CN108314727A - 膜型金属蛋白酶抑制蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，本发明要求保护一种膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE，本发明还公开了膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE的用途，可以用于制备治疗以MT1‐MMP或TACE蛋白内切酶为靶点的药物。

Description

膜型金属蛋白酶抑制蛋白及其用途

技术领域

本发明生物医药技术领域，具体涉及具有抑制人肾癌细胞增殖作用的膜型金属蛋白酶抑制蛋白。

背景技术

膜型基质金属蛋白酶(Membrane Type 1-Matrix MetalloProteinase,MT1-MMP)和TNF-α转换酶TACE(TNF-αConverting Enzyme,TACE)是目前研究最广泛的两种蛋白内切酶。这两种蛋白酶均位于细胞膜表面，在有锌离子结合的情况下，可以调控胞外蛋白和其他生物活性物质的浓度，从而促进癌细胞的生长、增殖、侵袭和转移。对于正常的细胞来说，MT-MMP和TACE的酶活性由细胞内源性的金属蛋白酶抑制蛋白(Tissue Inhibitors ofMetalloProteinase,TIMPs)来严密调控和抑制。目前已知的TIMP有四种，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。这四种分型对应调控和抑制不同范围的金属蛋白酶[文献:1]。

TIMP-1于1980年首次从人淋巴母细胞中被分离和提纯出来。最初被命名为红细胞强化因子(Erythroid Potentiating Activity,EPA)。后续研究表明，TIMP-1是一种糖基化的分泌蛋白，相对分子质量约为21kDa，而且对MT1-MMP和TACE并没有抑制效果。同时，研究表明TIMP-1作为一种细胞生长因子，可以增强癌细胞的活性。

现有蛋白(即原始TIMP-1)的缺点：(1)原始TIMP-1是一种可溶性分泌蛋白。无论是在胞内还是胞外，尚未有任何证据表明TIMP-1可以和MT1-MMP及TACE相互作用。(2)TIMP-1对MT1-MMP和TACE没有抑制效果。相关实验测定，TIMP-1针对MT1-MMP或TACE的K_i ^app均大于150nM。(3)TIMP-1可以增强细胞活性，极大地限制了其在癌症研究中的价值。

发明内容

本发明所要解决问题是根据现有技术金属蛋白酶抑制蛋白TIMP，提供一种编辑改良后的膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE。

本发明第一方面提供一种编辑改良后的膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

本发明第二方面提供上述膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE的用途，用于制备治用于制备治疗以MT1-MMP或TACE蛋白内切酶为潜在靶点的肿瘤药物的用途。

本发明第三方面提供一种药物，其包含膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE以及药学上可接受的赋形剂。

本发明优选的技术方案中，所述赋形剂为载体、溶剂、乳化剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、稳定剂、着色剂、香料。

本发明优选的技术方案中，所述药物为针剂、片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂或软膏剂。

上述技术方案中，所述治疗制备治疗以MT1-MMP或TACE蛋白内切酶为靶点的药物药物组合物可通过纯度98％(质量百分数)以上的蛋白T1^PrαTACE添加通用的药用辅助成分，制成片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂、软膏剂或针剂。

药学制剂和给药

根据在本领域中已知的用于制备各种剂型的常规方法，T1^PrαTACE蛋白可被配制成溶液、乳液、悬浮液、分散液，或诸如环糊精之类的在合适药物溶剂或载体中的包合配合物，或被配制成丸剂、片剂、锭剂、栓剂、小药囊、糖衣丸、颗粒剂、粉剂、重组粉剂、或连同固体载体的胶囊。实施方式中的药物组合物可通过适当的递送路径被施用，例如口服、肠胃外、直肠、鼻部、局部、或眼部途径，或通过吸入。优选地，组合物被配制成用于静脉内或口服给药。

