CN108295058A - 用于增强能量代谢的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了可用于诱导脂肪酸氧化或线粒体生物发生的升高、减少体重增加、诱导体重减轻或增加Sirt1、Sirt3或AMPK活性的组合物和方法。此类组合物包含PDE 5抑制剂如西地那非或淫羊藿苷和白藜芦醇和支链氨基酸如亮氨酸或其代谢物的组合。

Description

用于增强能量代谢的组合物和方法

本申请是2013年11月13日提交的发明名称为“用于增强能量代谢的组合物和方法”的第201380070248.9号(国际申请号PCT/US2013/069957)中国专利申请的分案申请。

交叉引用

本申请要求2012年11月13日提交的美国临时申请号61/726,006的优先权，该临时申请为了所有目的通过引用整体并入本文。

背景技术

所有的生物体都已发展了通过平衡其能量摄入和代谢与其生物支出需求而保持体内能量稳态的精妙的代谢途径。在哺乳动物中，这些途径调节食物摄取、葡萄糖稳态、脂肪和/或肌肉中的能量储存以及通过例如身体活动进行能量动员。通常由相对于能量支出而言过度的能量摄取所导致的这些途径的功能失常，导致能量稳态不平衡，其转而可能导致多种代谢紊乱。其中有肥胖、糖尿病、高血压、动脉硬化、高胆固醇和高脂血症。

人类代谢紊乱的高发病率及对健康和死亡率的相关影响显示出了对公共健康的显著负担。例如，肥胖，在临床上被定义为身体质量指数超过30kg/m²，据估计其影响35.7％的美国成年人口。肥胖增加了很多疾病的可能性，例如心脏疾病和II型糖尿病，且肥胖为世界上主要的可预防的死亡原因之一。在美国，据估计肥胖导致每年约110,000-365,000例死亡。糖尿病是一种代谢紊乱，其特征为高血糖水平或低葡萄糖耐受，据估计其影响了8％的美国人口。糖尿病还与由血管疾病、癌症、肾病、传染病、外部原因、故意自残、神经系统紊乱和慢性肺病导致的较高死亡风险显著相关(N Engl J Med 2011；364:829-841)。据估计，受试者表现出向心性肥胖和至少两种其他代谢紊乱(例如高胆固醇、高血压或糖尿病)的代谢综合征影响了25％的美国人口。

去乙酰化酶(Sirtuins)是高度保守的蛋白质去乙酰化酶和/或ADP-核糖基转移酶，已显示其能够延长低等模型生物如酵母、秀丽线虫(C.elegans)和果蝇的寿命。在哺乳动物中，去乙酰化酶已显示能充当代谢传感器，响应于环境信号，以协调调节多种能量稳态途径的基因的活性。例如，研究表明，去乙酰化酶活化模拟卡路里限制(caloricrestriction)——一种经证明能显著延长寿命的干预——的效果，并激活能改善葡萄糖稳态和脂肪通过脂肪酸氧化转化为能量的基因。

去乙酰化酶途径还包括磷酸二酯酶(PDE)。PDE是与环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)相互作用的酶。PDE酶家族包含多个子类，包括人类中的PDE-11。这些磷酸二酯酶的抑制剂可防止cAMP和cGMP的失活，并且可能具有多种不同的生理效应。PDE抑制剂可以是选择性的，即与另一子类相比优先抑制一个PDE子类，或是非选择性的，即对于各个PDE子类具有基本上较低程度的选择性。西地那非是选择性PDE抑制剂的一个实例，其对PDE5已经显示出选择性抑制。西地那非是已经用于治疗肺动脉高压、勃起功能障碍和高空病的药学活性剂。

已经进行了很多努力来尝试开发通过靶向特定的能量代谢途径的代谢紊乱治疗方法。这些努力已经导致开发了例如异黄酮类(美国专利申请号20110165125)、四氢利普司他汀(美国专利号6,004,996)和调节SIRT1和AMPK途径的组合物(美国专利申请号20100210692、20100009992、20070244202和20080176822)。然而，这些努力仅取得有限的成功。例如，SIRT1激活剂白藜芦醇在人类中的应用受到了其有限的生物利用度的限制，这需要高剂量，这会引发安全性考虑。因此，仍然亟需能够通过安全地调节代谢途径来解决多种代谢紊乱的治疗方法。

发明内容

本发明总体上涉及能量代谢调节领域。在一些实施方案中，本发明提供了使用PDE抑制剂如PDE5和支链氨基酸调节能量代谢的组合物、方法和试剂盒。

包含PDE抑制剂的组合物可以有效地调节能量代谢，因为PDE是去乙酰化酶途径的成员。由于这些PDE抑制剂可以对去乙酰化酶途径具有影响，因此包含选择性和非选择性PDE抑制剂的组合物均可对调节能量代谢具有有益的影响。

本发明满足了对用于调节能量代谢的改善的组合物及补充物的需求。能量代谢的调节可以允许体重或脂肪组织的减少、脂肪氧化或胰岛素敏感度的增加和/或炎症或氧化应激的减少。这些效应可以通过包括细胞代谢和线粒体生物发生在内的能量代谢的增加或调节的方式产生。

本申请提供了可用于诱导受试者中脂肪酸氧化和线粒体生物发生增加的组合物。该组合物还导致Sirt1和Sirt3的活化，从而介导有益的下游效应，包括对糖尿病、心血管疾病和炎性疾病的预防和治疗。这类组合物含有PDE抑制剂与支链氨基酸和/或其代谢物(例如β-羟甲基丁酸酯(HMB)、亮氨酸、酮异己酸(KIC)，或HMB、KIC和/或亮氨酸的组合)的组合，该PDE抑制剂包括但不限于PDE5抑制剂，例如阿伐那非、伊地那非(iodenafil)、米罗那非、西地那非、他达拉非、淫羊藿苷、伐地那非、乌地那非或扎普司特(zaprinst)。该支链氨基酸可以是亮氨酸且该代谢物可以是HMB和KIC。本申请还提供了增加受试者中的脂肪酸氧化的方法，其包括施用所公开的组合物。

本发明的一个方面提供了一种有效增强能量代谢的组合物，其包含：(a)PDE抑制剂，例如PDE5抑制剂；和(b)亮氨酸和/或亮氨酸代谢物。在一些实施方案中，与向受试者单独施用组分(a)或(b)相比，该组合物更大程度地增强受试者的能量代谢。在一些实施方案中，亮氨酸和/或亮氨酸代谢物以游离氨基酸和/或游离氨基酸代谢物的形式存在。例如，亮氨酸可以以不包含肽键的形式存在。

在一些实施方案中，增强的能量代谢通过以下项目来度量：脂肪细胞的脂肪酸氧化增加至少约300％，脂肪细胞的葡萄糖利用增加至少150％，脂肪细胞的葡萄糖利用增加变化至少60％，或线粒体生物量增加至少约15％。

在一些实施方案中，增强的能量代谢通过以下项目来度量：餐后血糖降低至少20％，餐后胰岛素降低至少30％，空腹血糖降低至少40％，空腹胰岛素降低至少40％，对葡萄糖负荷的血糖应答降低至少15％，胰岛素耐受结果的两倍改善，或炎性应激降低至少20％。在一些实施方案中，对葡萄糖负荷的血糖应答通过葡萄糖耐受曲线下面积来测量。

在一些实施方案中，所述PDE 5抑制剂是阿伐那非、伊地那非、米罗那非、西地那非、他达拉非、淫羊藿苷、伐地那非、乌地那非或扎普司特。在另一些实施方案中，所述PDE 5抑制剂是西地那非或淫羊藿苷。在一些实施方案中，所述PDE 5抑制剂是淫羊藿苷。在一些实施方案中，组分(b)是HMB。在一些实施方案中，组分(b)是游离亮氨酸。在另一些实施方案中，该组合物进一步包含非选择性PDE抑制剂。在另一些实施方案中，该组合物进一步包含维生素B6。

在一些实施方案中，该组合物进一步包含药学活性剂。该组合物可以进一步包含两种药学活性剂。这两种药学活性剂中的一种可以是西地那非。在一些实施方案中，该组合物被配制为用于口服。

该组合物可以是包含亚治疗量的组分(a)的单位剂量。亚治疗量的组分(a)可以是约0.1至20mg的西地那非。亚治疗量的组分(a)可以是约0.1至10mg的西地那非。亚治疗量的组分(a)可以是约0.5-50mg的阿伐那非、0.05-10mg的伊地那非、0.25-25mg的米罗那非、0.01-1.25mg的他达拉非、0.01-1.25mg的伐地那非、0.5-50mg的乌地那非、0.5-50mg的扎普司特或0.05-100mg的淫羊藿苷。组分(b)可以包含至少约500mg的亮氨酸。组分(b)可以包含至少约200mg的HMB。在一些实施方案中，组分(b)包含50-1000mg的游离亮氨酸。组分(b)可以包含500-700mg的游离亮氨酸。

本发明的另一个方面提供了一种有效增强能量代谢的组合物，其包含：(a)PDE 5抑制剂；和(b)多酚，其中与向受试者单独施用组分(a)或(b)相比，该组合物更大程度地增强受试者的能量代谢。所述多酚可以是白藜芦醇。

所述多酚可以是茋或羟基肉桂酸。所述多酚可以是绿原酸、白藜芦醇、咖啡酸、白皮杉醇、鞣花酸、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、葡萄籽提取物或其任何类似物。该组合物可以进一步包含亮氨酸和/或亮氨酸代谢物。

本发明的一个方面提供了一种调节有需要的受试者中的能量代谢的方法，其包括向该受试者施用本文所述的组合物。该组合物可以口服施用。

本发明的另一个方面提供了一种调节能量代谢的方法，其包括鉴别具有肥胖或糖尿病或有肥胖或糖尿病倾向的受试者，向该受试者施用本文所述的组合物。

本发明还提供了一种调节有需要的受试者中的能量代谢的方法，其包括向该受试者施用单位剂量，该单位剂量包含亚治疗量的PDE抑制剂，例如PDE 5抑制剂，和至少约500mg的亮氨酸或200mg的HMB。亚治疗量的PDE抑制剂，例如PDE 5抑制剂，可以少于约10mg/天。该PDE 5抑制剂可以是西地那非。该亮氨酸可以是游离氨基酸的形式，例如，完整形式。例如，该亮氨酸可以以不包含肽键的形式存在。

本发明的一个方面提供了一种增强受试者的能量代谢的方法，其包括：以选定的给药水平施用本文所述的组合物，其中该选定的给药水平诱导受试者中约1nM西地那非和约0.5mM亮氨酸的循环水平。该亮氨酸可以是游离氨基酸形式，例如完整形式。例如，该亮氨酸可以以不包含肽键的形式存在。在一些情况下，本文的任何方法包括施用该组合物超过1周、超过2周或超过6周。

本发明还提供了一种治疗有需要的受试者中的糖尿病的方法，其包括向该受试者施用在治疗上有效的组合物，该组合物包含PDE 5抑制剂；和游离氨基酸形式的支链氨基酸或其代谢物。该糖尿病可以是，例如，I型糖尿病或II型糖尿病。例如，该组合物的施用可以改善受试者的胰岛素敏感度。I型糖尿病的特征可以是，与没有I型糖尿病的受试者相比降低的产生胰岛素的能力。本文所述组合物的施用可以改善患有I型糖尿病的受试者对由受试者产生或施用给受试者的胰岛素的敏感度。改善的敏感度可大于在施用该组合物之前测量的该受试者的敏感度。II型糖尿病的特征可以是降低的对胰岛素的敏感度。因此，本文所述的组合物的施用可以改善患有II型糖尿病的受试者的胰岛素敏感度。该糖尿病可以是饮食诱导的糖尿病。在一些实施方案中，所述支链氨基酸是游离亮氨酸。在一些实施方案中，所述支链氨基酸代谢物是HMB。可以理解，在治疗上有效的组合物可以是本文所述的任何组合物。

在一些实施方案中，所述PDE5抑制剂是淫羊藿苷。在一些实施方案中，所述PDE5抑制剂是西地那非。在一些实施方案中，所述PDE5抑制剂是他达拉非。在一些实施方案中，所述PDE5抑制剂是伐地那非。在一些实施方案中，所述PDE5抑制剂是乌地那非。在一些实施方案中，所述PDE5抑制剂是扎普司特。

在一些实施方案中，所述方法包括口服施用在治疗上有效的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用在治疗上有效的组合物至少一周。在一些实施方案中，所述方法包括施用在治疗上有效的组合物至少两周。在一些实施方案中，所述方法包括施用在治疗上有效的组合物至少六周。

在一些实施方案中，施用在治疗上有效的组合物改善了受试者的糖尿病的症状。该糖尿病的症状可以是I型和/或II型糖尿病的症状。该糖尿病症状的改善可通过以下项目来度量：餐后血糖降低至少20％，餐后胰岛素降低至少30％，空腹血糖降低至少40％，空腹胰岛素降低至少40％，对葡萄糖负荷的血糖应答降低至少15％，胰岛素耐受结果的两倍改善，或炎性应激降低至少20％。在一些实施方案中，对葡萄糖负荷的血糖应答通过葡萄糖耐受曲线下面积来测量。

本发明的另一个方面提供了一种试剂盒，其包含本文所述组合物的单位剂量的多日供应以及指导在多天的一段时间内施用所述多日供应的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含可穿戴的活动监视器。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利以及专利申请在此通过引用并入本文，其程度如同特别地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。

附图说明

本发明的新特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1描绘了显示去乙酰化酶途径的图示。

图2显示了西地那非与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的脂肪酸氧化的交互影响。脂肪酸氧化被测量为O₂消耗对棕榈酸盐注射的应答，并表示为距注射前基线的％变化。垂直线表示棕榈酸盐注射时间；该线左侧的数据点为基线测量值，该线右侧的数据点显示出O₂消耗应答。

图3显示了西地那非与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的脂肪酸氧化的交互影响。数据表示为距对照值的％变化。*p＝0.013；**p＝0.015。

图4显示了西地那非与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对3T3-L1脂肪细胞中的脂肪酸氧化的交互影响。数据表示为距对照值的％变化。*p<0.05。

图5显示了西地那非与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的葡萄糖利用的交互影响。葡萄糖利用被测量为胞外酸化对葡萄糖注射的应答。*p＝0.04。

图6显示了西地那非与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖利用的交互影响。葡萄糖利用被测量为胞外酸化对葡萄糖注射的应答。*p＝0.05。

图7显示了淫羊藿苷与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的脂肪酸氧化的交互影响。脂肪酸氧化被测量为O₂消耗对棕榈酸盐注射的应答，并表示为距注射前基线的％变化。垂直线表示棕榈酸盐注射时间；该线左侧的数据点为基线测量值，该线右侧的数据点显示出O₂消耗应答。

图8显示了淫羊藿苷与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的脂肪酸氧化的交互影响。数据表示为距对照值的％变化。*p＝0.03；**p＝0.002。

图9显示了淫羊藿苷与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对3T3-L1脂肪细胞中的脂肪酸氧化的交互影响。数据表示为距对照值的％变化。*p<0.05。

图10显示了西地那非与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的一氧化氮产生的交互影响。*p<0.0001，相对于对照；**p＝0.0003，相对于所有其他处理。

图11显示了淫羊藿苷与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的一氧化氮产生的交互影响。p<0.0001，相对于对照；**p＝0.00013，相对于所有其他处理。

图12显示了西地那非与HMB、亮氨酸与白藜芦醇对C2C12肌管中的线粒体生物发生(测量为线粒体质量)的交互影响。*p<0.0001，相对于对照；**p＝0.0003，相对于所有其他处理。

图13显示了淫羊藿苷(1nM)与HMB(5μM)、亮氨酸和白藜芦醇对C2C12肌管中的线粒体生物发生(测量为线粒体质量)的交互影响。p<0.0001，相对于对照；**p＝0.00013，相对于所有其他处理。

图14显示了在六周低或高脂肪饮食之后，小鼠腹膜内葡萄糖耐受试验的结果。

图15显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理七天对餐后血糖水平的影响。

图16显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理十四天对餐后血糖水平的影响。

图17显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理十四天对餐后血浆胰岛素的影响。

图18显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理十四天对胰岛素抗性测量值的稳态评估的影响。

图19显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理28天后对1.2U胰岛素/kg体重的血糖应答。

图20显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理28天后对1.2U胰岛素/kg体重的30分钟血糖应答。

图21显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中用亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理5周时测量的葡萄糖耐受试验的结果。

图22显示了从图21所示的葡萄糖耐受试验获得的、经计算的随时间推移对葡萄糖负荷的综合血糖应答。

图23显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中用亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理6周后的空腹血糖水平。

图24显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中用亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理6周后的空腹胰岛素水平。

图25显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中用亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理6周后的胰岛素抗性的稳态评估。

图26显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中用亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理6周后的肝脏质量。

图27显示了与未经处理的低脂肪饮食小鼠相比，在高脂肪饮食小鼠中用亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷处理6周后的炎症标志物C反应蛋白的水平。

具体实施方式

本发明的几个方面参考用于说明的应用示例描述如下。应当理解，为了提供对本发明的完整理解，阐述了很多具体的细节、关系和方法。然而，相关领域普通技术人员将很容易认识到，可以不使用一种或多种所述具体细节或者可以用其他方法来实施本发明。除非另有说明，否则本发明不限于所述的行为或事件的顺序，因为一些行为可能以不同的顺序发生和/或与其他行为或事件同时发生。此外，并非需要所有描述的行为或事件来实施根据本发明的方法。所公开的组合物中多种组分的浓度是示例性的，并不意味着被限制于所提及的浓度本身。

如本文使用的，术语“受试者”或“个体”包括哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人和小鼠，包括转基因和非转基因小鼠。本文描述的方法可用于人类治疗、临床前和兽医应用。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物，在一些实施方案中，受试者为人。其他哺乳动物包括但不限于，猿、黑猩猩、猩猩、猴子；驯养动物(宠物)，如狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、兔和雪貂；驯养家畜，如牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；或通常在动物园中见到的野生动物，例如熊、狮、虎、豹、象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树懒、瞪羚、斑马、角马、草原犬鼠、无尾熊、袋鼠、熊猫、大熊猫、鬣狗、海豹、海狮和海象。

术语“施用”和“给药”被定义为通过本领域已知的途径向受试者提供组合物，该途径包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、颊部、局部、经皮、直肠、肌肉内、皮下、骨内、经粘膜或腹膜内给药途径。在本申请的某些实施方案中，施用组合物的口服途径可能是优选的。

如本文使用的，“药剂”或“生物活性剂”是指生物学、药学或化学化合物或其他部分。非限制性的实例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、肽核酸(PNA)、寡核苷酸(包括，例如，适体和多核苷酸)、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素或化疗化合物。可以合成各种化合物，例如，小分子和低聚物(例如，寡肽和寡核苷酸)，以及基于多种核心结构的合成有机化合物。另外，多种天然来源也可以提供用于筛选的化合物，例如植物或动物提取物等。熟练技术人员可以容易地认识到，对于本发明的药剂的结构性质没有限制。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指本文所述的化合物的量足以实现预期的应用，包括但不限于如下定义的疾病治疗。治疗有效量可根据预期的应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况(例如，受试者的体重和年龄、病情的严重程度、给药方式等)而变化，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。该术语也适用于将会诱导靶细胞中的特定应答(例如，增殖的减少或靶蛋白活性的下调)的剂量。具体剂量将根据所选的具体化合物、要遵循的给药方案、其是否与其他化合物联合施用、给药时机、其所施用到的组织和携带它的物理递送系统而变化。

如本文使用的术语“能量代谢”是指伴随体内生化反应的能量的转化，该生化反应包括细胞代谢和线粒体生物发生。能量代谢可以用本文描述的多种测量方法来定量，例如但不限于，体重减轻、脂肪损失、胰岛素敏感度、脂肪酸氧化、葡萄糖利用、甘油三酯含量、Sirt 1表达水平、AMPK表达水平、氧化应激和线粒体生物量。

