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CN108139375A - 靶向髓样衍生的抑制细胞中的四跨膜蛋白33(tspan33)的癌症疗法 - Google Patents

靶向髓样衍生的抑制细胞中的四跨膜蛋白33(tspan33)的癌症疗法 Download PDF

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Abstract

通过靶向表达Tspan33的髓样衍生的抑制细胞，例如与抗癌疗法，如免疫治疗一起来治疗癌症的方法，和用于鉴定候选治疗剂的方法。

Description

靶向髓样衍生的抑制细胞中的四跨膜蛋白33(TSPAN33)的癌 症疗法
优先权要求
本申请要求2015年6月26日提交的美国临时专利申请序列号62/185,358；2015年6月26日提交的美国临时专利申请序列号62/185,409；以及2015年7月7日提交的美国临时专利申请序列号62/189,587的权益。将前述的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及通过靶向Tspan33，例如与其它抗癌疗法一起治疗癌症和鉴定候选治疗剂的方法。
发明背景
肿瘤介导的免疫抑制阻止有效的癌症免疫治疗。癌症发展中对免疫效应物的耐受部分地是通过形成浸润肿瘤环境并迁移至转移性小生境的抑制性细胞群来实现的。迄今为止，这类群体的最佳表征包括调节性T细胞(Treg)、髓样衍生抑制细胞(MDSC)和M2极化的巨噬细胞。因此，MDSC是肿瘤用来逃避免疫监视的主要细胞类型。
发明概述
尽管小鼠中的MDSC已经被广泛地表征，但是它们的人类对应物没有被很好地定义，并且存在于小鼠中的细胞标志物不总是可用于人类。已经将MDSC描述为具有免疫抑制能力的髓样衍生细胞的异质群体(5,9,40,41)。最近对MDSC在人类肿瘤中积累的作用重新产生了兴趣，这导致更好地定义这些细胞的增加的需要，以便将其靶向用于治疗干预。尽管靶向小鼠中的MDSC的大多数研究已经使用CD11b+,Gr-1+作为鉴定标志物(9)，但是人MDSC是定义得不太好的并且已经被不同地表征为CD33+，CD11b+，Lin-和HLA-DR1o细胞(28，30，42)。
如本文所述，将从移植的鼠胰腺癌分离的脾MDSC的基因表达谱与来自不具有肿瘤的动物的MDSC的那些进行比较，以鉴定在小鼠和人两者中识别免疫抑制性MDSC群体的细胞表面抗原Tspan33。本文所述的MDSC标志物可以用作例如治疗的靶标，以对MDSC在癌症发展，进展和转移中的作用进行临床前研究，并用于监测抗癌疗法的功效。
因此，在第一方面，本发明提供了治疗受试者中的癌症或选择用于治疗的受试者的方法。所述方法包括检测来自所述受试者的样品中Tspan33+MDSC的水平，例如包含血液、血清，尿液或癌性组织(cancerous tissue)的样品；比较样品中Tspan33+MDSC的水平与Tspan33+MDSC的参考水平；和选择具有高于参考水平的Tspan33+MDSC水平的受试者以用靶向MDSC的免疫疗法进行治疗，并且任选地将所述靶向MDSC的免疫疗法施用于所述受试者；或者选择具有处于或低于参考水平的Tspan33+MDSC水平的受试者以用不靶向MDSC的疗法，例如，不靶向MDSC的免疫疗法或非免疫抗癌疗法进行治疗；并且任选地施用所述不靶向MDSC的疗法。
另一方面，本发明提供了用于治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括施用治疗有效量的特异性结合Tspan33的抗体并降低所述受试者中Tspan33+髓样衍生的抑制细胞的数量或活性。可以通过例如以下测定MDSC的数量：测量外周血中的Tspan33+细胞或通过IHC在来自外科手术后的患者的通过外科手术取出的肿瘤组织样品中检测Tspan 33+细胞。
在一些实施方案中，所述抗体是人类的、人源化的、嵌合的、双特异性的或双功能性的。在一些实施方案中，所述抗体偶联于细胞毒性肽或蛋白质、放射性同位素或抗癌药物。在一些实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用抗癌疗法，例如免疫疗法。
在一些实施方案中，在施用特异性结合Tspan33的抗体后，例如在施用特异性结合Tspan33的抗体的至少一周后，将抗癌疗法施用于受试者。
在一些实施方案中，抗癌疗法选自下组：用冷仪器(cold instrument)或激光手术切除、放疗、光疗(phototherapy)、生物疗法(例如用酪氨酸激酶抑制剂)、射频消融术(radiofrequency ablation)(RFA)，放射性栓塞法(radioembolisation)(例如用90Y球)、化学疗法和免疫疗法(例如，施用以下的一种或多种：癌症疫苗，IL-2，环磷酰胺，抗白介素-2R免疫毒素或检查点抑制剂或其他免疫治疗抗体)。在一些实施方案中，抗癌疗法包括施用检查点抑制剂，例如抗CD137，抗PD1，抗PDL1或抗CTLA-4抗体，和/或癌症疫苗，例如用经辐射的癌细胞，例如表达ICOS，GM-CSF(Gvax)或Flt3-配体(Fvax)的细胞进行疫苗接种。
在一些实施方案中，癌症是上皮起源的实体癌(solid cancer)。在一些实施方案中，癌症是白血病。在一些实施方案中，癌症的特征在于癌性组织(cancerous tissue)中存在Tspan33+髓样衍生的抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌，肺癌或肝癌。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述受试者获得样品，例如包含血液、尿液、CSF或癌性组织的样品；检测样品中Tspan33+MDSC的存在；和选择具有癌组织中存在的Tspan33+MDSC水平，例如高于Tspan33+MDSC参考水平的Tspan33+MDSC水平的受试者，并且然后施用治疗有效量的所述抗体。
另一方面，本发明提供了随时间监测受试者中癌症治疗效力的方法。所述方法包括，测定受试者中，例如来自所述受试者的第一样品中的Tspan33+MDSC的第一水平，例如包含血液、尿液、CSF或癌性组织的样品；测定受试者中，例如来自所述受试者的后续样品中的Tspan33+MDSC的后续水平，例如在包含血液或癌性组织的样品中；比较Tspan33+MDSC的第一水平和后续水平，和当Tspan33+MDSC的后续水平低于Tspan33+MDSC的第一水平时鉴定所述治疗为有效的。
在一些实施方案中，所述治疗特异性或非特异性地消减所述受试者中的Tspan33+MDSC。
在一些实施方案中，治疗是抗癌疗法，例如免疫疗法，如本领域已知或本文所述的。在一些实施方案中，治疗包括施用检查点抑制剂，例如抗CD137，抗PD1，抗PDL1或抗CTLA-4抗体。
另一方面，本发明提供了鉴定用于治疗癌症的候选化合物的方法。所述方法包括：选择结合Tspan33的测试化合物；使所述测试化合物与包含表达Tspan33的髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的样品接触；检测所述测试化合物对细胞的影响，例如对Tspan33+MDSC的存活力，Tspan33+MDSC的寿命，Tspan33+MDSC的免疫抑制能力或Tspan33+MDSC的增殖的影响；和选择降低MDSC的存活力、寿命、免疫抑制或增殖的测试化合物作为候选化合物。
在一些实施方案中，选择结合Tspan33的测试化合物包括提供包含Tspan33的样品，例如表达Tspan33的细胞或纯化的Tspan33蛋白；使所述样品与测试化合物接触；检测测试化合物与所述样品中Tspan33的结合；和选择结合Tspan33的测试化合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括将所选择的候选化合物施用于病症的体内模型，例如动物肿瘤模型，例如肿瘤异种移植物模型；检测对病症模型，例如对所述病症中的一种或多种症状(例如，肿瘤或脾中Tspan33+MDSC的数量，肿瘤生长或转移)的影响；和选择减少肿瘤或脾中Tspan33+MDSC的数量，减少肿瘤生长或减少转移并且改善动物存活的候选化合物作为候选治疗剂。
在一些实施方案中，病症的体内模型是动物肿瘤模型，例如肿瘤异种移植物模型。
另一方面，本发明提供了随时间确定治疗对受试者中MDSC水平的影响的方法。所述方法包括：测定所述受试者中，例如来自所述受试者的第一样品中的Tspan33+MDSC的第一水平，例如在包含血液、尿液、CSF或癌性组织的样品中；测定所述受试者中，例如来自所述受试者的后续样品中的Tspan33+MDSC的后续水平，例如在包含血液或癌性组织的样品中；比较Tspan33+MDSC的第一水平和后续水平，和当Tspan33+MDSC的后续水平高于Tspan33+MDSC的第一水平时鉴定治疗为增加MDSC，或当Tspan33+MDSC的后续水平低于Tspan33+MDSC的第一水平时鉴定治疗为降低MDSC。
在一些实施方案中，治疗是用于癌症的治疗。
在一些实施方案中，治疗特异性地或非特异性地消减所述受试者中的Tspan33+MDSC。
在另一方面，本发明提供了确定受试者中MDSC的存在或水平的方法。所述方法包括：任选地从所述受试者获得样品，例如包含血液，尿液，CSF或癌性组织或肿瘤裂解物的样品；任选地富集早期髓样祖细胞(early myeloid progenitor cell)(例如HLA-DR lo,CD33+细胞)中的样品，例如使用流式细胞术；使所述样品与结合Tspan33的抗体接触；检测所述抗体与所述样品的结合；和基于所述抗体与所述样品的结合来确定样品中Tspan33+MDSC的水平。
在本文的方法中，在一些实施方案中，癌症不是髓样癌，例如不是血液恶性肿瘤，例如不是与激活的B细胞相关的血液恶性肿瘤，例如不是B细胞淋巴瘤。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料，方法和实例仅是说明性的而不是意在用于限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献的全部内容通过引用并入本文。如有冲突，以本说明书，包括定义为准。
本发明的其它特征和优点从下面的详细描述和附图以及从权利要求书中将是显而易见的。
附图简述
图1.具有Pan02肿瘤的小鼠的脾中基因表达的微阵列分析。从胰腺肿瘤(Pan02)；黑素瘤(B16)分离的MDSC上；和来自由GM-CSF/IL-6转化后骨髓衍生的MDSC的Tspan33的差异表达。
图2显示了人组织中Tspan33的组织限制性表达模式。
图3是一组6个FACS图，显示来自B16黑素瘤(顶部)，移植的E0771乳腺肿瘤(中间)和Her2转基因小鼠乳腺肿瘤浸润细胞(底部)的MDSC中Tspan33的表达。左小图＝Tspan33。右小图＝CD11b+Gr1+细胞。
图4的直方图表明转基因诱导型HER2表达性肿瘤的肿瘤浸润物以及HER2去诱导后消退肿瘤中的Tspan33+MDSC的频率的降低。
图5是一组4个FACS图，显示靶向Gr-1蛋白的消减抗体与CD11b+Gr-1+(左)和Tspan33+MDSC(右)的频率降低相关。
图6是一组FACS图，显示GM-CSF/IL-6转化后骨髓衍生的MDSC中Tspan33的表达。
图7是显示在对照(正常组织)样品，肿瘤样品和用“节律性(metronomic)”环磷酰胺(CYC)和塞来昔布(celecoxib)(CTX)处理的肿瘤样品中Tspan33+细胞频率的条形图。接受环磷酰胺和塞来昔布处理的动物中Tspan33+MDSC降低。
图8的条形图显示从健康供体(HD)和前列腺癌患者(PD)分离的PBMC中Tspan33阳性MDSC的频率，如通过FACS分析确定。来自具有前列腺癌的患者的PBMC具有循环CD33+HLA-DR1o Tspan33+MDSC。分离来自从前列腺癌患者(PC)和健康供体(HD)收集的血液的PBMC，并针对HLA-DR，CD33和Tspan33染色，并通过FACS分析。
图9A的图像显示在移植有E90771肿瘤的C57/BL6小鼠中用抗Gr1抗体处理21天对肿瘤大小的影响。上面的一对图像代表用对照Ig处理的动物中的肿瘤；底部的一对图像，用抗Gr1抗体处理的动物中的肿瘤。
图9B的线形显示了移植有E90771肿瘤的C57/BL6小鼠；用对照Ig(菱形)或抗Gr1抗体(正方形)处理动物中的肿瘤体积。抗体处理后肿瘤生长急剧减少。
图9C的条形图显示与用对照Ig(黑色条形)处理的那些小鼠相比，在用抗Gr1抗体处理的移植有E90771肿瘤的C57/BL6小鼠(白色条形)中MDSC的频率降低。
图10是western印迹的图像，显示在来自肺癌患者的正常(N)和肿瘤(T)组织样品的匹配对，以及源自肝癌(肝细胞癌，作为阳性对照)的HepG2细胞系中的TSN33表达。
发明详述
在超过25年前描述了在癌症中的骨髓抑制细胞(1)，但其受到相对较少的关注。然而，在一些实验室的开创性工作已经强调了MDSC作为负责使肿瘤逃脱免疫监视的免疫系统调节物的意义(2-4)。MDSC是由单核细胞/巨噬细胞，粒细胞和树突状细胞组成的髓样细胞(myeloid cell)的异质群，所述髓样细胞在癌症患者的血液和具有肿瘤的小鼠中显著增加(5)。在遗传模型和移植的同基因小鼠中，MDSC在充分发展的癌症出现之前存在于肿瘤部位(或在癌前病变(pre-neoplastic lesion))和脾中(6,7)。MDSC受到的关注比Treg少，但对其兴趣迅速增长(如近期发表的论文所证实的)(8,9)。在人体中研究它们的一个关键障碍是缺乏可以用于鉴定和用于特异性靶向的特异性的细胞表面标志物(10)。在小鼠中，MDSC通常表征为CD11b+Gr-1+。此外，将CD11bhi，Gr-1 1o细胞称为单核细胞的，并将CD11b 1o，Gr-1hi细胞分类为粒细胞性MDSC(11)。人MDSC具有不成熟的表型，并且最初在肺癌，乳腺癌和头颈癌中定义为HLA-DR-Lin-细胞(12)。最近，在肾癌和黑素瘤中已经将它们描述为CD33+和HLA-DR-Lin-细胞(13,14)；在乳腺癌中作为HLA-DR-Lin-CD33+CD11b+细胞(15)；在晚期非小细胞肺癌中作为CD14-CD33+ CD11b+CD15+(16)，和在黑素瘤，前列腺癌，肾癌和肝细胞癌中为HLA-DR-CD14+细胞癌(17-19)。因此需要更好地定义与具有不同肿瘤的癌症患者中相关的MDSC群体以比较治疗结果。
此外，MDSC采用多种机制来靶向T细胞功能，包括产生精氨酸酶1，经由iNOS的一氧化氮(NO)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)(20)。发展中的肿瘤分泌促进MDSC的积累的多种因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-b(TGFb)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-10和前列腺素E2(21,22)。最近的研究(23,24,25)和本发明人的未公开数据支持以下事实：肿瘤衍生的乳酸也影响先天免疫功能并导致从髓样祖细胞的APC分化的停滞。MDSC通过利用许多机制介导免疫抑制，所述机制包括精氨酸代谢中涉及的两种酶(ARG和NOS)以及通过TGFb，前列腺素E2(PGE2)的产生和半胱氨酸的消减(5,26)。MDSC也通过调控调节性T细胞的生成来抑制免疫效应器功能(27-29)。这使得鉴定与免疫功能和治疗靶向相关的MDSC亚组以及定义跨物种适用的标志物是更为重要的。