对于口服给药，药物可以以固体的形式来提供，例如片剂或胶囊，或被配制成溶液、乳液或悬浮液。口服片剂可包括与药学上可接受的相容赋形剂混合的活性组分，所述赋形剂例如稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适当的惰性填充剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、乳糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。示例性的液体口服赋形剂包括乙醇、甘油、水等。示例性崩解剂包括淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、淀粉羟乙酸钠、微晶纤维素和藻酸。结合剂可包括淀粉和明胶。润滑剂—如果存在的话—可以是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可通过诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之类的材料而被包衣，以延缓在胃肠道中的吸收，或可通过肠溶衣而被包衣。口服制剂可以以下列形式存在：以离散单位的形式，例如胶囊、扁囊剂或片剂，各包含预定量的活性组分；以粉剂或颗粒剂的形式；以溶液或在水性液体或非水性液体中的悬浮液形式；或以水包油液体乳液或油包水液体乳液的形式。活性组分也可被制成大丸剂、药糖剂或糊剂。

口服胶囊包括硬的和软的明胶胶囊。为制备硬明胶胶囊，活性组分可与固体、半固体或液体稀释剂混合。软明胶胶囊的制备可通过将活性组分与以下物质混合而实现：水，诸如花生油或橄榄油之类的油，液体石蜡，短链脂肪酸的甘油单酯与甘油二酯的混合物，聚乙二醇400，或丙二醇。

可通过压制或模制而制成片剂，且可任选一种或多种辅助组分加入到片剂中。可通过在适当的机器中压制以诸如粉末或颗粒之类的自由流动形式存在的活性组分而制得制片剂，且可向其中任选混入粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、分解剂(例如，淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。可通过在适当的机器中对被惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物进行模制而制得模制片剂。片剂可任选被包衣或刻痕，且可被配制成使其中的活性组分缓慢或受控制地被释放，这例如可通过按不同比例使用羟丙基甲基纤维素而实现，以获得所需的释放曲线。

口服液可具有以下形式：悬浮液、溶液、乳液、或糖浆，或可被冻干或呈现为干燥产品，其可在被服用之前使用水或其他适当的载体重新配制。这类液体组合物可任选包含下列物质：药学上可接受的诸如悬浮剂之类的赋形剂(例如，山梨醇、甲基纤维素、藻酸钠、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶等)；诸如油之类的非水性载体(例如，杏仁油或分馏椰子油)，丙二醇，乙醇或水；防腐剂(例如，甲基或丙基对羟基苯甲酸或山梨酸)；诸如卵磷脂之类的润湿剂；以及—如果需要—调味剂或着色剂。

对于包括静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内或皮下途径在内的肠胃外施用，可将组合物制成如下形式：缓冲至适当pH值和等渗性的无菌水溶液或悬浮液，或肠胃外可接受的油。适当的水性载体包括林格氏溶液和等渗氯化钠。这类形式可被呈现如下：单位剂量形式，例如安瓿或一次性注射装置；多剂量形式，例如从中可抽取适当剂量的小瓶；或可用于制备可注射制剂的固体形式或预浓缩物。适用于包括静脉内给药在内的肠胃外给药的制剂包括以下形式：可包含抗氧化剂的水性和非水性无菌注射液，缓冲液，抑菌剂，以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。制剂可被存放在单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和小瓶，且可被存储在冷冻干燥(冻干)状态下，仅需在使用之前即刻加入无菌液态载体，例如注射用水。临时注射液和悬浮液可由先前所述的无菌粉剂、颗粒剂和片剂类型制得。

优选的单位剂量制剂是指那些包含一活性组分的每日剂量或单位、每天亚剂量或适当分量的制剂。

剂量和给药途径

本文描述的施用给个体(例如，人类)的T1^PrαTACE剂量可因特定组合物、施用方法、以及病情的特定阶段而变化。其量应足以产生期望的反应。在一些实施方式中，组合物的量是治疗有效量。在一些实施方式中，组合物的量是预防有效量。在一些实施方式中，T1^PrαTACE在组合物中的总量低于诱导毒理学效应的水平(即该水平高于在临床上可接受的毒性水平)，或处于当组合物被施用给个体时潜在副作用可被控制或容忍的水平。