当应用于本发明的组分，例如PDE 5抑制剂，包括但不限于西地那非和淫羊藿苷，亮氨酸和亮氨酸代谢物(如HMB)和白藜芦醇时，术语“分离的”是指缺乏至少一些其他组分的物质的制品，这些组分还可能存在于该物质或类似物质天然存在或最初获得之处。因此，例如，分离的物质可通过使用纯化技术从来源混合物中富集该物质来制备。富集可基于绝对量来测量，例如每单位体积的溶液的重量，或者其可相对于来源混合物中存在的第二、潜在干扰性物质来测量。本发明实施方案的越来越高的富集是逐渐更优选的。因此，例如，2倍富集是优选的，10倍富集是更加优选的，100倍富集是更加优选的，1000倍富集是更加优选的。物质还可以通过人工组装过程(如通过化学合成)以分离的状态提供。

途径的“调节剂”是指调节定位(mapped)到相同的特定信号转导途径的一种或多种细胞蛋白质的活性的物质或药剂。调节剂可以增强或抑制信号分子的活性和/或表达水平或模式。调节剂可以通过直接与途径中的组分结合来激活该组分。调节剂也可以通过与一种或多种相关组分相互作用来间接地激活途径中的组分。途径的输出可以用蛋白质的表达或活性水平来测量。途径中的蛋白质的表达水平可以由相应的mRNA或相关转录因子的水平以及该蛋白质在亚细胞定位中的水平来反映。例如，某些蛋白质通过在特定的亚细胞组分内部或外部改变位置而被激活，该亚细胞组分包括但不限于细胞核、线粒体、核内体、溶酶体或细胞的其他膜性结构。途径的输出也可以用生理效应如线粒体生物发生、脂肪酸氧化或葡萄糖摄取来测量。

“激活剂”是指以增加途径输出的方式影响途径的调节剂。特定靶标的激活可以是直接的(例如，通过与靶标相互作用)或间接的(例如，通过与包含靶标的信号传导途径中的靶标上游的蛋白质相互作用)。

术语“选择性抑制”或“选择性地抑制”当涉及生物活性剂时，是指该药剂通过与靶标的直接或间接相互作用，与脱靶信号活性相比，优先降低靶信号活性的能力。

“抑制剂”可以是以通过减少途径输出的方式影响途径的调节剂。

如本文使用的术语“基本上不含”是指具有少于约10％、少于约5％、少于约1％、少于约0.5％、少于0.1％或更少的特定组分的组合物。例如，基本上不含非支链氨基酸的组合物可以含有少于约1％的非支链氨基酸赖氨酸。例如，基本上不含非支链氨基酸可以通过与给定组合物中的其余氨基酸相比少于1％的非支链氨基酸来证实。

药剂、激活剂或治疗剂的“亚治疗量”是这样的量：其少于该药剂、激活剂或治疗剂的有效量，但是当与有效量或亚治疗量的另一种药剂或治疗剂联合时，由于例如得到的有效作用中的协同效应和/或减少的副作用，可以产生期望的结果。

“协同的”或“协同”效应可以是这样的，其使得联合组合物的一种或多种效应大于类似给药水平下每种单独组分的一种或多种效应，或者其可以大于类似给药水平下所有组分的效应之预测和，假定每种组分单独作用。协同效应可以比单独使用其中一种组分时对受试者的效应或当每种组分单独施用时测定的叠加效应高大约或大于约10％、20％、30％、50％、75％、100％、110％、120％、150％、200％、250％、350％或500％或更多。该效应可以是本文描述的任何可测量的效应。

如本文所用的术语“游离氨基酸形式”或“单独的氨基酸形式”可指没有与其他氨基酸结合(例如通过肽键)的氨基酸。例如，“游离的”或“单独的”亮氨酸是指没有与其他氨基酸通过肽键结合的亮氨酸。

组合物

本发明的组合物可以包含选择性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂。该PDE抑制剂可以对一种或多种PDE酶或靶标具有选择性。例如，该PDE抑制剂可以是PDE 1、2、3、4、5、6、9或11选择性抑制剂。去乙酰化酶途径包括但不限于信号分子，例如Sirt 1、Sirt 3和AMPK。该PDE抑制剂可以与提供协同效应的另一种组分组合，例如该PDE抑制剂可以与亮氨酸和/或其代谢物组合。在一些实施方案中，该组合物可以包含PDE 5抑制剂，例如西地那非或淫羊藿苷，和亮氨酸和/或其代谢物，例如羟甲基丁酸酯(HMB)。

本发明提供了能够增加或调节去乙酰化酶途径的输出的组合物。该途径的输出可以通过表达水平和/或途径的活性和/或生理效应来测定。在一些实施方案中，Sirt1途径的活化包括PGC1-α的刺激和/或随后的线粒体生物发生和脂肪酸氧化的刺激。通常，去乙酰化酶途径激活剂是激活或增加去乙酰化酶途径的一种或多种组分的化合物。去乙酰化酶途径的增强或活化可通过途径中的组分蛋白质活性的升高而观察到。例如，该蛋白质可以是Sirt1、PGC1-α、AMPK、Epac1、腺苷酸环化酶、Sirt3或任意其他蛋白质及其各自沿着图1所示的信号途径的相关蛋白质(Park等人，“Resveratrol Ameliorates Aging-RelatedMetabolic Phenotypes by Inhibiting cAMP Phosphodiesterases,”Cell 148，421-433，2012年2月3日)。可作为去乙酰化酶途径输出的量度的生理效应的非限制性实例包括线粒体生物发生、线粒体生物量、脂肪酸氧化、葡萄糖摄取、一氧化氮的产生、棕榈酸盐摄取、氧消耗、二氧化碳生成、体重减轻、热量产生、内脏脂肪组织减少、呼吸交换率、胰岛素敏感度、炎症标志物水平、血管舒张、脂肪细胞褐化和鸢尾素产生。脂肪细胞褐化的指标的实例包括但不限于增加的脂肪酸氧化和一种或多种褐化脂肪选择性基因(例如Ucp1、Cidea、Prdm16和Ndufs1)的表达。在一些实施方案中，可作为去乙酰化酶途径输出量度的一种或多种生理效应的变化由例如通过施用本发明的组合物而增加鸢尾素产量而诱导。

线粒体生物发生的升高可由新线粒体形成的增加、线粒体生物量的增加和/或线粒体功能的增强来证实，例如受试者中脂肪酸氧化增加、热量产生增加、胰岛素敏感度升高、葡萄糖摄取增加、血管舒张增强、体重减轻、脂肪体积减小和炎性应答或标志物的减少。

该组合物可以是联合组合物，其可包含一种或多种协同组分。包含多种组分的组合物可以是这样的，其使得协同效应是细胞代谢的增强，以及细胞代谢与施用每种组分的效应之和(如同每种组分独立地发挥其作用而确定，在本文中也被称为预测的累加效应)相比更大程度地增加，。例如，如果包含组分(a)的组合物产生细胞代谢改善20％的效应而包含组分(b)的组合物产生细胞组合物改善50％的效应，那么如果包含组分(a)和组分(b)的组合物对细胞代谢的效应大于70％，则该联合组合物将具有协同效应。

协同的联合组合物具有的效应可大于单独施用该联合组合物中的每种组分(犹如每种组分独立地发挥其效应)的预测累加效应。例如，如果预测的累加效应是70％，则140％的实际效应比该预测累加效应高70％或比该预测累加效应高一倍。协同效应可比预测累加效应高至少约20％、50％、75％、90％、100％、150％、200％或300％。或者，协同效应可比预测累加效应高至少约0.2、0.5、0.9、1.1、1.5、1.7、2或3倍。

在一些实施方案中，联合组合物的协同效应能够允许减少给药量，从而导致对受试者的副作用减少并降低治疗成本。在其他实施方案中，协同效应可以获得任何其他常规治疗均无法获得的结果。本发明的联合组合物提供了能量代谢调节的显著改善。

在一些实施方案中，所述组合物可以是一种或多种支链氨基酸和/或其代谢物与可以具有一种或多种特性的去乙酰化酶途径激活剂的联合组合物。所述一种或多种支链氨基酸可以是游离氨基酸形式。该联合组合物(a)可具有增加去乙酰化酶途径输出的协同效应，(b)使去乙酰化酶途径输出增加至少约1、2、5、7、10或20倍，(c)具有大于约20的支链氨基酸和/或其代谢物与去乙酰化酶途径输出的摩尔比，(d)被配制为用于口服的单位剂量，其中去乙酰化酶途径激活剂是基本上均质的一组多酚分子，且(e)可具有协同效应并进一步包含食物载体。本文描述的任意组合物可具备这些特性中的一种或多种。与一种或多种支链氨基酸联合使用的去乙酰化酶途径激活剂的实例描述在美国专利申请系列号13/549,381和13/549,399中，其均通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含(a)一种或多种类型的支链氨基酸和/或其代谢物和(b)以亚治疗量存在的选择性PDE抑制剂，其中该组合物与单独使用时的组分(a)或(b)相比，协同有效地使去乙酰化酶途径输出增加至少约5、10、50、100、200、500倍或更多倍。该组合物中的支链氨基酸可以是游离氨基酸的形式。

磷酸二酯酶抑制剂

在一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂调节磷酸二酯酶(PDE)的活性。去乙酰化酶途径激活剂可作为PDE抑制剂调节PDE的活性。该PDE抑制剂可以是选择性的或非选择性的。该PDE抑制剂可以对PDE子类如PDE 5表现出选择性抑制。选择性PDE抑制剂的实例包括针对PDE 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的抑制剂。非选择性PDE抑制剂可以对磷酸二酯酶的子类不加区分。此外，一些非选择性PDE抑制剂可以与超过一种代谢途径相互作用。例如，一些非选择性PDE抑制剂可以是黄嘌呤衍生物且充当腺苷拮抗剂，并且与其他代谢途径具有未知的相互作用。选择性PDE抑制剂可以是对所选PDE表现出优先相互作用的PDE抑制剂。例如，PDE抑制剂可与PDE 5具有强相互作用，而与其他PDE子类具有很弱的相互作用。

选择性地和负面地调节PDE子类如PDE 5的表达或活性的任何药剂可在本发明的组合物和方法中用作选择性PDE抑制剂。

例如，选择性PDE抑制剂备选地是这样一种药剂，其对PDE子类如PDE 5表现出的50％抑制浓度(IC50)比该抑制剂对一、二、三种或更多种其他PDE子类的IC50低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍、至少10,000倍。在一些实施方案中，选择性PDE抑制剂可以是这样一种药剂，其对PDE子类如PDE 5表现出的50％抑制浓度(IC50)比该抑制剂对所有其他PDE子类的IC50低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍、至少10,000倍或更多倍。

在一个方面，IC50是在基于细胞的试验中给定PDE的50％受到抑制时的浓度的测定值。IC50测定可以通过使用本领域已知的任何常规技术来实现。通常，IC50可如下测定：在一系列浓度的所研究的抑制剂的存在下测定给定酶的活性。然后将经实验获得的酶活性值针对所用的抑制剂浓度作图。显示50％酶活性(与不存在任何抑制剂下的活性相比)的抑制剂的浓度被当作“IC50”值。类似地，其他抑制浓度可以通过适当的活性测定来定义。例如，在一些设置中，确立90％抑制浓度，即IC90等是所期望的。

测定PDE抑制剂的选择性的方法描述在Zoraghi的“Phosphodiesterase-5 Gln-817 is critical for cGMP,vardenafil,or sildenafil affinity:its orientationimpacts cGMP but not cAMP affinity”(2006)和Bender的“Cyclic NucleotidePhosphodiesterases:Molecular Regulation to Clinical Use”(2006)中，其均通过引用而整体并入本文。

本发明的生物活性剂可抑制PDE活性，如在基于细胞的试验或体外激酶试验中所确定的，其IC50值为约100nM或更小，优选约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100pM、50pM、25pM、10pM、1pM或更小。

在一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂是PDE 1抑制剂，如尼莫地平、长春西汀(vinopocetine)和IC224。PDE 1抑制剂可以与PDE 1相互作用，PDE 1是Ca2+/钙调蛋白调节的磷酸二酯酶，其可用于降解cAMP和cGMP两者。长春西汀可以来源于长春花提取物，且可作为脑血管的血管扩张药。长春西汀可以是膳食补充剂的形式。

在另一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂是PDE 3抑制剂，如美立苯旦、氨力农(arinone)和西洛酰胺。去乙酰化酶途径激活剂可以是PDE 4抑制剂，如阿普斯特、松叶菊碱、异丁司特、吡拉米司特、四羟黄酮、罗氟司特、西洛司特、地西泮、咯利普兰和YM796。去乙酰化酶途径激活剂可以是PDE 4抑制剂，如咯利普兰和YM976。PDE 4抑制剂可以与PDE 4相互作用，PDE 4是在免疫细胞中占优势的cAMP特异性磷酸二酯酶。

在一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂是PDE 5抑制剂，如阿伐那非、伊地那非、米罗那非、西地那非、他达拉非、淫羊藿苷、伐地那非、乌地那非或扎普司特。在另一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂是西地那非或淫羊藿苷。PDE 5抑制剂可以与PDE 5相互作用，PDE 5是cGMP特异性PDE。cGMP信号的增强可以在体外和体内均增加线粒体生物发生。PDE 5抑制剂可以增加一氧化氮信号并且是一种有效的血管扩张药。PDE 5抑制剂的实例描述在美国专利号5,250,534和6,469,012中，其均通过引用而整体并入本文。

在一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂可以是选择性PDE抑制剂。在另一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂是非选择性PDE抑制剂。PDE抑制剂可以是天然存在的或非天然存在的(例如制造的)，并且可以以包含PDE抑制剂或其提取物(例如纯化的)的天然来源的形式提供。非选择性PDE抑制剂的实例包括但不限于咖啡因、茶碱、可可碱、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、己酮可可碱(3,7-二氢-3,7-二甲基-1-(5氧代己基)-1H-嘌呤-2,6-二酮)、氨茶碱、副黄嘌呤及其盐、衍生物、代谢物、分解代谢物、合成代谢物、前体及类似物。PDE抑制剂的天然来源的非限制性实例包括咖啡、茶、瓜拉那、巴拉圭茶、可可和巧克力(例如黑巧克力)。

另外的去乙酰化酶途径激活剂

在一些实施方案中，作为PDE-5抑制剂的替代或补充，施用多酚，如白藜芦醇，或另一种去乙酰化酶途径激活剂。在一些实施方案中，包含本文所述的一种或多种组分的组合物包含PDE抑制剂以作为白藜芦醇或其他去乙酰化酶途径激活剂的替代或补充。一般而言，PDE抑制剂以与组合物的一种或多种其他组分或治疗方法协同的量提供。

该多酚可以是茋或羟基肉桂酸。在一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂或AMPK途径激活剂可以是多酚。例如，该多酚可以是绿原酸、白藜芦醇、咖啡酸、白皮杉醇、鞣花酸、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、葡萄籽提取物或其任何类似物。在一些实施方案中，该激活剂可以是白藜芦醇、其类似物或其代谢物。例如，该激活剂可以是紫檀茋或白藜芦醇的小分子类似物。白藜芦醇的小分子类似物的实例描述在美国专利申请号20070014833、20090163476和20090105246中，这些申请通过引用而整体并入本文。

该多酚可以是基本上均质的一组多酚。该多酚可以是一种类型的多酚，其中该组合物可以排除所有其他类型的多酚。在其他实施方案中，该组合物可包含2、3或4种类型的多酚并排除所有其他类型的多酚。在一些实施方案中，该组合物可包含1、2、3或4种类型的多酚和少于0.1％、0.5％、1％或2％的任意其他类型的多酚。

在多个其他实施方案中，配制组合物以使其不含(或排除)一种或多种以下成分：咖啡因、绿茶提取物或瓜拉那种子或瓜拉那植物提取物。

在其他实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂或AMPK途径激活剂可以是鸢尾素、奎尼酸、肉桂酸、阿魏酸、褐藻素、双胍(如二甲双胍)、罗格列酮或其任意类似物。或者，去乙酰化酶途径激活剂或AMPK途径激活剂可以是异黄酮、吡咯并喹啉醌(PQQ)、槲皮素、L-肉碱、硫辛酸、辅酶Q10、丙酮酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核醣酸(ALCAR)、苯扎贝特、奥替普拉和/或染料木黄酮。在一些实施方案中，去乙酰化酶途径激活剂是PDE抑制剂。

在一些实施方案中，该组合物可包含选择性PDE-5抑制剂与以下一种或多种的组合：二甲双胍、白藜芦醇和支链氨基酸或其代谢物(例如，HMB水平)。

在一些实施方案中，该组合物可包含去乙酰化酶途径激活剂的协同组合。例如，该组合物可包含协同量的二甲双胍和PDE抑制剂。在一些实施方案中，该组合物包含二甲双胍和咖啡因。

在一些实施方案中，可与PDE-5抑制剂组合的去乙酰化酶途径激活剂包括刺激Fndc5、PGC1-α或UCP1表达的药剂。该表达可在基因或蛋白质表达水平方面进行测定。或者，去乙酰化酶途径激活剂可以是鸢尾素。增加鸢尾素水平的方法描述于等人，“APGC1-α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fatand thermogeneis,”Nature，2012年1月11日。

在一些实施方案中，可以如此组合的去乙酰化酶途径激活剂是黄酮或查耳酮。在一个实施方案中，示例性的去乙酰化酶激活剂是在Howitz等人(2003)Nature 425：191中描述的那些激活剂，包括，例如，白藜芦醇(3,5,4′-三羟基-反式-茋)、紫铆因(3,4,2′,4′-四羟基查耳酮)、白皮杉醇(3,5,3′,4′-四羟基-反式-茋)、异甘草素(4,2′,4′-三羟基查耳酮)、漆黄素(3,7,3′,4′-四羟基黄酮)、槲皮素(3,5,7,3′,4′-五羟基黄酮)、脱氧土大黄苷(3,5-二羟基-4′-甲氧基茋3-O-β-D-葡萄糖苷)；反式-茋；土大黄苷(3,3′,5-三羟基-4′-甲氧基茋3-O-β-D-葡萄糖苷)；顺式-茋；紫铆因(3,4,2′,4′-四羟基查耳酮)；3,4,2′4′6′-五羟基查耳酮；查耳酮；7,8,3′,4′-四羟基黄酮；3,6,2′,3′-四羟基黄酮；4′-羟基黄酮；5,4′-二羟基黄酮5,7-二羟基黄酮；桑色素(3,5,7,2′,4′-五羟基黄酮)；黄酮；5-羟基黄酮；(-)-表儿茶素(羟基位点：3,5,7,3′,4′)；(-)-儿茶素(羟基位点：3,5,7,3′,4′)；(-)-没食子儿茶素(羟基位点：3,5,7,3′,4′,5′)；(+)-儿茶素(羟基位点：3,5,7,3′,4′)；5,7,3′,4′,5′-五羟基黄酮；木犀草素(5,7,3′,4′-四羟基黄酮)；3,6,3′,4′-四羟基黄酮；7,3′,4′,5′-四羟基黄酮；茨非醇(3,5,7,4′-四羟基黄酮)；6-羟基芹黄素(5,6,7,4′-四羟基黄酮)；野黄芩素)；芹黄素(5,7,4′-三羟基黄酮)；3,6,2′,4′-四羟基黄酮；7,4′-二羟基黄酮；大豆苷(7,4′-二羟基异黄酮)；染料木素(5,7,4′-三羟基黄烷酮)；柚皮素(5,7,4′-三羟基黄烷酮)；3,5,7,3′,4′-五羟基黄烷酮；黄烷酮；氯化天竺葵色素(3,5,7,4′-四羟基花色基元黄详氯化物)；扁柏酚(b-苧侧素；2-羟基-4-异丙基-2,4,6-环庚三烯-1-酮)；L-(+)-麦角硫因((S)-a-羧基-2,3-二氢-N,N,N-三甲基-2-硫基-1H-咪唑-4-乙胺内盐)；咖啡酸苯基酯；MCI-186(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)；HBED(N,N′-二-(2-羟基苄基)乙二胺-N,N′-二乙酸-H2O)；氨溴索(反-4-(2-氨基-3,5-二溴苄基氨基)环己烷-HCl；以及U-83836E((-)-2-((4-(2,6-二-1-吡咯烷基-4-嘧啶基)-1-哌嗪基)甲基)-3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-6-醇.2HCl)。也可使用其类似物和衍生物。