值得注意的是，随着用于癌症治疗的抗GITR单克隆抗体(TRX518)(Schaer etal.,Curr Opin Investig Drugs.2010 Dec；11(12):1378-86；Rosenzweig et al.,J ClinOncol 28,2010(suppl；abstr el3028))的发展(现在在I期试验(TRX518-001)中)，Treg特异性疗法已经成为现实。消减或降低Treg活性的其它治疗也是已知的，例如，环磷酰胺(节律性剂量(metronomic dose)，例如通常每日并通常口服递送而不中断)，三氧化二砷，紫杉醇(paclitaxel)，舒尼替尼(sunitinib)，奥沙利铂(oxaliplatin)，PLX4720，基于蒽环类(anthracycline)的化学疗法以及选择性靶向VEGF-VEGFR信号传递轴的药物，例如VEGF阻断性抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab))或VEGFR酪氨酸激酶活性抑制剂(例如，乐伐替尼(lenvatinib))。由于MDSC在早期出现并可诱导Tregs，因此抗MDSC疗法作为癌症的治疗剂可能是有效的。MDSC活性的抑制或MDSC数量的消减可以克服动物移植模型中的肿瘤生长，这可以通过多种机制实现，包括：通过使用抗Gr-1抗体消减MDSC；用非特异性抑制剂诸如5-FU，多西他赛(docetaxel)和吉西他滨(gemcitabine)降低MDSC数量；改变MDSC向非抑制性髓样细胞的转化或通过例如使用紫杉醇来调节MDSC的功能(30,31)。使用抗Gr-1治疗消减在具有肿瘤的小鼠中的MDSC导致肿瘤负荷降低和寿命延长(32)。从肾癌患者体内分离的CD11b+，CD14-MDSC的体外消减恢复了对无变应性(anergic)T细胞的功能(33)。然而，副作用诸如嗜中性粒细胞的消减和人MDSC上Gr-1+的缺乏已经阻碍了将这些令人感兴趣的发现转化到临床。已经为了用药物减少MDSC而进行的少数研究，包括在肾癌患者中使用舒尼替尼(34)或全反式视黄酸(ATRA)，之后用IL-2治疗(13-14)，已经显示了某种功效。这些药物中一些的主要问题是它们缺乏特异性：它们影响其他免疫区室中的细胞(例如ATRA促进Treg并且cox-2抑制剂可以抑制DC成熟，两种在癌症免疫治疗的背景下不希望的结果)。
将鼠MDSC进一步定义为粒细胞性CD11b+Gr-1hi(Ly6GhiLy6Clo/int)和单核细胞性CD11b+Gr-11o(Ly6G-Ly6Chi)MDSC。Greifenberg等人(43)使用LPS和IFNg诱导的MDSC进一步细分为5种不同的MDSC亚型，并且这种更精细的表征将有可能基于鉴定的新标志物而继续(34,44)。许多最近的论文已经报道了用于(主要是鼠)MDSC群体的表型表征的新的标志物。这些分类器包括使用CD49d作为区分小鼠中的免疫抑制性“单核细胞性”CD11b+ CD49d+和“粒细胞性”CD11+CD49d–MDSC的标志物(45)。还在小鼠中报道了许多用于抑制性MDSC的其他标志物，包括CD80(46)、CD115(47,48)、CD124/IL-4Ra(48)和最近报道的S100A9，其据报道存在于人和鼠MDSC两者中(49)。根据CD14+HLA-DR-/lo髓样细胞的表达阵列分析，将S100A9鉴定为与抑制性单核细胞性细胞相关的MDSC标志物。已经将小鼠MDSC进一步表征为表达一氧化氮合酶(NOS2)的CD11b+Ly6GloLy6Chi单核细胞性MDSC(Mo-MDSC)和表达精氨酸酶1(ARG1)的CD11b+Ly6GhiLy6Clo粒细胞性MDSC(G-MDSC)(9)。在小鼠肿瘤中，更通常将G-MDSC表征为是脾中占优势的群体收集，较少量的小鼠肿瘤中Mo-MDSC是占优势的(11)。然而，尽管G-MDSC更普遍存在，认为Mo-MDSC是更有效的免疫抑制剂(50)。
二十年来，人类癌症研究已经证明了存在具有T细胞抑制物功能的髓样细胞(9,51-53)。在命名混淆了数年之后，最近可接受的人MDSC标志物包括Lin-,HLA-DRlo,CD11b+,CD33+,CD14+细胞。进一步的亚组定义包括将CD14+用于Mo-MDSC以及将CD15+用于G-MDSC(9,54)。尽管MDSC可塑性已经归因于MDSC群体中的这种多样性，但是功能分析和治疗性靶向两者由于在小鼠和人MDSC之间缺乏重叠而受到阻碍。关于MDSC在疾病中的产生和随后操作的所有动物数据主要基于随后的CD11b+Gr-1+ MDSC并且与多种表型特征的人MDSC相关。本研究的一个目的是为MDSC找到共同的标志物，其不仅鉴定小鼠和人MDSC，而且还鉴定了这些细胞的功能性质(即基于NO的T细胞抑制功能和NK细胞的细胞毒性)。随着越来越多的临床研究正在考虑抑制MDSC(无论是与标准化学疗法或免疫疗法诸如癌症疫苗或过继性T细胞疗法一起)以改善抗肿瘤反应的重要性(30,54)，用适当的MDSC频率监测来跟踪临床结果将变得至关重要。
在基因表达序型分析之后，在来自许多不同移植肿瘤模型和自发性胰腺癌模型的MDSC中观察到Tspan33表达(24)。本数据表明CD11b+Gr-1+细胞表达Tspan33，并且从不同来源获得的Tspan33+细胞在其免疫抑制能力方面也是功能相似的。因此，从具有肿瘤的小鼠的脾或从骨髓细胞衍生的MDSC分离的Tspan33+细胞均同样有效地抑制CD4增殖，抗原非依赖性CD8功能以及NK细胞的细胞毒性。由于这些Tspan33+细胞类似于通常描述的来自小鼠的MDSC表达NOS2和ARG1，我们将Tspan33+细胞表征为代表免疫抑制性MDSC。此外，还通过用GM-CSF和IL-6组合处理从PBMC产生Tspan33+细胞(如Lechner et al.[39]所证明的)，并且这些细胞(表达CD33)表达NOS2，TGFβ，IL-6和VEGF，这表明Tspan33+细胞群也代表细胞因子诱导的MDSC，由此支持Tspan33表达在该免疫抑制群体中的作用。
本发明人已经表征了可以在脾和多种癌症类型的肿瘤浸润细胞中观察到的髓样细胞的异质群体，并且显示这些细胞也可以基于它们细胞表面表达Tspan33进行分类。可以使小鼠BM细胞分化成表达常规CD11b，Gr-1标志物的MDSC；如这里所示，CD11b+Gr-1hi(Ly6GhiLy6Clo/int)G-MDSC和CD11b+Gr-1lo(Ly6G-Ly6C hi)Mo-MDSC可以进一步分类为Tspan33+髓样细胞(为Mo-MDSC)。这些Tspan33+ MDSC表达NOS2并且是T细胞抑制性的，并抑制NK细胞溶解活性。重要的是，当用GM-CSF和IL-6处理PBMC或当它们在来自多种癌细胞系的CM的存在下培养时，Tspan33+髓样细胞也可以在体外产生。这些结果支持Tspan33+髓样细胞作为真正免疫抑制性Mo-MDSC，其存在于鼠癌症和在体外产生的人PBMC衍生的MDSC群体。
尽管MDSC的消减或抑制已经证实了改善的免疫谱，并且在最近几次开发有效的癌症疫苗的尝试中证明是有益的(54,58)，但是所有这些研究已经使用多种药物来降低MDSC的频率，功能或导致其分化。然而，选择性靶向MDSC消减仍然是不可用的。虽然抗Gr-1抗体已被用于消减MDSC并在动物肿瘤模型中显示出有效的结果(例如59,60)，但是Gr-1在包括单核细胞和树突细胞亚群(61)的不同细胞类型中的表达利用有限临床价值的MDSC的这种基于抗体的定义。而且，用中和抗体消减Gr-1+细胞也再次显示没有抗肿瘤作用(62,63)，这可能是由于对其他细胞类型的广泛效应。虽然人MDSC缺乏Gr-1的表达，但是那些证明动物中Gr-1抗体介导的MDSC消减的改善结果的研究再次突出了对靶向抗MDSC治疗的需要。
Tspan33
如本文所述，Tspan33是一种新的表面标志物，其识别来自携带肿瘤的小鼠，来自小鼠骨髓细胞的MDSC，和来自由GM-CSF和IL-6或癌细胞条件化培养基转化为免疫抑制细胞的人PBMC的MDSC。在鼠乳腺和胰腺导管腺癌的遗传模型中，Tspan33+细胞存在于小鼠的脾和肿瘤浸润物中。Tspan33鉴定小鼠MDSC和人PBMC衍生的免疫抑制细胞的功能性群体，并且与临床应用相关。
Tspan33，也被称为Penumbra，编码通常具有四个跨膜结构域的四跨膜蛋白(tetraspanin)家族成员。该基因位于7q32.1，包含9个外显子并跨越大约25kb(Chen etal.,Cancer Genet.Cytogenet.162:95-98,2005)；在7个分析的具有7q缺失的骼样恶性肿瘤病例中的5个中发现了Tspan33中的突变(同上)。也参见Pasquini et al.,“Cloning andcharacterization of human Penumbra:a gene encoding a new erythroid membraneprotein that modulates the proliferation and adhesion of proerythroblasts/erythroblasts.”Blood 102:212a(摘要),2003。
SEQ ID NO：1是示例性的人Tspan33蛋白质序列。
在人类和其他物种中的核酸和氨基酸的序列的GenBank登录号如下表A所示。基因组序列在NC_000007.14(范围为129144716-129169694；参考GRCh38.p2初级装配(PrimaryAssembly))。
治疗方法
如本文所证明的，人类肿瘤中的MDSC可以通过Tspan33和任选的其他标志物诸如Lin-，HLA-DRlo，CD11b+，CD33+，CD14+细胞的表达来鉴定；在一些实施方案中，Tspan33的表达，加上CD33、CD14、以及HLA-DR的低表达中的一种或多种用于鉴定MDSC。因此，本文所述的方法包括用于治疗癌症的方法。通常，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的靶向Tspan33的分子(例如抗Tspan33抗体)施用于需要此种治疗或已经确定需要此种治疗的受试者。在一些实施方案中，所述方法包括检测Tspan33+细胞，即Tspan33+MDSC的存在(并且任选地基于其他标志物诸如Lin-,HLA-DRlo，CD11b+，CD33+，CD14+细胞的存在；在一些实施方案中，Tspan33的表达，加上CD33、CD14、和/或HLA-DR的低表达中的一种或多种用于在来自受试者的样品中(例如来自受试者肿瘤(例如来自原发性肿瘤，淋巴结或转移部位)的样品或外周血，CSF，尿或骨髓的样品))鉴定MDSC，并且选择具有存在于其肿瘤或血液中的Tspan33+MDSC的受试者来使用消减Tspan33+MDSC的疗法治疗。
如在本文中使用的，“治疗”是指改善癌症的至少一个临床参数。在一些实施方案中，参数是肿瘤大小，肿瘤生长速率，复发或转移，并且改善将是肿瘤大小的减小或正常快速生长的肿瘤中无变化；减少或停止肿瘤生长；复发的减少，延迟复发或无复发，或转移减少，延迟转移或无转移。施用治疗有效量的本文所述的化合物以治疗癌症将导致以下中的一种或多种：肿瘤大小的减小或在正常快速生长的肿瘤无变化；肿瘤生长的减少或停止；或转移减少，延迟转移或无转移。在一些实施方案中，例如设计用于防止癌症复发的治疗，所述治疗将在局部肿瘤已经被移除(例如通过外科手术)，或用放射疗法或用靶向疗法(伴有或不伴有其它疗法诸如标准化学疗法)治疗发生之后给出。不希望受理论束缚，这种治疗可以通过保持微转移休眠(micrometastases dormant)，例如通过防止它们从休眠释放来起作用。
如本文所用，术语“过度增殖(hyperproliferative)”是指细胞具有自主生长能力，即表征为快速增殖的细胞生长的异常状态或状况。过度增殖性疾病状态可以归类为病理性的，即表征或构成疾病状态，或者可以归类为非病理性的，即偏离正常但与疾病状态无关。该术语意指包括癌性生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化的细胞，组织或器官的所有类型，而不考虑组织病理学类型或侵袭阶段。“肿瘤”是超增殖细胞的异常生长。“癌症”是指病理性疾病状态，例如特征在于恶性肿瘤生长。本文所述的方法可以用于治疗癌症，例如，上皮起源的实体瘤(例如，如ICD-O(International Classification of Diseases–Oncology)代码(修订版3)，部分(8010-8790)所定义的)，例如早期阶段癌症，由于上皮癌细胞中卫星重复序列(satellite repeat)的转录和加工的增加而与卫星的大量水平的存在相关。因此，方法可以包括包含已知或疑似是肿瘤细胞的细胞的样品中卫星重复序列的干扰，所述细胞例如是来自上皮起源的实体瘤，例如胰腺癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，肾癌，卵巢癌或结肠癌/结肠直肠癌细胞。
上皮起源的癌症可以包括胰腺癌(例如胰腺腺癌)，肺癌(例如，非小细胞肺癌或小细胞肺癌)，肝癌(例如肝细胞癌)，前列腺癌，乳腺癌，肾癌，卵巢癌或结肠癌。白血病可以包括AML，CML或CLL，并且在一些实施方案中包含癌性MDSC。方法也可用于治疗早期肿瘤前期癌症(preneoplastic cancer)，以作为预防侵入性癌症(invasive cancer)发展的手段。
治疗的受试者选择
将Tspan33+细胞鉴定为MDSC允许鉴定某些患者比其他人更可能受益于消减MDSC的疗法(在本文中也称为MDSC消减疗法)。因此，例如，所述方法可以包括确定来自受试者的样品，例如在癌性组织的生检样品或外周血液样品或骨髓样品中的Tspan33+MDSC的水平，并将该水平与参考水平比较。当受试者具有高于参考水平的Tspan33+MDSC的水平时，那么该受试者更有可能受益于MDSC消减疗法，并且应该选择用于(并且任选地施用)MDSC消减疗法。在一些实施方案中，当受试者具有低于参考水平的Tspan33+MDSC的水平时，那么该受试者更可能受益于非MDSC消减疗法的疗法，例如免疫疗法，并且应该选择用于(和任选地施用)不特异性消减MDSC的疗法。
合适的参考水平可以使用受试者群体的常规统计分析来确定，并且可以表示例如通过对MDSC消减疗法的响应和免疫疗法开始时的Tspan33+MDSC水平分层的受试者群体的百分位的截断水平，例如通过Tspan33+MDSC水平分层的受试者的最低五分位数，四分位数或三分位数，或其他阈值，高于所述其它阈值，受试者不太可能响应免疫疗法。也可以使用其他参考水平。MDSC消减疗法可以包括如本文所述的特异性靶向消减Tspan33+MDSC的那些疗法，以及免疫疗法和其它免疫消减疗法。
