CN108251450B - 原位过量表达载体pGV64及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种原位过量表达载体pGV64及应用，属于基因工程领域，利用Omega序列，4×VP16，GAL4等不同元件的有效组合，将基因表达转化为转录因子激活来实施，通过引入基因自身启动子驱动反式作用因子GAL4‑BD融合VP64的表达，进而促进基因自身表达水平，增强了基因在原位水平的表达程度。该原位过量表达载体pGV64，包括pCAMBIA3301载体以及顺式连接的下述功能元件：OMega，序列如SEQ ID No:1所示；Kozak，序列如SEQ ID No:2所示；3×Flag，序列如SEQ ID No:3所示；GAL4‑BD，序列如SEQ ID No:4所示；NLS，序列如SEQ ID No:5所示；VP64，序列如SEQ ID No:6所示；Nos‑Terminal‑5XUAS，序列如SEQ ID No:7所示；minimal 35S，序列如SEQ ID No:8所示；4×MYC，序列如SEQ ID No:9。

Description

原位过量表达载体pGV64及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种原位过量表达载体pGV64及应用。

背景技术

过量表达即通过一些技术使被研究基因在表达量上明显提升的技术，作为一种研究手段过表达在基因功能分析过程中具有重要应用。目前，植物基因功能研究中，通常利用组成型启动子驱动基因过表达，如烟草花叶病毒CaMV 35S，玉米泛素蛋白启动子ubi，植物管家基因启动子actin等。该类启动子具有表达量高的特点，但组成型启动子的缺点是无法控制基因表达的位置，使得过量表达的基因在组织特异性上没有选择性，造成基因的异位表达，而这种异位表达的结果是过表达基因在不该表达的地方表达了，进而产生一些假的表型。这种缺陷在植物家族基因研究中尤为突出，如模式植物拟南芥CLE家族有30多个成员，他们在序列上极为相似。利用35S驱动的过量表达会造成不同CLE成员产生相似的表型，但研究表明CLE家族成员在组织特性性表达上明显有差异，因此，研究认为CLE家族成员的功能执行可能与它们的表达位置相关。

随着植物基因工程的发展，逐步发展起了诱导型启动子驱动基因表达，这类启动子可以根据需要，人为设计在植物的特定发育阶段，特定条件下表达基因，通过化学或者物理因素来使基因能够产生开和关的模式，与组成型启动子相比，诱导型启动子具有精准调控的优势，目前正被广泛应用。但这类启动子还是不能使基因在其本位表达，通常只是调控了基因表达的时间，表达的方式；没法在基因表达空间上进行干预，还是不能精确反映基因的准确功能。因此，用特异性启动子驱动基因过表达显得尤为重要。通过构建自身启动子驱动基因表达可以使基因在原位水平表达，但这种表达方式在表达程度上明显依赖于基因启动子的表达强弱。

综合以上，现阶段既能够过量表达又能在原位表达的研究至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原位过量表达载体pGV64及应用，利用Omega序列，4×VP16，GAL4等不同元件的有效组合，将基因表达转化为转录因子激活来实施，通过引入基因自身启动子驱动反式作用因子GAL4-BD融合VP64的表达，进而促进基因自身表达水平，增强了基因在原位水平的表达程度。

本发明一方面提供了一种原位过量表达载体pGV64，包括pCAMBIA3301载体以及顺式连接的下述功能元件：

OMega，序列如SEQ ID No:1所示；Kozak，序列如SEQ ID No:2所示；3×Flag，序列如SEQ ID No:3所示；GAL4-BD，序列如SEQ ID No:4所示；NLS，序列如SEQ ID No:5所示；VP64，序列如SEQ ID No:6所示；Nos-Terminal-5XUAS，序列如SEQ ID No:7所示；minimal35S，序列如SEQ ID No:8所示；4×MYC，序列如SEQ ID No:9。

进一步的，所述原位过量表达载体pGV64包括合成的含有上述功能元件的核苷酸序列GV64，如SEQ ID No:10所示，长度为1389bp；所述GV64核苷酸序列两端含有SacⅠ和BglⅡ酶切位点。