本申请提供了可用于诱导受试者中的脂肪酸氧化和线粒体生物发生升高的组合物。此类组合物含有：HMB与白藜芦醇的组合；亮氨酸与白藜芦醇的组合；亮氨酸和HMB二者与白藜芦醇的组合；KIC与白藜芦醇的组合；KIC和HMB二者与白藜芦醇的组合；KIC和亮氨酸二者与白藜芦醇的组合；或KIC、HMB和亮氨酸与白藜芦醇的组合。

支链氨基酸

可与PDE-5抑制剂组合的支链氨基酸具有脂肪族侧链，该侧链具有与两个或更多个其他原子结合的分支碳原子。所述其他原子可以是碳原子。支链氨基酸的实例包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。支链氨基酸也可包括其他化合物，例如4-羟基异亮氨酸。在一些实施方案中，该组合物基本上不含一种或多种或全部的非支链氨基酸。在一些实施方案中，该组合物基本上不含一种或多种或全部的游离氨基酸形式的非支链氨基酸。例如，该组合物可基本上不含丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和/或酪氨酸。该组合物可基本上不含游离氨基酸形式的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和/或酪氨酸。在一些实施方案中，该支链氨基酸是亮氨酸。在一些实施方案中，该组合物可基本上不含可为游离形式的异亮氨酸和/或缬氨酸。当亮氨酸被异亮氨酸和缬氨酸替代时观察不到如本文所述的亮氨酸与PDE5抑制剂之间的协同效应。不希望受任何特定理论的限制，异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸彼此竞争转运和/或吸收，且在组合物中包含异亮氨酸和缬氨酸将会降低该组合物中任何亮氨酸的功效。而且，异亮氨酸和缬氨酸均缺乏激活sirt信号途径(包括Sirt 1和/或AMPK)的基本能力。

支链氨基酸可以以游离氨基酸的形式存在于组合物中。该组合物可基本上不含游离氨基酸形式的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，该组合物基本上不含非游离形式的非支链氨基酸(例如，已与其他氨基酸形成肽键的非支链氨基酸)。

不受理论限制，支链氨基酸如亮氨酸的摄取能通过依赖和不依赖mTOR的途径刺激组织蛋白质合成，以及发挥抗蛋白水解效应。这些效应在肌肉中占优势，但也可出现在包括脂肪组织在内的其他组织中。鉴于蛋白质合成和转化的能量成本，亮氨酸可以增加脂肪酸氧化和净能量利用，并缓解肥胖。事实上，已有报道称亮氨酸在能量限制过程中发挥了产热效应并增加了体重和脂肪组织的损失。同样，亮氨酸和富含亮氨酸的饮食能有利地调节脂肪细胞和小鼠中的炎性细胞因子模式。

在一些实施方案中，本文描述的任一组合物可包含任意支链氨基酸的盐、衍生物、代谢物、分解代谢物、合成代谢物、前体及类似物。该代谢物可以是亮氨酸的代谢物，如HMB。该支链氨基酸的代谢物可包括羟甲基丁酸酯(HMB)、α-羟基异己酸和酮异己酸(KIC)、酮异戊酸盐和酮异己酸盐。支链氨基酸的非限制性的示例性合成代谢物可包括谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、α-酮丁酸、α-乙酰-α-羟基丁酸酯、α,β-二羟基-β-甲基戊酸酯、α-酮-β-甲基戊酸酯、α,β-二羟基异戊酸酯和α-酮异戊酸酯。

在本发明的某些实施方案中，可配制本文公开的任意组合物以使它们不含(或排除)一种或多种选自赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、肉碱、胱氨酸和半胱氨酸的氨基酸。在本发明的某些实施方案中，可以配制本文公开的任意组合物以使它们不含(或排除)一种或多种选自赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、肉碱、胱氨酸和半胱氨酸的氨基酸。在一些情况下，该组合物不含任何非支链氨基酸。在一些情况下，该组合物不含任何游离氨基酸形式的非支链氨基酸。非支链氨基酸的质量或摩尔量可小于总组合物的0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％或5％。游离氨基酸形式的非支链氨基酸的质量或摩尔量可小于总组合物的0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％或5％。除亮氨酸或其代谢物外的任何支链氨基酸或其代谢物的质量或摩尔量可小于总组合物的0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％或5％。除亮氨酸或其代谢物外的任何游离氨基酸形式的支链氨基酸或其代谢物的质量或摩尔量可小于总组合物的0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％或5％。

维生素B6

在一些实施方案中，本文所述的组合物可包含PDE 5抑制剂、亮氨酸和/或亮氨酸代谢物和维生素B6。在另一些实施方案中，该组合物可包含西地那非、白藜芦醇和维生素B6。该亮氨酸可为游离氨基酸的形式。

不受任何特定理论或作用模式限制，活性B6代谢物(磷酸吡哆醛)的升高能够降低脂肪细胞钙通道的基调(tone)和活性。胞内游离Ca2+是脂肪细胞脂肪酸合成酶表达和活性的主要调节剂，其可导致对脂肪酸合酶的表达和活性的抑制，后者反过来是脂肪细胞中中性脂质合成的限速步骤。

如本文使用的维生素B6包括其不同形式，包括吡哆醇、吡哆醇5’-磷酸、吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醛5’-磷酸、吡哆胺、吡哆胺5’-磷酸。在其他实施方案中，维生素B6还可包括4-吡哆酸，后者是排出的上述形式的维生素B6的分解代谢物。本文描述的组合物可包含任何一种或多种这些形式的维生素B6。

维生素B6在体内的活性形式为吡哆醛5-磷酸，其是一种用于所有的转氨反应以及一些脱羧和脱氨反应的辅酶。此外，在体内发生的所有转氨反应都需要吡哆醛5-磷酸作为辅酶(Peterson D L，Martinez-Carrion M.The mechanism of transamination.Functionof the histidyl residue at the active site of supernatant aspartatetransaminase.J Biol Chem.1970年2月25日；245(4):806-13)。

在一些实施方案中，本文描述的任意组合物可以包含任何形式的维生素B6的盐、衍生物、代谢物、分解代谢物、合成代谢物、前体及类似物。维生素B6的示例性的分解代谢物包括2-甲基-3-羟基-5-甲酰吡啶-4-羧酸盐和3-羟基-2-甲基吡啶-4,5,-二羧酸盐。维生素B6的示例性类似物描述于美国专利号7,230,009和6,369,042。维生素B6的示例性前体描述于美国专利号7,495,101中。

药学活性剂

本发明的组合物可以进一步包含一种或多种除PDE-5抑制剂外的药学活性剂。治疗活性剂的实例包括布洛芬、aldoril和吉非贝齐、维拉帕米、maxzide、双氯芬酸和美托洛尔、马普替林、三唑仑和米诺地尔。例如，联合组合物可包含药学活性抗糖尿病剂、体重减轻剂或钙调节剂。通过引用并入本文的美国专利号7,109,198和美国专利申请号20090142336描述了适于包含在本文描述的联合组合物中的多种药学活性剂或治疗活性剂。抗糖尿病剂的实例包括双胍(如二甲双胍)、噻唑烷二酮和氯茴苯酸(如瑞格列奈、吡格列酮和罗格列酮)、α葡萄糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖)、磺脲类(如甲苯磺丁脲、醋酸己脲、妥拉磺脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列齐特)、肠降血糖素、麦角生物碱(例如溴隐亭)和DPP抑制剂(如西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利格列汀(lingliptin)、度格列汀、吉格列汀、阿格列汀和小檗碱)。抗糖尿病剂可以是口服抗糖尿病剂。抗糖尿病剂也可以是可注射的抗糖尿病药物，包括胰岛素、糊精类似物(例如普兰林肽)和肠降血糖素模拟物(例如艾塞那肽和利拉鲁肽)。抗肥胖治疗剂的实例包括脂肪酶抑制剂(例如奥利司他)、多巴胺、去甲肾上腺素和血清素化合物、大麻素受体拮抗剂(例如利莫那班)、艾塞那肽、普兰林肽和CNS剂(如topimerate)。提供这些实例仅出于讨论的目的，并且旨在证明本发明的适用性范围广至众多的药物。并不意味着以任何方式限制本发明的范围。

在一些实施方案中，PDE-5抑制剂可与如下一对药学活性剂组合：格列吡嗪和二甲双胍；格列本脲和二甲双胍；吡格列酮和格列美脲；吡格列酮和二甲双胍；瑞格列奈和二甲双胍；罗格列酮和格列美脲；罗格列酮和二甲双胍；以及西他列汀和二甲双胍。

药物剂或在本文描述的联合组合物中使用的任何其他组分的量可以以治疗有效的量来使用。本文描述的联合组合物中使用的药物剂或任意其他组分的量可以是亚治疗量。在一些实施方案中，使用亚治疗量的药剂或组分能够减少药剂的副作用。亚治疗量的使用仍然可以是有效的，特别是当与其他药剂或组分协同使用时。

亚治疗量的药剂或组分可以是这样的，以使其量低于被认为是治疗性的量。例如，FDA指南可能建议了治疗特定病症的特定给药水平，而亚治疗量就是低于FDA建议的给药水平的任何水平。亚治疗量可以比被认为是治疗量的量低约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、50％、75％、90％或95％。可以对个体受试者或成组受试者评估治疗量。成组受试者可以是全部的潜在受试者或具有特定特征如年龄、体重、种族、性别或生理活性水平的受试者。

以盐酸二甲双胍为例，医师建议起始剂量为每天1000mg，受试者特定的给药范围为每天500mg到最大2500mg(盐酸二甲双胍缓释片标签www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/021574s010lbl.pdf)。对受试者的特定给药可以由临床医师通过对剂量进行滴定和测定治疗应答来确定。治疗给药水平可以通过测定空腹血浆葡萄糖水平和测定糖化血红蛋白来确定。亚治疗量可以是低于推荐的二甲双胍剂量的任何水平。例如，如果受试者的治疗给药水平被确定为700mg每天，则600mg的剂量就是亚治疗量。或者，亚治疗量可以相对于一组受试者而非个体受试者来确定。例如，如果对于体重超过300lbs的受试者，二甲双胍的平均治疗量是2000mg，那么亚治疗量可以是低于2000mg的任何量。在一些实施方案中，该给药可以由包括但不限于患者的医生、护士、营养师、药剂师或其他健康护理专业人员的医疗保健提供者推荐。卫生保健专业人员可包括与卫生保健系统相关的个人或实体。卫生保健专业人员的实例可包括外科医生、牙医、听力学家、言语病理学家、内科医生(包括全科医生和专科医生)、助理医师、护士、助产士、药师/药剂师、营养师、治疗师、心理学家、物理治疗师、刺络医师、职业治疗师、验光师、脊医、临床医务人员、紧急医疗技术人员、护理人员、医疗化验员、放射技师、医疗假肢技师社会工作者，以及众多的经过培训以便提供某种类型的医疗保健服务的其他人力资源。

给药量

本发明提供作为分离的组分的组合的组合物，该分离的组分已从一种或多种来源中分离出来，如亮氨酸、亮氨酸代谢物，如HMB、西地那非、淫羊藿苷和白藜芦醇。本发明提供富含亮氨酸、亮氨酸代谢物如HMB、西地那非、淫羊藿苷和/或白藜芦醇的组合物。该组分可从天然来源中分离出来或由合成来源制备，然后富集以提高该组分的纯度。例如，西地那非可以由合成来源制备，然后通过一种或多种纯化方法进行富集。此外，亮氨酸(例如游离亮氨酸)可以从天然来源中分离出来，然后通过一种或多种分离方法进行富集。分离并富集的组分，如西地那非和亮氨酸，然后可以进行组合并配制以供施用给受试者。

在一些实施方案中，组合物包含一定量的选择性PDE抑制剂(例如PDE-5抑制剂，包括但不限于西地那非或淫羊藿苷)。PDE抑制剂的量可以是亚治疗量，和/或与该组合物中的一种或多种其他化合物或与该组合物同时或以相近的时间施用的一种或多种化合物协同的量。在一些实施方案中，PDE抑制剂以低剂量、中等剂量或高剂量施用，其描述了两种剂量之间的关系，而通常不限定任何具体的剂量范围。

西地那非的每日剂量可以是大约或少于约0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、60、80、100mg的西地那非。在另一些实施方案中，淫羊藿苷的每日剂量可以是大约或少于约1、10、20、50、100、150、300、400、500、750、1000、1500或2000mg的淫羊藿苷。白藜芦醇的每日低剂量可包含大约、少于约或多于约0.5mg/kg、1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg或更多；白藜芦醇的每日中等剂量可包含大约、少于约或多于约20mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg或更多；而白藜芦醇的每日高剂量可包含大约、少于约或多于约150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg或更多。

本发明的另一个方面提供了包含协同量的PDE-5抑制剂如西地那非和淫羊藿苷与亮氨酸、HMB、KIC、维生素D、维生素K2和/或白藜芦醇的组合的组合物。这些协同量可以为如下：亮氨酸大约、少于约或多于约0.5–3.0g/天(例如0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3或更多g/天)；HMB大约、少于约或多于约0.20–3.0g/天(例如0.2、0.4、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3或更多g/天)；KIC大约、少于约或多于约0.2–3.0g/天(例如0.2、0.4、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3或更多g/天)；维生素D大约、少于约或多于约2.5-25μg/天(例如2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25或更多μg/天)；维生素K2大约、少于约或多于约5-200μg/天(例如5、10、25、50、75、100、150、200或更多μg/天)；西地那非大约、少于约或多于约0.05-100mg/天(例如0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、60、80或100mg/天)；淫羊藿苷大约、少于约或多于约1-2000mg(例如1、10、20、50、100、150、300、400、500、750、1000、1500或2000mg/天)和/或白藜芦醇大约、少于约或多于约10–500mg/天(例如10、25、50、51、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多mg/天)。因此，一个实施方案提供了包含量为约0.75至约3.0g(0.75-3.0g)的亮氨酸和量为约0.05至约100mg(或0.05-100mg)的西地那非的组合物。另一实施方案提供了包含量为0.40-3.0g(或0.40-3.0g)的HMB和量为0.05-100mg(或0.050-100mg)的西地那非的组合物。另一实施方案提供了包含量为约0.75-约3.0g(或0.75-3.0g)的亮氨酸、量为约0.40至约3.0g(或0.40-3.0g)的HMB和量为约0.05至约100mg(或0.05-100mg)的西地那非的组合物。在包含PDE抑制剂的组合物或包括(与一种或多种其他组分分开或同时)施用PDE抑制剂的方法中，可以以产生大约、小于约或大于约0.1、1、5、10、25、50、100、500、1000、2500、5000、10000或更高nM的血浆峰值浓度的量提供PDE抑制剂。

另一实施方案提供了包含协同量的西地那非和白藜芦醇与HMB或亮氨酸的组合的组合物。在这类组合物中，亮氨酸和HMB在组合物中的总量可少于3.0g(或少于约3.0g；例如少于约0.7、0.75、1、1.5、2、2.5、3克)且至少0.70g(或至少约0.70g；例如至少约0.7、0.75、1、1.5、2、2.5、3克)。包含亮氨酸和HMB的组合物可含有在组合物中总量为大约、少于约或多于约0.70g到3.0g(约0.70g至约3.0g；例如0.7、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3或更多克)、0.75g到3.0g(约0.75g至约3.0g)或1.0g到3.0g(约1.0g至约3.0g)的亮氨酸和HMB以及协同量的白藜芦醇(至少35mg的白藜芦醇和不多于500(或约500)mg的白藜芦醇(例如大约、少于约或多于约35、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg白藜芦醇)或量为50-500mg(或约50至约500mg)的白藜芦醇。

在一些实施方案中，单位剂量可包含与一种或多种其他组分组合的PDE 5抑制剂，如西地那非。在一些实施方案中，单位剂量包含以下一种或多种：大约、少于约或多于约可以是约或少于约0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、60、80或100mg的选择性PDE-5抑制剂(例如西地那非)；大约、少于约或多于约50、100、200、300、400、500或更多mg的HMB；大约、少于约或多于约10、20、30、40、50、75、100或更多mg白藜芦醇；大约、少于约或多于约2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20或更多mg的维生素B6；大约、少于约或多于约2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25或更多μg的维生素D；大约、少于约或多于约5、10、25、50、75、100、150、200或更多μg的维生素K2；以及大约、少于约或多于约400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250、1500或更多mg的亮氨酸。单位剂量可包含大约、少于约或多于约500mg的β羟基、β甲基丁酸酯和大约、少于约或多于约50mg的白藜芦醇。单位剂量可包含大约、少于约或多于约500mg的β羟基、β甲基丁酸酯；和大约、少于约或多于约50mg的白藜芦醇；以及大约、少于约或多于约15mg的维生素B6。

在一些实施方案中，单位剂量可包含约0.1-10mg的西地那非。在一些实施方案中，单位剂量可包含约0.5-100mg的阿伐那非、0.05-20mg的伊地那非、0.25-50mg的米罗那非、0.01-2.5mg的他达拉非、0.01-2.5mg的伐地那非、0.5-100mg的乌地那非或0.5-100mg的扎普司特。在一些实施方案中，单位剂量可以包含约0.5-50mg的阿伐那非、0.05-10mg的伊地那非、0.25-25mg的米罗那非、0.01-1.25mg的他达拉非、0.01-1.25mg的伐地那非、0.5-50mg的乌地那非或0.5-50mg的扎普司特。

在一些实施方案中，单位剂量可包含与大约、少于约或多于约指示量的一种或多种其他组分组合的绿原酸(例如大约、少于约或多于约25、50、75、100、150、200或mg)。单位剂量可包含500mgβ羟基、β甲基丁酸酯(例如50、100、200、300、400、500或更多mg)和100mg绿原酸。单位剂量可包含500mgβ羟基、β甲基丁酸酯(例如50、100、200、300、400、500或更多mg)；和100mg绿原酸；以及15mg维生素B6。单位剂量可包含1.125g亮氨酸(例如400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250或更多mg)和100mg绿原酸。单位剂量可包含1.125g亮氨酸(例如400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250或更多mg)；100mg绿原酸；和15mg维生素B6(例如2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20或更多mg)。单位剂量可包含750mg亮氨酸、75mg绿原酸和10mg维生素B6。

在一些实施方案中，单位剂量可包含与大约、少于约或多于约指示量的一种或多种其他组分组合的大约、少于约或多于约指示量(例如10、15、20、25、30、40、50或更多mg)的奎尼酸。单位剂量可包含500mgβ羟基、β甲基丁酸酯(例如50、100、200、300、400、500或更多mg)和25mg奎尼酸。单位剂量可包含500mgβ羟基、β甲基丁酸酯(例如50、100、200、300、400、500或更多mg)、25mg奎尼酸和15mg维生素B6(例如2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20或更多mg)。单位剂量可包含1.125g亮氨酸(例如400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250或更多mg)和25mg奎尼酸。单位剂量可包含1.125g亮氨酸(例如400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250或更多mg)、25mg奎尼酸和15mg维生素B6(例如2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20或更多mg)。单位剂量可包含750mg亮氨酸、15mg奎尼酸和10mg维生素B6。

在一些实施方案中，单位剂量可包含与大约、少于约或多于约指示量的一种或多种其他组分组合的大约、少于约或多于约指示量(例如0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、3，5或更多mg)的褐藻素。单位剂量可包含500mgβ羟基、β甲基丁酸酯(例如50、100、200、300、400、500或更多mg)和2.5mg褐藻素。单位剂量可包含500mgβ羟基、β甲基丁酸酯(例如50、100、200、300、400、500或更多mg)、2.5mg褐藻素和15mg维生素B6(例如2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20或更多mg)。单位剂量可包含1.125g亮氨酸(例如400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250或更多mg)和2.5mg褐藻素。单位剂量可包含1.125g亮氨酸(例如400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250或更多mg)、2.5mg褐藻素和15mg维生素B6(例如2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20或更多mg)。单位剂量可包含750mg亮氨酸、1.5mg褐藻素和10mg维生素B6。