抗癌疗法
在一些实施方案中，方法包括对受试者施用抗癌疗法，所述受试者例如为使用如本文所述的Tspan33+MDSC消减疗法(例如施用如本文所述的靶向Tspan33的分子)治疗的受试者，或是使用本文的方法来选择的，即，鉴定为具有高于/低于阈值的Tspan33+细胞的水平的受试者。癌症治疗包括本领域已知的那些，例如用冷仪器或激光手术切除、放疗、光疗、生物疗法(例如用酪氨酸激酶抑制剂)、射频消融术(RFA)，放射性栓塞法(例如用90Y球)、化学疗法和免疫疗法。化学疗法剂的非限制性实例包括：环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorabucil)、美法仑(melphalan)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、戊柔比星(valrubicin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、塔夫鲁肽(tafluposide)、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(axathioprine)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨喋呤(methotrexate)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、博来霉素(bleomycin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、全反式视黄酸、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、和贝伐单抗(bevacizumab)(或其抗原结合片段)。抗癌治疗的另外的实例是本领域已知的；参见例如美国临床肿瘤协会(American Societyof Clinical Oncology)(ASCO)，欧洲医学肿瘤内协会(European Society for MedicalOncology)(ESMO)或美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network)(NCCN)的治疗指南。
在一些实施方案中，方法包括对受试者，例如使用MDSC消减疗法治疗的受试者或使用本文的方法选择的受试者，即，鉴定为具有低于阈值的TSPan33+细胞的水平的受试者施用免疫疗法。免疫疗法包括靶向肿瘤诱导的免疫抑制的那些疗法；参见例如Stewart andSmyth,Cancer Metastasis Rev.2011Mar；30(1):125-40。可用于本文所述方法中的免疫疗法包括那些特异性消减Tspan33+MDSC的疗法，例如其包括施用如本文所述的靶向Tspan33的分子；非特异性消减MDSC的疗法，例如其可以不特异性靶向Tspan33+MDSC群但仍导致Tspan33+MDSC和/或其他MDSC的消减，定位改变或降低的活性(在本文中统称为“非特异性MDSC消减免疫疗法”)；和不消减MDSC的疗法(在此称为“非MDSC消减性免疫疗法”)。在一些实施方案中，所述方法包括在施用靶向Tspan33的分子的同时或之后将免疫疗法，例如非特异性MDSC消减免疫疗法或非MDSC消减免疫疗法共同施用于受试者。在一些实施方案中，所述方法包括施用靶向Tspan33的分子达足够的时间以基本上消减存在于肿瘤或受试者中(例如骨髓，脾或外周血中)的MDSC的数量，例如到处理前水平的少于50％，例如到处理前水平的小于40％，30％，20％或10％的水平，例如，至少一周，两周，三周或一个月或更多，并且然后施用免疫疗法；靶向Tspan33的分子可以继续与免疫疗法一起施用，或两种治疗方式可以交替。
非MDSC消减免疫疗法
促进抗癌免疫力但不特异性消减MDSC(或未知或未设计为特异性消减MDSC)的许多免疫疗法是本领域已知的。在一些实施方案中，这些疗法例如通过减少数量，改变功能或防止免疫调节细胞类型的肿瘤定位可以主要地靶向其他免疫调节细胞类型，诸如调节性T细胞(Treg)或M2极化巨噬细胞。例如，Treg靶向疗法包括抗GITR单克隆抗体(TRX518)，环磷酰胺(例如，(例如节律剂量)，三氧化二砷，紫杉醇，舒尼替尼，奥沙利铂，PLX4720，基于蒽环类的化学疗法，达克珠单抗(Daclizumab)(抗CD25)；免疫毒素例如Ontak(地尼白介素2(denileukin diftitox))；淋巴消融(lymphoablation)(例如化学或放射性淋巴消融)和选择性靶向VEGF-VEGFR信号传导轴的试剂，诸如VEGF阻断性抗体(例如，贝伐单抗)或VEGFR酪氨酸激酶活性的抑制剂(例如，乐伐替尼)或ATP水解的抑制剂(例如，使用外核苷酸酶抑制剂，例如，ARL67156(6-N,N-二乙基-D-β,γ-二溴亚甲基ATP三钠盐)，8-(4-氯苯基巯基)cAMP(pCPT-cAMP)和相关的环核苷酸类似物(8-[4-氯苯基硫基]cGMP；pCPT-cGMP)以及WO2007135195中描述的那些，以及针对CD73或CD39的mAb)。多西他赛对M2巨噬细胞也有影响。参见例如Zitvogel et al.,Immunity 39:74-88(2013)。在另一个实例中，M2巨噬细胞靶向疗法包括氯膦酸盐-脂质体(clodronate-liposome)(Zeisberger,et al.,Br JCancer.95:272-281(2006))，基于DNA的疫苗(Luo,et al.,J Clin Invest.116(8):2132-2141(2006))和M2巨噬细胞靶向性促细胞凋亡肽(Cieslewicz,et al.,PNAS.110(40):15919-15924(2013))。也可以使用靶向自然杀伤T(NKT)细胞的免疫疗法，例如相对于II型NKT支持I型NKT的免疫疗法(例如CD1d I型激动剂配体)或抑制NKT的免疫抑制功能，例如拮抗TGF-beta或中和CD1d的免疫疗法。
一些有用的免疫疗法靶向免疫的代谢过程，并且包括腺苷受体拮抗剂和小分子抑制剂，例如，伊曲茶碱(istradefylline)(KW-6002)和SCH-58261；吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，例如小分子抑制剂(例如1-甲基-色氨酸(1MT)，1-甲基-d-色氨酸(D1MT)和Toho-1)或IDO特异性siRNA，或天然产物(例如Brassinin或exiguamine)(参见例如Munn,Front Biosci(Elite Ed).2012 Jan 1；4:734-45)或中和IDO的代谢物的单克隆抗体，例如针对N-甲酰基-犬尿氨酸的单克隆抗体。
在一些实施方案中，免疫疗法可以拮抗细胞因子和趋化因子诸如IL-10，TGF-beta，IL-6，CCL2和与癌症中免疫抑制相关的其他细胞因子和趋化因子的作用。例如，TGF-beta中和疗法包括抗TGF-beta抗体(例如fresolimumab，英夫利昔单抗(Infliximab)，Lerdelimumab(乐地单抗)，GC-1008)，反义寡脱氧核苷酸(例如Trabedersen)和TGF-beta的小分子抑制剂(例如LY2157299)(Wojtowicz-Praga,Invest New Drugs.21(1):21-32(2003))。拮抗免疫抑制细胞因子的疗法的另一个实例可以包括抗IL-6抗体(例如siltuximab)(Guo,et al.,Cancer Treat Rev.38(7):904-910(2012)。也可以使用针对IL-10或其受体的mAb，例如在Llorente et al.,Arthritis&Rheumatism,43(8):1790–1800,2000(抗-IL-10mAb)，或Newton et al.,Clin Exp Immunol.2014 Jul；177(1):261-8中描述的抗体的人源化形式(抗白介素-10R1单克隆抗体)。也可使用针对CCL2或其受体的mAb。在一些实施方案中，细胞因子免疫疗法与US8476246中所述的常用化学治疗剂(例如，吉西他滨，多西他赛，顺铂，他莫昔芬(tamoxifen))组合。
在一些实施方案中，免疫疗法可包括据信引发刺激针对癌症的免疫应答的“危险”信号，例如“PAMP”(病原体相关分子模式)或“DAMP”(损伤相关分子模式)的试剂。参见例如Pradeu and Cooper,Front Immunol.2012,3:287；Escamilla-Tilch et al.,ImmunolCell Biol.2013Nov-Dec；91(10):601-10。在一些实施方案中，免疫疗法可以激动toll样受体(TLR)以刺激免疫应答。例如，TLR激动剂包括疫苗佐剂(例如3M-052)和小分子(例如咪喹莫特(Imiquimod)，胞壁酰二肽(muramyl dipeptide)，CpG和米伐木肽(mifamurtide)(胞壁酰三肽(muramyl tripeptide)))以及多糖云芝多糖(krestin)和内毒素。参见Galluzi etal.,Oncoimmunol.1(5):699-716(2012),Lu et al.,Clin Cancer Res.Jan 1,2011；17(1):67–76,US8795678和US8790655。在一些实施方案中，免疫疗法可涉及施用引发抗癌免疫应答的细胞因子，参见Lee&Margolin,Cancers.3:3856-3893(2011)。例如，可以施用细胞因子IL-12(Portielje,et al.,Cancer Immunol Immunother.52:133-144(2003))或将其作为基因疗法(Melero,et al.,Trends Immunol.22(3):113-115(2001))。在另一个实例中，干扰素(IFN)(例如IFNgamma)可作为辅助疗法施用(Dunn et al.,Nat Rev Immunol.6:836-848(2006))。
在一些实施方案中，免疫疗法可以拮抗细胞表面受体以增强抗癌免疫应答。例如，增强抗癌免疫应答的拮抗性单克隆抗体可以包括靶向CTLA-4的抗体(依匹单抗(ipilimumab)，参见Tarhini and Iqbal,Onco Targets Ther.3:15-25(2010)和US7741345或替西木单抗(Tremelimumab))或靶向PD-1的抗体(纳武单抗(nivolumab)，参见Topalian,et al.,NEJM.366(26):2443-2454(2012)和WO2013/173223A1，派姆单抗(pembrolizumab)/MK-3475，皮地珠单抗(Pidilizumab)(CT-011))。
一些免疫疗法增强T细胞向肿瘤部位的募集(诸如内皮素受体-A/B(ETR A/B)阻断，例如用马西替坦(macitentan)或ETRA以及ETRB拮抗剂BQ123和BQ788的组合，参见Coffman et al.,Cancer Biol Ther.2013Feb；14(2):184-92)，或增强CD8T细胞记忆细胞形成(例如使用雷帕霉素(rapamycin)和二甲双胍(metformin)，参见例如Pearce et al.,Nature.2009Jul 2；460(7251):103-7；Mineharu et al.,Mol Cancer Ther.2014Sep25.pii:molcanther.0400.2014；和Berezhnoy et al.,Oncoimmunology.2014May 14；3:e28811)。免疫疗法还可以包括施用以下中的一种或多种：过继性细胞转移(ACT)，其涉及离体扩增的自体或同种异体肿瘤反应性淋巴细胞，例如树突细胞或肽与佐剂的转移；癌症疫苗，诸如基于DNA的疫苗，细胞因子(例如IL-2)，环磷酰胺，抗白介素-2R免疫毒素，前列腺素E2抑制剂(例如使用SC-50)和/或检查点抑制剂，包括抗体诸如抗CD137(BMS-663513)，抗PD1(例如纳武单抗，派姆单抗/MK-3475，皮地珠单抗(CT-011))，抗PDL1(例如BMS-936559，MPDL3280A)或抗CTLA-4(例如依匹单抗；参见例如Krüger et al.,“Immune basedtherapies in cancer,”Histol Histopathol.2007Jun；22(6):687-96；Eggermont etal.,“Anti-CTLA-4antibody adjuvant therapy in melanoma,”Semin Oncol.2010 Oct；37(5):455-9；Klinke DJ 2nd,“A multiscale systems perspective on cancer,immunotherapy,and Interleukin-12,”Mol Cancer.2010Sep 15；9:242；Alexandrescu etal.,“Immunotherapy for melanoma:current status and perspectives,”JImmunother.2010Jul-Aug；33(6):570-90；Moschella et al.,“Combination strategiesfor enhancing the efficacy of immunotherapy in cancer patients,”Ann N Y AcadSci.2010Apr；1194:169-78；Ganesan and Bakhshi,“Systemic therapy for melanoma,”Natl Med J India.2010Jan-Feb；23(1):21-7；Golovina and Vonderheide,“RegulatoryT cells:overcoming suppression of T-cell immunity,”Cancer J.2010Jul-Aug；16(4):342-7。在一些实施方案中，方法包括施用包含肿瘤脉冲树突细胞(tumor-pulseddendritic cell)的组合物，例如，如WO2009/114547和其中引用的参考文献中所述。也参见Shiao et al.,Genes&Dev.2011.25:2559-2572。
MDSC消减疗法