进一步的，所述原位过量表达载体pGV64的核苷酸序列如SEQ IDNo:11所示，长度为11876bp。

本发明另一方面提供了上述原位过量表达载体pGV64的制备方法，包括以下步骤：合成含有核苷酸序列GV64的T载体，核苷酸序列GV64两端含有SacⅠ和BglⅡ酶切位点，将上述T载体和pCAMBIA3301载体分别用SacⅠ和BglⅡ双酶切，酶切后的片段在T4连接酶的催化下连接后得载体pGV64。

本发明再一方面提供了上述原位过量表达载体pGV64在调控拟南芥基因原位过量表达中的应用。

进一步的，上述原位过量表达载体pGV64的在调控拟南芥基因原位过量表达中的应用，具体步骤包括：扩增目的基因启动子片段，将目的基因启动子片段连接入pGV64载体；用目的基因开放阅读框替换pGV64载体中的GUS基因；连接载体转化入农杆菌，阳性农杆菌浸染拟南芥，筛选拟南芥阳性苗。

本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明的原位过量表达载体使用方便，效率高，其形成的原位过表达系统在植物中可以高效工作，原位过量表达目的基因，并能够产生表型；

(2)本发明的原位过量表达载体形成的原位过量表达系统可以有效避免功能冗余基因研究中的异位过表达产生的假表型现象，在植物基因尤其是基因家族的功能研究中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的pCAMBIA3301载体示意图；

图2a为本发明实施例所提供的纯化后的带有粘性末端的足量GV64片段和pCAMBIA3301空载体片段的电泳图；

图2b为本发明实施例所提供的pGV64载体片段的电泳图；

图3为本发明实施例所提供的pGV64载体示意图；

图4为本发明实施例2的GUS基因表达分析结果图；

图5为本发明实施例3的转基因阳性苗中IDA基因表达量结果图；

图6为本发明实施例3的原位过量表达IDA基因的表型分析图；

图7为本发明实施例4的将CLE14开放阅读框替换掉pGV64载体中的GUS区域的简单示意图；

图8为本发明实施例4的转基因阳性苗中CLE14表达量结果图；

图9为本发明实施例4的原位过量表达CLE14基因的表型分析图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一实施例提供了一种原位过量表达载体pGV64，包括pCAMBIA3301载体以及顺式连接的下述功能元件：

OMega，序列如SEQ ID No:1所示；Kozak，序列如SEQ ID No:2所示；3×Flag，序列如SEQ ID No:3所示；GAL4-BD，序列如SEQ ID No:4所示；NLS，序列如SEQ ID No:5所示；VP64，序列如SEQ ID No:6所示；Nos-Terminal-5XUAS，序列如SEQ ID No:7所示；minimal35S，序列如SEQ ID No:8所示；4×MYC，序列如SEQ ID No:9。本实施中，利用OMega，VP64，GAL4-BD等不同元件的有效组合，将基因表达转化为转录因子激活来实施，通过引入基因自身启动子驱动反式作用因子GAL4-BD融合VP64的表达，进而促进基因自身表达水平，增强了基因在原位水平的表达程度。

在一优选的实施例中，所述原位过量表达载体pGV64包括合成的含有上述功能元件的核苷酸序列GV64，如SEQ ID No:10所示，长度为1389bp；所述GV64核苷酸序列两端含有SacⅠ和BglⅡ酶切位点。

在一优选的实施例中，所述原位过量表达载体pGV64的核苷酸序列如SEQ ID No:11所示，长度为11876bp。

本发明的另一实施例提供了上述原位过量表达载体pGV64的制备方法，包括以下步骤：合成含有核苷酸序列GV64的T载体，核苷酸序列GV64两端含有SacⅠ和BglⅡ酶切位点，将上述T载体和pCAMBIA3301载体分别用SacⅠ和BglⅡ双酶切，酶切后的片段在T4连接酶的催化下连接后得载体pGV64。

本发明的再一实施例提供了上述原位过量表达载体pGV64在调控拟南芥基因原位过量表达中的应用。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的原位过量表达载体pGV64及应用，以下将结合具体实施例进行说明。

实施例1载体pGV64的构建

(1)利用基因合成技术合成GV64-T，T载体上连接包含有上述功能性元件的核苷酸序列GV64(两端含有SacI和BgIII限制性内切酶位点)，GV64序列如SEQ ID No:10所示，大小为1389bp。