在一些实施方案中，组合物包含一定量的抗糖尿病剂，例如双胍(例如二甲双胍)。抗糖尿病剂的量可以是亚治疗量，和/或与该组合物中的一种或多种其他化合物或与该组合物同时或以相近的时间施用的一种或多种化合物协同的量。在一些实施方案中，抗糖尿病剂以极低剂量、低剂量、中等剂量或高剂量施用，其描述了两种剂量之间的关系，而通常不限定任何具体的剂量范围。例如，二甲双胍的每日极低剂量可包含大约、少于约或多于约5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg或更多；二甲双胍的每日低剂量可包含大约、少于约或多于约75mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg或更多；二甲双胍的每日中等剂量可包含大约、少于约或多于约150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg或更多；且二甲双胍的每日高剂量可包含大约、少于约或多于约200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、700mg/kg或更多。

在一些实施方案中，单位剂量可包含与大约、少于约或多于约指示量的一种或多种其他组分(例如10、20、30、40、50、75、100或更多mg的白藜芦醇；50、100、200、300、400、500或更多mg的HMB；和/或400、500、600、700、800、900、1000、1100、1250或更多mg的亮氨酸)组合的大约、少于约或多于约指示量(例如25、50、100、150、200、250、300、400、500或更多mg)的二甲双胍。单位剂量可包含大约、少于约或多于约50mg的二甲双胍、500mgβ羟基、β甲基丁酸酯和50mg白藜芦醇。单位剂量可包含大约、少于约或多于约50mg的二甲双胍、1.125g亮氨酸和50mg白藜芦醇。单位剂量可包含大约、少于约或多于约100mg的二甲双胍、500mgβ羟基、β甲基丁酸酯和50mg白藜芦醇。单位剂量可包含大约、少于约或多于约100mg的二甲双胍、1.125g亮氨酸和50mg白藜芦醇。单位剂量可包含大约、少于约或多于约250mg的二甲双胍、500mgβ羟基、β甲基丁酸酯和50mg白藜芦醇。单位剂量可包含大约、少于约或多于约250mg的二甲双胍、1.125g亮氨酸和50mg白藜芦醇。在一些实施方案中，组合物进一步包含协同量的PDE抑制剂。在一些实施方案中，二甲双胍组合物进一步包含协同量的选择性PDE抑制剂。

在一些实施方案中，单位剂量包含亮氨酸和淫羊藿苷。该单位剂量可包含约500至约2000mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约700至约1500mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约900至约1300mg的亮氨酸。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.01-0.1。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.02-0.06。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.03-0.05。包含亮氨酸和淫羊藿苷的单位剂量的示例性制剂在表1中示出。

表1：制剂1

组分	质量(mg)	重量比(相对于亮氨酸)
			亮氨酸	1110	1
淫羊藿苷	50	0.045

在一些实施方案中，单位剂量包含亮氨酸、淫羊藿苷和白藜芦醇。该单位剂量可以包含约500至约2000mg的亮氨酸。该单位剂量可以包含约700至约1500mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约900至约1300mg的亮氨酸。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.01-0.1。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.02-0.06。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.03-0.05。白藜芦醇相对于亮氨酸的重量比可为0.01-0.1。白藜芦醇相对于亮氨酸的重量比可为0.02-0.06。白藜芦醇相对于亮氨酸的重量比可为0.03-0.05。包含亮氨酸、淫羊藿苷和白藜芦醇的单位剂量的示例性制剂在表2中示出。

表2：制剂2

组分	质量(mg)	重量比(相对于亮氨酸)
			亮氨酸	1110	1
淫羊藿苷	50	0.045
			白藜芦醇	50	0.045

在一些实施方案中，单位剂量包含亮氨酸、淫羊藿苷和二甲双胍。该单位剂量可以包含约500至约2000mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约700至约1500mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约900至约1300mg的亮氨酸。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.01-0.1。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.02-0.06。淫羊藿苷相对于亮氨酸的重量比可为0.03-0.05。二甲双胍相对于亮氨酸的重量比可为0.01-0.6。二甲双胍相对于亮氨酸的重量比可为0.1-0.5。二甲双胍相对于亮氨酸的重量比可为0.15-0.3。二甲双胍相对于亮氨酸的重量比可为0.22-0.23。包含亮氨酸、淫羊藿苷和二甲双胍的单位剂量的示例性制剂在表3中示出。

表3：制剂3

组分	质量(mg)	重量比(相对于亮氨酸)
			亮氨酸	1110	1
淫羊藿苷	50	.045
			二甲双胍	250	.225

在一些实施方案中，单位剂量包含亮氨酸和西地那非。该单位剂量可包含约500至约2000mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约700至约1500mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约900至约1300mg的亮氨酸。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.00001-0.05。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.0001-0.03。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.001-0.02。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.005-0.015。包含亮氨酸和西地那非的单位剂量的示例性制剂在表4中示出。

表4：制剂4

组分	质量(mg)	重量比(相对于亮氨酸)
			亮氨酸	1110	1
西地那非	10	0.009

在一些实施方案中，单位剂量包含亮氨酸、白藜芦醇和西地那非。该单位剂量可包含约500至约2000mg的亮氨酸。该单位剂量可包含约700至约1500mg的亮氨酸。该单位剂量可包含900-1300mg的亮氨酸。白藜芦醇相对于亮氨酸的重量比可为0.00001-0.05。白藜芦醇相对于亮氨酸的重量比可为0.0001-0.03。白藜芦醇相对于亮氨酸的重量比可为0.001-0.02。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.00001-0.05。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.0001-0.03。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.001-0.02。西地那非相对于亮氨酸的重量比可为0.005-0.015。包含亮氨酸、白藜芦醇和西地那非的单位剂量的示例性制剂在表5中示出。

表5：制剂5

在一些实施方案中，单位剂量包含HMB和淫羊藿苷。该单位剂量可包含约50-1000mg的HMB。该单位剂量可包含约100-500mg的HMB。该单位剂量可包含150-400mg的HMB。该单位剂量可包含200-300mg的HMB。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.05-0.5。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.07-0.4。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.1-0.3。包含HMB和淫羊藿苷的单位剂量的示例性制剂在表6中示出。

表6：制剂6

组分	质量(mg)	重量比(相对于HMB)
			HMB	250	1
淫羊藿苷	50	0.2

在一些实施方案中，单位剂量包含HMB、淫羊藿苷和白藜芦醇。该单位剂量可包含约50-1000mg的HMB。该单位剂量可包含约100-500mg的HMB。该单位剂量可包含约150-400mg的HMB。该单位剂量可包含200-300mg的HMB。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.05-0.5。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.07-0.4。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.1-0.3。白藜芦醇相对于HMB的重量比可为0.05-0.5。白藜芦醇相对于HMB的重量比可为0.07-0.4。白藜芦醇相对于HMB的重量比可为0.1-0.3。包含HMB、淫羊藿苷和白藜芦醇的单位剂量的示例性制剂在表7中示出。

表7：制剂7

组分	质量(mg)	重量比(相对于HMB)
			HMB	250	1
淫羊藿苷	50	0.2
			白藜芦醇	50	0.2

在一些实施方案中，单位剂量包含HMB、淫羊藿苷和二甲双胍。该单位剂量可包含约50至约1000mg的HMB。该单位剂量可包含约100至约500mg的HMB。该单位剂量可包含约150至约400mg的HMB。该单位剂量可包含约200至约300mg的HMB。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.05-0.5。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.07-0.4。淫羊藿苷相对于HMB的重量比可为0.1-0.3。二甲双胍相对于HMB的重量比可为0.2-4。二甲双胍相对于HMB的重量比可为0.5-2。二甲双胍相对于HMB的重量比可为0.75-1.25。包含HMB、淫羊藿苷和二甲双胍的单位剂量的示例性制剂在表8中示出。

表8：制剂8

组分	质量(mg)	重量比(相对于HMB)
			HMB	250	1
淫羊藿苷	50	0.2
			二甲双胍	250	1

在一些实施方案中，单位剂量包含HMB和西地那非。该单位剂量可包含约50-1000mg的HMB。该单位剂量可包含约100-500mg的HMB。该单位剂量可包含约150-400mg的HMB。该单位剂量可包含200-300mg的HMB。西地那非相对于HMB的重量比可为0.01-0.1。西地那非相对于HMB的重量比可为0.02-0.08。西地那非相对于HMB的重量比可为0.03-0.05。包含HMB和西地那非的单位剂量的示例性制剂在表9中示出。

表9：制剂9

组分	质量(mg)	重量比(相对于HMB)
			HMB	250	1
西地那非	10	0.04

在一些实施方案中，单位剂量包含HMB、西地那非和白藜芦醇。该单位剂量可包含约50-1000mg的HMB。该单位剂量可包含约100-500mg的HMB。该单位剂量可包含约150-400mg的HMB。该单位剂量可包含200-300mg的HMB。西地那非相对于HMB的重量比可为0.01-0.1。西地那非相对于HMB的重量比可为0.02-0.08。西地那非相对于HMB的重量比可为0.03-0.05。白藜芦醇相对于HMB的重量比可为0.01-0.1。白藜芦醇相对于HMB的重量比可为0.02-0.08。白藜芦醇相对于HMB的重量比可为0.03-0.05。包含HMB和西地那非的单位剂量的示例性制剂在表10中示出。

表10：制剂10

组分	质量(mg)	重量比(相对于HMB)
			HMB	250	1
西地那非	10	0.04
			白藜芦醇	10	0.04

在一些实施方案中，本文中的任何单位剂量，例如在表1-10中描述的单位剂量，进一步包含维生素B6。在一些实施方案中，本文中的任何单位剂量，例如在表1-10中描述的单位剂量，进一步包含15mg的维生素B6。该单位剂量可进一步包含约5-50mg的维生素B6。维生素B6与HMB(如果存在的话)的重量比可以约为0.06、0.002-0.18、0.03-0.12或0.05-0.07。维生素B6与亮氨酸(如果存在的话)的重量比可以约为0.0135、0.005-0.03、0.007-0.025或0.01-0.017。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可基本上不含一种或多种指定的组分或具有指定水平的这些组分。该组合物，例如表1-10中描述的组合物，可基本上不含或包含少于40、20、10、15、5或1％(总重量)的血糖碳水化合物。该组合物可基本上不含或包含少于40、20、10、15、5或1％(总重量)的糖，包括但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖和蔗糖。该组合物可基本上不含或包含少于40、20、10、15、5或1％(总重量)的高血糖指数碳水化合物。该组合物可基本上不含或包含少于40、20、10、15、5或1％(总重量)的复合碳水化合物。该组合物可基本上不含或包含少于40、20、10、15、5或1％(总重量)的简单碳水化合物。该组合物可基本上不含或包含少于40、20、10、15、5或1％(总重量)的淀粉、玉米糖浆、大米(short grain whiterice)、白面粉。

在本发明的一些实施方案中，联合组合物可具有指定的支链氨基酸和/或其代谢物与选择性PDE抑制剂的比值。该指定的比值可以提供能量代谢的有效和/或协同调节。例如，该指定的比值可以导致受试者的体重增加降低、受试者的内脏脂肪体积减小、受试者的脂肪氧化增加、受试者的胰岛素敏感度升高、受试者的肌肉中葡萄糖摄取增加、炎症标志物降低、血管舒张增强和/或体温升高。这些有益效果可能部分地是由于线粒体生物发生的升高或能量代谢途径中的很多其他变化。支链氨基酸和/或其代谢物与选择性PDE抑制剂激活剂的比值可以是质量比、摩尔比或体积比。

在一些实施方案中，(a)支链氨基酸和/或其代谢物与(b)选择性PDE抑制剂的摩尔比为大约或大于约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、120或150。在其他实施方案中，本发明的组合物中包含的一种或多种支链氨基酸和/或其代谢物与选择性PDE抑制剂的摩尔比为大约或大于约20、30、40、50、60、70、80、90、95、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250、300、350、400或500。在一些实施方案中，所述组合物中组分(a)与(b)的摩尔比大于约20、40、60、80、100、120或150。在一些实施方案中，所述组合物中组分(a)与(b)的摩尔比大于约80、100、120或150。在一些实施方案中，所述组合物中组分(a)与(b)的摩尔比大于约80、100、120或150。在一些实施方案中，所述组合物中组分(a)与(b)的摩尔比大于约200、250或300。在一些实施方案中，所述组合物中组分(a)与(b)的摩尔比大于约40、150、250或500。

在一些实施方案中，可设计亮氨酸、亮氨酸的任何代谢物、PDE抑制剂(如PDE 5抑制剂，如西地那非)的给药，以达到亮氨酸、亮氨酸代谢物和/或PDE 5抑制剂的指定生理浓度或循环水平。该生理浓度可以是在受试者的血流中测定的循环水平。该受试者可以是人或动物。选择的给药可以根据受试者的特性如体重、能量代谢速率、遗传学、种族、身高或任何其他特性而改变。单位剂量中亮氨酸的量可以是这样的，其使得受试者中亮氨酸的循环水平约为或大于约0.25mM、0.5mM、0.75mM或1mM。约1,125mg亮氨酸(例如游离亮氨酸)的给药可在受试者中达到约0.5mM的亮氨酸循环水平。约300mg亮氨酸(例如游离亮氨酸)的给药可在受试者中达到约0.25mM的亮氨酸循环水平。西地那非的给药可达到约为或小于约0.1、0.5、1、2、5或10nM的循环浓度。在一些实施方案中，目标或已达到的西地那非的循环浓度小于约1nM。约20mg西地那非的单位剂量可达到约100nM西地那非的循环浓度。约0.2mg西地那非的单位剂量可达到约1nM西地那非的循环浓度。淫羊藿苷的给药可达到约为或小于约0.1、0.5、1、2、5或10nM的循环浓度。在一些实施方案中，目标或已达到的淫羊藿苷的循环浓度小于约1nM。约20mg淫羊藿苷的单位剂量可达到约100nM淫羊藿苷的循环浓度。约0.1mg淫羊藿苷的单位剂量可达到约1nM淫羊藿苷的循环浓度。

在一些实施方案中，摩尔比或质量比是对受试者施用一种或多种组合物后达到的循环摩尔比或质量比。该组合物可以是本文描述的联合组合物。可以调节剂型中的联合组合物的摩尔比以达到期望的循环摩尔比。可以调节摩尔比以利于联合组合物的一种或多种组分的生物利用度、摄取和代谢加工。例如，如果一种组分的生物利用度低，那么该组分的摩尔量可以相对于联合组合物中的其他组分增加。在一些实施方案中，循环摩尔比或质量比在施用后约0.1、0.5、0.75、1、3、5或10、12、24或48小时内达到。循环摩尔比或质量比可维持约为或大于约0.1、1、2、5、10、12、18、24、36、48、72或96小时的一段时间。

在一些实施方案中，亮氨酸与西地那非的循环摩尔比约为或大于约100,000、250,000、500,000、750,000或更高。在一些实施方案中，HMB与西地那非的循环摩尔比约为或大于约1,000、2,500、5,000、7,500或更高。在一些实施方案中，白藜芦醇与西地那非的循环摩尔比约为或大于约50、100、200、400、800或更高。

可向受试者施用该组合物，以使得向该受试者施用选定的每日总剂量的该组合物。该每日总剂量可以取决于在24小时周期内施用的剂量的总和。该组合物的每日总剂量可包含约0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、60、80或100mg的西地那非。该组合物的每日总剂量可包含约1、10、20、50、100、150、300、400、500、750、1000、1500或2000mg的淫羊藿苷。该组合物的每日总剂量可包含至少约250、500、750、1000、1125、2000、2250mg或更多的支链氨基酸或其代谢物。该支链氨基酸可为亮氨酸、HMB或本文所述的任何其他的支链氨基酸。该组合物的每日总剂量可包含至少约3、7.5、15、30、45、90mg或更多的B6。该组合物的每日总剂量可具有约为、大于约或小于约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、500、750、1000或更高的支链氨基酸或其代谢物与维生素B6的质量比。

在一些实施方案中，可向受试者施用选定剂量的组合物，以使得该受试者达到该组合物的期望的循环水平。该组合物的期望的循环水平可至少约为0.25、0.5、0.75、1mM或更多的亮氨酸。该组合物的期望的循环水平可至少约为10、25、50、100、150或200nM或更多的B6。该组合物的期望的循环水平可约为0.1、0.5、1、2、5、10nM或更多的西地那非。该组合物的期望的循环水平可约为0.1、0.5、1、2、5、10nM或更多的淫羊藿苷。选定的剂量可根据受试者的特性如体重、身高、种族或遗传学来选择。

剂型

本文描述的组合物可以配制成多种不同的剂型。其可作为片剂、可咀嚼片剂、囊片、胶囊、软明胶胶囊、锭剂或溶液口服使用。其也可以在其溶液形式下用作鼻腔喷雾剂或用于注射。在一些实施方案中，所述组合物可以是适于口服的液体组合物。适合于口服的本发明的组合物可以作为离散的剂型，如各自含有作为粉末或颗粒剂的预定量的活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂，或液体或喷雾剂，溶液，水性或非水性液体中的悬浮液，水包油乳剂或油包水液体乳剂，包括液体剂型(例如，悬浮液或浆液)，和口服固体剂型(例如，片剂或散装粉末)。口服剂型可以配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、乳剂、亲脂和亲水性悬浮液、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于待治疗的个体或患者口服摄入。这样的剂型可以通过任何制剂方法来制备。例如，活性成分可以与构成一种或多种必要成分的载体联合。适合于口服给药的胶囊包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以包含与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。任选地，可通过将组合物与固体赋形剂混合，任选地通过研磨得到混合物，并在加入合适的助剂(如果需要)后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯，来获得用于口服的本发明的组合物。合适的赋形剂尤其是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。通常，通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀地且紧密地混合，然后，如果需要，将产品成型为所需的形式，来制备组合物。例如，片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分一起压制或模制来制备。压制片剂可通过在合适的机器中压缩自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分来制备，该活性成分任选地与赋形剂混合，该赋形剂例如但不限于粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂或分散剂。模制片剂可通过在合适的机器中对用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物进行模制来制备。

可引入本文公开的制剂以供口服或通过注射施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水或油悬浮液和调味的含食用油如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的乳液以及酏剂和类似的药物载体。用于水性悬浮液的合适的分散剂或悬浮剂包括合成的天然树胶如黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。

可以用可注射组合物和口服组合物的组合治疗受试者。

用于口服的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以呈现为干产品，以供在使用前用水或其他合适的载体进行重建。这类液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂肪)、乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性载体(例如，杏仁油、油酯或乙醇)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)以及人造的或天然的增色剂和/或甜味剂来制备。

本发明的药物组合物的制备按照普遍接受的药物制剂制备程序进行。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版(1990)，E.W.Martin编，Mack PublishingCo.，PA。根据预期用途和施用方式，可能需要在药物组合物的制备中进一步处理镁-反离子化合物。合适的处理可以包括与适当的非毒性和非干扰性组分混合、灭菌、分成剂量单位并包埋在递送装置内。

本发明进一步包括含有活性成分的无水组合物和剂型，因为水可以促进一些化合物的降解。例如，本领域中可以采用加水(例如5％)作为模拟长期贮存的手段，以确定诸如贮存期限或制剂随时间的稳定性等特性。本发明的无水组合物和剂型可以使用无水或低含水成分在低水分或低湿度条件下制备。如果在制造、包装和/或储存过程中预期到会与水分和/或潮湿大量接触，那么含有乳糖的本发明的组合物和剂型可制成无水的。可以制备和贮存无水组合物，使其无水性质得以保持。因此，无水组合物可以使用已知能防止暴露于水的材料来包装，使得它们可以包含在合适的处方试剂盒中。合适的包装的实例包括但不限于密封的箔、塑料等、单位剂量容器、泡罩包装和条状包装。

本文所述的成分可以按照常规药物配制技术在紧密掺合物中与药物载体进行组合。取决于施用所需的制剂形式，载体可以采取多种形式。在制备用于口服剂型的组合物时，任何常用的药物介质都可用作载体，例如，在口服液体制剂(如悬浮液、溶液剂和酏剂)或气雾剂的情况下采用水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或者在口服固体制剂的情况下可以使用诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂等载体，在一些实施方案中不使用乳糖。例如，对于固体口服制剂，合适的载体包括粉末、胶囊和片剂。如果需要，片剂可以通过标准含水或非含水技术来包衣。

可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二元醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)在药物制剂中使用的其他无毒的相容性物质。