本文所述的方法还可包括施用消减MDSC，改变MDSC的定位或降低MDSC(任选地包括Tspan33+MDSC)的活性的治疗。在一些实施方案中，治疗将特异性靶向Tspan33+MDSC，例如将包括施用如本文所述的靶向Tspan33的分子。在一些实施方案中，治疗可以不特异性靶向Tspan33+MDSC群体，但仍导致Tspan33+MDSC和/或任何Tspan33-MDSC的消减，定位改变或活性降低(在本文中统称为“非特异性MDSC消减免疫疗法”)。例如，许多癌症治疗已显示降低MDSC的水平，包括磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂诸如西地那非(sildenafil)和他达拉非(tadalafil；)；硝基阿司匹林(Nitroaspirin)(NO-阿司匹林)；合成的三萜类诸如甲基巴多索隆(Bardoxolone methyl)(CDDO-Me)，环加氧酶2(Cyclooxygenase 2)(COX2)抑制剂诸如塞来昔布(celecoxib)和罗非考昔(rofecoxib)；精氨酸酶抑制剂如N-羟基-L-精氨酸(NOHA)，正-NOHA，硝基阿司匹林或N(G)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)；NF-κB抑制剂；一氧化氮合酶抑制剂，例如1-NMMA，硝基阿司匹林；集落刺激因子及其受体的抑制剂，例如阻断CSF-1R的单克隆抗体(例如IMC-CS4)以及CSF-1R(例如PLX3397)或cFMS激酶(例如GW2580)的小分子抑制剂；组胺或H2阻断剂诸如西咪替丁(cimetidine)；IL-17；全反式视黄酸(ATRA)；维生素D3或维生素A；TLR9配体激动剂，诸如CpG寡脱氧核苷酸(ODN)；硝酸双膦酸盐(N-双膦酸盐)，诸如唑来膦酸(zoledronic acid)；STAT3激活的抑制剂，诸如肽模拟物，小分子抑制剂(例如，姜黄色素(Curcurmin)的衍生物诸如葫芦素B(cucurbitacin B)(CuB))和铂剂，诸如顺铂；舒尼替尼；吉西他滨；5-氟尿嘧啶(5-FU)；紫杉醇；热休克蛋白90(HSP90)抑制剂，诸如17-DMAG(17-二甲氨基乙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(geldanamycin))；与假单胞菌外毒素连接的IL-13(IL-13-PE)；和抗Gr1+抗体。参见例如Wesolowski et al.,JImmunother Cancer.1:10(2013)doi:10.1186/2051-1426-1-10.eCollection 2013。
监测Tspan33+MDSC的水平
本文描述的是可用于监测受试者中的MDSC水平的方法，例如监测疗法(例如，免疫疗法，如本文所述的旨在消减MDSC的治疗，或可以已知或疑似影响MDSC水平或者可以未知或未怀疑影响MDSC水平的另一种癌症疗法)的效力。在这些实施方案中，多次检测Tspan33+细胞的水平(例如，在来自肿瘤的样品，诸如活组织检查样品，或在循环中，例如在血液样品中)；Tspan33+细胞水平的变化指示疗法的功效。例如，肿瘤中Tspan33+细胞的减少指示免疫抑制的减少，例如疗法有效消减MDSC；尽管这与疗法，诸如免疫疗法或如本文所述的旨在消减Tspan33+MDSC的治疗特别相关，但Tspan33+MDSC的减少还指示其他类型的疗法通过可以包括除去允许MDSC生成/迁移的因子的机制消减MDSC。此外，监测受试者中Tspan33+MDSC的水平可用于确定何时开始治疗；例如，这些监测方法可以用于确定何时在(例如，使用本文的方法)治疗的受试者中施用免疫疗法以在施用免疫疗法之前消减Tspan33+细胞。对于不希望MDSC消减的状况，例如在自身免疫性疾病中，也可以监测MDSC的水平；在这些情况下，MDSC的增加与对疗法的改善的反应相关。
本文还描述了可用于确定或监测癌症疗法对受试者中MDSC水平的影响的方法。类似于上述方法，多次检测Tspan33+细胞的水平(例如，在来自肿瘤的样品，诸如活组织检查样品，或在循环中，例如在血液样品中)；Tspan33+水平的变化指示指示该疗法对MDSC水平有影响(即，Tspan33+水平的增加指示该疗法增加了MDSC水平，并且Tspan33+水平的降低指示该疗法降低了MDSC水平)。在一些实施方案中，该信息可以用于确定是否应该使用另外的疗法，例如是否应该将靶向MDSC的另外的疗法添加到初始疗法中。因此，方法可以用来选择多种治疗模式；当在初始疗法施用后检测到Tspan33+MDSC增加时，可以选择(并且任选施用)如本文所述的降低MDSC水平的另外的疗法。
另外，本文描述了用于预测疗法功效的方法。已经在下列各项中证实了肿瘤负荷与MDSC频率之间的直接关系：几种小鼠模型(Younos et al.,Int.Immunopharmacol.13:245–256(2012)；Donkor et al.,Int.Immunopharmacol.9:937–948(2009))，和胰腺癌的人类临床研究(Porembka et al.,Cancer Immunol.Immunother.61:1373–1385(2012))；胶质瘤(Kohanbash and Okada,Immunol Invest.41(6-7):658-79(2012))；胃癌(Wang et al.,J.Immunol.190,794–804(2013))；结肠直肠癌(Zhang et al.,PLoS One.8(2):e57114(2013))；乳腺癌(Markowitz et al.,Breast Cancer Res Treat.140(1):13-21(2013))；Gabitass et al.,Cancer Immunol Immunother.60(10):1419-30(2011))；和包括乳腺癌的实体瘤(Diaz-Montero et al.,Cancer Immunol.Immunother.58:49–59(2009))。因此，MDSC水平的降低(如本文通过Tspan33+水平的降低所确定)与肿瘤缩小相关；MDSC的较高水平(如由Tspan33+水平的增加，或由存在超过阈值(例如，代表有可能反应的受试者中的水平的阈值)的Tspan33+水平所指示)预测对疗法的较差反应或无反应。
监测方法可以包括确定Tspan33+细胞的第一或基线水平，并且然后例如在施用一种或多种治疗(例如旨在消减Tspan33+细胞的治疗或免疫疗法)之后或期间，随时间确定一个或多个后续水平。本领域已知的方法可用于检测并任选定量样品中的Tspan33+细胞，例如固体或液体样品中的免疫测定(例如使用可检测的第一或第二抗体，例如荧光标记的的或酶促可检测的抗体)；或细胞分选(例如，例如流体样品中荧光激活细胞分选术)或通过western印迹或基于RNA的表达分析。
尽管在大多数实施方案中将使用Tspan33蛋白的检测，但也可以使用Tspan33mRNA的检测，例如使用RNA原位杂交或本领域已知的其它方法。
MDSC的二级标志物(Secondary Marker)
在一些情况下，除Tspan33外还可以希望使用二级标志物来鉴定MDSC。作为一个实例，对于体外扩增的细胞，可以使用单独的Tspan33。在一些实施方案中，例如在样品中存在造血细胞的混合群体的情况下，例如，其中Tspan33可以在样品中的某些其他细胞类型上表达，使用二级标志物可以是希望的；在这些情况下，也可使用CD33或CD14的检测，即Tspan33+CD33+，Tspan33+CD14+或Tspan33+CD33+CD14+细胞的检测可用于本文所述的任何方法中。或者/另外，可以使用二级标志物来排除非MDSC；例如，可以使用标志物诸如ABO血型抗原或血型糖蛋白A阳性RBC抗原或Diego抗原来排除红细胞。其他排除性二级标志物可以包括HLA-DR高和Lin阳性群体。
靶向Tspan33的分子
本文还描述了靶向Tspan33并且可用于MDSC消减疗法，预后和诊断的分子以及鉴定那些分子的方法。本文所述的方法可以包括施用靶向Tspan33的分子，从而消减Tspan33+MDSC。此类分子可以包括抗体或其他治疗性化合物，例如小分子，多肽，肽或抑制性核酸。
抗Tspan33抗体
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或其抗原结合部分。免疫球蛋白分子的抗原结合部分的实例包括保留结合抗原的能力的F(ab)和F(ab')2片段。抗体可以是多克隆的，单克隆的，重组的，嵌合的，去免疫的或人源化的，完全人的，非人的(例如鼠的)或单链抗体。在一些实施方案中，抗体具有效应器功能并且可以固定补体。在一些实施方案中，抗体具有降低的结合Fc受体的能力或不具有结合Fc受体的能力。例如，抗体可以是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型，片段或其他突变体，例如其具有诱变的或缺失的Fc受体结合区。制备抗体及其片段的方法是本领域已知的，参见例如Harlow et.al.编,Antibodies:A Laboratory Manual(1988)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,(N.Y.Academic Press 1983)；Howard and Kaser,Making and Using Antibodies: A Practical Handbook(CRC Press；第1版,Dec 13,2006)；Kontermann andDübel,Antibody Engineering Volume 1(Springer Protocols)(Springer；第2版,May21,2010)；Lo,Antibody Engineering:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Humana Press；Nov 10,2010)；和Dübel,Handbook ofTherapeutic Antibodies: Technologies,Emerging DevelopmentsandApprovedTherapeutics,(Wiley-VCH；第1版2010年9月7日)。可以使用这些方法中的任何一种来制备抗ICAM抗体。另外，与人Tspan33结合的抗体是本领域已知的并且可商购获得，例如来自Abbexa；Abcam；Abnova Corporation；Acris Antibodies GmbH；antibodies-online；Atlas Antibodies；Aviva SystemsBiology；Creative Diagnostics；LifeSpan BioSciences；Novus Biologicals；R&DSystems；Santa Cruz Biotechnology,Inc.；St John's Laboratory；和United StatesBiological。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指已经被工程化改造为包含至少一个人恒定区的抗体。例如，小鼠抗体(例如小鼠单克隆抗体)轻链可变区中的一个或全部(例如一个，两个或三个)和/或重链可变区中的一个或全部(例如一个，两个或三个)可以各自连接到人恒定区，诸如但不限于IgG1人恒定区。相对于非嵌合抗体，嵌合抗体通常对人类具有较低的免疫原性，并因此在某些情况下提供治疗益处。本领域技术人员将了解嵌合抗体，并且也将了解适合其生成的技术。参见例如美国专利号4,816,567；4,978,775；4,975,369；和美国专利号4,816,397。
术语“人源化抗体”当该术语在本文中使用时是指已经被工程化改造为在可变区中包含一个或多个人框架区以及重链和/或轻链的非人(例如小鼠，大鼠或仓鼠)互补决定区(CDR)的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含除了CDR区之外完全人的序列。相对于非人源化抗体，人源化抗体通常对人类具有较低的免疫原性，并且因此在某些情况下提供治疗益处。人源化抗体是本领域已知的，并且用于产生人源化抗体的合适技术也是已知的。参见例如Hwang et al.,Methods 36:35,2005；Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033,1989；Jones et al.,Nature 321:522-25,1986；Riechmann et al.,Nature 332:323-27,1988；Verhoeyen et al.,Science 239:1534-36,1988；Orlandi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:3833-3837,1989；美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；以及WO 90/07861。
如本文所用，术语“完全人的抗体”是仅含有人衍生的氨基酸序列的抗体或抗体的抗原结合片段。例如，可以从人B细胞或人杂交瘤细胞产生完全人的抗体。在另外的实施方案中，抗体可以从含有人重链免疫球蛋白和人轻链免疫球蛋白的基因座，或含有编码特定人抗体的重链和轻链的核酸的转基因动物产生。
“互补决定区”或“CDR”当该术语在本文中使用时是指重链和轻链多肽两者的可变区内的主要负责介导特异性抗原识别的短多肽序列。CDR已经由Kabat,et al.,J.Biol.Chem.252,6609-6616,1977；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917,1987；和MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745,1996描述。在每个VL和每个VH内有三个CDR(称为CDR1，CDR2和CDR3)。
“片段”或“抗体片段”当该术语在本文中使用时是指来源于抗体多肽分子的多肽(例如，抗体重链和/或轻链多肽)，其不包含全长抗体多肽，但是仍然至少包含全长抗体多肽中能够结合抗原的部分。抗体片段可以包含全长抗体多肽的切割部分，但该术语不限于这种切割的片段。抗体片段可以包括例如Fab片段，F(ab’)2片段，scFv(单链Fv)片段，线性抗体，单特异性或多特异性抗体片段，诸如双特异性，三特异性和多特异性抗体(例如双抗体(diabody)，三抗体(triaabody)，四抗体(tetrabody))，微型抗体(minibody)，螯合重组抗体，三抗体或二抗体(bibodies)，胞内抗体(intrabodies)，纳米抗体，小模块免疫药物(small modular immunopharmaceutical)(SMIP)，结合域免疫球蛋白融合蛋白，骆驼化抗体和含VHH的抗体。本领域已知抗原结合抗体片段的其他实例。
“框架区”当该术语在本文中使用时是指重链和轻链多肽两者的可变区内不是CDR序列，并且主要负责维持CDR序列的正确定位以允许抗原结合的氨基酸序列。如本领域已知的，尽管框架区本身通常不直接参与抗原结合，但是某些抗体的框架区内的某些残基可以直接参与抗原结合，或者可以影响CDR中的一个或多个氨基酸与抗原相互作用的能力。