在一些实施方式中，蛋白T1^PrαTACE在所述药物中的量在以下任一范围内：约0.5mg至约5mg，约5mg至约10mg，约10mg至约15mg，约15mg至约20mg，约20mg至约25mg，约20mg至约50mg，约25mg至约50mg，约50mg至约75mg，约50mg至约100mg，约75mg至约100mg，约100mg至约125mg。

在一些实施方式中，T1^PrαTACE蛋白在药物中的给药量至少约为一天0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg。

T1^PrαTACE蛋白有效的剂量可以根据给药方式、病人的年龄体重、病情严重程度以及其它相关的因素而改变，口服给药时推荐剂量为10-2000mg/次，每日1-2次；肠胃外给药推荐剂量为5-500mg/次，每日1次。

虽然蛋白T1^PrαTACE保留了TIMP-1原有的基本蛋白结构，但是对其“MMP-结合脊”(与目标MMP的实际结合部位)以及羧基端的结构进行了大量的编辑改良。从而使改良后的T1^{Pr αTACE}同时具有对MT1-MMP和TACE的抑制作用。除此之外，本实验数据表明，T1^PrαTACE可以有效抑制人肾癌细胞(Caki-1)在小鼠体内的成瘤效果。

本发明的蛋白T1^PrαTACE的优点在于：

(1)原始TIMP-1对MT1-MMP和TACE并没有明显的抑制效果。而T1^PrαTACE则具有十分高效的抑制作用。经实验测定，K_i ^app可低至7.70nM(抑制MT1-MMP)和0.14nM(抑制TACE)。和水溶性的原始TIMP-1不同，新开发的T1^PrαTACE成功在细胞中表达，并嵌入了细胞膜表面。后续的免疫荧光实验进一步表明位于膜表面的T1^PrαTACE更容易和MT1-MMP或TACE相结合。

(2)小鼠异种细胞成瘤模型实验表明，不同于原始TIMP-1，T1^PrαTACE不会促进细胞生长(即失去了增强细胞活性的功能)。

(3)小鼠移植人肾癌细胞(Caki-1)的模型试验进一步表明，T1^PrαTACE具有有效抑制人肾癌细胞在小鼠体内生长、成瘤的作用。

附图说明

图1为T1^PrαTACE和原始TIMP-1的氨基酸序列示意图。

图2显示了T1^PrαTACE对MT1-MMP和TACE的抑制机理图解，展示了T1^PrαTACE的作用机制。T1^PrαTACE蛋白可大致分为两个相对独立且功能不同的结构域。

(1)第一个为抑制结构域，可以和MT1-MMP(K_i ^app 7.70nM，表1)及TACE(K_i ^app0.14nM，表1)的酶活性位点紧密结合，通过阻止底物被酶解，从而高效抑制金属蛋白酶的活性。

(2)第二个为跨膜结构域，包含一个GPI锚链，使游离的TIMP嵌入到细胞膜表面，更接近(同样位于膜表面的)MT1-MMP和TACE。

图3为(细胞膜)非穿透性免疫荧光实验图，其中，图3A为T1^PrαTACE和MT1-MMP在细胞膜表面相互结合非穿透性免疫荧光图；图3B为T1^PrαTACE和TACE在细胞膜表面相互结合非穿透性免疫荧光图。

图4为T1^PrαTACE和TIMP-1对MT1-MMP酶解明胶的抑制效果对比图。

图5A,5B为胞外活性TNF-α和HB-EGF浓度的变化。

图6显示了TIMP-1和T1^PrαTACE的表达对癌细胞在NOD/SCID小鼠(异种细胞成瘤模型)中成瘤体积的影响。

图7为本发明的T1^PrαTACE氨基酸序列示意图。

具体实施方式

以下结合附图描述本发明具体实施方式。

一、材料

1.实验动物

NOD-SCID小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)