适用于剂型中的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、黄蓍胶粉、瓜尔豆胶、纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素，以及它们的混合物。

可用于形成本发明的组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石粉、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂，或它们的混合物。其他的润滑剂包括，例如，syloid硅胶、合成二氧化硅的凝聚型气溶胶或其混合物。可任选地加入少于组合物的约1重量％的润滑剂。

润滑剂还可以与组织障碍物结合使用，该组织障碍物包括但不限于多糖、多聚糖、生物膜、interceed和透明质酸。

崩解剂可用于本发明的组合物中，以提供当暴露于水性环境中时发生崩解的片剂。太多的崩解剂可能会产生在瓶中可崩解的片剂。太少可能不足以导致崩解的发生，并因此可能改变活性成分从剂型中释放的速率和程度。因此，可以使用既不太少也不太多而不会有害地改变活性成分的释放的足量的崩解剂，以形成本文所公开的化合物的剂型。所用的崩解剂的量可以根据制剂类型和施用方式而变化，并且本领域普通技术人员可以容易地辨别。在药物组合物中可使用约0.5％至约15％(重量)的崩解剂或约1％至约5％(重量)的崩解剂。可用于形成本发明的组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚克立林钾、羟基乙酸淀粉钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶化淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、树胶或其混合物。

用于本文所公开的组合物和剂型的合适的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、葡聚糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预胶化淀粉，以及它们的混合物。

当期望使用水性悬浮液和/或酏剂进行口服时，其中的活性成分可以与多种甜味剂或调味剂、着色物质或染料组合，并且如果需要的话，可以与乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种组合进行组合。

片剂可以不包衣或通过已知的技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并由此在较长时期内提供持续作用。例如，可采用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。供口服使用的制剂还可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

在一个实施方案中，该组合物可包含增溶剂以确保本发明的化合物的良好的溶解和/或溶出，并使本发明的化合物的沉淀最小化。这对于非口服使用的组合物，例如，用于注射的组合物是特别重要的。也可加入增溶剂来增加亲水性药物和/或其他组分如表面活性剂的溶解度，或者维持该组合物作为稳定或均一的溶液或分散液。

该组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的添加剂和赋形剂。这样的添加剂和赋形剂包括但不限于防粘剂、消泡剂、缓冲剂、聚合物、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度调节剂(viscomodulators)、张力调节剂(tonicifier)、调味剂、着色剂、增味剂、遮光剂、助悬剂、粘合剂、填充剂、增塑剂、润滑剂及其混合物。赋形剂的实例的非穷举列表包括单酰甘油、硬脂酸镁、改性食用淀粉、明胶、微晶纤维素、甘油、硬脂酸、二氧化硅、黄蜂蜡、卵磷脂、羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠和交聚维酮。

本文描述的组合物也可以配制成延长释放、持续释放或定时释放，以使得一种或多种组分随时间而释放。延迟释放可通过将该一种或多种组分配制在各种材料的基质中或通过微囊化来实现。该组合物可以配制为在4、6、8、12、16、20或24小时的一段时间内释放一种或多种组分。一种或多种组分的释放可以以恒定的或变化的速率进行。

使用本文提供的控释剂型，一种或多种辅因子在其剂型中可以比在组分量相同的即释制剂中所观察到的更慢的速率释放。在一些实施方案中，对于控释制剂根据从施用至其最大浓度的规定时间内的浓度变化所测得的生物样品的改变速率小于即释制剂速率的约80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。此外，在一些实施方案中，浓度随时间的改变速率小于即释制剂速率的约80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。

在一些实施方案中，通过以相对比例的方式增加达到最大浓度的时间来降低浓度随时间的改变速率。例如，达到最大浓度的时间增加2倍可使浓度改变速率降低约2倍。因此，可以提供一种或多种辅因子从而使其以显著低于即释制剂的速率达到其最大浓度。可将本发明的组合物配制为到24小时、16小时、8小时、4小时、2小时或至少1小时时提供最大浓度的改变。浓度改变速率的相关减少可以是约0.05、0.10、0.25、0.5或至少0.8倍。在某些实施方案中，这通过在这种施用后的1小时内向循环系统释放少于约30％、50％、75％、90％或95％的该一种或多种辅因子来实现。

任选地，控释制剂表现出的血浆浓度曲线具有小于含相同剂量的相同辅因子的即释制剂的75％、50％、40％、30％、20％或10％的起始(例如，施用后2小时至施用后4小时)斜率。

在一些实施方案中，在最初1、2、4、6、8、10或12小时内，溶出研究中测定的辅因子释放速率小于含相同辅因子的即释制剂的约80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。

本文提供的控释制剂可采用多种形式。在一些实施方案中，该制剂为口服剂型，包括液体剂型(例如，悬浮液或浆液)和口服固体剂型(例如，片剂或整装粉剂)，例如但不限于本文描述的那些剂型。

本文公开的制剂的控释片剂可以是基质、贮库(reservoir)或渗透系统的。虽然三个系统都适用，但是后两个系统可具备更优的包封相对较大质量的能力，例如用于容纳大量的单一辅因子或容纳多种辅因子，其取决于个体的遗传构成。在一些实施方案中，缓释片剂基于贮库系统，其中包含一种或多种辅因子的核心被多孔膜包衣包裹，该包衣在水化时允许该一种或多种辅因子扩散通过。由于有效成分的组合质量通常是克级数量，所以有效的递送系统能够提供最优的结果。

因此，片剂或丸剂也可以被包衣或以其他方式复合，以提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量和外剂量组分，后者为在前者之上的包被的形式。这两种组分可被肠溶层隔开，肠溶层在胃中能够抵抗崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这些材料包括多种聚合酸和聚合酸与诸如紫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素这样的材料的混合物。在一些实施方案中，含有多种辅因子的制剂可以具有以不同速率或在不同时间释放的不同辅因子。例如，可以存在夹杂有肠溶层的额外的辅因子层。

制备缓释片剂的方法是本领域已知的，例如参见美国专利公开2006/051416和2007/0065512或本文公开的其他参考文献。例如在美国专利号4,606,909、4,769,027、4,897,268和5,395,626中描述的方法可用于制备由个体的遗传构成决定的一种或多种辅因子的持续释放制剂。在一些实施方案中，使用例如在美国专利号6,919,373、6,923,800、6,929,803和6,939,556中描述的技术来制备制剂。例如在美国专利号6,797,283、6,764,697和6,635,268中描述的其他方法也可用于制备本文公开的制剂。

在一些实施方案中，所述组合物可配制在食物组合物中。例如，该组合物可以是饮料或其他液体、固体食品、半固体食品，其含有或不含食物载体。例如，该组合物可以包括补充有本文描述的任意组合物的红茶。该组合物可以是补充有本文描述的任意组合物的乳制品。在一些实施方案中，该组合物可配制在食物组合物中。例如，该组合物可包含饮料、固体食品、半固体食品或食物载体。

在一些实施方案中，可以使用液体食物载体，如作为饮料的形式，如补充性果汁、咖啡、茶、汽水、加味水等。例如，该饮料可以包含制剂以及液体组分，如各种除臭剂或存在于常规饮料中的天然碳水化合物。天然碳水化合物的实例包括但不限于：单糖，如葡萄糖和果糖；二糖，如麦芽糖和蔗糖；传统糖，如糊精和环糊精；和糖醇，如木糖醇和赤藓糖醇。也可使用天然除臭剂如索马甜、甜叶菊提取物、莱包迪苷A(levaudioside A)、甘草苷，和合成的除臭剂如糖精和天冬甜素。也可以使用例如调味剂、着色剂以及其他试剂。例如，也可使用果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体粘合剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇或碳化剂。也可以在制备含有本文讨论的制剂的食品或饮料中使用水果和蔬菜。

备选地，所述组合物可以是补充有本文所述的任何组合物的小吃棒。例如，该小吃棒可以是巧克力棒、燕麦(granola)棒或什锦杂果(trail mix)棒。在另一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食物组合物被配制成具有合适的和期望的口感、质地和粘度以供消费。任何合适的食物载体可在本发明的食物组合物中使用。本发明的食物载体包括几乎任何食品。这类食物载体的实例包括但不限于食物棒(燕麦棒，蛋白棒、糖果棒等)、谷物制品(燕麦片、早餐麦片、燕麦等)、烘焙食品(面包、甜甜圈、饼干、百吉饼、糕点、蛋糕等)、饮料(牛奶为主的饮料、运动饮料、果汁、酒精饮料、瓶装水)、面食、谷物(大米、玉米、燕麦、黑麦、小麦、面粉等)、蛋制品、零食(糖果、薯片、口香糖、巧克力等)、肉类、水果和蔬菜。在一个实施方案中，本文所采用的食物载体可掩盖不良的味道(例如苦味)。当需要时，本文中所呈现的食物组合物比本文描述的任何组分表现出更理想的质地和香味。例如，根据本发明可以使用液体食物载体来获得本发明的食物组合物的饮料形式，如补充性果汁、咖啡、茶等。在其他实施方案中，可以根据本发明使用固体食物载体来获得代餐形式的本发明食物组合物，如补充性小吃棒、面食、面包等。在其他实施方案中，可以根据本发明使用半固体食物载体来获得本发明的食物组合物的口香糖、咀嚼糖果或零食等形式。

联合组合物的给药可以每天施用大约、少于约或多于约1、2、3、4、5、6，7、8、9、10次或更多次。受试者可以在大约、少于约或大于约1、2、3、4、5、6，7、8、9、10、11、12、13、14或更多天、周或月内接受给药。单位剂量可以是每日剂量的一部分，例如每日剂量除以每天待施用的单位剂量数。单位剂量可以是每日剂量的一部分，其为每日剂量除以每天待施用的单位剂量数，再除以每次施用的单位剂量数(例如片数)。每次施用的单位剂量数可以约为、少于约或多于约1、2、3、4、5、6，7、8，9、10或更多。每天的剂量数可以约为、少于约或多于约1、2、3、4、5、6，7、8、9、10或更多。每天的单位剂量数可以通过用每日剂量除以单位剂量来确定，且其可以约为、少于约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、20或更多单位剂量每天。例如，单位剂量可以是约1/2、1/3、1/4、1/5、1/6，1/7、1/8、1/9、1/10。单位剂量可以是每日量的约三分之一并对受试者每天施用三次。单位剂量可以是每日量的约二分之一并对受试者每天施用两次。单位剂量可以是每日量的约四分之一并对受试者每天施用两次，每次两个单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量包含大约、少于约或多于约50mg白藜芦醇。在一些实施方案中，单位剂量包含大约、少于约或多于约550mg亮氨酸。在一些实施方案中，单位剂量包含大约、少于约或多于约200mg的一种或多种亮氨酸代谢物。在一些实施方案中，单位剂量(例如包含亮氨酸的单位剂量)每天施用两次，每次两个单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量(例如包含一种或更多亮氨酸代谢物如HMB的单位剂量)每天施用两次，每次一个单位剂量。

本文公开的组合物可以进一步包含增香剂，并可以是固体、液体、凝胶或乳液。

方法

本申请提供了使用选择性PDE抑制剂增加受试者中的去乙酰化酶途径输出(包括AMPK，去乙酰化酶途径中的一种信号分子)的方法。如本文所述，去乙酰化酶途径的输出可在分子水平上或通过获得的生理效应进行表征。在一些实施方案中，本发明提供了增加受试者中的脂肪酸氧化的方法，其包括对受试者施用本文公开的组合物。在本发明的多个实施方案中，以递送足以增加受试者细胞内脂肪酸氧化的协同量的一种或多种支链氨基酸或其代谢物(如亮氨酸或HMB)和PDE 5抑制剂(如西地那非或淫羊藿苷)的量向受试者施用组合物。

本文描述的方法可用于多种应用。这些应用包括(a)去乙酰化酶途径输出的升高，(b)线粒体生物发生的升高，(c)新线粒体形成的增加，(d)线粒体功能的增强，(e)脂肪酸氧化的升高，(f)热量产生的增加，(g)胰岛素敏感度升高，(h)葡萄糖摄取的升高，(i)血管舒张的增强，(j)体重降低，(k)脂肪细胞体积的减少，(l)受试者中炎症应答或标志物的降低，和(m)鸢尾素产量的增加。可以通过施用本文描述的一种或多种组合物来实现这些应用中的任何应用。

据此，本发明提供了一种施用组合物的方法，该组合物包含(a)一种或多种类型的支链氨基酸和/或其代谢物，和(b)以亚治疗量存在的选择性PDE抑制剂，其中与单独使用时的组分(a)或(b)相比，该组合物协同有效地使去乙酰化酶途径输出增加至少约5倍。

该途径的输出可使用本文公开的和/或本领域已知的一种或多种方法来测量。例如，脂肪酸氧化可以通过测量氧消耗或³H标记的棕榈酸盐氧化来测定。线粒体生物发生可以通过使用荧光用线粒体探针来测量。AMPK活性可以通过经由ELISA分析测量AMPK磷酸化或通过Western印迹法来确定。Sirt1活性可以通过测定可使用荧光团检测的底物的去乙酰化来确定。

通过将对应的底物应用于在体外进行的去乙酰化分析中而观察sirt1、sirt2或sirt3的升高。用于测定SIRT1活性的底物可以是本领域已知的任何底物(例如包含人p53的氨基酸379-382(Arg-His-Lys-Lys[Ac])的肽)。用于测定SIRT3活性的底物可以是本领域已知的任何底物(例如包含人p53的氨基酸317-320(Gln-Pro--Lys-Lys[Ac])的肽)。在一些情况下，与只存在联合组合物的一种组分的情况下测定的活性相比，在存在本文描述的一种或多种联合组合物的情况下进行的一种或多种分析中sirt活性的增加导致活性增加至少约1、2、3、5或10倍。例如，与只存在单独的(a)或(b)的情况下测定的活性相比，包含(a)去乙酰化酶途径激活剂(如西地那非)和(b)支链氨基酸或其代谢物(如HMB)的联合组合物的使用导致sirt3活性升高至少约5倍。同样，本发明组合物的使用导致sirt1活性比在只存在该组合物的一种组分的情况下测定的活性高1.5、2、5或10倍。

本发明提供了一种施用组合物的方法，该组合物包含：(a)一种或多种类型的支链氨基酸和/或其代谢物，和(b)选择性PDE抑制剂，其中在施用所述组合物的受试者中组分(a)与(b)的目标或达到的循环摩尔比大于约100,000、200,000或500,000，且其中当施用至有需要的受试者时，该组合物协同地增强如由受试者的体重增加降低、受试者的内脏脂肪体积减小、受试者的脂肪氧化增加、受试者的胰岛素敏感度升高、受试者的肌肉中葡萄糖摄取增加、炎症标志物降低、血管舒张增强和/或体温升高所测量的能量代谢。

本发明提供了一种施用食物组合物的方法，该食物组合物包含：(a)一种或多种类型的支链氨基酸和/或其代谢物；(b)选择性PDE抑制剂(例如西地那非或淫羊藿苷)，其中(a)和(b)以协同地实现受试者的体重增加降低、受试者的内脏脂肪体积减小、受试者的脂肪氧化增加、受试者的胰岛素敏感度升高、受试者的肌肉中葡萄糖摄取增加、血管舒张增强、氧化应激降低、炎性应激降低和/或体温升高的量存在；和(c)食物载体。

本发明提供了一种施用组合物的方法，该组合物包含：(a)一种或多种类型的支链氨基酸和/或其代谢物与(b)PDE-5抑制剂的组合，其中该组合物基本上不含非支链氨基酸，其中当将该组合施用至有需要的受试者时，与将组分(a)或组分(b)单独施用至受试者相比，更大程度地增强线粒体生物发生，且其中线粒体生物发生的增强由受试者的体重降低、受试者的内脏脂肪体积减小、受试者的脂肪氧化增加、受试者的胰岛素敏感度升高、受试者的肌肉中葡萄糖摄取增加、血管舒张增强、氧化应激降低、炎性应激降低和/或体温升高来测量。对于一些实施方案，(a)的量和(b)的量是协同的。

本发明提供了一种施用组合物的方法，该组合物包含：(a)一种或多种类型的支链氨基酸和/或其代谢物与(b)PDE-5抑制剂的组合，其中该组合物基本上不含非支链氨基酸，其中当将该组合施用至有需要的受试者时，与将组分(a)或组分(b)单独施用至受试者相比，更大程度地增强线粒体生物发生，且其中增强的线粒体生物发生由受试者的体重降低、受试者的内脏脂肪体积减小、受试者的脂肪氧化增加、受试者的胰岛素敏感度升高、受试者的肌肉中葡萄糖摄取增加、血管舒张增强、氧化应激降低、炎性应激降低和/或体温升高来测量。在一些实施方案中，(a)的量和(b)的量是协同的。

本发明提供了一种增强有需要的受试者中的脂肪氧化的方法，其包括在一段时间内向该受试者施用本文描述的任何组合物，其中该受试者中的脂肪氧化在此段时间内增强。脂肪氧化可增加大约或大于约5％、10％、15％、20％、50％、100％、200％或500％。

本发明提供了一种降低有需要的受试者中的炎症应答的方法，其包括在一段时间内向该受试者施用本文描述的任何组合物，其中该受试者中的炎症应答在此段时间内降低。炎症应答可降低大约或大于约5％、10％、15％、20％、50％或100％。

炎性标志物和细胞因子水平，包括但不限于血浆中的IL-6、脂连蛋白、TNF-α和CRP水平，可通过诸如ELISA(Assay Designs,Ann Arbor,MI；Linco Research,St.Charles,MO；和Bioscience,San Diego,CA)等免疫分析来确定。

本发明提供了一种升高或保持受试者体温的方法，其包括在一段时间内向该受试者施用本文描述的任何组合物，其中该受试者的体温在此段时间内升高。体温可升高大约或大于约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％或20％。

本发明提供了一种诱导血管舒张的方法，其包括在一段时间内向受试者施用本文描述的任何组合物，其中该受试者的血管舒张在此段时间内得到诱导。血管的血管舒张可增加大约或大于约1％、2％、3％、5％、10％、20％、50％或100％。可通过光学方式、通过测量血管限制(vasorestriction)或通过许多其他技术来测量血管舒张。这些技术包括侵入性前臂技术、肱动脉超声技术和脉波分析。用于测量血管舒张的方法描述于Lind等人，“Evaluation of four different methods to measure endothelium-dependentvasodilation in the human peripheral circulation,”Clinical Science 2002，102，561-567中。

本发明提供了一种增加鸢尾素产量的方法，其包括在一段时间内向受试者施用本文描述的任何组合物，其中该受试者中的鸢尾素产量在此段时间内增加。在一些实施方案中，鸢尾素产量的增加(或提供其证据的指标的增加)是大约或多于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％或更多的增加。在一些实施方案中，鸢尾素产量的增加(或提供其证据的指标的增加)是大约或多于约1倍、3倍、5倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、50倍或更多的增加。在一些实施方案中，鸢尾素产量的增加由FNDC5表达的升高(例如从mRNA和/或蛋白质水平上测定的)来证实。在一些实施方案中，鸢尾素产量的增加由脂肪细胞褐化的一种或多种指标的升高(例如，脂肪酸氧化，和/或脂肪组织中一种或多种褐色脂肪选择性基因的表达的升高)来证实。褐色脂肪选择性基因的非限制性实例包括Ucp1、Cidea、Prdm16和Ndufs。在一些实施方案中，鸢尾素产量的增加由细胞分泌鸢尾素的增加(例如由培养细胞的培养基或受试者的循环血浆测定的)来证实。基因水平的增加可直接测定(例如mRNA或蛋白质水平的改变)或间接测定(与表达增加相关的效应变化，例如下游基因表达的增加)。检测基因表达水平变化的方法是本领域已知的，且包括但不限于检测mRNA的方法(例如RT-PCR、Northern印迹法和微阵列杂交)、蛋白质产物的检测(例如Western印迹法和ELISA)、翻译后蛋白质的一种或多种活性的检测(例如酶活性分析)。