(2)SacⅠ和BglⅡ酶切：

分别利用SacⅠ和BglⅡ双酶切GV64-T(100ng/μL)与pCAMBIA3301(100ng/μL)载体，方法为：

建立酶切体系(100μL)：

名称	加入量
		SacⅠ(BglⅡ)	2.4μL
载体	15μL
		10×NEB buffer	10μL
超纯水	补齐至100μL

37℃反应3小时。

pCAMBIA3301载体示意图参见图1。

反应结束后，1.2％琼脂糖凝胶电泳，并利用胶回收试剂盒(全式金生物科技有限公司)切胶回收，获得纯化后的带有粘性末端的足量GV64片段和pCAMBIA3301空载体，电泳图参见图2a。

(3)连接反应并转化大肠杆菌

利用T4连接酶(NEB公司)，将纯化后的GV64片段与pCAMBIA3301载体进行连接，连接体系为：

名称	加入量
		T4连接酶	1μL
10×连接酶缓冲液	2μL
		GV64片段	6μL
pCAMBIA3301载体	8μL
		超纯水	补齐20μL

反应条件为4℃，过夜(16小时)。

待反应结束后，取5μL反应液利用热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ，方法为：5μL反应液加入50μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入500μL无抗生素的LB培养基，37℃条件下，摇床设定200rpm，复苏1h，并将菌液涂布到含有卡那霉素抗生素(50μg/mL卡那霉素)的LB固体培养基上，37℃过夜培养(约生长16h)；

(4)阳性鉴定

由于新连接成功后的pCAMBIA3301载体上具有抗卡那霉素的基因，转入质粒成功的阳性菌能够在加有卡那霉素的LB固体培养基上生长；提取单菌落送去测序公司测序，大小为11876bp。待测序比对正确后，提取质粒，命名为pGV64，阳性鉴定的电泳图参见图2b，质粒示意图参见图3。

实施例2原位过量表达载体pGV64的功能验证

一、构建proIDA-pGV64载体

(1)扩增IDA基因启动子序列

取生长20天拟南芥col，取叶片提取基因组DNA，以此为模板，扩增引物序列如下：

GV64_PROMOTER_IDAF:ATGATTACGAATTCGAGCTCAACCCTCGTTCTGAATCAAAGGGT；

GV64_PROMOTER_IDAR:CCTCAGATCTGGATCCTTGGTAGTCAATGTTTTTTTTCTTCTC；

设定扩增程序，利用PCR仪扩增目的片段：95℃3min，(95℃30s，56℃30s，72℃1min30s)32个循环，72℃10min，25℃保温；

对PCR产物凝胶电泳并切胶回收(利用全式金公司试剂盒)，获得纯化后的IDA启动子片段。

(2)利用infusion酶系统将IDA启动子片段连入pGV64载体

利用infusion重组酶系统将IDA启动子片段连接入pGV64的SacI单酶切位点处，方法为：利用SacI单酶切pGV64载体，并利用胶回收试剂盒纯化载体片段，至少保证酶切纯化后的载体浓度不低于80ng/μL，按照infusion酶体系进行连接反应：

名称	加入量
		infusion酶	1μL
5×缓冲液	2μL
		IDA启动子片段	4μL
pGV64载体	3μL

反应条件为：50℃，15min。

待反应结束后，取1.5μL反应液于50μL大肠杆菌感受态DH5α，冰浴20min，42℃热击90s，冰浴2min，加入600μL无抗生素的LB培养基，37℃条件下，摇床设定180rpm，复苏50min，并将菌液涂布到含有卡那霉素抗生素(50μg/mL卡那霉素)的LB固体培养基上，37℃过夜培养(约生长16h)；直至长出菌斑，挑取单菌落；利用克隆引物，进行菌落PCR阳性鉴定；选取阳性菌斑，加入2mL LB液体培养基，扩繁菌斑，测序，选择测序正确的阳性菌斑，提取质粒，并命名为proIDA-pGV64。

(3)利用infusion酶系统建立体系对照载体

利用infusion重组酶系统将IDA启动子连接入pGV64的SacⅠ和BamHⅠ双酶切位点处，方法为：利用SacⅠ和BamHⅠ双酶切pGV64载体，并利用胶回收试剂盒纯化载体片段，至少保证酶切纯化后的载体浓度不低于90ng/μL，按照infusion酶体系进行连接反应；