2、药品和试剂：

2.1药品:puromycin

2.2试剂:TIMP-1抗体(R&D)、MT1-MMP抗体(Abcam)、TACE抗体(Abcam)、AlexaFluor488抗鼠二抗(Invitrogen)、Alexa Fluor555抗兔二抗(Invitrogen)、DAPI封片剂(Invitrogen)、38％多聚甲醛(Sigma)、绿色荧光明胶(ThermoScientific：Oregon green488)、lipofectamine转染试剂盒(Invitrogen)、丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、磷酸盐底物(Sigma)、TNF-αElisa试剂盒(Sino Bio)、EcoRI内切酶(ThermoScientific)、Xho I内切酶(ThermoScientific)、Apa I内切酶(ThermoScientific)、Nde I内切酶(ThermoScientific)，相关基因序列及引物由生工合成。

2.3仪器:LS-55荧光光谱仪(PerkinElmer Life Sciences)、C1-Si激光共聚焦显微镜(Nikon)、正置荧光显微镜(Nikon)、倒置荧光显微镜(Nikon)、多功能酶标仪(ThermoScientific)。

二、实施例

(一)T1^PrαTACE对MT1-MMP和TACE的抑制效果：

根据文献的方法：

1.Lee MH,Rapti M,Knauper V,Murphy G.Threonine 98,the pivotal residueof tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMP)-1in metalloproteinaserecognition.J.Biol.Chem.2004；279(17):17562-69.

2.Lee MH,Rapti M,Murphy G.Unveiling the surface epitopes that rendertissue inhibitor of metalloproteinase-1inactive against membrane type 1-matrix metalloproteinase.J.Biol.Chem.2003；278(41):40224-30.具体操作如下：

1.从R&D公司购买MT1-MMP(R&D，918-MP-010)和TACE(R&D，930-ADB-010)蛋白。

2.制备合成TIMP-1基因序列(GenBank:S68252.1)，用以下引物(生工合成)进行PCR扩增，正向引物：5'-GAACCATATGTGCACCTGTGTACCACCCCACCCA-3'(已标出Nde I酶切位点，如Seq ID No.3所示)，反向引物：5'-TCAACTGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGATGATGGGCTATCTGGGACCGCAGGGACTG-3'(标出Xho I酶切位点，如Seq ID No.4所示)，得到PCR产物。

3.制备合成同样目的的T1^PrαTACE序列，正向引物：5'-GAAC CATATGTGCACCTGTTCCCCACCCCACCCA-3'，如Seq ID No.5所示，反向引物与TIMP-1序列相同，得到PCR产物。

4.将得到的两种PCR产物进行Nde I和Xho I酶切，分别插入经过同样酶切的pRSET-c表达载体(Invitrogen)，得到携带目的基因的重组质粒。对重组的质粒进行测序(上海生工技术有限公司)，插入的目的基因没有出现突变。

5.测序后的重组质粒TIMP-1和T1^PrαTACE分别转化到BL21(DE3)pLys感受态细胞内，利用E.coli蛋白表达系统来得到这两种目的蛋白。

6.分别以MT1-MMP和TACE为靶向蛋白，用LS-55荧光光谱仪对这两种纯化后的蛋白进行动力学分析。

结果：如下表1所示：

表1

T1^PrαTACE对MT1-MMP和TACE的抑制效果远强于原始TIMP-1

表1显示了T1^PrαTACE和原始TIMP-1分别对金属蛋白酶MT1-MMP以及TACE的抑制效果。所有实验均使用了同样的检测方法，即使用LS-55荧光光谱仪测量荧光多肽底物(Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2,R&D Systems)的变化，从而计算相应的抑制效果。不论是针对MT1-MMP还是TACE，T1^PrαTACE(K_i ^app分别为7.70nM和0.14nM)的抑制效果都要远强于原始TIMP-1(K_i ^app均>150nM)。

