-14G和ZEN-16G)的方法，可以有效的于体外将玉米赤霉烯酮(ZEN)转化为玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(ZEN-14G和ZEN-16G)。该方法快捷有效，重现性好，得率高(转化效率为99.18％)，节省成本。本发明制备的产率相近的两种玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(ZEN-14G和ZEN-16G)，可为玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的检测、筛查、毒理代谢等研究提供大量的标准品，能够促进后续的检测技术和风险评估等方面研究的发展，可提升我国隐蔽型真菌毒素研究领域的科技创新能力，

本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

以ZEN和UDP作为底物，HvUGT14077为催化酶，20-40℃反应5～10分钟，甲醇或者乙腈终止反应，制备得到ZEN-G。

2.根据权利要求1所述的制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的方法，其特征在于其中HvUGT14077的制备方法如下：

重组表达载体的构建：全基因合成大麦二磷酸尿苷葡萄糖-糖基转移酶HvUGT14077基因，克隆入pET22b-MBP，构建重组表达载体；

重组酶的表达纯化：载体转入大肠杆菌BL21，接种于LB培养基，25-40℃培养至OD600为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1～1mmol/L，10-30℃诱导表达10-30小时，利用Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化得到。