待反应结束后，取1.5μL反应液于50μL大肠杆菌感受态DH5ɑ，冰浴20min，42℃热击90s，冰浴2min，加入500μL无抗生素的LB培养基，37℃条件下，摇床设定200rpm，复苏1h，并将菌液涂布到含有卡那霉素抗生素(50μg/mL卡那霉素)的LB固体培养基上，37℃过夜培养(约生长16h)；直至长出菌斑，挑取单菌落，利用克隆引物，进行菌落PCR阳性鉴定；选取阳性菌斑，加入2mL LB液体培养基，扩繁菌斑，测序，选择测序正确的阳性菌斑，提取质粒，并命名为proIDA-GUS。

二、转基因阳性苗的获取和表达分析

(1)载体转化入农杆菌GV3101

构建好的上述重组质粒，采用液氮冻融转化法，转入农杆菌GV3101。

方法如下：

向感受态农杆菌GV3101中加入5μL重组质粒，混匀；冰浴20min，放入液氮中3min，迅速取出，37℃水浴3min；在超净工作台中，向感受态中加入700μL YEP液体培养基，置于28℃摇床中，200rpm培养3h；3000g离心3min，超净台中去掉上清，用移液枪吹打悬浮菌体；将菌液均匀涂布在YEP固体培养基(含利福平和卡那霉素)上，封口后倒置于28℃培养箱中，培养2-3天。

(2)拟南芥转化

用牙签挑取阳性农杆菌GV3101单菌斑，放入含2mL YEP培养基(含利福平和卡那霉素)的5mL离心管中，28℃摇床中240rpm培养过夜(约16-24h)；待菌液浑浊后，吸取1mL，转接到50mL YEP培养基(含利福平和卡那霉素)的250mL三角瓶中，28℃摇床中240rpm培养过夜(约16-24h)；分光光度计测量OD600值达到1.0左右即可开始侵染；

侵染方法为：50mL离心管收集菌液，4000g离心10min，弃上清，用侵染液(浓度为5％蔗糖，加入0.02％Silwet L-77)重悬菌体，测量侵染液的OD600值，0.8左右为最佳；将野生型拟南芥的主花序浸入侵染液中1min；待浸染完成后，用不透光的保鲜袋包裹植株，平放在暗处24h；然后，将拟南芥放到正常光照条件下培养，及时浇水。

(3)拟南芥阳性苗筛选

收获的T0代转基因种子37℃干燥一周左右，均匀地撒播在土壤表面，盖好盖子保持湿度，待幼苗生长10天左右，草甘膦喷洒幼苗，待一周后，喷洒第二遍草甘膦，由于转化的载体可表达抗草甘膦的基因，因此，少数转基因幼苗能正常生长，而非转基因幼苗变黄死去。之后，将生长正常的转基因幼苗移至新的小盆中，于正常光照条件下生长。

(4)GUS基因表达分析

通过荧光定量PCR分析GUS基因的表达量，结果参见图4，图4的验证表明本发明的原位过量表达载体能够在拟南芥中发挥过量表达的功能。

实施例3利用原位过量表达载体pGV64研究拟南芥IDA基因参与叶片衰老过程

一、构建proIDA-pGV64载体

步骤(1)-(2)同实施例2，

(3)将IDA开放阅读框替换掉proIDA-GUS载体中的GUS区域

以生长20天的野生型拟南芥cDNA为模板，加有接头的引物，

IDA-GV64F:CCTGCCCGGGGGATCCATGGCTCCGTGTCGTACGA

IDA-GV64R:CCTCAGATCTGGATCC ATGAGGAAGAGAGTTAACAAAA

扩增IDA开放阅读框，将扩增产物纯化回收(IDA-CDS)；利用限制性内切酶NcoⅠ和BglⅡ双酶切proIDA-GV64载体，将酶切产物回收大片段，利用infusion技术将IDA开放阅读框连接到proIDA-GV64中替换掉原有的GUS基因，方法为：

名称	加入量
		infusion酶	1μL
5×缓冲液	2μL
		IDA CDS	4μL
proIDA-pGV64	3μL

反应条件为：50℃，15min

待反应结束后，取1.5μL反应液于50μL大肠杆菌感受态DH5ɑ，冰浴20分钟，42℃热击90s，冰浴2min，加入600μL无抗生素的LB培养基，37℃条件下，摇床设定180rpm，复苏50min，并将菌液涂布到含有卡那霉素抗生素(50μg/mL卡那霉素)的LB固体培养基上，37℃过夜培养(约生长16h)；直至长出菌斑，挑取单菌落，利用克隆引物，进行菌落PCR阳性鉴定；选取阳性菌斑，加入2mL LB液体培养基，扩繁菌斑，测序，选择测序正确的阳性菌斑，提取质粒，并命名为IDA-GV64。

