CN108186676A - 一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶，主要成分是Cu₂WS₄纳米材料和凝胶剂。无论在遮光或光存在的条件下，Cu₂WS₄纳米材料对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和耐药菌(耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，MRSA)等均展示出优异的抗菌性能，在较低浓度(0.1～5μg/mL)下即可实现99.999％以上的杀菌率。Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶不仅具有良好的生物安全性，而且在较低剂量下(0.01～1mg/kg)即可有效治疗伤口的MRSA感染并具有促进伤口愈合的能力。本发明所提供的纳米抗菌凝胶具有制作工艺简单、无毒副作用、给药方便、低剂量、高疗效、成本低廉的特性，能有效解决当前生物医学界的细菌感染问题。

Description

一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米抗菌技术和外伤治疗领域，具体涉及一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶。

背景技术

细菌一直是危害公共健康的主要原因，如何有效地控制和防止细菌的滋生和蔓延一直是深受关注的一个课题。因此，抗菌制剂在医疗界一直占有一片广阔的市场，大部分的抗菌制剂是由抗生素或者中药配制的，抗生素主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，在应用初期效果较为显著，但是随着抗生素长久和广泛的应用，细菌的耐药性变得越来越强，微生物感染已经严重威胁着人类的健康和安全，利用中药配制的抗菌制剂的临床效果也不明显。

值得关注的是，在全球，每年用于感染疾病的治疗费用高达上千亿美元，众多的制药企业愿意长期投入新药的研发之中，然而一款新型高效抗菌制剂的研发不仅费用极为高昂，而且耗时较长，生产出来的制剂也可能因为细菌的耐药性而只具有极短的使用寿命。因而，通过一种新型的技术发展出效果优异的抗菌剂越来越受到制药公司的关注。

随着纳米技术和纳米生物医学的发展，新的长期控制微生物感染疾病的方式应运而生：将生物方法与纳米技术相结合生产纳米抗菌新材料，并与凝胶结合更好的作用于人体。纳米材料促使细菌失活的途径主要为：(1)纳米颗粒直接黏附在细菌膜上，或者直接物理破坏细菌膜；(2)纳米颗粒释放出的金属离子破坏细菌内的蛋白质或DNA；(3)活性氧的产生破坏脂质和DNA。在此，纳米材料展现出不受细菌耐药性的限制的特性，更重要的是活性物种的产生，可以更加容易的渗透到细菌内部，破坏细菌的DNA和蛋白质。近年来，许多纳米材料(诸如银，石墨烯，二氧化钛，过渡金属硫族化合物等)已经被应用在抗菌领域；凝胶是一种可吸收大量溶剂但不溶于溶剂的高分子或大分子聚集体，它们在水中可迅速溶胀平衡并能保持其形状和三维空间网络结构，也被称为“软材料”。凝胶表现出许多聚合物的特性，不会自由溶解，这样的材料在生理条件下可以留在原地，同时保持抗微生物活性。这些特性使他们理想地应用于伤口愈合，植入物、导管涂料，皮肤感染，甚至孔口阻隔。

但是，在现有技术中存在以下几个问题：金属纳米颗粒存在一定的毒性，过量使用会滞留在环境中；抗菌纳米材料的制备过程比较复杂繁琐；抑菌率较低。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在解决现有技术中的不足，提供一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶，选取Cu₂WS₄纳米材料作为抗菌剂，加入相应的凝胶剂，形成Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶，起到治疗伤口感染、促进伤口愈合的作用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明所述的一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶是由Cu₂WS₄纳米材料的水溶液和凝胶的水溶液混合制备而成的，选取Cu₂WS₄纳米材料的水溶液0.5-5份；凝胶剂水溶液0.5-5份进行混合，所述Cu₂WS₄纳米材料的水溶液和凝胶的水溶液的体积比为1：0.5～5，所述Cu₂WS₄纳米材料的水溶液的浓度为1～100μg/mL，所述凝胶剂水溶液质量百分比为0.1％～50％。

进一步地，所述Cu₂WS₄纳米材料可为纳米片、纳米立方体、纳米薄膜中的一种。

进一步地，所述纳米片粒径为500～1000nm，纳米立方体尺寸为10～500nm，纳米薄膜直径大小为100～300nm。

进一步地，所述的凝胶为明胶、桃胶、海藻酸钠、琼脂、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂糖中的一种或多种。

