CN108265026B - 一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法，包括：1).将牙鲆雌鱼性腺组织剥去白膜剪碎、离心后得到的沉淀用组合酶液消化，所得细胞消化液经细胞筛网过滤、离心后重悬得到细胞悬液；其中，所述组合酶液中含有胰蛋白酶以及DNA酶Ⅰ；2).将生理渗透压的Percoll液配制成不同浓度梯度，用制备好的每级Percoll梯度液按照密度从高到低逐层轻轻沿着管壁流入离心管中制备成Percoll梯度液，将所述细胞悬液置于梯度最上层；离心后吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞。本发明所提供的方法易于操作，整个操作可控，采用上述方法能够成功分离出牙鲆卵原细胞，卵原细胞占比在80％以上，纯化前后卵原细胞的数量损失不大。

Description

一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生殖生物学及生物技术领域，具体而言，涉及一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法。

背景技术

在大多数物种中，原始生殖细胞、精原细胞和卵原细胞已经被证明是具有自我更新且产生功能性配子的干细胞。其中，在具有大量产卵生殖策略的无脊椎动物和有脊椎动物中，卵原细胞是存在于雌性动物卵巢中的祖细胞，执行着干细胞的功能，在动物的整个育龄期确保持续地产生卵母细胞，最终形成卵子。

近年来，生殖细胞移植技术(Germ cell transplantation，GCT)已在水产养殖和濒危物种保护方面得到广泛的应用，均获得了源自供体的功能配子或后代。一般地多采用原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)、精原细胞(Spermatogonial，SG)和卵原细胞(oogonia，OG)进行生殖细胞移植。其中，斑马鱼和银汉鱼的卵原细胞已经被证明移植成功。然而，牙鲆的卵原细胞移植尚未见报道。而如何获得高比例和高数量的卵原细胞则是牙鲆卵原细胞移植成功的最为关键的一个环节。另外，牙鲆卵原细胞是雌鱼成体干细胞中唯一与下一代遗传背景密切相关的细胞，其日益成为研究牙鲆基因学者关注的对象。因此，需要可靠的方法来鉴定和分离纯化牙鲆卵原细胞，以便获取高比例且足够数量的卵原细胞用于开展其他实验研究

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法，包括：

1).将牙鲆雌鱼性腺组织剥去白膜剪碎、离心后得到的沉淀用组合酶液消化，所得细胞消化液经细胞筛网过滤、离心后重悬得到细胞悬液；

其中，所述组合酶液中含有0.20％～0.30％胰蛋白酶以及0.050％～0.060％DNA酶Ⅰ；

2).将生理渗透压的Percoll液配制成15％～25％、30％～40％、45％～55％浓度梯度，将制备好的每级Percoll梯度液按照密度从高到低逐层轻轻沿着管壁流入离心管中制备成Percoll梯度液，将所述细胞悬液置于梯度最上层，每层梯度及所述细胞悬液的量均为1.4ml～2.5ml；

180G～220G离心20min～40min后，吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞。

本发明所提供的方法对于本领域技术人员而言易于操作，所需试剂盒器械都是生物学领域常用的试剂和器械。且本发明规范了操作中的详细参数，使得整个操作可控，采用上述方法能够成功分离出牙鲆卵原细胞，制备得到的卵原细胞占比在80％以上，且纯化前后卵原细胞的数量损失不大。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中牙鲆卵巢组织切片及Vasa在卵巢的定位结果；A.牙鲆卵巢组织切片图(H-E染色)；B.Vasa在卵巢中免疫荧光定位图；箭头表示初级卵母细胞；虚线圈起来的区域为卵原细胞或卵原细胞簇；

图2为本发明一个实施例中细胞普通光学观察(A)及Vasa在雌性生殖细胞中定位图(B)；BC，表示血细胞；DC，表示死细胞；OC，表示卵母细胞；OG表示卵原细胞；SC，表示支持细胞；

图3为本发明一个实施例中卵原细胞纯化结果；箭头表示卵原细胞。

具体实施方式

本发明涉及一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法，包括：

1).将牙鲆雌鱼性腺组织剥去白膜剪碎、离心后得到的沉淀用组合酶液消化，所得细胞消化液经细胞筛网过滤、离心后重悬得到细胞悬液；

其中，所述组合酶液中含有0.20％～0.30％胰蛋白酶以及0.050％～0.060％DNA酶Ⅰ；

2).将生理渗透压的Percoll液配制成15％～25％、30％～40％、45％～55％浓度梯度，用制备好的每级Percoll梯度液按照密度从高到低逐层轻轻沿着管壁流入离心管中制备成Percoll梯度液，将所述细胞悬液置于梯度最上层，每层梯度及所述细胞悬液的量均为1.4ml～2.5ml；

180G～220G离心20min～40min后，吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞；

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，所述组合酶液中含有0.25％胰蛋白酶以及0.055％DNA酶Ⅰ；