二、转基因阳性苗的获取和表达分析

步骤(1)-(3)同实施例2

(4)转基因阳性苗中IDA表达情况鉴定

利用qRT-PCR方法，鉴定IDA-GV64转基因拟南芥中IDA表达情况，参见图5，图5的结果表明，IDA-GV64转基因材料较野生型col0，IDA表达量较对照明显升高，说明原位表达系统进行了基因IDA的原位过量表达。

(5)原位过量表达IDA基因的表型分析

原位过量表达IDA后，持续光照条件下生长4周的转基因材料与对照相比，IDA原位过表达的植株明显有衰老表型，参见图6，图6的叶绿素含量结果表明，相同条件下，IDA原位过表达的叶绿素含量较野生型叶绿素含量明显下降，进一步说明通过IDA的原位过表达可以明显促进叶片衰老。

实施例4利用原位过量表达载体pGV64研究拟南芥CLE14基因参与叶片衰老过程

一、构建pro CLE14-pGV64载体

(1)扩增CLE14基因启动子序列

取生长20天拟南芥col，取叶片提取基因组DNA，以此为模板，扩增引物序列如下：

GV64_PROMOTER_CLE14F:ATGATTACGAATTCGAGCTCAAGTAATTTGACTATGTAAGTAC；

GV64_PROMOTER_CLE14R:CCTCAGATCTGGATCCTTTGTTTTGAATGTTTTCTCTC；

设定扩增程序，利用PCR仪扩增目的片段：95℃3min，(95℃30s，56℃30s，72℃2min20s)32个循环，72℃10min，25℃保温；

对PCR产物凝胶电泳并切胶回收(利用全式金公司试剂盒)，获得纯化后的CLE14启动子片段。

(2)利用infusion酶系统将CLE14启动子片段连入pGV64载体

利用infusion重组酶系统将CLE14启动子片段连接入pGV64的SacI单酶切位点处，方法为：利用SacI单酶切pGV64载体，并利用胶回收试剂盒纯化载体片段，至少保证酶切纯化后的载体浓度不低于80ng/μL，按照infusion酶体系进行连接反应：

名称	加入量
		infusion酶	1μL
5×缓冲液	2μL
		CLE14启动子片段	4μL
pGV64载体	3μL

反应条件为：50℃，15min。

待反应结束后，取1.5μL反应液于50μL大肠杆菌感受态DH5α，冰浴20min，42℃热击90s，冰浴2min，加入600μL无抗生素的LB培养基，37℃条件下，摇床设定180rpm，复苏50min，并将菌液涂布到含有卡那霉素抗生素(50μg/mL卡那霉素)的LB固体培养基上，37℃过夜培养(约生长16h)；直至长出菌斑，挑取单菌落；利用克隆引物，进行菌落PCR阳性鉴定；选取阳性菌斑，加入2mL LB液体培养基，扩繁菌斑，测序，选择测序正确的阳性菌斑，提取质粒，并命名为pro CLE14-pGV64。

(3)将CLE14开放阅读框替换掉pGV64载体中的GUS区域

以生长20天的野生型拟南芥cDNA为模板，加有接头的引物，

CLE14-GV64F:CCTGCCCGGGGGATCCATGAAAGTTTGGAGCCAAAG；

CLE14-GV64R:CCTCAGATCTGGATCCTCATTTGTTGTGAAGCGGGTT；

扩增CLE14开放阅读框，将扩增产物纯化回收(CLE14-CDS)；利用限制性内切酶NcoⅠ和BglⅡ双酶切proCLE14-GV64载体，将酶切产物回收大片段，利用infusion技术将CLE14开放阅读框连接到proCLE14-VP16中替换掉原有的GUS基因，方法为：