本发明提供了一种治疗患有糖尿病的受试者(例如患有I型糖尿病、II型糖尿病和/或饮食诱导的糖尿病的受试者)的方法，该方法包括在一段时间内向该受试者施用本文所述的任何组合物。糖尿病的特征可在于降低的胰岛素水平、胰岛素抗性或此两者的组合。在一些实施方案中，该施用有效地改善受试者的糖尿病症状。例如，该组合物的施用可改善受试者的胰岛素敏感度。I型糖尿病的特征可在于，与没有I型糖尿病的受试者相比降低的胰岛素产生。本文所述的组合物的施用可改善患有I型糖尿病(例如，具有减少的胰岛素)的受试者对由该受试者产生或施用给该受试者的胰岛素的敏感度。II型糖尿病的特征可在于降低的对胰岛素的敏感度。因此，本文所述的组合物的施用可改善患有II型糖尿病的受试者的胰岛素敏感度。

糖尿病的一个示例性症状是降低的胰岛素敏感度。胰岛素敏感度可以通过本领域已知的任何手段来确定。例如，可以在施用胰岛素团注后，在一些情况下经过一段时间，通过测量受试者的血糖水平来确定胰岛素敏感度。与具有正常胰岛素敏感度的受试者相比，胰岛素敏感度降低的受试者在施用胰岛素后一般表现出减弱的血糖水平下降。本文所述组合物的施用可增加受试者的胰岛素敏感度。与例如受试者在施用之前的胰岛素敏感度水平相比，本文所述组合物的施用可增加受试者的胰岛素敏感度。与受试者在施用组合物之前的胰岛素敏感度水平相比，胰岛素敏感度可增加大约或大于约1、2、3、5、10、20、50、100或200％。

糖尿病的另一个示例性症状是降低的葡萄糖耐受。葡萄糖耐受可通过本领域已知的任何手段来确定。例如，可以在施用葡萄糖团注后，在一些情况下经过一段时间，通过测量受试者的血糖水平来确定葡萄糖耐受。与具有正常葡萄糖耐受的受试者相比，葡萄糖耐受降低的受试者一般表现出升高的血糖水平和/或较慢的血液葡萄糖清除。本文所述组合物的施用可提高受试者的葡萄糖耐受。与例如受试者在施用之前的葡萄糖耐受水平相比，本文所述的组合物的施用可提高受试者的葡萄糖耐受。与例如受试者在施用之前的葡萄糖耐受水平相比，葡萄糖耐受可提高大约或大于约1、2、3、5、10、20、50、100或200％。

糖尿病的另一个症状是升高的餐后或空腹血糖水平。血糖水平可以通过本领域已知的任何手段来确定。例如，血糖水平可通过例如血糖监测仪来测定。升高的血糖水平可以是，例如，与没有糖尿病的受试者或对照群体的血糖水平相比，患有糖尿病的受试者的血糖水平的增加。本文所述的组合物的施用可降低受试者的血糖水平(例如，餐后和/或空腹血糖)。与例如受试者在施用之前的血糖水平相比，本文所述组合物的施用可降低受试者的血糖水平(例如，餐后和/或空腹血糖)。与受试者在施用之前的血糖水平相比，本文所述组合物的施用可使血糖水平降低大约或大于约1、2、3、5、10、20、50、60、70、80、90或100％。本文所述组合物的施用可使血糖水平降至正常水平，例如，在没有糖尿病的对照群体中所见的水平。

糖尿病的另一个症状是升高的胰岛素抗性的稳态评估(HOMA_IR)。HOMA_IR可通过本领域已知的任何手段来确定，例如通过以下方程：HOMA_IR＝[胰岛素(uU/mL)X葡萄糖(mM)]/22.5。本文所述组合物的施用可降低受试者的HOMA_IR水平。升高的HOMA_IR可以是，例如，与没有糖尿病的受试者或对照群体的HOMA_IR水平相比，患有糖尿病的受试者的HOMA_IR水平的增加。本文所述组合物的施用可以降低受试者的HOMA_IR水平。与例如受试者在施用本文所述组合物之前的HOMA_IR水平相比，本文所述组合物的施用可以降低受试者的HOMA_IR水平。与受试者在施用该组合物之前的HOMA_IR水平相比，该组合物的施用可以使HOMA_IR水平降低大约或大于约1、2、3、5、10、20、50、60、70、80、90或100％。HOMA_IR水平可以降至正常水平，例如，在没有糖尿病的对照群体中所见的水平。

糖尿病的另一个症状是升高的肝脏质量。肝脏质量可通过本领域已知的任何手段来估计，例如通过成像或通过活组织检查。升高的肝脏质量可以是，例如，与没有糖尿病的受试者或对照群体的肝脏质量相比，患有糖尿病的受试者的肝脏质量的增加。本文所述组合物的施用可以降低受试者的肝脏质量。与例如受试者在施用本文所述组合物之前的肝脏质量相比，本文所述组合物的施用可以降低受试者的肝脏质量。与受试者在施用该组合物之前的肝脏质量相比，该组合物的施用可以使肝脏质量降低大约或大于约1、2、3、5、10、20、50、60、70、80、90或100％。该组合物的施用可以使受试者的肝脏质量降至正常值，例如，在没有糖尿病的对照群体中所见的平均肝脏质量。

糖尿病的另一个症状是升高的炎症。受试者的炎症可以通过本领域已知的任何手段来评估，例如，通过分析受试者中或从受试者获得的生物样品中与炎症相关的标志物。与炎症相关的标志物在本领域中是已知的，且包括例如炎性细胞类型、蛋白质受体、炎性分子和参与炎性途径的其他指示物。示例性的与炎症相关的标志物包括但不限于细胞因子、IL-6、脂连蛋白、MCP-1和C反应蛋白(CRP)。该生物样品可以是，例如，全血、血浆、血清、唾液、痰、尿、粪便、皮肤、毛发或组织活检。该生物样品可以通过本领域已知的任何手段来获得。该标志物可以通过本领域已知的任何手段来检测和/或评估，例如，通过成像、通过免疫荧光法、通过免疫组织化学、通过基因表达分析、通过原位杂交、通过RNase保护试验、通过报道分子试验、通过ELISA或通过任何其他方法。本文所述组合物的施用可以降低受试者的炎症。与例如受试者在施用之前的炎症水平相比，本文所述组合物的施用可以降低受试者的炎症。升高的炎症可以是，例如，与没有糖尿病的受试者或对照群体的炎症水平相比，患有糖尿病的受试者的炎症水平的增加。与受试者在施用之前的炎症水平相比，本文所述组合物的施用可以降低大约或大于约1、2、3、5、10、20、50、60、70、80、90或100％。本文所述组合物的施用可以使受试者的炎症降至正常水平，例如，降至在没有糖尿病的对照群体中所见的平均炎症水平。

在一些实施方案中，也可以测量胰岛素信号传导。可以通过用来自InvitrogenLife Science的Luminex试剂盒“Akt Pathway Total 7-Plex Panel”(目录号LHO0002)和“Akt Pathway Phospho 7-Plex Panel”(目录号LHO0001)测定组织裂解物中的全部和磷酸化的Akt、GSK-3β、IGF-1R、IR、IRS-1、p70S6K和PRAS40来测量胰岛素信号传导。

在一些实施方案中，以减少对受试者而言的二甲双胍的治疗有效剂量的量施用支链氨基酸(或其代谢物)和/或选择性PDE抑制剂。在一些实施方案中，二甲双胍的治疗有效剂量减少大约或多于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99.9％、99.99％或更多。在一些实施方案中，本发明的组合物的施用使体脂肪(例如内脏脂肪)减少大约或多于约5％、10％、15％、20％、25％、50％或更多。

本申请还提供了增加受试者中的线粒体生物发生的方法，其包括向该受试者施用本文公开的组合物。在本发明的多个实施方案中，以递送足以增加受试者细胞内线粒体生物发生的协同量的选择性PDE抑制剂的量向受试者施用组合物。另一实施方案提供了以足以增加受试者细胞内线粒体生物发生的量向受试者施用包含协同量的亮氨酸和PDE抑制剂(例如PDE-5抑制剂)的组合物。又一实施方案提供了以足以增加受试者中的线粒体生物发生的量向受试者施用包含协同量的亮氨酸、PDE抑制剂(例如PDE-5抑制剂)和白藜芦醇的组合物。线粒体生物发生和脂肪氧化可在包括肌细胞和脂肪细胞在内的多种细胞中诱导。

本发明的另一方面提供了在受试者中减少体重增加或减少脂肪细胞体积的方法，其包括施用本文公开的组合物。可使用刻度秤称量体重，通过壁挂式测量仪测量身高，并可通过标准公式计算身体质量指数(kg/m²)。可以通过双能X-射线吸收测定法在基线及12和24周评估脂肪量。可以维护和校准LUNAR Prodigy双能X-射线吸收测定系统(GEHealthcare，Madison，WI)或本领域已知的任何其他X-射线吸收测定系统以供使用。可以每天评估脊模(spine phantom)来确定仪器是否发生任何偏移，随后是每日校准模块(calibration block)。

在本发明的这一方面，向受试者施用一定量的组合物，该量递送足以减少受试者体重增加的协同量的选择性PDE抑制剂与亮氨酸、HMB和白藜芦醇中一种或多种的组合。

本文所公开的增加SIRT1及SIRT3活性的组合物的施用在需要代谢激活脂肪细胞或其一种或多种肌肉(例如，骨骼肌、平滑肌或心肌或其肌细胞)的任何受试者中可能是有用的。受试者可以是患有恶病质或肌肉萎缩的受试者。增加SIRT3活性也可以用于增加或保持例如低温受试者的体温，而增加SIRT1活性有利于治疗糖尿病(2型糖尿病)和葡萄糖耐受降低并减少受试者的炎症应答。

增加SIRT3活性也可用于治疗或预防心血管疾病，通过血管舒张降低血压，增加心血管健康，以及增加血管组织例如血管和动脉的收缩功能(例如，通过影响平滑肌)。通常，SIRT3的激活可用于刺激脂肪细胞或任何类型的肌肉(例如，肠道或消化系统或泌尿道的肌肉)的代谢，并且由此可用来控制肠道运动，例如便秘和失禁。SIRT3激活在勃起功能障碍中也可能是有用的。它也可以用来刺激精子能动性，例如被用作生育药。其中增加SIRT3将会有用的其他实施方案包括肌肉的修复(如手术或事故后)、肌肉量的增加和运动表现的增加。

因此，本发明提供了通过使一种或多种肌细胞与增加细胞中SIRT3的蛋白质水平或活性水平的试剂接触而产生有益效果的方法。这些方法有效地促进、增加或刺激以下的一项或多项：模拟肌细胞中的卡路里限制或锻炼的益处，增加线粒体生物发生或代谢，提高肌细胞中的线粒体活性和/或持久性，使肌细胞对葡萄糖摄取致敏，增加肌细胞中的脂肪酸氧化，减少肌细胞中的活性氧(ROS)，增加肌细胞中的PGC-1α和/或UCP3和/或GLUT4表达，以及激活肌细胞中的AMP活化的蛋白激酶(AMPK)。根据本发明，可接触各种类型的肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞是骨骼肌细胞。在某些实施方案中，该肌细胞是慢缩肌细胞，如比目鱼肌细胞。

通过间接量热法使用开路技术在12小时禁食和48小时禁运动后的6AM和10AM之间用SensorMedics Vmax 29n代谢车(Sensor Medics，Anaheim，CA)测定静息代谢速率(RMR)/底物氧化。在尿排空后，受试者在隔离室内温度受控(21-24℃)的环境中安静休息30分钟。然后将受试者置于通风橱中至少30分钟，直到达到稳态。有效测量的标准可以是最少15分钟的稳态，稳态被确定为每分钟通气量和耗氧量的波动小于10％且呼吸商的波动小于5％。代谢速率用Weir方程计算，RQ被计算为CO₂产生/O₂消耗，底物氧化由尿氮损失修正后的RQ来计算。

葡萄糖摄取可以使用体内或体外技术来测量。例如，可在体内使用PET扫描结合标记的葡萄糖或葡萄糖类似物来测量葡萄糖摄取。葡萄糖摄取的测量可以由PET扫描或通过本领域中已知的任何其他技术来量化。在一些实施方案中，葡萄糖摄取可以通过对经由PET外源施用的18-F-脱氧葡萄糖摄取进行定量来测量。

ROS/氧化应激可以通过抽血至EDTA处理的试管中、离心以分离血浆并整分样品以用于单独的分析来测量。测量前可以将血浆保持在-80℃和氮气下以防止氧化改变。血浆丙二醛(MDA)可使用荧光分析来测量，血浆8-异前列烷F_2α通过ELISA来测量(Assay Designs,Ann Arbor,MI)。

另一实施方案提供了以足以增加受试者细胞内的脂肪酸氧化的量向受试者施用包含协同量的亮氨酸和白藜芦醇的组合物。其他实施方案提供了以足以增加受试者内的脂肪酸氧化的量向受试者施用包含协同量的亮氨酸、HMB和白藜芦醇的组合物。该亮氨酸可以是游离氨基酸形式。

该组合物可以通过口服或通过任意其他方法施用至受试者。口服方法包括施用作为液体、固体或半固体的组合物，其可以采用膳食补充剂或食品的形式。

该组合物可以定期施用。例如，该组合物可以每天施用1、2、3、4次或更频繁。可以每隔1、2、3、4、5、6或7天向受试者进行施用。在一些实施方案中，该组合物每天施用3次。该施用可以与受试者的用餐时间同时。治疗或饮食补充的周期可以是约1、2、3、4、5、6、7、8或9天、一周或更久、2周或更久、六周或更久、1-11个月或更久、1年或更久、2年或更久、5年或更久。在本发明的一些实施方案中，治疗周期中向受试者施用的剂量可以变化或保持不变。例如，可以在施用周期中增加或减少每日给药量。

该组合物可以在延长的时间段是治疗有效的，以使有益效果得到维持。该有益效果可通过施用本文所述组合物至少约4、6、8、10或12周，或至少约4、6、12、48或72个月的一段时间来维持。

如本文所述，该组合物可以如此施用至受试者，以使得向该受试者施用选定的每日总剂量的该组合物。例如，该组合物的每日总剂量可以包含约0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、60、80或100mg的西地那非。

在一些实施方案中，如本文所述，可以向受试者施用选定的剂量的组合物，以使该受试者达到该组合物的期望的循环水平。例如，组合物的期望的循环水平可以约为0.1、0.5、1、2、5、10nM或更多的西地那非，且组合物的期望的循环水平可以至少约为0.25、0.5、0.75、1mM或更多的亮氨酸。选定的剂量可以根据受试者的特性如体重、身高、种族或遗传学来选择。

在另一个方面，本发明提供了提高受试者的能量代谢的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的组合物，例如包含选择性PDE抑制剂的组合物，持续受试者的能量代谢得以增加的一段时间。本发明还提供了增强有需要的受试者中的脂肪氧化的方法，其包括在一段时间内施用本文所述组合物每日至少两次，其中与该受试者在所述时间段之前的脂肪氧化相比，该受试者在这段时间内的脂肪氧化得到增加。可以在处理前及处理后测量受试者的能量代谢，以确定受试者的能量代谢是否增加。或者，可以将受试者合并为测试组和对照组，其中在组间测量能量代谢的增加。

施用时间段的长度和/或给药量可以由医师、营养师或任何其他类型的临床医生来确定。该时间段可以是一、二、三、四周或更久。或者，该时间段可以是一、二、三、四、五、六个月或更久。

在另一个方面，本发明提供了增加受试者的能量代谢的方法，该方法包括以选定的给药水平施用本文所述的组合物，其中选定的给药水平在受试者中诱导约0.5mM亮氨酸和约1nM西地那非的循环水平。该给药水平可以根据受试者的特性如体重、身高、种族、遗传学或能量代谢基线水平进行调整。

医师、营养师或临床医生可以观察受试者对施用的组合物的应答，并基于受试者的表现或测定的亮氨酸、PDE 5抑制剂或该组合物的任何其他组分的循环水平来调节给药。例如，对于显示出能量调节效果减弱或PDE5抑制剂或亮氨酸的循环水平低于所需目标水平的受试者，可以增加给药水平。

在一些实施方案中，可以对给定的受试者优化向该受试者施用的组合物。例如，可以调节支链氨基酸与选择性PDE抑制剂的比值或联合组合物中的特定组分。可以在向受试者施用具有不同的支链氨基酸与选择性PDE抑制剂的比值或不同的联合组合物组分的一种或多种组合物后对受试者进行评估，然后选择该比值和/或特定组分。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括单独施用本发明的组合物。但是，本文所述的任何方法可以包括联合治疗。该联合治疗可以包括联合施用本文所述的组合物(例如，包含支链氨基酸或其代谢物和PDE抑制剂的组合物)与额外的治疗剂。该额外的治疗剂可以是，例如，用于糖尿病治疗的治疗剂。如本文所用的，术语“共同施用”、“联合施用”及其语法上的等同语旨在涵盖向单一受试者施用本发明组合物和额外的治疗剂，且意在包括其中该组合物和额外的治疗剂通过相同或不同的施用途径或在相同或不同的时间施用的治疗方案。在一些实施方案中，本文所述的组合物与一种或更多额外的治疗剂共同施用。这些术语涵盖向受试者施用本发明组合物和额外的治疗剂，以使本发明组合物的活性成分、额外的治疗剂和/或其代谢物在受试者中同时存在。它们包括在分开的组合物中同时施用、在分开的组合物中在不同时间施用和/或在其中存在PDE抑制剂、支链氨基酸和额外治疗剂的单一组合物中施用。因此，在一些实施方案中，PDE抑制剂、支链氨基酸和额外的治疗剂在单一组合物中施用。在一些实施方案中，PDE抑制剂、支链氨基酸和额外的治疗剂在单一组合物中混合。示例性的额外治疗剂在本文中描述。

在一些实施方案中，额外的治疗剂是双胍。在一些实例中，双胍降低血液和/或血浆葡萄糖水平。双胍的实例包含但不限于二甲双胍、丁双胍、苯乙双胍、氯胍等。

在一些实施方案中，额外的治疗剂是肠降血糖素拟似物。在一些实施方案中，肠降血糖素拟似物增加了胰腺对食物摄入的应答。在一些实例中，肠降血糖素拟似物与本文描述的任何化合物的联合施用降低了血液和/或血浆葡萄糖水平。肠降血糖素拟似物的实例包括但不限于艾塞那肽一种用于糖尿病治疗的当前使用的疗法是皮下注射艾塞那肽

在一些实施方案中，额外的治疗剂是噻唑烷二酮。在一些实例中，噻唑烷二酮逆转胰岛素抗性并降低血液和/或血浆葡萄糖水平。噻唑烷二酮的实例包括但不限于罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)、曲格列酮(Rezulin)、MCC-555、利格列酮、环格列酮等。

在一些实施方案中，额外的治疗剂是肠内分泌肽。在一些实施方案中，肠内分泌肽逆转胰岛素抗性并降低血液和/或血浆葡萄糖水平。作为额外治疗剂施用的肠内分泌肽的实例包括但不限于GLP-1或GLP-1类似物，如他泊鲁肽(Ispen)等。

在特定的实施方案中，额外的治疗剂抑制了L-细胞肠内分泌肽的降解。在某些实施方案中，额外的治疗剂是DPP-IV抑制剂。适于本文所述方法使用的DPP-IV抑制剂包括但不限于(2S)-1-{2-[(3-羟基-1-金刚烷基)氨基]乙酰基}吡咯烷-2-甲腈(维格列汀)、(3R)-3-氨基-1-[9-(三氟甲基)-1,4,7,8-四氮杂双环[4.3.0]壬-6,8-二烯-4-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(西格列汀)、(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羟基-1-金刚烷基)乙酰基]-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲腈(沙格列汀)和2-({6-[(3R)-3-氨基哌啶-1-基]-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基}甲基)苯甲氰(阿格列汀)。作为治疗糖尿病的当前医疗标准的另一种疗法是二甲双胍或二甲双胍与西格列汀的组合。

在一些实施方案中，化合物的具体选择依赖于主治医师的诊断和他们对个体的状况与适当的治疗方案的判断。该化合物任选地同时(例如，同时地、基本上同时地或在同一治疗方案内)或顺序地施用，这取决于于疾病、病症或状况的性质，个体的状况，以及所用化合物的实际选择。在某些情况下，治疗方案中每种治疗剂的施用顺序和施用重复次数是基于对正在治疗的疾病与个体状况的评价。