进一步地，一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：制备Cu₂WS₄纳米材料的水溶液；

步骤2：将凝胶溶解于水中，高温加热形成水溶液，待凝胶水溶液冷却至35～55℃，加入Cu₂WS₄纳米材料的水溶液，混合至均匀；

步骤3：将上述Cu₂WS₄纳米材料的凝胶水溶液，室温下保存，即得纳米抗菌凝胶。

有益效果为：

(1)本发明采用Cu₂WS₄纳米材料作为抗菌剂，结合天然的凝胶剂，不含中药成分和抗生素，因而不存在副作用和耐药菌产生的问题。

(2)广谱的抗菌性能。可用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和耐药菌中，而且不受外界环境光的约束。

(3)产品的用量极低，极大的提高了生物安全性。

(4)Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶用于活体模型的伤口及耐药菌感染的伤口治疗，在低剂量下展现出有效的治疗及促进伤口愈合的能力。

(5)Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶的制备工艺简单。

(6)采用凝胶的方式较容易涂抹和作用在伤口处，极大的提高了给药率。

附图说明

图1a是本发明实施例1验证Cu₂WS₄纳米材料的溶血效应的结果示意图；

图1b是本发明实施例1验证Cu₂WS₄纳米材料的生物安全性的结果示意图；

图2是本发明实施例2验证Cu₂WS₄纳米材料的体外抗菌性能的结果示意图；

图3a是本发明Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶的照片；

图3b是本发明实施例3验证Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶的体外抗菌性能的结果示意图；

图4是本发明实施例4验证Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶对于活体的伤口治疗效果的示意图；

其中，Water：水；Saline:生理盐水；CWS:Cu₂WS₄纳米材料；Heart：心；Liver：肝；Spleen：脾；Lung：肺；kidney：肾；E.coli：大肠杆菌(革兰氏阴性菌)；S.aureus：金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)；Light no treatment：光照下不加Cu₂WS₄纳米材料处理；Dark CWS：遮光下加Cu₂WS₄纳米材料处理；Light CWS：光照下加Cu₂WS₄纳米材料处理。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图1-4和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

实施例1

a)参照图1a，使用新鲜的人血研究纳米材料的溶血效应。

首先，在装有新鲜血液的离心管中加入3-10mL生理盐水，混匀后，将离心管置于离心机中。在4℃下，500～3000rpm离心5分钟，同样的离心条件使用生理盐水清洗3次。

随后将纯净的0.1～1mL血红细胞溶于5～10mL生理盐水中混匀。在1mL不同浓度Cu₂WS₄纳米材料的生理盐水溶液(0.8～34μg/mL)中加入0.01～0.8mL血红细胞，混匀后置于小型摇床中。

在温度为37℃，转速为50～200rpm下，孵育0.5～10h。

从图1a中可以看出，Cu₂WS₄纳米材料具备良好的生物相容性。

b)参照图1b，活体的生物安全性的验证

将BALA/c小鼠(18-22g，雌性)分为2组(每组6只)，分别通过尾静脉注射100μL生理盐水作为对照组；注射100μL Cu₂WS₄纳米材料水分散液作为实验组，随后将2组小鼠放置于笼中。

小鼠自由活动14天后，将小鼠安乐死，取下主要的器官(心、肝、脾、肺、肾)置于福尔马林中固定，随后切片、包埋、染色等。

最后通过奥林巴斯倒置显微镜观察这些器官组织的变化；

从图1b中显示的结果可以看出经过Cu₂WS₄纳米材料处理的器官组织与对照组相比无明显变化，说明Cu₂WS₄纳米材料无毒性。

实施例2

参照图2，大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)被分别存放在5～30％的甘油中，保存于-80℃冰箱。

使用无菌枪头挑取部分冻存液，分别刮涂在LB平板上，置于37℃培养过夜，形成肉眼可见的菌落。

使用枪头挑取单个菌落于LB(蛋白胨10g·L^-1，酵母5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1)(1～20mL)培养液中，震荡过夜(220rpm，37℃)。

取1mL过夜的菌悬液于1.5mL离心管中，5000～12000rpm离心1～5min，加入生理盐水清洗两次。最终的离心产物加入1mL生理盐水吹打重悬备用。

取200μL悬浮液于96孔板中，酶标仪测定光密度值(OD 600nm)，以确定细菌的浓度。

分别取等体积的菌悬液和Cu₂WS₄纳米材料水溶液于离心管中，一式三份，对照使用去离子水替代Cu₂WS₄纳米材料。

在37℃摇床中220rpm震荡0.5～12h。

使用涂板计数法评估Cu₂WS₄纳米材料的抗菌性能。

从图2显示的结果可以看出，与对照组相比，无论是在遮光或者是在光照条件下，经过CWS处理的接种有大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的培养皿板上菌株的生长量都极少，说明CWS具有广谱抗菌性能，且不受外界环境光的约束。