(二)、T1^PrαTACE与MT1-MMP(或TACE)在细胞膜表面相互结合聚集作用：

1.制备包装携带目的蛋白编码基因的慢病毒：

a.制备TIMP-1基因序列(GenBank:S68252.1)用于转染细胞，用以下引物进行PCR扩增，正向引物：5'-GCAGCAGAATTCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTGGCT-3'(已标出EcoR I酶切位点，如Seq ID No.6所示)，反向引物：5'-TCAACTGGGGCCCTTAGGCTATCTGGGACCGCAGGGACTG-3'(标出Apa I酶切位点，如Seq ID No,7所示)，得到PCR产物。

b.制备同样用途的T1^PrαTACE序列，正向引物与TIMP-1相同，反向引物：依次①5'-GGCCTGAGATTCCCTCTCGTACTGGGCTATCTGGGACCGCAGGGACTG-3，如Seq ID No.8所示；②5'-CACAGGTGGGGAGGAGAAGAGGACCATGCTCGATCCTCTCTGGTAATAGGCCTGAGATTCCCTCTCGTACTG-3'；如Seq ID No.9所示；③5'-TAAACGGGCCCTCATCCCACTATTAGGAAGATGAGGAAAGAGATCAGGAGGATCACAGGTGGGGAGGAGAAGAGGAC-3'，如Seq ID No.10所示；由1个正向引物和3个反向引物依次作用得到PCR产物。

c.将得到的两种PCR产物进行EcoR I和Apa I酶切，分别与经过同样酶切的pLVX-Puro(Takara)表达载体连接，得到携带目的基因的重组质粒。对重组的质粒进行测序，插入的目的基因没有出现突变。

d.测序之后，用Maxiprep质粒抽提试剂盒(AXYGEN)提取大量的目的DNA，纯化备用。

e.0.5ml无菌超纯水溶解Lenti-X病毒包装试剂(Takara 631276)，然后取10μgTIMP-1和T1^PrαTACEDNA分别与Lenti-X病毒包装试剂混合。

f.将上述混合溶液分别加入到接种在10cm细胞培养皿的Lenti-X 293T细胞中，37℃，5％二氧化碳条件下培养3天，然后收集上清培养液。

g.用含有目的基因的慢病毒的培养液感染CaKi-1细胞，然后用puromycin抗生素对细胞进行筛选，得到稳定表达TIMP-1和T1^PrαTACE的CaKi-1细胞。

2.T1^PrαTACE与MT1-MMP(或TACE)在细胞膜表面相互结合聚集作用

根据文献的方法：

Jiang B,Zhang Y,Liu J,et al.Ensnaring membrane type 1-matrixmetalloproteinase(MT1-MMP)with tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-2using the haemopexin domain of the protease as a carrier:a targeted approachin cancer inhibition.Oncotarget,2017,8(14):22685。具体操作如下：

(1)接种稳定表达TIMP-1和T1^PrαTACE的CaKi-1细胞到腔式载玻片上，37℃，5％二氧化碳条件下培养2天，

(2)4％多聚甲醛固定细胞10分钟，然后用PBS冲洗3遍，

(3)用含有5％BSA的PBS封闭载玻片，放置室温2个小时，

(4)在载玻片上加入两种不同来源的抗体TIMP-1+MT1-MMP/TIMP-1+TACE，4℃孵育过夜，

(5)PBS浸洗载玻片3次，每次5分钟，

(6)同时加入两种不同荧光的二抗，室温孵育2个小时，

(7)PBS浸洗3次之后，封片备用，

(8)用激光共聚焦显微镜观察准备好的载玻片。

结果：(细胞膜)非穿透性免疫荧光实验应用了稳定表达TIMP-1和T1^PrαTACE的CaKi-1细胞系。原始TIMP-1可溶解于水，因此不存在于细胞膜表面。如图3A、3B所示，T1^PrαTACE则只存在于细胞膜表面，并且和膜表面的MT1-MMP或者TACE相互结合、聚集。

(三)、T1^PrαTACE抑制MT1-MMP分解动物明胶基质:

根据文献的方法：

Jiang B,Zhang Y,Liu J,et al.Ensnaring membrane type 1-matrixmetalloproteinase(MT1-MMP)with tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-2using the haemopexin domain of the protease as a carrier:a targeted approachin cancer inhibition.Oncotarget,2017,8(14):22685。具体操作如下：