在一些实施方案中，当药物在联合治疗中使用时，治疗有效剂量有所变化。文献中描述了经实验确定供联合治疗方案使用的药物和其他药剂的治疗有效剂量的方法。

在本文所述的联合疗法的一些实施方案中，共同施用的化合物的剂量根据所用的联合药物的类型、所用的具体药物、正在治疗的疾病或状况等而变化。此外，当与一种或多种生物活性剂共同施用时，本文提供的化合物任选地与该生物活性剂同时或顺序地施用。在某些情况下，如果顺序地施用，主治医师将决定本文所述的治疗化合物联合额外治疗剂的适当顺序。

多种治疗剂任选地以任何顺序或甚至同时地施用。如果同时施用，治疗剂任选地以单一的统一形式或以多种形式(仅举例来说，作为单一的丸剂或作为两种分开的丸剂)提供。在某些情况下，治疗剂中的一种任选地以多剂量提供。在其他情况下，两者均任选地作为多剂量提供。如果不是同时的，则在多个剂量之间的时机是任何合适的时机，例如从多于零周至少于四周。此外，该组合方法、组合物和制剂不限于仅两种药剂的使用；还设想了多种治疗组合的使用(包括两种或更多种本文所述的化合物)

在某些实施方案中，根据多种因素修改用于治疗、预防或改善寻求缓解的状况的剂量方案。这些因素包括受试者罹患的病症，以及受试者的年龄、体重、性别、饮食和医疗状况。因此，在多个实施方案中，实际使用的剂量方案是不同的且偏离本文所述的剂量方案。

在一些实施方案中，组成本文所述的联合疗法的药物剂以组合剂型或目的在于基本上同时施用的分开的剂型提供。在某些实施方案中，顺序地施用组成联合疗法的药物剂，任一种治疗化合物通过需要两步施用的方案来施用。在一些实施方案中，两步施用方案需要活性剂的顺序施用或分开的活性剂的空间隔离施用。在某些实施方案中，根据每种药物剂的性质，例如药物剂的效能、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学谱，多个施用步骤之间的时间段，作为非限制性的实例，从几分钟到数小时不等。

在一些实施方案中，本文的方法包括本文所述组合物和身体活动方案的施用。该身体活动方案可以是锻炼方案。该身体活动方案可以由例如医护提供者推荐给受试者，或者可由受试者主动进行。该身体活动方案可以包含任何种类的身体活动或锻炼(仅举例来说，包括散步、快走、徒步旅行、背包远足、跑步、慢跑、自由跑步、跑酷、骑自行车、游泳、漫步、踏车运动、健身车运动、划船、瑜伽、尊巴、举重、跳舞、体操、武术、田径活动、体育活动、运动例如足球、棒球、垒球、板球、踢球、躲球游戏、英式足球、篮球、曲棍球、滑冰、四轮鞋滑冰、滚轴溜冰、滑板运动、冲浪、保龄球、滑雪、马球、水球、长曲棍球、滑雪板、橄榄球、摔跤、拳击、特技飞行、箭术、剑术、羽毛球、网球、乒乓球、壁球、跳水、飞盘、极限飞盘、攀缘例如攀岩、撞球、骑马、高尔夫球、定向越野比赛、马戏艺术例如蹦床运动、秋千、柔术、魔术、空中技巧(aerial fabrics)等等)的一个或多个事件或回合。身体活动的事件或回合可以进行一段时间长度，例如1-10分钟、5-20分钟、15-30分钟、30-60分钟(1小时)、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时或多于24小时。身体活动的一个回合可以少于30分钟。受试者可以每个月、每周参加身体活动的一个回合，每周两个回合，每周三个回合或更多，每天一个回合的运动，一天两次，或多于一天两次。身体活动方案可包含，仅举例来说，每天一个回合的身体活动，其中一个回合的身体活动持续例如20分钟。本文所述组合物与身体活动方案的联合施用对受试者可具有协同有益效果，例如协同治疗效果。

向受试者施用本文所述的组合物，例如联合组合物，可允许调节或维持受试者的能量代谢。能量代谢的调节或维持可使受试者经历许多有益效果。这些有益效果包括体重下降、脂肪组织减少、脂肪酸氧化增多、胰岛素敏感度增大、氧化性应激减少和/或炎症减少。与治疗之前的基线相比，这些效果可引起约为或大于约5、10、15、20、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400或500％的改善。或者，本文所述组合物的施用可允许维持受试者的体重、脂肪组织的量、脂肪酸氧化的量、胰岛素敏感度水平、氧化应激水平和/或炎症水平。这些量和/或水平可维持在施用起始时的量和/或水平的0、1、5或10％内。

本发明的另一方面提供了在施用本文描述的联合组合物指定时间段后在一个或多个受试者中获得期望的效果。

在施用组合物6周的一段时间后，包含(a)一定给药水平的PDE5抑制剂和一定给药水平的HMB或(b)一定给药水平的PDE抑制剂例如PDE 5抑制剂和一定给药水平的亮氨酸(例如游离亮氨酸)的联合组合物可以使一个或多个受试者的体重增加减少至少约10％、15％、20％或20.5％。p-值可小于0.05(例如小于约0.05、0.03、0.02、0.01、0.001、0.0001或更低)。用相同给药水平的一种组分(西地那非、淫羊藿苷、白藜芦醇、亮氨酸或HMB)治疗的一个或多个受试者可能具有不显著的体重减轻或少于约0％、5％或10％的体重减轻。

施用2周的一段时间后，包含(a)一定给药水平的PDE抑制剂例如PDE 5抑制剂和一定给药水平的HMB或(b)一定给药水平的白藜芦醇和一定给药水平的亮氨酸(例如游离亮氨酸)的组合物可以使一个或多个受试者中的全身脂肪氧化增加至少约10％、15％或20％。p-值可小于0.05(例如小于约0.05、0.03、0.02、0.01、0.001、0.0001或更低)。全身脂肪氧化的增加可以在向受试者施用该组合物时维持，或维持至少2、4、6、10、13、26或52周的一段时间。用相同给药水平的一种组分(西地那非、淫羊藿苷、白藜芦醇、亮氨酸或HMB)治疗的一个或多个受试者可能具有不显著的全身脂肪氧化增加或少于约0％、5％或10％的全身脂肪氧化增加。

施用2周的一段时间后，包含(a)一定给药水平的PDE抑制剂例如PDE 5抑制剂和一定给药水平的HMB或(b)一定给药水平的白藜芦醇和一定给药水平的亮氨酸(例如游离亮氨酸)的组合物可以使一个或多个受试者中食物的热效应增加至少约10％、15％、17％或20％。p-值可小于0.05(例如小于约0.05、0.03、0.02、0.01、0.001、0.0001或更低)。食物热效应的增加可以在向受试者施用该组合物时维持，或维持至少2、4、6、10、13、26或52周的一段时间。用相同给药水平的一种组分(西地那非、淫羊藿苷、白藜芦醇、亮氨酸或HMB)治疗的一个或多个受试者可能具有不显著的食物热效应增加或少于约0％、5％或10％的食物热效应增加。

施用2周的一段时间后，包含(a)一定给药水平的PDE抑制剂例如PDE 5抑制剂和一定给药水平的HMB或(b)一定给药水平的PDE抑制剂例如PDE 5抑制剂和一定给药水平的亮氨酸(例如游离亮氨酸)的组合物可以使一个或多个受试者中总能量消耗增加至少约10％、15％、17％或20％。p-值可小于0.05(例如小于约0.05、0.03、0.02、0.01、0.001、0.0001或更低)。总能量消耗的增加可以在向受试者施用该组合物时维持，或维持至少2、4、6、10、13、26或52周的一段时间。用相同给药水平的一种组分(西地那非、淫羊藿苷、白藜芦醇、亮氨酸或HMB)治疗的一个或多个受试者可能具有不显著的总能量消耗增加或少于约0％、5％或10％的总能量消耗增加。

向受试者施用本文描述的组合物，例如联合组合物，能够允许对受试者能量代谢的调节或维持。能量代谢的调节或维持可以使受试者经历多种有益效果。这些有益效果包括体重减轻、脂肪组织减少、脂肪酸氧化升高、脂肪组织的褐化增加(如脂肪细胞褐化的一种或多种指标所示)、胰岛素敏感度升高、氧化应激降低和/或炎症降低。与治疗前的基线相比，这些效果能够导致大约或大于约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、75％或更多的改善。在一些实施方案中，与处理前的基线相比，这些效果能够导致大约或大于约100％、125％、150％、200％、250％、300％、400％、500％或更多的改善。或者，本文描述的组合物的施用可允许维持受试者的体重、脂肪组织量、脂肪酸氧化量、胰岛素敏感度水平、氧化应激水平和/或炎症水平。这些量和/或水平可维持在施用起始时的量和/或水平的约0％、1％、5％或10％内。

本发明提供了一种治疗受试者的方法，其包括鉴别适合治疗的一批受试者。该鉴别步骤可以包括一种或多种筛查测试或分析。例如，可选择被鉴别为糖尿病、具有胰岛素抗性或具有超过平均或显著大于平均体重指数和/或体重的受试者进行治疗。该鉴别步骤可以包括遗传测试，其鉴别一种或多种提示受试者适合治疗的遗传变异。然后可以用一种或多种本文描述的组合物治疗经鉴别的受试者。在一个实施方案中，本发明提供了一种调节能量代谢的方法，其包括：(a)鉴别具有肥胖或糖尿病或有肥胖或糖尿病倾向的受试者；和(b)向该受试者施用本文所述的组合物，例如权利要求1-29的任何组合物。例如，可以用包含选择性PDE抑制剂如PDE 5抑制剂和支链氨基酸的联合组合物对其进行治疗。

本发明还提供了制备本文描述的组合物的方法。在一些实施方案中，本文描述的组合物的制备包括混合或组合两种或更多种组分。这些组分可以包括选择性PDE抑制剂(包括但不限于PDE 5抑制剂)与亮氨酸(例如游离亮氨酸)和/或亮氨酸代谢物的组合。该组合物可进一步包含额外的去乙酰化酶或AMPK途径激活剂(例如多酚或多酚前体如白藜芦醇、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸、EGCG、白皮杉醇或葡萄籽提取物或其他药剂如奎尼酸和褐藻素)。在一些实施方案中，该去乙酰化酶激活剂为多酚。在其他实施方案中，该去乙酰化酶激活剂为多酚前体。组分的量或比值可以是本文所述的量或比值。

在一些实施方案中，所述组合物还可以与除PDE-5抑制剂外的药物活性剂、载体和/或赋形剂组合或混合。本文描述了此类组分的实例。联合组合物可配制为诸如片剂、胶囊、凝胶胶囊、缓释片剂等单位剂量。

在一些实施方案中，制备组合物以获得包含该一种或多种组分的基本上均质的混合物的固体组合物，从而该一种或多种组分均匀分散于该组合物中，使得能够将该组合物容易地细分为同样有效的单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊。

试剂盒

本发明还提供了试剂盒。该试剂盒包括处于适当包装中的本文所述的一种或多种组合物和可以包括使用说明、临床研究的讨论、副作用列表等的书面材料。这样的试剂盒还可以包括诸如科学参考文献、包装说明书材料、临床试验结果和/或这些的摘要等信息，这些信息表明或确立该组合物的活性和/或优势，和/或描述给药、施用、副作用、药物相互作用或对医疗保健提供者有用的其他信息。这样的信息可以基于多种研究的结果，例如，使用涉及体内模型的实验动物的研究和基于人类临床试验的研究。该试剂盒可进一步包含另一种试剂。在一些实施方案中，本发明的化合物和试剂作为试剂盒内单独的容器中的单独组合物来提供。在一些实施方案中，本发明的化合物和试剂作为试剂盒的容器中的单一组合物来提供。合适的包装和附加用品(例如，用于液体制剂的量杯、使空气暴露最小化的箔包装等)是本领域已知的并且可以被包括在试剂盒中。可以将本文所述的试剂盒提供、销售和/或推销给医疗服务提供者，包括医生、护士、药剂师、处方官员，等等。在一些实施方案中，试剂盒也可以直接销售给消费者。

在一些实施方案中，试剂盒可包含单位剂量的多日供应。该单位剂量可以是本文所述的任何单位剂量。该试剂盒可包含指导在多天的一段时间内施用单位剂量的多日供应的说明书。该多日供应可以是一个月供应、30天供应或多周供应。该多日供应可以是90天、180天、3个月或6个月供应。该试剂盒可包含包装的每日单位剂量，例如1、2、3、4或5个单位剂量的包装。该试剂盒可与其他的膳食补充剂、维生素和膳食替代条、混合物和饮料一起包装。

在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含可穿戴的活动监视器。该可穿戴的活动监视器可以通过步数计、加速表监视身体活动和/或步行活动，或示例性可穿戴活动监视器包括，例如：JawboneLarkLife^TM、Nike FuelBand、Striiv Play、BodyMediaFitCore及其他。这类可穿戴的活动监视器在美国专利号:8,403,845；8,398,546；8,382,590；8,369,936；8,275,635；8,157,731；8,073,707；7,959,567；7,689,437；7,502,643；7,285,090；7,261,690；7,153,262；7,020,508；6,605,038；6,595,929；6,527,711；8,562,489；8,517,896；8,469,862；8,408,436；8,370,549；8,088,044；8,088,043和美国专利申请公开号20130158369和20130151196中描述，其均通过引用在此并入。这类试剂盒除了组合物的使用说明外，还可进一步包含受试者参加身体活动方案的说明。这类试剂盒可进一步包含可穿戴的活动监视器的使用说明。这类试剂盒还可包含可穿戴的活动监视器配件，例如充电器，和/或用于从活动监视器到计算机或服务器进行数据通信的端口或无线通讯。

本发明提供了包括但不限于以下实施方案：

1.一种有效增强能量代谢的组合物，其包含：

a)磷酸二酯酶5(PDE 5)抑制剂；和

b)亮氨酸和/或亮氨酸代谢物。

2.如实施方案1所述的组合物，其中与向受试者单独施用组分(a)或组分(b)相比，该组合物更大程度地增强受试者的能量代谢。

3.如实施方案2所述的组合物，其中所述增强的能量代谢通过以下项目来度量：脂肪细胞的脂肪酸氧化提高至少约300％，脂肪细胞的葡萄糖利用提高至少150％，脂肪细胞的葡萄糖利用提高变化至少60％，或线粒体生物量提高至少约15％。

4.如实施方案2所述的组合物，其中所述增强的能量代谢通过以下项目来度量：餐后血糖降低至少20％，餐后胰岛素降低至少30％，空腹血糖降低至少40％，空腹胰岛素降低至少40％，对葡萄糖负荷的血糖应答降低至少15％，胰岛素耐受结果的两倍改善，或炎性应激降低至少20％。

5.如实施方案4所述的组合物，其中对葡萄糖负荷的血糖应答的降低由葡萄糖耐受曲线下面积来证明。

6.如实施方案1所述的组合物，其中所述PDE 5抑制剂是阿伐那非、伊地那非、米罗那非、西地那非、他达拉非、淫羊藿苷、伐地那非、乌地那非或扎普司特。

7.如实施方案1所述的组合物，其中所述PDE 5抑制剂是西地那非或淫羊藿苷。

8.如实施方案1所述的组合物，其中所述PDE 5抑制剂是淫羊藿苷。

9.如实施方案1所述的组合物，其中组分(b)是HMB。

10.如实施方案1所述的组合物，其中组分(b)是游离亮氨酸。

11.如实施方案1所述的组合物，其进一步包含非选择性PDE抑制剂。

12.如实施方案1所述的组合物，其进一步包含维生素B6。

13.如实施方案1所述的组合物，其进一步包含除所述PDE 5抑制剂外的药学活性剂。

14.如实施方案1所述的组合物，其中该组合物基本上不含游离氨基酸形式的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。

15.如实施方案1所述的组合物，其中该组合物基本上不含游离氨基酸形式的异亮氨酸和缬氨酸。

16.如实施方案1所述的组合物，其中该组合物被配制成用于口服。

17.如实施方案1所述的组合物，其中该组合物是包含亚治疗量的组分(a)的单位剂量。

18.如实施方案17所述的单位剂量，其中所述亚治疗量的组分(a)是约0.1至约20mg的西地那非。

19.如实施方案17所述的单位剂量，其中所述亚治疗量的组分(a)是约0.1至约10mg的西地那非。

20.如实施方案17所述的单位剂量，其中所述亚治疗量的组分(a)是约0.5-约50mg的阿伐那非、约0.05-约10mg的伊地那非、约0.25-约25mg的米罗那非、约0.01-约1.25mg的他达拉非、约0.01-约1.25mg的伐地那非、约0.5-约50mg的乌地那非、约0.5-约50mg的扎普司特或约0.05-约100mg的淫羊藿苷。

21.如实施方案17所述的单位剂量，其中组分(b)包含约50至约1000mg的游离亮氨酸。

22.如实施方案17所述的单位剂量，其中组分(b)包含约500至约700mg的游离亮氨酸。

23.如实施方案17所述的单位剂量，其中组分(b)包含至少约500mg的游离亮氨酸。

24.如实施方案17所述的单位剂量，其中组分(b)包含至少约200mg的HMB。

25.一种有效增强能量代谢的组合物，其包含：

a)PDE 5抑制剂；和

b)多酚，

其中与向受试者单独施用组分(a)或组分(b)相比，该组合物更大程度地增强受试者的能量代谢。

26.如实施方案25所述的组合物，其中所述多酚是白藜芦醇。

27.如实施方案25所述的组合物，其中所述多酚是茋或羟基肉桂酸。

28.如实施方案25所述的组合物，其中所述多酚是绿原酸、白藜芦醇、咖啡酸、白皮杉醇、鞣花酸、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、葡萄籽提取物或其任何类似物。

29.如实施方案25所述的组合物，其进一步包含亮氨酸和/或亮氨酸代谢物。

30.一种调节有需要的受试者的能量代谢的方法，其包括向该受试者施用如前述实施方案中任一项所述的组合物。

31.如实施方案30所述的方法，其中所述组合物经口服施用。

32.一种调节能量代谢的方法，其包括：

a)鉴别具有肥胖或糖尿病或有肥胖或糖尿病倾向的受试者；和

b)向该受试者施用如实施方案1-29中任一项所述的组合物。

33.一种调节有需要的受试者的能量代谢的方法，其包括向该受试者施用包含亚治疗量的PDE 5抑制剂和至少约500mg的亮氨酸或约200mg的HMB的单位剂量。

34.如实施方案33所述的方法，其中所述PDE 5抑制剂的亚治疗量低于约10mg/天。

35.如实施方案33所述的方法，其中所述PDE 5抑制剂是西地那非。

36.一种增强受试者的能量代谢的方法，其包括：

以选定的给药水平向所述受试者施用如实施方案1-29中任一项所述的组合物，其中该选定的给药水平诱导受试者中约1nM西地那非和约0.5mM亮氨酸的循环水平。

37.一种治疗有需要的受试者的糖尿病的方法，其包括向该受试者施用在治疗上有效的组合物，该组合物包含：

a)PDE抑制剂；和

b)游离氨基酸形式的支链氨基酸或其游离代谢物。

38.如实施方案37所述的方法，其中所述支链氨基酸是游离亮氨酸。

39.如实施方案37所述的方法，其中所述代谢物是HMB。

40.如实施方案37所述的方法，其中所述PDE抑制剂是PDE 5抑制剂。

41.如实施方案37所述的方法，PDE 5抑制剂是阿伐那非、伊地那非、米罗那非、西地那非、他达拉非、淫羊藿苷、伐地那非、乌地那非或扎普司特。

42.如实施方案37所述的方法，其包括口服施用在治疗上有效的组合物。

43.如实施方案37所述的方法，其包括施用在治疗上有效的组合物至少一、二或六周。

44.如实施方案37所述的方法，其中所述施用改善了受试者的糖尿病症状。

45.如实施方案44所述的方法，其中所述糖尿病症状的改善通过以下项目来度量：餐后血糖降低至少20％，餐后胰岛素降低至少30％，空腹血糖降低至少40％，空腹胰岛素降低至少40％，对葡萄糖负荷的血糖应答降低至少15％，胰岛素耐受结果的两倍改善，或炎性应激降低至少20％。