名称	加入量
		infusion酶	1μL
5×缓冲液	2μL
		CLE14 CDS	4μL
proCLE14-pGV64	3μL

反应条件为：50℃，15min。

待反应结束后，取1.5μL反应液于50μL大肠杆菌感受态DH5ɑ，冰浴20分钟，42℃热击90s，冰浴2min，加入600μL无抗生素的LB培养基，37℃条件下，摇床设定180rpm，复苏50min，并将菌液涂布到含有卡那霉素抗生素(50μg/mL卡那霉素)的LB固体培养基上，37℃过夜培养(约生长16h)；直至长出菌斑，挑取单菌落，利用克隆引物，进行菌落PCR阳性鉴定；选取阳性菌斑，加入2mL LB液体培养基，扩繁菌斑，并送去测序，选择测序正确的阳性菌斑，提取质粒，并命名为CLE14-GV64，简图如图7所示。

二、转基因阳性苗的获取和表达分析

步骤(1)-(3)同实施例2

(4)转基因阳性苗中CLE14表达情况鉴定

利用qRT-PCR方法，鉴定CLE14-GV64转基因拟南芥中CLE14表达情况，如图8所示，CLE14-GV64转基因材料中CLE14表达量较对照明显升高，说明原位过量表达系统进行了基因CLE14的原位过量表达。

(5)原位过量表达CLE14多肽的表型分析

对原位过量表达材料进行了表型分析，结果参见图9，发现CLE14原位过量表达能够明显抑制叶片衰老，图9的叶绿素测定中，转基因材料的叶绿素含量明显增加，进一步表明这种原位过量表达方法更能准确反映出该基因特异性的在叶片衰老过程中产生作用。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 原位过量表达载体pGV64及应用

<130> QP1180503

<141> 2018-03-27

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atttttacaa caattaccaa caacaacaaa caacaaacaa cattacaatt acatttacaa 60

ttacca 66

<210> 2

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccacc 6

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gattataaag acgatgacga taaagactac aaggatgacg atgacaagga ttacaaagat 60

gatgacgaca aa 72

<210> 4

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60

tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120

tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180

ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240

ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300

aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360

acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420

caaagacagt tgactgtatc gccggaattc ccg 453

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccccta agaagaagag aaaggtcggt attcacggcg ttcctgcggc g 51

<210> 6

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggacgcgc tggacgattt cgatctcgac atgctgggtt ctgatgccct cgatgacttt 60

gacctggata tgttgggaag cgacgcattg gatgactttg atctggacat gctcggctcc 120

gatgctctgg acgatttcga tctcgatatg tta 153

<210> 7

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggtgacag ccctccgacg ggtgacagcc ctccgacggg tgacagccct ccgacgggtg 60

acagccctcc gacgggtgac agccctccga cgggtgacag ccctccga 108

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agagga 46

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagcagaagc ttaattctga agaggatctg gaacagaaat tgaattcaga ggaggaccta 60

gagcaaaagt tgaactcgga ggaagacctg gaacaaaaac ttaattctga agaagatctg 120

<210> 10

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagctcattt ttacaacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt acaattacat 60

ttacaattac cagccaccat ggattataaa gacgatgacg ataaagacta caaggatgac 120

gatgacaagg attacaaaga tgatgacgac aaaaagctac tgtcttctat cgaacaagca 180

tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag 240

tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact 300

agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg ctagaaagac tggaacagct atttctactg 360

atttttcctc gagaagacct tgacatgatt ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa 420

gcattgttaa caggattatt tgtacaagat aatgtgaata aagatgccgt cacagataga 480

ttggcttcag tggagactga tatgcctcta acattgagac agcatagaat aagtgcgaca 540

tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt caaagacagt tgactgtatc gccggaattc 600

ccgaagcttg cccctaagaa gaagagaaag gtcggtattc acggcgttcc tgcggcgtct 660

agaagtgctc ctggtactcc tgacgcgctg gacgatttcg atctcgacat gctgggttct 720

gatgccctcg atgactttga cctggatatg ttgggaagcg acgcattgga tgactttgat 780

ctggacatgc tcggctccga tgctctggac gatttcgatc tcgatatgtt agttcaaaca 840

tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat 900

aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta 960

tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca 1020

aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc 1080

gggaattccg ggtgacagcc ctccgacggg tgacagccct ccgacgggtg acagccctcc 1140

gacgggtgac agccctccga cgggtgacag ccctccgacg ggtgacagcc ctccgacaag 1200

acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gagccaccat ggagcagaaa 1260