在一些实施方案中，抗Tspan33抗体是双特异性抗体，例如在其结合臂中具有双重特异性并因此同时结合两种抗原的抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体结合存在于同一细胞上的两种抗原，例如都在MDSC上，例如结合Tspan33和ICAM4，CD33或CD14。在一些实施方案中，双特异性抗体结合存在于两种不同细胞(即两种类型的细胞)上的抗原，诸如MDSC上的Tspan33加上可存在于不同类型的细胞上的抗原，例如PD-1，PDL1，GITR，CTLA4或CD16A。因此，方法可以包括使用结合Tspan33和CD33，CD14，PDL1，PD1，GITR，CTLA4或CD16A的双特异性抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的；参见例如Kufer et al.,TRENDS in Biotechnology 22(5):238-244(2004)；Reusch et al.,mAbs 6(3):727–738(2014)；Kudo et al.,Tohuko J.Exp.Med.188:275-288(1999)；Das and Suresh,MethodsMol Med.109:329-46(2005)；Nolan and O’Kennedy,Biochim Biophys Acta.1040(1):1-11(1990)；Compte et al.,Oncoimmunology.2014May 23；3:e28810.eCollection 2014；Jost and Plückthun,Curr Opin Struct Biol.27C:102-112(2014)；和Byrne et al.,Trends Biotechnol.31(11):621-32(2013)。
如本文所述的抗Tspan33抗体可用于递送多种抗癌治疗剂以杀死肿瘤细胞或MDSC自身，所述抗癌治疗剂例如为放射性同位素；抗癌药物诸如基因毒素(genotoxin)；或任何其他细胞毒部分，例如植物，真菌或细菌来源的分子，或生物蛋白质(例如蛋白质毒素)或颗粒(例如，重组病毒颗粒，例如经由病毒外壳蛋白)或其混合物。治疗剂可以是细胞内活性药物或其他试剂(agent)，例如短程辐射发射体(short range radiation emitter)，包括例如如本文所述的短距离、高能量α-发射体。在一些实施方案中，抗Tspan33抗体可偶联于植物或细菌来源的分子(或其衍生物)，例如美登素生物碱(maytansinoid)(例如美登醇(maytansinol)或DM1美登素。DM1是美坦辛(maytansine)的含巯基的衍生物，其可以例如通过当在靶细胞内释放DM1的二硫化物接头连接到肽。二硫化物接头在储存和血清中显示出比其他接头更高的稳定性。美坦辛是通过防止微管形成并使现存微管解聚而实现细胞杀伤的细胞毒剂。它比目前临床使用的抗癌剂诸如多柔比星，甲氨蝶呤和长春花生物碱的细胞毒性高100至1000倍。或者，如本文所述的抗Tspan33抗体可偶联至紫杉烷，加利车霉素(calicheamicin)，蛋白体抑制剂或拓扑异构酶抑制剂。[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧代-3-苯基-2-[(3-巯基乙酰基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸是合适的蛋白体抑制剂。N,N’-双[2-(9-甲基吩嗪-1-甲酰氨基(carboxamido))乙基]-1,2-乙二胺是一种合适的拓扑异构酶抑制剂。
酶促活性毒素及其片段以下列各项示例：白喉毒素A片段，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(abrin)A链，α-sacrin，某些油桐(Aleuritesfordii)蛋白，某些香石竹毒蛋白(Dianthin)，美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白质(PAP，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica chantintia)抑制剂，麻风树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂，白树毒素(gelonin)，米托洁林(mitogillin)，局限曲霉素(mitogillin)，酚霉素(phenomycin)和伊诺霉素(enomycin)。在一些实施方案中，抗Tspan33抗体缀合到美登素生物碱，例如美登醇(参见美国专利号5,208,020)，CC-1065(参见美国专利号5,475,092，5,585,499，5,846,545)。在WO84/03508和WO85/03508中描述了用于制备免疫毒素的酶活性多肽的方法，将其通过引用并入本文。可以与抗体缀合的细胞毒部分的实例包括阿霉素，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，道诺霉素(daunomycin)，甲氨蝶呤，新制癌菌素(neocarzinostatin)和铂。
为了杀死或消除癌细胞或Tspan33+MDSC，可以将抗Tspan33抗体与仅在紧邻前药活化剂时才被激活的前药缀合。前药活化剂与第二抗Tspan33抗体，优选结合相同受体(例如Tspan33)或细胞(例如CD33)上的非竞争性位点的抗体结合。两种抗Tspan33抗体是否结合竞争性或非竞争性结合位点可通过常规竞争性结合测定来确定。适合使用的药物-前药对是本领域已知的，参见例如Blakely et al.,Cancer Research 56:3287 3292(1996)。
与如本文所述的抗Tspan33抗体附接的药物还可以包括来源于宿主生物学过程或有利地调控宿主生物学过程的试剂，诸如干扰素，肿瘤生长因子，肿瘤坏死因子，生长因子诸如GM-CSF和G-CSF，以及白介素例如白介素-2，白介素-6，白介素-7和白介素-12等。与如本文所述的抗Tspan33抗体附接的药物可以包含损害DNA和/或防止细胞繁殖的试剂，诸如基因毒素。基因毒素包括但不限于烷化剂，抗代谢物，DNA切割剂(DNA cutter)，DNA结合剂，拓扑异构酶毒物和纺锤体毒素(spindlepoison)。烷化剂的实例是洛莫司汀(lomustine)，卡莫司汀(carmustine)，链脲霉素(streptozocin)，氮芥(mechlorethamine)，美法仑(melphalan)，尿嘧啶氮芥(uracilnitrogenmustard)，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，异环磷酰胺(iphosphamide)，顺铂，卡铂，丝裂霉素，噻替派(thiotepa)，达卡巴嗪(dacarbazin)，丙卡巴肼(procarbazine)，六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)，三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)，白消安(busulfan)，哌泊溴烷(pipobroman)，米托坦(mitotane)和其他普拉廷白铜(platine)衍生物。
或者，可将抗Tspan33抗体偶联至在肿瘤部位定位时导致几个细胞直径内的杀死的高能辐射发射体，例如放射性同位素，例如131I，γ-发射体。参见，例如，Order,“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody in Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.(编),pp 303-316(Academic Press 1985)。其他合适的放射性同位素包括α-发射体，诸如212Bi，213Bi和211At，和β-发射体，诸如186Re和90Y。Lu117也可以用作成像和细胞毒剂两者。
也可以使用放射免疫疗法(RIT)，其使用用131I，90Y和177Lu标记的抗Tspan33抗体进行。这三种核素的物理特性存在显著差异，并且因此，放射性核素的选择对于向肿瘤递送最大辐射剂量可以是重要的。90Y的较高的β能粒子对于体积大的肿瘤可以是良好的，但对于小的肿瘤尤其是骨转移(例如，前列腺癌常见的那些)可以不是必需的。131I的相对低能量的β粒子是理想的，但放射性碘化分子的体内脱卤是内化抗Tspan33抗体的主要缺点。相反，与90Y相比，177Lu具有低能量β粒子(仅具有0.2-0.3mm的范围)，并且对骨髓递送低得多的辐射剂量。此外，由于较长的物理半衰期(与90Y相比)，肿瘤停留时间更长。结果，经177Lu标记的试剂的较高活性(更多mCi量)可以以相对较低的辐射剂量施用于骨髓。已经有几项临床研究，其调查了经177Lu标记的抗体在治疗各种癌症中的用途(参见例如Mulligan et al.,ClinCancer Res.1:1447-1454(1995)；Meredith et al.,J Nucl Med 37:1491-1496(1996)；Alvarez et al.,Gynecologic Oncology 65:94-101(1997))。
抗Tspan33抗体也可以与病毒颗粒上存在的病毒表面蛋白缀合或融合。例如，抗Tspan33抗体可以与病毒表面蛋白融合(例如形成融合蛋白)。或者，抗Tspan33抗体可化学缀合(例如，通过化学接头)至病毒表面蛋白。优选地，病毒是与内吞膜融合的病毒，例如流感病毒，使得病毒与抗Tspan33抗体一起被内化，并由此进入和杀死Tspan33+MDSC。可以将病毒基因工程化改造为细胞性毒素。例如，病毒可以表达或诱导表达对细胞有毒性的基因，例如细胞死亡促进基因。优选地，此类病毒将不能进行病毒复制。
细胞毒性肽或蛋白质的其它实例包括伊达比星(Idarubicin)；CRM9(例如，FN18-CRM9，Knechtle et al.,Transplantation 1997；63:1-6)；或美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白质。在一些实施方案中，细胞毒性蛋白是细菌毒素，例如白喉毒素(DT)或其部分或变体，例如Met1-Thr387，例如在以下中所描述的：Aullo et al.,EMBO J.11(2):575-83(1992)；Abi-Habib et al.,Blood.104(7):2143-2148(2004)；Perentesis et al.,Proc.Nati.Acad.Sci.USA 85:8386-8390(1988)；Zettlemeissl et al.,Gene.41(1):103–111(1986)；US 2009/0010966；US20090041797；US5843711；US7585942；US7696338；和US20080166375；一甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E)；或假单胞菌外毒素(PE)或其部分或变体，例如如在以下所描述的：US 4,545,985；4,892,827；5,458,878；7,314,632；Song et al.,Protein Expression and Purification 44(1):52-57(2005)；Theuer etal.,J.Biol.Chem.267(24):16872-16877(1992)；Heimbrook et al.,Proc Natl Acad SciU S A.87(12):4697–4701(1990)；Debinski et al.,Mol Cell Biol.11(3):1751–1753(1991)；Chaudhary et al.,Proc.Nadl.Acad.Sci.USA 87:308-312(1990)。在一些实施方案中，细胞毒性蛋白是植物毒素，例如植物全毒素(例如II类核糖体失活蛋白，诸如蓖麻毒蛋白(例如去糖基化的蓖麻毒蛋白A链(dgA))，相思豆毒蛋白，槲寄生凝集素(mistletoelectin)或蒴莲根毒素(modeccin))或半毒素(I类核糖体失活蛋白，例如，PAP，皂草毒蛋白(saporin)，异株泻根毒蛋白(bryodin)1，Bouganin或白树毒素(gelonin))，或其保留细胞毒活性的片段或变体。参见例如Neville et al.,J Contr Rel 1993；24:133-141；Vallera,Blood 1994；83:309-317；Vitetta et al.,Immunology Today 1993；14:252-259；Kreitman et al.,AAPS Journal.2006；8(3):E532-E551)。合适的序列是本领域已知的。
可以使用任何已知的手段，例如化学或肽接头将抗癌剂与抗体偶联以产生稳定的连接；可以使用可切割的(二硫化物，腙或肽)或不可切割的(硫醚)接头。在一些实施方案中，使用肽接头，例如柔性或刚性肽接头。在一些实施方案中，包括组织蛋白酶可切割接头(缬氨酸-瓜氨酸)和一个或多个间隔物，例如对氨基苄基氨基甲酸酯间隔物。也可以使用交联试剂诸如琥珀酰亚胺基反-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(succinimidyltrans-4-(maleimidyl methyl)cyclohexane-1-carboxylate)(SMCC)。
在上述实例中，其中抗Tspan33抗体与细胞内作用的治疗剂连接(即，抗体-药物缀合物)，期望使用在与MDSC结合后经历内化的抗体。在一些实施方案中，可使用未被内化但允许补体结合并引起抗体依赖性细胞毒性的抗体以主动消减MDSC。在一些实施方案中，优选紧密结合且未被内化的抗体，例如用于检测和监测Tspan33+MDSC水平，或用于血浆置换术(plasmapharesis)。在一些实施方案中，也可以使用与Tspan33结合并例如通过物理机制诸如空间抑制来阻止与其受体结合的抗体。
抗Tspan33抗体还可以用于从受试者在身体上消减Tspan33+MDSC，例如使用具有Tspan33结合交换膜或树脂的免疫吸附/血浆置换术(或治疗性血浆交换)。参见例如Reevesand Winters,Br J Haematol.2014Feb；164(3):342-51。
在一些实施方案中，代替传统的免疫球蛋白或单克隆抗体，使用噬菌体，例如，如Petrenko and Smith,Protein Eng.13(8):589-92(2000)中所描述的。
小分子