实施例3

参照图3a和3b，首先配制质量百分比为0.1％～50％的凝胶剂水溶液，121℃下高压灭菌20分钟。

随后分别量取等体积的凝胶剂水溶液(35～55℃)和生理盐水(saline)或者Cu₂WS₄纳米材料水分散液于玻璃瓶中，室温下放置一段时间后，逐渐形成凝胶状，凝胶成像结果如图3a所示。

金黄色葡萄球菌被存放在甘油中，保存于-80℃冰箱。使用无菌枪头挑取部分冻存液刮涂在LB琼脂板上，置于37℃培养箱，静置过夜。随后使用枪头挑取单个菌落于含有LB培养基的50mL离心管中，吹打混匀，将离心管放置于37℃摇床中，震荡(200rpm)过夜。

取200μL菌悬液于96孔板中，酶标仪测定光密度值(OD 600nm)，以确定细菌浓度。

使用生理盐水对细菌的悬浮液进行一系列的稀释，最终得到浓度为1×10⁸CFU/mL的菌悬液备用。

取10～200μL菌悬液于LB固体琼脂板上，使用玻璃刮涂器刮涂均匀，使用移液器分别加入2～50μL体积的生理盐水凝胶(对照组，Saline)和2～50μLCu₂WS₄纳米抗菌凝胶(治疗组，CWS)于LB琼脂板上，一式两份，置于37℃烘箱中孵育24h，菌株生长状况如图3b所示，由图3b中可以看出与对照组相比，在接种有Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶部位的周围出现明显的抑菌圈，说明Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶具备抑制细菌生长的能力。

实施例4

a)为了研究Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶对于伤口感染的治疗，伤口模型被建立在小鼠的背部。

将BALA/c小鼠(18-22g)背部的毛清理干净，使用手术剪刀剪一个直径2～8mm的伤口，使用移液枪滴入100μL体积的1*10⁴～1*10⁹CFU/mL细菌或者耐药菌于伤口上。

将老鼠分为2组(每组6只)，每隔24h，分别使用移液枪取5～50μL生理盐水凝胶(对照组)和5～50μLCu₂WS₄纳米抗菌凝胶(治疗组)于伤口上，并且拍照记录伤口愈合情况。

b)为了研究Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶对于伤口愈合的促进，伤口模型被建立在小鼠的背部。

将BALA/c小鼠(18-22g)背部的毛清理干净，使用手术剪刀剪一个直径2～10mm的伤口。

将老鼠分为2组(每组6只)，每隔24h，每隔24h，分别使用移液枪取5～50μL生理盐水凝胶(对照组)和5～50μL Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶(治疗组)于伤口上，并且拍照记录伤口愈合情况。

从图4中可以看出与对照组相比，经过Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶处理治疗后的小鼠背部伤口愈合效果更好，说明Cu₂WS₄纳米抗菌凝胶具备治疗耐药菌感染的伤口且促进伤口愈合的能力。

Claims (6)

1.一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶，其特征在于，其具体组分如下：Cu₂WS₄纳米材料的水溶液0.5-5份；

凝胶剂水溶液0.5-5份。

2.根据权利要求书1所述的一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶，其特征在于，所述Cu₂WS₄纳米材料的水溶液的浓度为1～100μg/mL，所述凝胶剂水溶液质量百分比为0.1％～50％。

3.根据权利要求书1所述的一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶，其特征在于，所述的Cu₂WS₄纳米材料为纳米片、纳米立方体、纳米薄膜形式中的一种。

4.根据权利要求书1所述的一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶，其特征在于，所述的凝胶剂为明胶、桃胶、海藻酸钠、琼脂、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂糖中的一种或多种。

5.根据权利要求书3所述的一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶，其特征在于，所述的纳米片粒径为500～1000nm，纳米立方体尺寸为10～500nm，纳米薄膜直径大小为100～300nm。

6.根据权利要求书1-4中任一项所述的一种治疗伤口感染及促愈合的纳米抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：制备Cu₂WS₄纳米材料的水溶液；

步骤2：将凝胶溶解于水中，高温加热形成水溶液，待凝胶水溶液冷却至35～55℃，加入Cu₂WS₄纳米材料的水溶液，混合至均匀；

步骤3：将上述Cu₂WS₄纳米材料的凝胶水溶液于室温下保存，即得纳米抗菌凝胶。