1.用上述(二).1.包装成功的慢病毒感染HT1080细胞，以同样的方法得到稳定表达TIMP-1和T1^PrαTACE的HT1080细胞，

2.用0.5mg/ml荧光明胶包被腔式载玻片，然后室温放置2个小时，

3.PBS轻揉地冲洗载玻片2次，然后用4％多聚甲醛固定明胶10分钟，

4.重复冲洗步骤5次，以确保充分地去除多聚甲醛，

5.接种分别稳定表达TIMP-1和T1^PrαTACE的HT1080细胞，培养1天，

6.同样方法固定细胞，然后PBS冲洗3次，

7.冷的甲醇穿透细胞膜20分钟(低温条件下)，PBS冲洗3遍，

8.含5％BSA+0.3％Triton X-100的封闭液封闭载玻片之后，孵育MT1-MMP抗体，4℃过夜，

9.孵育荧光二抗，室温2小时，封片备用，

10.用正置荧光显微镜观察和拍照。

结果：该实验以能够稳定表达TIMP-1和T1^PrαTACE的人纤维肉瘤HT1080细胞为样本。将其接种在以荧光明胶为基底的载玻片上，并且过夜培养。实验结果表明，如图4所示，稳定表达T1^PrαTACE的细胞对明胶的酶解能力受到明显抑制，远低于表达TIMP-1的细胞。

(四)、和原始TIMP-1相比较，T1^PrαTACE可以更高效地抑制TACE，从而有效阻碍TNF-α和HB-EGF被(TACE)激活和释放:

根据文献的方法：

Duan J X,Rapti M,Tsigkou A,Lee MH.Expanding the activity of tissueinhibitors of metalloproteinase(TIMP)-1against surface-anchoredmetalloproteinases by the replacement of its C-terminal domain:Implicationsfor anti-cancer effects[J].PloS one,2015,10(8):e0136384。具体操作如下：

1.接种三组HT1080细胞到24孔板中，分别为对照组、TIMP-1(稳定表达)组和T1^{Pr αTACE}稳定表达)组，每组细胞接种3个孔，每个孔的细胞数为1x 10⁵，培养过夜。

2.转染0.1μg HB-EGF/TNF-α质粒，培养2天。

3.吸掉旧的培养液，然后每组细胞一个孔加新鲜培养液，另一个孔加含有PMA(200ng/ml)的培养液，培养3小时，三组细胞做同样的处理。

4.收集每个孔的培养液(含有HB-EGF/TNF-α)，贮存备用。

5.把含有HB-EGF的培养液(-PMA/+PMA 200ng/ml)加入到有碱性磷酸盐底物的二乙醇胺缓冲液中，然后转移到96孔板，放置37℃直到颜色变化。

6.酶标仪读取HB-EGF的吸光度。

7.TNF-α(-PMA/+PMA 200ng/ml)的浓度由TNF-αELISA试剂盒(Sino Bio)检测。

结果：胞外活性TNF-α和HB-EGF浓度的变化表明，T1^PrαTACE对TACE的抑制效果明显优于原始TIMP-1。

该离体实验使用能够稳定表达T1^PrαTACE和TIMP-1的HT1080细胞为样本，检测胞外TNF-α和HB-EGF的浓度变化，从而反映各细胞系中TACE酶活性的强弱。两组实验结果综合表明，T1^PrαTACE对TACE的抑制效果比原始TIMP-1更强。

(五)、T1^PrαTACE(在载体实验中)不具有促进细胞生长的作用：

材料：T175培养瓶(Corning)、细胞计数薄片(Invitrogen)、1ml注射器

试剂：0.4％台盼蓝溶液(Sigma)、DMEM

仪器：自动细胞计数器(Invitrogen)、游标卡尺、天平

方法：

1.培养空白CaKi-1细胞、稳定表达原始TIMP-1和T1^PrαTACE的CaKi-1细胞，直到达到实验所需要的细胞数。

2.分别收集细胞，然后用0.4％台盼蓝溶液染色计数。

3.DMEM重悬细胞，使每组细胞的浓度均达到2x10⁶/ml。

4.NOD/SCID小鼠随机分成3组，对照组、TIMP-1组、T1^PrαTACE组，每组8只小鼠、

5.0.1ml/处注射到小鼠腹部皮下，左右腹各一处。

6.持续培养小鼠35天，一周内测量两次瘤体的大小(游标卡尺测)。

7.35天之后处死小鼠，取瘤称重。

结果：如图6所示，被植入TIMP-1细胞的8只小鼠中，有6只都形成了不同体积(体积在20mm³到248mm³之间)的肿瘤。但是在对照组和被植入了T1^PrαTACE细胞的小鼠体内均未发现有细胞成瘤(*p<0.05)。T1^PrαTACE不具有促进细胞生长的作用，不同于原始的TIMP-1。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