如本文所用，“小分子”是指分子量低于约3,000道尔顿的小有机或无机分子。通常，可用于本发明的小分子具有小于3,000道尔顿(Da)的分子量。小分子可以是例如至少约100Da至约3,000Da(例如，约100至约3,000Da，约100至约2500Da，约100至约2,000Da，约100至约1,750Da，约100至约1,500Da，约100至约1,250Da，约100至约1,000Da，约100至约750Da，约100至约500Da，约200至约1500，约500至约1000，约300至约1000Da，或约100至约250Da)。本文包括用于筛选测试化合物，例如小分子测试化合物以鉴定试剂的方法，所述试剂靶向Tspan33并消减Tspan33+MDSC的数量和/或活性并且可用于治疗如本文所述的癌症。如本文所用，Tspan33+MDSC的活性可以包括表达NOS2和Arg1、抑制T细胞功能(例如IFNg产生)、和抑制NK细胞溶解活性。用于这些活性中每个的测定法在本领域中是已知的。例如，为确定化合物，例如抗体或小分子是否是中和性的，将该化合物加入到Tspan33+MDSC，加入T细胞，并且例如使用抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞，并且检测T细胞增殖或IFNgamma的分泌，如本文所示。T细胞增殖和IFNg分泌的增加指示化合物中和MDSC；参见(图4)。或者/另外，可以使用NK细胞裂解测定，并且评估化合物(例如小分子或抗体)抑制Tspan33+MDSC介导的对NK细胞裂解活性的抑制的能力，例如，裂解K562细胞的能力。在化合物存在下NK细胞裂解的增加指示该化合物抑制MDSC活性。
测试化合物可以是例如天然产物或组合化学文库的成员。应使用一组不同的分子来覆盖多种功能，诸如电荷，芳香性，氢键键合，柔性，大小，侧链长度，疏水性和刚性。适用于合成小分子的组合技术在本领域是已知的，例如以Obrecht and Villalgordo,Solid- SupportedCombinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries,Pergamon-Elsevier Science Limited(1998)示例，并且包括诸如“分开和合并(split and pool)”或“平行”合成技术，固相和溶液相技术以及编码技术的技术(参见例如Czarnik,Curr.Opin.Chem.Bio.1:60-6(1997))。另外，许多小分子文库是可商购的。美国专利号6,503,713中列出了许多合适的小分子测试化合物，将其整体并入本文作为参考。
要筛选的文库可以包含多种类型的测试化合物。给定的文库可以包含一组结构相关或不相关的测试化合物。在一些实施方案中，测试化合物是肽或肽模拟物分子。在一些实施方案中，测试化合物是核酸。
在一些实施方案中，可以如下获得测试化合物及其文库：系统地改变第一测试化合物，例如与靶多肽的已知天然结合配偶体结构相似的第一测试化合物，或例如使用本领域已知的方法或本文所述的方法鉴定为能够结合靶多肽的第一小分子的结构，并将该结构与所得到的生物学活性相关联，例如结构-活性关系研究。如本领域技术人员将认识到的，存在用于创建此类结构-活性关系的多种标准方法。因此，在一些情况下，该工作可以在很大程度上是凭经验的，而在另一些情况下，内源多肽或其部分的三维结构可以用作合理设计一个小分子化合物或多个小分子化合物的起点。例如，在一个实施方案中，例如使用本文的方法筛选小分子的通用文库。
在一些实施方案中，将测试化合物应用于测试样品，例如癌细胞或活的癌组织或器官，例如肿瘤外植块(explant)，并且评估测试化合物的一种或多种效应。例如，在培养的或原代的细胞中，可以评估测试化合物降低Tspan33表达和/或Tspan33+MDSC数量或活性的能力。
在一些实施方案中，测试样品是或来源于(例如样品取自)如本文所述的病症的体内模型。例如，可以使用动物模型，例如啮齿动物，诸如大鼠或小鼠中的异种移植物模型，并且可以评估测试化合物抑制Tspan33表达和/或Tspan33+MDSC数量或活性的能力。
评估这些效应的方法是本领域已知的。例如，可以在基因或蛋白质水平上评估调节蛋白质表达的能力，例如使用定量PCR或免疫测定法。在一些实施方案中，高通量方法，例如如本领域已知的蛋白质或基因芯片可用于检测对Tspan33表达的影响(参见例如Ch.12,Genomics,in Griffiths et al.编Modern genetic Analysis,1999,W.H.Freeman andCompany；Ekins and Chu,Trends in Biotechnology,1999,17:217-218；MacBeath andSchreiber,Science 2000,289(5485):1760-1763；Simpson,Proteins and Proteomics:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002；Hardiman,Microarrays Methods and Applications:Nuts & Bolts,DNA Press,2003)。
已经通过本文所述方法筛选并确定降低Tspan33表达和/或Tspan33+MDSC数量或活性的测试化合物可被认为是候选化合物。可认为下述的候选化合物是候选治疗剂，所述候选化合物已经被筛选，例如在病症的体内模型，例如动物肿瘤模型，例如肿瘤异种移植物模型中筛选，并且确定为对病症，例如对该病症的一种或多种症状(例如对肿瘤生长或转移)具有期望的作用。候选治疗剂一旦在临床环境中筛选后就是治疗剂。候选化合物，候选治疗剂和治疗剂可以任选地优化和/或衍生化，并与生理上可接受的赋形剂一起配制以形成药物组合物。
因此，可以选择在第一筛选中被鉴定为“命中(hit)”的测试化合物(例如降低Tspan33表达和/或Tspan33+MDSC数量或活性的测试化合物)并且例如使用合理的设计来系统性地改变以优化结合亲和力，亲合力，特异性或其他参数。也可以使用本文描述的方法来筛选这种优化。因此，在一个实施方案中，本发明包括使用本领域已知和/或本文所述的方法筛选化合物的第一文库，鉴定该文库中的一个或多个命中，对那些命中进行系统性的结构改变以产生与命中结构相关的化合物的第二文库，并使用本文的方法筛选第二文库。
鉴定为命中的测试化合物可以认为是可用于治疗如本文所述的癌症的候选治疗性化合物。用于确定“命中”结构的多种技术可用于本文所述的方法中，例如，NMR，质谱法，配备有电子俘获检测器(electron capture detector)的气相色谱，荧光和吸收光谱法。因此，本发明还包括通过本文所述方法鉴定为“命中”的化合物，和其施用方法以及其在治疗，预防本文所述的病症或延迟本文所述的病症的发展或进展中的用途。
鉴定为候选治疗化合物的测试化合物可以通过施用于癌症动物模型来进一步筛选。可以监测动物病症的改变，例如，病症的参数，例如与临床结果有关的参数的改善。在一些实施方案中，参数是肿瘤大小，肿瘤生长速率，复发或转移，并且改善将是肿瘤大小的减小或正常快速生长的肿瘤的无变化；减少或停止肿瘤生长；减少复发，延迟复发或无复发；或减少转移，延迟转移或无转移。在一些实施方案中，参数是寿命或诊断后的存活时间，并且改善将是诊断后寿命或存活时间的增加。
用于小分子的上述方法也可用于鉴定靶向Tspan33并抑制Tspan33+MDSC的活性或减少其数量的肽，多肽或核酸。
抑制性核酸
可用于本方法和组合物的抑制性核酸包括与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功能的反义寡核苷酸，核酶，外部指导序列(EGS)寡核苷酸，siRNA化合物，单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物诸如siRNA化合物，修饰的碱基/锁定核酸(LNA)，肽核酸(PNA)以及其他寡聚化合物或寡核苷酸模拟物。在一些实施方案中，抑制性核酸包括反义RNA，反义DNA，嵌合反义寡核苷酸，包含经修饰的连接的反义寡核苷酸，干扰RNA(RNAi)，短干扰RNA(siRNA)；微小的干扰RNA(miRNA)；小的暂时RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导基因激活(RNAa)；小活化RNA(saRNA)或其组合。参见例如WO 2010040112。
在一些实施方案中，抑制性核酸的长度为10至50、10至20、10至25、13至50或13至30个核苷酸。本领域普通技术人员将会理解，这体现了具有长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸，或其中的任何范围的互补部分的抑制性核酸。在一些实施方案中，抑制性核酸的长度是15个核苷酸。在一些实施方案中，抑制性核酸长度为12或13至20、25或30个核苷酸。本领域普通技术人员将理解，这体现了具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，或其中的任何范围的互补部分(互补部分是指抑制性核酸中与靶序列互补的那些部分)的抑制性核酸。
用于本方法中的抑制性核酸与靶RNA充分互补，即充分良好且以足够的特异性杂交，以产生所期望的效果。“互补”是指在包含天然或非天然存在的碱基或其类似物的两个序列之间通过氢键键合配对的能力。例如，如果抑制性核酸的一个位置上的碱基能够与RNA的相应位置上的碱基进行氢键键合，则认为该碱基在该位置处彼此互补。不需要100％的互补性。
可以使用常规方法来设计以足够特异性与Ablim3序列结合的抑制性核酸。在一些实施方案中，所述方法包括使用本领域已知的生物信息学方法来鉴定二级结构的区域，例如一个，两个或更多个茎环结构或假结(pseudoknot)，并选择用抑制性核酸靶向的那些区域。例如，可以使用“基因步行(gene walk)”方法来优化核酸的抑制活性；例如，可以制备跨越靶RNA长度的10-30个核苷酸的一系列寡核苷酸，随后测试活性。任选地，可以在靶序列之间留下例如5-10个核苷酸或更多的缺口，以减少合成和测试的寡核苷酸的数量。GC含量优选在约30-60％之间。在可能的情况下(例如，对于非常短(例如，约9-10nt)的寡核苷酸或许是不可能的)，应避免三个或更多个G或C的连续运行。
在一些实施方案中，可以将抑制性核酸分子设计成靶向RNA序列的特定区域。例如，可以靶向特定的功能区域，例如包含已知的RNA定位基序的区域(即与RNA发挥作用的靶核酸互补的区域)。或者/另外，可以靶向高度保守的区域，例如通过比对来自不同物种诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)的序列并寻找具有高度同一性的区域而鉴定的区域。可以常规地使用碱基局部比对搜索工具(BLAST程序)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)，例如使用缺省参数测定同一性百分比。
一旦已经鉴定了一个或多个靶区域，片段或位点，例如，在本领域已知的或本文提供的Ablim3序列内，选择与靶标充分互补的抑制性核酸化合物，即充分良好地并以足够的特异性杂交(即，基本上不与其他非靶RNA结合)，以产生所期望的效果。
在本发明的上下文中，杂交是指互补的核苷或核苷酸碱基之间的氢键键合，其可以是沃森-克里克(Watson-Crick)，Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补性核酸碱基。如本文所用，互补性是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸的某个位置上的核苷酸能够与RNA分子的相同位置上的核苷酸进行氢键键合，则认为抑制性核酸和RNA在该位置处彼此互补。抑制性核酸和RNA当每个分子中足够数量的相应位置被能彼此进行氢键键合的核苷酸占据时彼此互补。因此，“特异性可杂交”和“互补”是用于指示足够程度的互补性或精确配对，使得抑制性核酸和RNA靶标之间发生稳定且特异性结合的术语。例如，如果抑制性核酸的一个位置上的碱基能够与RNA的相应位置上的碱基进行氢键键合，则认为碱基在该位置处彼此互补。不需要100％的互补性。
在本领域中应该理解，互补的核酸序列不需要与其要特异性可杂交的靶核酸的序列100％互补。当序列与靶RNA分子的结合干扰靶RNA的正常功能以引起活性丧失，并且存在足够程度的互补性以避免该序列在期望特异性结合的条件下，例如在体内测定或治疗处理情况下在生理条件下，以及在体外测定的情况下在合适的严格条件下进行测定的条件下，与非靶RNA序列的非特异性结合时，对于本方法目的的互补核酸序列是特异性可杂交的。例如，严格的盐浓度通常将小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在不存在有机溶剂，例如甲酰胺的情况下可以获得低严格杂交，而在至少约35％甲酰胺，更优选至少约50％甲酰胺的存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件通常将包括至少约30℃，更优选至少约37℃，和最优选至少约42℃的温度。改变另外的参数，诸如杂交时间，去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度，并且包括或排除载体DNA，是本领域技术人员熟知的。根据需要通过组合这些各种条件来实现不同程度的严格性。在一个优选的实施方案中，杂交将在30℃在750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，杂交将在37℃下在500mM NaCl，50mM柠檬酸三钠，1％SDS，35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中发生。在最优选的实施方案中，杂交将在42℃在250mM NaCl，25mM柠檬酸三钠，1％SDS，50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。这些条件的有用变化对于本领域技术人员而言将是容易显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将在严格性上变化。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过升高温度来增加洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度将优选小于约30mMNaCl和3mM柠檬酸三钠，并且最优选小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，和甚至更优选至少约68℃的温度。在一个优选实施方案中，洗涤步骤将在25℃下在30mM NaCl，3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃在15mM NaCl，1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃下在15mM NaCl，1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。这些条件的其他变化对于本领域技术人员而言将是容易显而易见的。杂交技术为本领域技术人员所熟知，并在例如以下中描述：Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guideto Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；和Sambrook etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York。