cttaattctg aagaggatct ggaacagaaa ttgaattcag aggaggacct agagcaaaag 1320

ttgaactcgg aggaagacct ggaacaaaaa cttaattctg aagaagacct gcccggggga 1380

tccagatct 1389

<210> 11

<211> 11876

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagctcattt ttacaacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt acaattacat 60

ttacaattac cagccaccat ggattataaa gacgatgacg ataaagacta caaggatgac 120

gatgacaagg attacaaaga tgatgacgac aaaaagctac tgtcttctat cgaacaagca 180

tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag 240

tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact 300

agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg ctagaaagac tggaacagct atttctactg 360

atttttcctc gagaagacct tgacatgatt ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa 420

gcattgttaa caggattatt tgtacaagat aatgtgaata aagatgccgt cacagataga 480

ttggcttcag tggagactga tatgcctcta acattgagac agcatagaat aagtgcgaca 540

tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt caaagacagt tgactgtatc gccggaattc 600

ccgaagcttg cccctaagaa gaagagaaag gtcggtattc acggcgttcc tgcggcgtct 660

agaagtgctc ctggtactcc tgacgcgctg gacgatttcg atctcgacat gctgggttct 720

gatgccctcg atgactttga cctggatatg ttgggaagcg acgcattgga tgactttgat 780

ctggacatgc tcggctccga tgctctggac gatttcgatc tcgatatgtt agttcaaaca 840

tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat 900

aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta 960

tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca 1020

aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc 1080

gggaattccg ggtgacagcc ctccgacggg tgacagccct ccgacgggtg acagccctcc 1140

gacgggtgac agccctccga cgggtgacag ccctccgacg ggtgacagcc ctccgacaag 1200

acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gagccaccat ggagcagaaa 1260

cttaattctg aagaggatct ggaacagaaa ttgaattcag aggaggacct agagcaaaag 1320

ttgaactcgg aggaagacct ggaacaaaaa cttaattctg aagaagacct gcccggggga 1380

tccagatctg agggtaaatt tctagttttt ctccttcatt ttcttggtta ggaccctttt 1440

ctctttttat ttttttgagc tttgatcttt ctttaaactg atctattttt taattgattg 1500

gttatggtgt aaatattaca tagctttaac tgataatctg attactttat ttcgtgtgtc 1560

tatgatgatg atgatagtta cagaaccgac gactcgtccg tcctgtagaa cgtgaaatca 1620

aaaaactcga cggcctgtgg gcattcagtc tggatcgcga aaactgtgga attgatcagc 1680

gttggtggga aagcgcgtta caagaaagcc gggcaattgc tgtgccaggc agttttaacg 1740

atcagttcgc cgatgcagat attcgtaatt atgcgggcaa cgtctggtat cagcgcgaag 1800

tctttatacc gaaaggttgg gcaggccagc gtatcgtgct gcgtttcgat gcggtcactc 1860

attacggcaa agtgtgggtc aataatcagg aagtgatgga gcatcagggc ggctatacgc 1920

catttgaagc cgatgtcacg ccgtatgtta ttgccgggaa aagtgtacgt atcaccgttt 1980

gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg aatggtgatt accgacgaaa 2040

acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa ctatgccgga atccatcgca 2100

gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga tatcaccgtg gtgacgcatg 2160

tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat ggtgatgtca 2220

gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc actagcggga 2280

ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga aggttatctc tatgaactgt 2340

gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc ggcatccggt 2400

cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa accgttctac tttactggct 2460

ttggtcgtca tgaagatgcg gacttacgtg gcaaaggatt cgataacgtg ctgatggtgc 2520

acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta ccgtacctcg cattaccctt 2580

acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat cgtggtgatt gatgaaactg 2640

ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac aagccgaaag 2700

aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta caggcgatta 2760

aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt attgccaacg 2820

aaccggatac ccgtccgcaa gtgcacggga atatttcgcc actggcggaa gcaacgcgta 2880

aactcgaccc gacgcgtccg atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg 2940

ataccatcag cgatctcttt gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc 3000

aaagcggcga tttggaaacg gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg 3060

agaaactgca tcagccgatt atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc 3120

actcaatgta caccgacatg tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc 3180

accgcgtctt tgatcgcgtc agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt 3240

ttgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg 3300

accgcaaacc gaagtcggcg gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg 3360

gtgaaaaacc gcagcaggga ggcaaacaag ctagccacca ccaccaccac cacgtgtgaa 3420

ttacaggtga ccagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 3480

agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 3540

aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 3600

agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 3660

gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gggaattaaa ctatcagtgt 3720

ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag cgtttattag aataacggat 3780

atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca 3840

gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg 3900

cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac 3960

gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat 4020

aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc 4080

tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag gacttgacca accaacgggc 4140

cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg 4200

cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt 4260

gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat 4320

ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc 4380

ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat 4440

catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc 4500

ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg 4560

ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc 4620

acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga 4680

ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca 4740

agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag 4800

gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg 4860

ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg 4920

gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc 4980

ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg 5040

aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg 5100

caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg 5160

atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg 5220

tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg 5280

tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg 5340

acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat atgggccacc gccgacctgg 5400

tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg 5460

tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt 5520

acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg 5580

ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg 5640

cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag 5700

caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac 5760

gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga 5820

ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct 5880

atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa 5940

ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg 6000

aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc 6060

ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc ggcgtgacgg tcgcaaacca 6120

tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc 6180

gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa 6240

gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg 6300

attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat gctctatgac 6360

gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt 6420

gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc 6480

gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc 6540

catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg 6600

ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag 6660

aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt 6720

acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc cttgattagc 6780

cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat cgagctagct 6840

gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc 6900

gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc 6960

gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc 7020

ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg 7080

gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc 7140

aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa 7200

attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa ggtctctttc ctgtggatag cacgtacatt 7260

gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac 7320

attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc 7380

gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg 7440

tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc 7500

ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc 7560

ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg 7620

cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 7680

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 7740

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 7800

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 7860

gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 7920

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 7980

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 8040

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 8100

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 8160

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 8220

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 8280

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 8340

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 8400

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 8460

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 8520

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 8580

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 8640

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 8700

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 8760

ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc 8820

tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg 8880

atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg 8940

cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct 9000

cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca 9060

tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg 9120

gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta 9180

tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg 9240

ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc 9300

tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca 9360

ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc 9420

cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta 9480

tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt 9540

tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac 9600

agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc 9660

ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg 9720

cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc 9780

tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg 9840

cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac 9900

aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt 9960

tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt 10020

aaacaaattg acgcttagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat 10080

taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat tttagtactg gattttggtt ttaggaatta 10140

gaaattttat tgatagaagt attttacaaa tacaaataca tactaagggt ttcttatatg 10200

ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc ttatctggga actactcaca 10260

cattattatg gagaaactcg agtcaaatct cggtgacggg caggaccgga cggggcggta 10320

ccggcaggct gaagtccagc tgccagaaac ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc 10380

cggccgcccg cagcatgccg cggggggcat atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg 10440

ggtcgttggg cagcccgatg acagcgacca cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact 10500

tcagcaggtg ggtgtagagc gtggagccca gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt 10560

acacggtcga ctcggccgtc cagtcgtagg cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg 10620

cgatgccggc gacctcgccg tccacctcgg cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac 10680

ggacgaggtc gtccgtccac tcctgcggtt cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc 10740

ttgtctcgat gtagtggttg acgatggtgc agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac 10800

ggcggatgtc ggccgggcgt cgttctgggc tcatggtaga ctcgagagag atagatttgt 10860

agagagagac tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga 10920

ggaaggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca 10980

catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc 11040

gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttgaac gatagccttt 11100

cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg 11160

aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga 11220

aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt tgatattctt ggagtagacg 11280

agagtgtcgt gctccaccat gttatcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga 11340

acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg 11400

gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca 11460

ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg 11520

aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact 11580

gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt ggcaagctgc 11640

tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 11700

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 11760

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 11820

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattc 11876

Claims (1)

1.原位过量表达载体 pGV64 在调控拟南芥基因原位过量表达中的应用，其特征在于，具体步骤包括：扩增目的基因启动子片段，将目的基因启动子片段连接入 pGV64 载体；用目的基因开放阅读框替换 pGV64 载体中的 GUS 基因；连接载体转化入农杆菌，阳性农杆菌浸染拟南芥，筛选拟南芥阳性苗；

所述原位过量表达载体 pGV64 的核苷酸序列如 SEQ ID No:11 所示，长度为11876bp。

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