46.如实施方案45所述的方法，其中对葡萄糖负荷的血糖应答的降低由葡萄糖耐受曲线下面积来证明。

47.一种试剂盒，其包含如实施方案1-29中任一项所述的组合物的单位剂量的多日供应以及指导在多天的一段时间内施用所述多日供应的说明书。

实施例

实施例1—用于调节能量代谢的PDE 1抑制剂

测试了长春西汀(一种PDE 1抑制剂)与亮氨酸、HMB和白藜芦醇组合对能量代谢的影响。剂量应答显示，0.1nM或低于0.1nM浓度的长春西汀不发挥作用；因此，这是这些实验中所用的浓度。长春西汀与亮氨酸(0.5mM)或HMB(5μM)在脂肪氧化或葡萄糖利用方面不表现出协同作用，尽管它与低剂量白藜芦醇(200nM)表现出协同效应，这导致脂肪细胞中的葡萄糖利用增加了70％(p＝0.03)。

实施例2—用于调节能量代谢的PDE 3抑制剂

研究了两种PDE 3抑制剂——氨力农和西洛酰胺——与亮氨酸和HMB组合对能量代谢的影响。剂量应答显示，10nM或低于10nM浓度的任一种PDE 3抑制剂均不发挥作用；因此，在这些实验中对PDE 3抑制剂使用这一浓度。氨力农与亮氨酸或HMB不发挥显著的协同作用。但是，亮氨酸(0.5mM)或HMB(5μM)与西洛酰胺组合导致肌细胞中的脂肪氧化提高了92％(p<0.05)而脂肪细胞中提高了58％(p<0.05)。该西洛酰胺-HMB混合物协同地使肌细胞中的葡萄糖利用增加了202％(p＝0.024)且脂肪细胞中增加了83％(p＝0.05)，而西洛酰胺-亮氨酸混合物不发挥作用。

实施例3—用于调节能量代谢的PDE 4抑制剂

研究了两种PDE 4抑制剂——咯利普兰和YM796——与亮氨酸和HMB组合对能量代谢的影响。剂量应答显示，0.1nM或低于0.1nM浓度的咯利普兰和YM796不发挥作用；因此，这是这些实验中所用的浓度。咯利普兰与亮氨酸、HMB或白藜芦醇在肌细胞中的脂肪氧化、葡萄糖利用或AMPK活性方面没有协同效应；尽管咯利普兰激活AMPK磷酸化，但亮氨酸或HMB的存在不加强这一作用。然而，脂肪氧化协同作用在脂肪细胞中是明显的，脂肪氧化响应于咯利普兰-亮氨酸组合提高125％(p＝0.026)而响应于咯利普兰-HMB组合提高63％。然而，对于葡萄糖利用或AMPK激活没有发现协同作用。

实施例4—用于调节能量代谢的PDE 5抑制剂

用西地那非(1nM)、淫羊藿苷(1nM)、亮氨酸(0.5mM)、HMB(5μM)和白藜芦醇(200nM)的组合处理细胞。用0.5mM亮氨酸处理相当于通过对人类受试者施用约1,125mg的饮食亮氨酸所达到的相同摩尔浓度的循环水平。用0.25mM亮氨酸处理相当于通过对人类受试者施用约300mg的饮食亮氨酸所达到的相同摩尔浓度的循环水平。用1nM西地那非处理相当于通过对人类受试者施用约0.2mg的饮食西地那非所达到的相同摩尔浓度的循环水平。用1nM西地那非处理相当于通过对人类受试者施用约0.1mg的饮食西地那非所达到的相同摩尔浓度的循环水平。

西地那非剂量-应答曲线显示，低于1nM的浓度不发挥作用；因此，这是协同实验中所用的浓度。这是响应于低剂量药物(20mg)达到的峰值血浆浓度(约100nM)的约1％。用西地那非单独处理C2C12肌管导致脂肪酸氧化从基线变化约50％。用亮氨酸单独处理将脂肪酸氧化刺激至73％，p<0.05。这一浓度的西地那非在刺激肌管脂肪氧化方面与HMB(203％提高，p＝0.003)和亮氨酸(232％提高，p＝0.015)发挥了显著的协同作用，但是在肌细胞中没有显示出与白藜芦醇的相互作用(图2和图3)。

在3T3-L1脂肪细胞中，用亮氨酸处理使脂肪酸氧化提高至27％，p<0.05，而用HMB处理将脂肪酸氧化刺激至29％，p<0.05。与C2C12细胞一样，西地那非-亮氨酸和西地那非-HMB分别协同地使脂肪细胞中的脂肪氧化增加了137％和240％(p<0.05；图4)。向西地那非-亮氨酸或西地那非-HMB中增加白藜芦醇(200nM)没有发挥附加效应，并且与不含白藜芦醇的这些混合物没有显著不同。

西地那非还在刺激肌管和脂肪细胞中的葡萄糖利用方面与亮氨酸和HMB表现出协同作用。用亮氨酸单独处理C2C12肌管使葡萄糖利用增加至9.3％。西地那非-亮氨酸和西地那非-HMB分别协同地使肌管葡萄糖利用加强了53％和66％(p＝0.04，图5)，且西地那非还显示与白藜芦醇协同作用以产生类似的加强(53％，p＝0.04)。用亮氨酸处理将3T3-L1细胞中的葡萄糖利用刺激至48.6％，p<0.05。在3T3-L1脂肪细胞中，西地那非-亮氨酸使葡萄糖利用增加了285％(p＝0.05，图6)，而HMB或白藜芦醇均没有与西地那非发挥任何明显的协同作用。

淫羊藿苷是一种天然存在的黄酮醇，具有明显的PDE 5抑制活性。剂量-应答曲线显示，低于1nM的淫羊藿苷浓度不发挥作用；因此，这是在协同实验中所用的浓度。用亮氨酸单独处理C2C12肌管将脂肪酸氧化刺激至73％，p<0.05。此浓度的淫羊藿苷在刺激C2C12肌管脂肪氧化方面与HMB(75％提高)和亮氨酸(77％提高)发挥了显著的协同作用(p＝0.03，图7和图8)，而白藜芦醇发挥了独立的协同效应(157％提高，p＝0.002，图8)。在脂肪细胞中获得了类似的数据(p<0.05；图9)；但是，淫羊藿苷没有在葡萄糖利用方面表现出明显的协同作用。

在西地那非和淫羊藿苷与亮氨酸、HMB、白藜芦醇及其组合之间存在对一氧化氮产生的明显的协同相互作用。图10显示了西地那非和亮氨酸、HMB和白藜芦醇之间的相互作用，而图11显示了淫羊藿苷和亮氨酸、HMB和白藜芦醇之间的相互作用。亮氨酸、HMB和白藜芦醇各自与低剂量的西地那非(1nM)相互作用以产生一氧化氮产生量的适度的、显著的提高(15-30％提高，p<0.0001)，而西地那非、亮氨酸和白藜芦醇的组合产生了更稳健的应答(52％提高，p＝0.0003，相对于所有其他的处理，图10)。对于淫羊藿苷注意到了相似的效果，其中与亮氨酸、HMB和白藜芦醇中的每一种相互作用以引发适度的、显著的效应(p<0.0001)，使用西地那非、亮氨酸和白藜芦醇的组合发现了更稳健的效应(图11；p＝0.00013)。

已证明一氧化氮调节PGC1α从而刺激线粒体生物发生；因此，我们评估了西地那非和淫羊藿苷与亮氨酸、HMB和白藜芦醇组合对线粒体生物发生的影响，以线粒体生物量来度量。用亮氨酸单独处理C2C12细胞具有22.05+/-0.4AFU/μg蛋白质的线粒体生物量，p<0.05，图12表明西地那非(1nM)与亮氨酸或HMB之间的明显协同作用，因为亮氨酸-西地那非和亮氨酸-HMB各自刺激了线粒体生物量的明显增加(p<0.01)，而白藜芦醇对该相互作用没有明显的影响。类似地，淫羊藿苷与亮氨酸和HMB均表现出了明显的协同作用，从而上调线粒体生物发生(p<0.001)，而白藜芦醇没有表现出明显的相互作用(图13)。

所观察到的亮氨酸/HMB与西地那非之间在加强氧化代谢方面的协同作用是非显而易见的，因为最近的报告显示，这种药物类别的一种密切相关的成员——他达拉非(商品名为Cialis)，据报道其抑制相同细胞系统(C2C12肌管)中的有氧代谢。但是，长期(12周)施用西地那非导致能量消耗增加、体重减轻和脂肪增加以及胰岛素敏感度增加，尽管急性施用没有效果。我们的数据提示，将实质上低于用来治疗勃起功能障碍的浓度的浓度与亮氨酸或HMB组合将会是用于糖尿病管理的一种有用的治疗策略。作为西地那非的备选方案，淫羊藿苷是在淫羊藿科植物(淫羊草)中发现的天然存在的黄酮醇，其还具有PDE5抑制活性且发挥相似的作用。

实施例5—PDE 5抑制剂对血糖过多和胰岛素敏感的体内影响

在饮食诱导的肥胖小鼠(其可用作2型糖尿病的鼠类模型)中评估了淫羊藿苷(一种具有特异性PDE5抑制性质的黄酮醇)对血糖过多和胰岛素敏感度的交互作用。

方法

为六周龄的雄性C57/BL6小鼠提供标准低脂肪食物(对照；10％能量来自脂肪)或高脂肪食物(60％能量来自脂肪,Research Diets#D12492,Research Diets,Inc,NewBrunswick,NJ)以诱导胰岛素抗性。与低脂肪饮食的小鼠相比，高脂肪饮食的小鼠在暴露6周后显示出受损的葡萄糖耐受(图14)。

然后将动物随机分组，以接受以下饮食持续另外六周，每组10只动物：低脂肪饮食(LFD)对照；高脂肪饮食(HFD)对照；HFD+亮氨酸(24g/kg饮食，比对照水平增加两倍)；HFD+亮氨酸(24g/kg饮食)+淫羊藿苷(25mg/kg饮食)。先前发表的关于淫羊藿苷的研究已表明所选定的水平(25mg/kg饮食；约4mg/kg体重)没有作用。

使小鼠禁食整夜(约16小时)，之后测量空腹血糖、胰岛素和葡萄糖耐受。在测量空腹血糖后通过腹膜内施用葡萄糖(1.2g/kg体重)之后在15、30、60、90和120分钟时测量血糖来确定葡萄糖耐受。餐后血糖在停止进食后的一小时之内测量。胰岛素耐受通过胰岛素耐受试验(ITT)测量。移除食物4-6个小时后进行ITT，并测量基线血糖。然后向小鼠腹膜内注射胰岛素(1.2U/kg体重)并在注射胰岛素之后15、30、60、90和120分钟测量血糖。胰岛素抗性的稳态模型评估(HOMA_IR)用作胰岛素敏感度变化的筛选指标。HOMA_IR由空腹血浆胰岛素和葡萄糖按照以下标准公式计算：HOMA_IR＝[胰岛素(uU/mL)X葡萄糖(mM)]/22.5。分别使用来自Biovision(Milpitas,CA)的葡萄糖检测试剂盒和来自Millipore(Billerica,MA)的胰岛素试剂盒测量血浆葡萄糖和胰岛素浓度。血浆中的CRP水平通过ELISA测定(CRP:LifeDiagnostics,West Chester,PA)。

通过单向方差分析来分析数据；当ANOVA显示出显著性差异时，通过Tukey多重比较检验(Graphpad Prism,6.0版)分离平均值。小于0.05的p-值通常被认为是统计上显著的。

结果

到处理的第7天，餐后血糖响应于高脂肪饮食明显升高(图15)。尽管亮氨酸对葡萄糖没有发挥独立的作用，但是与未处理的HFD小鼠相比，在处理7天后，亮氨酸与淫羊藿苷的组合引起了餐后血糖约10％的显著下降(p<0.01，相对于HFD，图15)。该作用的幅度在14天后增加至约20％，使得HFD小鼠中的亮氨酸-淫羊藿苷联合处理将餐后血糖降至在低脂肪饮食小鼠中所见的水平(p<0.001，相对于HFD，图16)。

处理14天后测量所有实验组中的餐后胰岛素或循环胰岛素水平。与LFD小鼠相比，HFD小鼠显示出循环胰岛素升高了约5倍(图17)。然而，与未处理的HFD小鼠相比，用胰岛素单独处理HFD小鼠14天使循环胰岛素降低了约30％(图17)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸和淫羊藿苷处理HFD小鼠14天使循环胰岛素水平进一步降低了约50％(p<0.01，相对于HFD，图17)。

处理14天后所有实验组均通过胰岛素抗性的稳态评估(HOMA_IR)测量胰岛素敏感度。(HOMA_IR＝胰岛素(uU/mL)X葡萄糖(mM)/22.5)。与LFD小鼠相比，HFD小鼠显示出HOMA_IR升高了10倍(图18)。但是，与未处理的HFD小鼠相比，用胰岛素单独处理HFD小鼠14天使HOMA_IR降低了约40％(p<0.001，相对于HFD，图18)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸和淫羊藿苷处理HFD小鼠14天使HOM_IR水平进一步降低了约65％(p<0.001，相对于全部，图18)。

处理28天后所有实验组均通过胰岛素耐受试验测量胰岛素敏感度。如图19所示，向高脂肪饮食中添加亮氨酸和淫羊藿苷使得对胰岛素的应答改善至与低脂肪饮食中发现的水平相匹配的水平。由于血糖的最大降低在30分钟时发现，因此对血糖在30分钟时的变化进行统计分析(图20)。对胰岛素耐受试验30分钟时间点的分析显示HFD小鼠中的葡萄糖清除与LFD小鼠相比降低了约50％(图20)。但是，用亮氨酸和淫羊藿苷处理HFD小鼠将葡萄糖清除完全拯救至在LFD小鼠中发现的水平，相对于未用亮氨酸和淫羊藿苷处理的HFD小鼠为两倍的变化(p<0.02，相对于HFD，图20)。该分析显示，亮氨酸-淫羊藿苷组合的添加完全逆转了由高脂肪饮食引起的钝化的对胰岛素的应答。

处理五周之后评估所有实验组中的葡萄糖耐受。图21描绘了在处理五周时测量的葡萄糖耐受试验的结果，并且表明了血糖对葡萄糖激发的应答的明显下降。对图21的葡萄糖浓度曲线进行曲线下面积(AUC)测量，以获得随时间对葡萄糖负荷的整合葡萄糖应答的测量值。与LFD小鼠相比AUC增加了约75％(p<0.01，图22)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸和淫羊藿苷处理HFD小鼠使葡萄糖负荷显著减少了约40％(p<0.01，相对于HFD小鼠，图22)。

在6周研究结束时，评估了所有实验组中的空腹血糖水平、胰岛素水平、HOM_IR、肝脏质量和循环C反应蛋白(一种炎症生物标志物)(图23-27)。6周研究结束时对空腹血糖的评估显示，与LFD小鼠相比，HFD小鼠显示出空腹葡萄糖提高了约1倍(图23)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸单独处理HFD小鼠6周使空腹血糖降低了约20％(图23)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸+淫羊藿苷处理HFD小鼠6周使空腹血糖降低了约40％(p＝0.0014，相对于HFD，图23)。在6周研究结束时对空腹胰岛素水平的评估显示，与LFD小鼠相比，HFD小鼠显示出循环胰岛素增加8倍(图24)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸单独处理HFD小鼠6周使禁食期间的循环胰岛素降低了约25％(图24)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸+淫羊藿苷处理HFD小鼠6周使禁食期间的循环胰岛素降低了约40％(p<0.05，相对于HFD，图24)。在6周研究结束时对HOMA_IR的评估显示，与LFD小鼠相比，HFD小鼠显示出循环胰岛素增加约10倍(图25)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸单独处理HFD小鼠6周使HOMA_IR降低了约30％(图25)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸+淫羊藿苷处理HFD小鼠6周使HOMA_IR降低了约45％(p<0.03，相对于HFD，图25)。这些结果表明，支链氨基酸(例如游离亮氨酸)与PDE 5抑制剂的联合施用对糖尿病是长期保持在治疗上有效的，甚至在施用6周后在小鼠中也没有失去有效性。考虑到实验小鼠的预期寿命相对于人类的平均预期寿命，在小鼠中的这种有效性提示支链氨基酸(例如游离亮氨酸)与PDE5抑制剂的联合施用可保持在治疗上有效(例如针对糖尿病)四年或更久。

长期的高脂肪饮食与其他有害后果相关。例如，长期的高脂肪饮食可增加肝脏质量，很可能起因于肝脏内的脂肪积聚。长期的高脂肪进食还与慢性炎症相关，慢性炎症可引起许多疾病。为了确定亮氨酸或亮氨酸+淫羊藿苷施用对高脂肪进食的其他后果的影响，在6周研究结束时评估了所有实验组中的肝脏质量和C反应蛋白(一种炎症生物标志物)。6周研究结束时对肝脏质量的评估显示，与LFD小鼠相比，HFD小鼠显示出肝脏质量增加了约40％(p＝0.01，图26)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸单独处理HFD小鼠6周使肝脏质量降低了约10％(图26)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸+淫羊藿苷处理HFD小鼠6周使肝脏质量降低了约25％(p<0.01，相对于HFD，图26)。6周研究结束时对C反应蛋白的评估显示，与LFD小鼠相比，HFD小鼠显示出肝脏质量增加了约30％(图27)。与未处理的HFD小鼠相比，用亮氨酸+淫羊藿苷处理HFD小鼠6周使C反应蛋白水平降低了约20％(p<0.05，相对于HFD，图27)。

综合起来，这些数据表明了空腹和餐后葡萄糖、葡萄糖耐受和胰岛素敏感度响应于低剂量淫羊藿苷与亮氨酸组合的稳健改善。这些改善与抗糖尿病药物在该动物模型中的改善是相当的，表明了该组合的治疗潜力。此外，该组合引起肝脏质量和炎症生物标志物C反应蛋白的显著改善。

从上文应当可以理解，尽管已经示出和描述了特定实施方案，但仍可以对其做出各种修改，这些修改也是本文所设想到的。也并不打算由说明书中提供的具体实例来限制本发明。虽然本发明已参照前述说明书进行了描述，但本文优选的实施方案的描述和图示并不意味着以限制的意义来解释。此外，应当理解，本发明的所有方面都不限于本文提出的具体描述、构造或相对比例，其取决于多种条件和变量。对本发明的实施方案的形式和细节的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，可以预期，本发明还应当涵盖任何这样的修改、变化和等同方案。

Claims (10)

1.一种有效增强能量代谢的组合物，其包含：

a)磷酸二酯酶5(PDE 5)抑制剂；和

b)亮氨酸和/或亮氨酸代谢物。

2.如权利要求1所述的组合物，其中与向受试者单独施用组分(a)或组分(b)相比，该组合物更大程度地增强受试者的能量代谢。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述增强的能量代谢通过以下项目来度量：脂肪细胞的脂肪酸氧化提高至少约300％，脂肪细胞的葡萄糖利用提高至少150％，脂肪细胞的葡萄糖利用提高变化至少60％，或线粒体生物量提高至少约15％。

4.如权利要求2所述的组合物，其中所述增强的能量代谢通过以下项目来度量：餐后血糖降低至少20％，餐后胰岛素降低至少30％，空腹血糖降低至少40％，空腹胰岛素降低至少40％，对葡萄糖负荷的血糖应答降低至少15％，胰岛素耐受结果的两倍改善，或炎性应激降低至少20％。

5.如权利要求4所述的组合物，其中对葡萄糖负荷的血糖应答的降低由葡萄糖耐受曲线下面积来证明。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述PDE 5抑制剂是阿伐那非、伊地那非、米罗那非、西地那非、他达拉非、淫羊藿苷、伐地那非、乌地那非或扎普司特。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述PDE 5抑制剂是西地那非或淫羊藿苷。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述PDE 5抑制剂是淫羊藿苷。

9.如权利要求1所述的组合物，其中组分(b)是HMB。

10.一种调节有需要的受试者的能量代谢的方法，其包括向该受试者施用如前述权利要求中任一项所述的组合物。