一般，可用于本文所述方法的抑制性核酸与靶核酸内的靶区域具有至少80％的序列互补性，例如与RNA内的靶区域具有90％，95％或100％的序列互补性。例如，下述的反义化合物将代表90％的互补性，其中反义寡核苷酸的20个核碱基中的18个是互补的并因此将与靶区域特异性杂交。抑制性核酸与靶核酸区域的互补性百分比可以使用碱基局部比对搜索工具(BLAST程序)常规确定(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhangand Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)。可以通过常规实验来鉴定与RNA杂交的抑制性核酸。一般，抑制性核酸必须保留对其靶标的特异性，即必须不直接结合除预期靶标之外的转录物或必须不直接显著影响除预期靶标之外的转录物的表达水平。
关于抑制性核酸的进一步公开，请参见US2010/0317718(反义寡核苷酸)；US2010/0249052(双链核糖核酸(dsRNA))；US2009/0181914和US2010/0234451(LNA)；US2007/0191294(siRNA类似物)；US2008/0249039(修饰的siRNA)；以及WO2010/129746和WO2010/040112(抑制性核酸)。
反义
在一些实施方案中，抑制性核酸是反义寡核苷酸。通常将反义寡核苷酸设计为通过结合靶标并在转录，翻译或剪接水平阻止表达来阻断DNA或RNA靶标的表达。本发明的反义寡核苷酸是设计用于在严格条件下与RNA杂交的互补核酸序列。因此，选择与靶标充分互补的寡核苷酸，即充分良好且以足够的特异性杂交，以产生期望的效应。
siRNA/shRNA
在一些实施方案中，与Ablim3RNA互补的核酸序列可以是干扰RNA，包括但不限于小干扰RNA(“siRNA”)或小发夹RNA(“shRNA”)。构建干扰RNA的方法在本领域中是公知的。例如，干扰RNA可以由两个单独的寡核苷酸组装而成，其中一条链是有义链而另一条是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；诸如在反义链和有义链形成双链体或双链结构的情况中)；反义链包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列(即，不期望的基因)互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。或者，干扰RNA由单个寡核苷酸组装而成，其中自身互补的(self-complementary)有义和反义区通过基于核酸的或非基于核酸的接头连接。干扰RNA可以是具有双链体，不对称双链体，发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自身互补的的有义区和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列分子，而有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。干扰可以是具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中反义区包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列分子，而有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中所述环状多核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNA干扰的活性siRNA分子。
在一些实施方案中，干扰RNA编码区编码具有有义区，反义区和环区的自身互补RNA分子。当表达时，这种RNA分子期望地形成“发夹”结构，并且在本文中称为“shRNA”。环区的长度通常在约2至约10个核苷酸之间。在一些实施方案中，环区的长度为约6至约9个核苷酸。在一些实施方案中，有义区和反义区的长度在约15至约20个核苷酸之间。在转录后加工后，小发夹RNA通过酶Dicer(其是RNA酶III家族的成员)介导的切割事件转化成siRNA。然后siRNA能够抑制与其共享同源性的基因的表达。详情参见Brummelkamp et al.,Science296:550-553,(2002)；Lee et al,Nature Biotechnol.,20,500-505,(2002)；Miyagishiand Taira,Nature Biotechnol 20:497-500,(2002)；Paddison et al.Genes&Dev.16:948-958,(2002)；Paul,Nature Biotechnol,20,505-508,(2002)；Sui,Proc.Natl.Acad.Sd.USA,99(6),5515-5520,(2002)；Yu et al.Proc NatlAcadSci USA99:6047-6052,(2002)。
由siRNA指导的靶RNA切割反应是高度序列特异性的。通常，含有与靶核酸的一部分相同的核苷酸序列的siRNA优选用于抑制。然而，siRNA和靶基因之间100％的序列同一性不是实施本发明所必需的。因此，本发明具有能够容许由于基因突变，株系多态性或进化趋异(evolutionary divergence)而可能预期的序列变异的优点。例如，也已经发现相对于靶序列具有插入，缺失和单点突变的siRNA序列对于抑制是有效的。或者，具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列可以对于抑制是有效的。通常，siRNA必须保持对其靶标的特异性，即必须不直接结合除了预期靶标之外的转录物或必须不直接显著影响除了预期靶标之外的转录物的表达水平。
核酶
也可以使用反式切割酶促核酸分子(Trans-cleaving enzymatic nucleic acidmolecule)；它们已经显示了作为人类疾病治疗剂的希望(Usman&McSwiggen,1995Ann.Rep.Med.Chem.30,285-294；Christoffersen and Marr,1995J.Med.Chem.38,2023-2037)。可以将酶促核酸分子设计成在细胞RNA的背景中切割特定的RNA靶标。这种切割事件使得RNA无功能。
通常，具有RNA切割活性的酶促核酸通过首先结合靶RNA而发挥作用。此类结合通过酶促核酸分子的靶标结合部分发生，所述靶标结合部分保持靠近分子中作用为切割靶RNA的酶促部分。因此，酶促核酸首先识别靶RNA，并且然后通过互补的碱基配对结合靶RNA，并且一旦结合到正确的位点，发挥酶促作用以切割靶RNA。这种靶RNA的策略性切割将破坏其指导所编码的蛋白质合成的能力。在酶促核酸已经结合并切割其RNA靶标后，其从该RNA释放以搜索另一个靶标，并且可以反复结合和切割新的靶标。
已经使用几种方法诸如体外选择(进化)策略(Orgel,1979,Proc.R.Soc.London,B205,435)来进化能够催化多种反应，诸如磷酸二酯连接和酰胺连接的切割和连接的新核酸催化剂(Joyce,1989,Gene,82,83-87；Beaudry et al.,1992,Science 257,635-641；Joyce,1992,Scientific American 267,90-97；Breaker et al,1994,TIBTECH 12,268；Bartel et al,1993,Science 261:1411-1418；Szostak,1993,TIBS 17,89-93；Kumar etal,1995,FASEB J.,9,1183；Breaker,1996,Curr.Op.Biotech.,1,442)。对于催化活性而言最佳的核酶的开发将显著地促进采用RNA切割核酶以用于调节基因表达的目的的任何策略。例如，锤头状核酶(hammerhead ribozyme)在饱和(10rnM)浓度的Mg2+辅因子的存在下以约1min-1的催化速率(kcat)发挥功能。已经显示人工“RNA连接酶”核酶以大约100min-1的速率催化相应的自我修饰反应。此外，已知具有由DNA制成的底物结合臂的某些经修饰的锤头状核酶以接近100min-1的多重周转率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。
经修饰的抑制性核酸
在一些实施方案中，用于本文所述方法的抑制性核酸是经修饰的，例如包含一个或多个经修饰的键或碱基。许多经修饰的碱基包括硫代磷酸酯(phosphorothioate)，膦酸甲酯(methyl phosphonate)，肽核酸或锁定核酸(LNA)分子。一些抑制性核酸是被完全修饰的，而另一些是嵌合的并且包含两个或多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个核苷酸组成。这些抑制性核酸通常含有至少一个赋予一种或多种有益特性(诸如，例如增加的核酸酶抗性，增加的对细胞的摄入，增加的对靶标的结合亲和力)的经修饰的核苷酸区域和作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合物的酶的底物的区域。本发明的嵌合抑制性核酸可形成为如上所述的两种或多种寡核苷酸，经修饰的寡核苷酸，寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。此类化合物在本领域中也被称为杂合物或gapmer。教导制备此类杂合物结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，将其中的每一篇通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抑制性核酸包含在糖的2’位置经修饰的至少一个核苷酸，最优选2’-O-烷基，2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟代-经修饰的核苷酸。在其他优选的实施方案中，RNA修饰包括在RNA的3’末端的嘧啶，无碱基残基或反向碱基(inverted base)的核糖上的2’-氟代，2’-氨基和2’O-甲基修饰。将此类修饰常规掺入寡核苷酸中，并且已显示针对给定的靶标，这些寡核苷酸比2’-脱氧寡核苷酸具有更高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。
已经显示许多核苷酸和核苷修饰使得接受其掺入的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶消化更具抗性；这些经修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整存在更长时间。经修饰的寡核苷酸的具体实例包括包含经修饰的主链的那些，例如硫代磷酸酯，磷酸三酯，膦酸甲酯，短链烷基或环烷基糖间连接或短链杂原子或杂环糖间连接。最优选的是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，特别是CH2-NH-O-CH2,CH,～N(CH3)～O～CH2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]，CH2--O--N(CH3)-CH2,CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链，其中天然的磷酸二酯主链表示为O-P--O-CH,)；酰胺主链(参见De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995,28:366-374)；吗啉代主链结构(参见Summerton and Weller,美国专利号5,034,506))；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺主链取代，所述核苷酸直接或间接与聚酰胺主链的氮杂氮原子结合，参见Nielsen et al.,Science 1991,254,1497)。含磷的连接包括但不限于硫代磷酸酯(phosphorothioate)，手性硫代磷酸酯(chiral phosphorothioate)，二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)，磷酸三酯(phosphotriester)，氨基烷基磷酸三酯(aminoalkylphosphotriester)，膦酸甲酯和其他膦酸烷基酯，膦酸3'亚烃基酯(3'alkylene phosphonates)和手性膦酸酯，次膦酸酯，氨基磷酸酯(phosphoramidate)，包含3'-氨基氨基磷酸酯(3'-amino phosphoramidate)和氨基烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)，硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)，硫羰烷基磷酸酯，硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriester)，和具有正常3’-5’连接的硼烷磷酸酯(boranophosphate)，这些的2’-5’连接类似物和具有反向极性的那些(其中相邻的核苷单元对从3’-5’连接到5’-3’或从2’-5’连接到5’-2’；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
在以下中描述了基于吗啉代的寡聚化合物：Dwaine A.Braasch and DavidR.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510)；Genesis,volume 30,issue 3,2001；Heasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209-214；Nasevicius et al.,Nat.Genet.,2000,26,216-220；Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591-9596；和在1991年7月23日公告的美国专利号5,034,506。
环己烯基核酸寡核苷酸模拟物描述于Wang et al.,J.Am.Chem.Soc.,2000,122,8595-8602。
不包括磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接形成的主链。这些包括具有吗啉代连接(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物，亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基主链和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N，O，S和CH2组分部分的其他主链的那些；参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，将其中每一篇通过引用并入本文。