<110> 西交利物浦大学

<120> 膜型金属蛋白酶抑制蛋白及其用途

<160> 10

<210> 1

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工合成 T1PrαTACE

<400> 1

Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Ser Pro Pro His Pro Gln

20 25 30

Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe Val Gly

35 40 45

Thr Pro Glu Val Asn Gln Gly Pro Phe Gly Thr Gln Arg Tyr Glu Ile

50 55 60

Lys Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala

65 70 75 80

Asp Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Leu Cys Gly Tyr

85 90 95

Phe His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Leu Cys Ser Phe Val Ala Pro

115 120 125

Trp Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr

130 135 140

Thr Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro

145 150 155 160

Cys Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu

165 170 175

Gln Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro

180 185 190

Arg Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala

195 200 205

Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met

210 215 220

Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile

225 230 235 240

Phe Leu Ile Val Gly

245

<210> 2

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggccccct ttgagcccct ggcttctggc atcctgttgt tgctgtggct gatagccccc 60

agcagggcct gcacctgttc cccaccccac ccacagacgg ccttctgcaa ttccgacctc 120

gtcatcaggg ccaagttcgt ggggacacca gaagtcaatc agggtccgtt cggcacccag 180

cgttatgaga tcaagatgac caagatgtat aaagggttcc aagccttagg ggatgccgct 240

gacatccggt tcgtctatac ccccgccatg gagagtctct gcggatactt ccacaggtcc 300

cacaaccgca gcgaggagtt tctcattgct ggaaaactgc aggatggact cttgcacatc 360

actctctgca gtttcgtggc tccctggaac agcctgagct tagctcagcg ccggggcttc 420

accaagacct acactgttgg ctgtgaggaa tgcacagtgt ttccctgttt atccatcccc 480

tgcaaactgc agagtggcac tcattgcttg tggacggacc agctcctcca aggctctgaa 540

aagggcttcc agtcccgtca ccttgcctgc ctgcctcggg agccagggct gtgcacctgg 600

cagtccctgc ggtcccagat agcccagtac gagagggaat ctcaggccta ttaccagaga 660

ggatcgagca tggtcctctt ctcctcccca cctgtgatcc tcctgatctc tttcctcatc 720

ttcctaatag tgggatga 738

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gaaccatatg tgcacctgtg taccacccca ccca 34

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tcaactgctc gagttaatga tgatgatgat gatgatgatg ggctatctgg gaccgcaggg 60

actg 64

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaaccatatg tgcacctgtt ccccacccca ccca 34

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcagcagaat tcaccatggc cccctttgag cccctggct 39

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcaactgggg cccttaggct atctgggacc gcagggactg 40

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggcctgagat tccctctcgt actgggctat ctgggaccgc agggactg 48

<210> 9

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cacaggtggg gaggagaaga ggaccatgct cgatcctctc tggtaatagg cctgagattc 60

cctctcgtac tg 72

<210> 10

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

taaacgggcc ctcatcccac tattaggaag atgaggaaag agatcaggag gatcacaggt 60

ggggaggaga agaggac 77

Claims (5)

1.一种膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述的膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE用途，其特征在于，用于制备治疗以MT1‐MMP或TACE蛋白内切酶为潜在靶点的肿瘤药物的用途。

3.一种药物，其包含权利要求1所述的膜型金属蛋白酶抑制蛋白T1^PrαTACE以及药学上可接受的赋形剂。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述赋形剂为载体、溶剂、乳化剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、稳定剂、着色剂、香料。

5.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物为针剂、片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂或软膏剂。