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤2)中，将生理渗透压的Percoll液配制成17％～23％、32％～38％、47％～53％浓度梯度，更优选为20％、35％、50％浓度梯度，将制备好的每级Percoll梯度液按照密度从高到低逐层轻轻沿着管壁流入离心管中制备成Percoll梯度液，将所述细胞悬液置于梯度最上层；

200G离心30min后，吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤1)中，所述牙鲆雌鱼性腺组织与所述组合酶液的固液比为60mg～140mg：1ml；

更优选为80mg～120mg：1ml；更优选为100mg：1ml。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤1)中，所述消化的条件为：22℃～28℃消化2h～4h；

更优选的，所述消化的条件为：24℃～26℃消化2.5h～3.5h。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤1)中，所述组合酶液所用溶剂为含有3％～8％胎牛血清的培养基。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，所述培养基为L-15培养基。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤1)中，所述牙鲆雌鱼为15～20月龄；更优选为17～19月龄。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤1)中，所述剪碎具体为剪碎至0.3cm³～0.7cm³

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤1)中，所述离心为：

300～400G离心力离心5min～10min。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤1)中，还包括：

将所述牙鲆雌鱼性腺组织进行石蜡切片，分别做H-E染色和免疫荧光以鉴定卵原细胞；

所述免疫荧光所染色对象包括：Vasa蛋白。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，在步骤2)后，还包括：

将吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞固定后涂片，做免疫荧光以鉴定卵原细胞；

所述免疫荧光所染色对象包括：Vasa蛋白。

优选的，如上所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，所述免疫荧光的方法中一抗的浓度和孵育时间为：

αVasa 1:400～600，2℃～6℃孵育8h～16h。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

本实施例提供了一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法。

①实验用鱼

选取18月龄牙鲆雌鱼4尾，测量全长、体重后断脊柱放血，待血流干后，采集卵巢组织称重，并用PBS(pH 7.2)冲洗一遍后剪取0.5cm³左右性腺组织用波恩试液固定。固定24h后更换至70％酒精中保存备用。统计18月龄牙鲆生长情况见表1。

表1 18月龄牙鲆生长情况

②牙鲆Vasa抗体(αVasa)设计及生产

通过牙鲆Vasa蛋白序列(GenBank序列号：XP_019957862.1)1～204aa作为抗原序列，构建质粒，表达纯化蛋白制备抗原用于制备牙鲆Vasa兔多克隆抗体(杭州华安生物技术有限公司制备)。

③组织学及免疫荧光分析

对性腺组织样进行常规石蜡连续切片，切片厚度5μm。部分切片进行苏木素-伊红(H-E)染色，中性树胶封片，用3D Histech数字切片扫描分析系统(型号Pannoramic MIDI)进行扫描观察。部分切片进行免疫荧光分析。切片脱蜡复水，抗原修复，3％过氧化氢溶液室温孵育25min阻断内源性过氧化物酶，BSA封闭，加入一抗：αVasa(1:500)4℃孵育过夜，第二天洗涤甩干切片加入羊抗兔荧光二抗(谷歌生物，GB21303，1:300，阳性红光)，DAPI染液(谷歌生物，G1012，1:500)复染细胞核，最后脱水封片，全组织切片扫描观察。

④卵原细胞分离方法

分离方法做4个重复。每个重复称取300mg卵巢组织放入含有1ml PBS的凹面皿中，剥离卵巢薄膜、剪碎组织。将含有剪碎的组织PBS溶液转移至15ml离心管中，采用300G离心力，离心5min，去除上清液，加入3ml酶消化工作液，每隔半小时吹打1次。酶消化工作液包括：0.25％胰蛋白酶(worthington公司，LS004454)，0.055％DNA酶Ⅰ(sigma公司，11284932001)，5％胎牛血清(Gibco公司，16000-044)，溶剂为L-15培养基。25℃下消化3小时后，依次过滤孔径100μm、40μm细胞筛网，300G离心5min，用L-15培养基清洗两次，将细胞悬浮于1.5ml L-15培养基(含有5％胎牛血清)中待用，并用台盼蓝染色，计算活细胞数量。

⑤Percoll密度梯度离心纯化及细胞免疫荧光分析

做3个重复，每个重复按照如下步骤进行。

Percoll密度梯度离心纯化方法

a.按照1.5M NaCl：percoll＝1：9比例将Percoll原液配制成生理渗透压。

b.用生理盐水将已达到生理渗透压的Percoll液配制成20％、35％、50％浓度梯度各1.5ml待用。

c.用1ml小牛血清湿润15ml离心管，除去多余血清，再用移液枪将制备好的每级Percoll梯度液按照密度从高到低逐层轻轻沿着管壁流入离心管中制备成Percoll梯度液。

d.将待纯化的1.5ml细胞悬液置于梯度最上层，200G离心30min后，将各级细胞带小心移出，清洗两次，浓缩至不同的容积，吹打均匀，取10μl台盼蓝染色，计算活细胞量，显微拍照。

细胞免疫荧光分析步骤

e.细胞固定：用4％的多聚甲醛溶液固定细胞24小时，PBS清洗3次，对纯化前细胞和纯化后最上面两个细胞带分别涂片。

f.涂片干后，加入100μL破膜液(谷歌生物，G1204)，室温孵育10min进行细胞破膜，然后按照上述切片免疫荧光步骤，加一抗、二抗、DAPI复染细胞核、封片、扫描观察。

g.结合卵原细胞形态学特征和vasa基因在生殖细胞中的特异表达分析，统计纯化前后卵原细胞量及卵原细胞占比。

实验结果

①卵原细胞鉴定分析效果

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)细胞直径范围为10-12μm，细胞核直径范围为6-10μm，有1-2个致密核仁，并且具有特征性的亚细胞结构-生殖质颗粒。而牙鲆卵原细胞与原始生殖细胞形态学上十分相似，呈圆形或椭圆形，核质比较高(细胞直径范围为6.3-12.8μm，平均值为8.9±1.3μm；细胞核直径范围为5.0-10.6μm，平均值为7.4±1.2μm)，显著大于周围的体系细胞，不过小于卵母细胞，是牙鲆卵巢组织中最小的生殖细胞。其一般位于卵巢上皮基底膜沿着产卵板成簇状分布(见图1-A)。vasa基因是DEAD-box家族成员之一，是生殖系细胞特异基因。牙鲆vasa基因在牙鲆雌性卵巢中的卵原细胞和卵母细胞中表达(见图1-B)，不在其他体系细胞中表达。所以，通过细胞形态学和Vasa在卵巢中的定位分析很容易鉴定出牙鲆卵原细胞。

②卵原细胞分离效果分析

经过组合酶消化处理、过滤和清洗，最终得到18月龄牙鲆卵巢单细胞悬液。平均细胞存活率为93.0％±6.9％。结合卵原细胞形态学特征和vasa基因在生殖细胞中的特异表达分析(见图2)，统计获得纯化前18月龄牙鲆平均卵原细胞占比为53.2％±4.9％，平均每毫克卵巢组织含有卵原细胞量为3.4±0.7万个，平均每尾牙鲆含有卵原细胞量为1.3±0.8亿个。

通过percoll密度梯度离心纯化后，获得4个细胞带，从上向下分别为A、B、C、D四层，将各层细胞带小心吸出，清洗2次，进行普通光学观察和细胞免疫荧光分析(见图3)。根据卵原细胞的形态学特征和vasa基因在生殖细胞中的特异表达分析，A、B细胞带主要为卵原细胞和少量的支持细胞。A、B细胞带平均卵原细胞占比分别为87.0％±6.9％，84.7％±8.3％，均显著高于纯化前卵原细胞占比(P<0.05)。C细胞带主要为卵母细胞，D细胞带主要为血细胞及杂质。虽然纯化后平均每毫克卵巢组织获得的卵原细胞量为1.9±1.0万个，显著低于纯化前(P<0.05)，但纯化后平均每尾鱼获得的卵原细胞量为0.7±0.3亿个，与纯化前无显著性差异(P>0.05)。因此，通过本发明方法能获得高比例且高数量的牙鲆卵原细胞。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法，包括：

1）. 将牙鲆雌鱼性腺组织剥去白膜剪碎、离心后得到的沉淀用组合酶液消化，所得细胞消化液经细胞筛网过滤、离心后重悬得到细胞悬液；

其中，所述组合酶液中含有0.20%~0.30%胰蛋白酶以及0.050%~0.060% DNA酶Ⅰ；

2）. 将生理渗透压的Percoll液配制成15%~25%、30%~40%、45%~55%浓度梯度，用制备好的每级Percoll 梯度液按照密度从高到低逐层轻轻沿着管壁流入离心管中制备成Percoll梯度液，将所述细胞悬液置于梯度最上层，每层梯度及所述细胞悬液的量均为1.4ml ~2.5ml；

180G~220G离心20min~40min后，吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞。

2.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述牙鲆雌鱼性腺组织与所述组合酶液的固液比为60mg~140mg：1ml。

3.根据权利要求2所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述消化的条件为：22℃~28℃消化2h~4h。

4.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述组合酶液所用溶剂为含有3%~8% 胎牛血清的培养基。

5.根据权利要求4所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，所述培养基为L-15培养基。

6.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述牙鲆雌鱼为15~20月龄。

7.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述离心为：

300G~400G离心力离心5min~10min。

8.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，还包括：

将所述牙鲆雌鱼性腺组织进行石蜡切片，分别做H-E染色和免疫荧光以鉴定卵原细胞；

所述免疫荧光所染色对象包括：Vasa蛋白。

9.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤2）后，还包括：

将吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞固定后涂片，做免疫荧光以鉴定卵原细胞；

所述免疫荧光所染色对象包括：Vasa蛋白。

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