也可以包括一个或多个取代的糖部分，例如在2’位置上的以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n为1至约10；C1-C10低级烷基，烷氧基烷氧基，取代的低级烷基，烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-、或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；嵌入剂(intercalator)；改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或改善寡核苷酸的药代动力学性质性质的基团和具有相似性质的其他取代基的基团。优选的修饰包括2’-甲氧基乙氧基[2'-0-CH2CH2OCH3,也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)](Martin et al,HeIv.Chim.Acta,1995,78,486)。其他优选的修饰包括2’-甲氧基(2'-0-CH3)，2’-丙氧基(2'-OCH2CH2CH3)和2’-氟代(2’-F)。寡核苷酸的其他位置也可以进行类似的修饰，特别是3’末端核苷酸上的糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物诸如环丁基代替戊呋喃糖基(pentofuranosyl)基团。
另外/或者，抑制性核酸还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”核碱基包括腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括在天然核酸中仅罕见或短暂地发现的核碱基，例如次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’-脱氧胞嘧啶，并且在本领域中通常称为5-Me-C)，5-羟甲基胞嘧啶(HMC)，糖基HMC和龙胆二糖基(gentobiosyl)HMC，以及合成的核碱基，例如，2-氨基腺嘌呤，2-(甲氨基)腺嘌呤，2-(咪唑烷基)腺嘌呤，2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羟甲基尿嘧啶，8-氮杂鸟嘌呤(azaguanine)，7-脱氮鸟嘌呤，N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1980,pp75-77；Gebeyehu,G.,et al.Nucl.Acids Res.1987,15:4513)。也可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已显示5-Me-C取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃。(Sanghvi,Y.S.,in Crooke,S.T.and Lebleu,B.,eds.,Antisense Researchand Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)，并且是目前优选的碱基取代。
不必要一致地修饰给定的寡核苷酸中的所有位置，并且事实上，超过一个上述修饰可以掺入到单个寡核苷酸中，或者甚至在寡核苷酸内的单个核苷内。
在一些实施方案中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即主链)均替换为新基团。维持碱基单元与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物，即已经显示具有优异杂交性质的寡核苷酸模拟物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链替换为含酰胺的主链，例如氨乙基甘氨酸主链。核碱基得到保留并且直接或间接地结合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，将其每一篇通过引用并入本文。PNA化合物的进一步教导可以参见Nielsen et al,Science,1991,254,1497-1500。
抑制性核酸还可以包括一个或多个核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”的核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，并且嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶(2-thiocytosine)，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
另外，核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的那些，在“The ConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering',第858-859页,Kroschwitz,J.I.编John Wiley&Sons,1990”中公开的那些，由Englisch et al.,Angewandle Chemie,International Edition,1991,30,第613页”中公开的那些和由Sanghvi,Y.S.,Chapter15,Antisense Research and Applications',第289-302页,Crooke,S.T.and Lebleu,B.ea.,CRC Press,1993公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.编'Antisense Research and Applications',CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)，并且其是目前优选的碱基取代，甚至尤其是当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰相结合时。经修饰的核碱基描述于美国专利号3,687,808，以及4,845,205；5,130,302；5,134,,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692和5,681,941，将其中每一篇通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抑制性核酸与增强寡核苷酸的活性，细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物以化学方式连接。此类部分包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)，胆酸(Manoharanet al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(hexyl-S-trityl thiol)(Manoharan et al,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)，硫代胆固醇(thiocholesterol)(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)，脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49-54)，磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Mancharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)，棕榈基部分(Mishra etal.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)，或十八胺或己基氨基-羰基-叔-氧代胆固醇部分(hexylamino-carbonyl-t oxycholesterol moiety)(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。另请参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，将其中的每一篇通过引用并入本文。
这些部分或缀合物可以包括与官能团诸如伯羟基或仲羟基共价结合的缀合物基团。本发明的缀合物基团包括嵌入剂，报道分子，聚胺，聚酰胺，聚乙二醇，聚醚，增强寡聚物药效学性质的基团和增强寡聚物药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇，脂质，磷脂，生物素，吩嗪，叶酸，菲啶，蒽醌，吖啶，荧光素，罗丹明，香豆素和染料。在本发明的背景下，增强药效学性质的基团包括改善摄取，增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的范围内，增强药代动力学性质的基团包括改善本发明化合物的摄取，分布，代谢或排泄的基团。代表性的缀合物基团公开于在1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196,和美国专利号6,287,860，将其通过引用并入本文。缀合物部分包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分，胆酸，硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇，硫代胆固醇，脂族链如十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸三乙铵，多胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸，棕榈酰基部分或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见例如美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
锁定核酸(LNA)
在一些实施方案中，用于本文所述方法中的经修饰的抑制性核酸包含锁定核酸(LNA)分子，例如包含[alpha]-L-LNA。LNA包含核糖核酸类似物，其中核糖环通过2’-氧和4’-碳之间的亚甲基桥“锁定”，即寡核苷酸含有至少一个LNA单体，所述单体为一个2’-O，4’-C-亚甲基-β-D-核糖呋喃糖基核苷酸。LNA碱基形成标准的沃森-克里克碱基对，但锁定的构型增加碱基配对反应的速度和稳定性(Jepsen et al.,Oligonucleotides,14,130-146(2004))。与DNA相比，LNA具有增加的与RNA碱基配对的亲和力。这些性质使得LNA尤其可用作荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交的探针，作为miRNA的敲低(knockdown)工具，和作为靶向mRNA或其它RNA，例如如本文所述的RNA的反义寡核苷酸。
LNA分子可以包括在每条链中包含10-30，例如12-24，例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的分子，其中一条链与RNA中的靶区域基本上相同，例如是至少80％(或更多，例如85％，90％，95％或100％)相同，例如，具有3个，2个，1个或0个错配的核苷酸。可以使用本领域已知的方法化学合成LNA分子。
可以使用本领域已知的任何方法设计LNA分子；许多算法是已知的，并且是可商购的(例如，在互联网上，例如在exiqon.com上)。参见例如You et al.,Nuc.Acids.Res.34:e60(2006)；McTigue et al.,Biochemistry 43:5388-405(2004)；和Levin et al.,Nuc.Acids.Res.34:e142(2006)。例如，与用于设计反义寡核苷酸的方法类似的“基因步行”方法可用于优化LNA的抑制活性；例如，可以制备跨越靶RNA长度的一系列10-30个核苷酸的寡核苷酸，随后测试活性。任选地，可以在LNA之间留下例如5-10个核苷酸或更多的空位，以减少合成和测试的寡核苷酸的数量。GC含量优选在约30-60％之间。用于设计LNA的一般准则是本领域已知的；例如，LNA序列将与其他LNA序列非常紧密地结合，所以优选避免LNA内的显著互补性。在可能的情况下，应避免超过四个LNA残基的连续运行(例如，在具有很短的寡核苷酸(例如，例如约9-10nt)时，或许是不可能的)。在一些实施方案中，LNA是木糖-LNA(xylo-LNA)。
有关LNA的另外的信息，参见美国专利号6,268,490；6,734,291；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,060,809；7,084,125；和7,572,582；和美国授权前公开号20100267018；20100261175；和20100035968；Koshkin et al.Tetrahedron 54,3607–3630(1998)；Obika et al.Tetrahedron Lett.39,5401–5404(1998)；Jepsen et al.,Oligonucleotides 14:130–146(2004)；Kauppinen et al.,Drug Disc.Today 2(3):287-290(2005)；和Ponting et al.,Cell 136(4):629–641(2009)，以及其中引用的参考文献。
适体
适体是短的寡核苷酸序列，其可以紧密和谨慎结合特定的靶分子，例如蛋白质。已经证明，不同的适体序列可以特异性结合不同的蛋白质，例如序列GGNNGG与凝血酶特异性结合，其中N＝鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，腺苷(A)或胸苷(T)(Bock et al(1992)Nature 355:564 566and U.S.Pat.No.5,582,981(1996)Toole et al)。
可以通过如下产生适体种类：将随机产生的寡核苷酸序列与靶分子温育，选择能够结合靶标的寡核苷酸序列，扩增以产生新的合并物，并且重复该过程直到观察到期望的表型和/或显著最小化序列多样性(参见Tuerk and Gold,Science 249:505-510(1990)；Ellington and Szostak,Nature 346:818-822(1990))。可以通过引入负选择步骤来增加特异性，其中将寡核苷酸序列与非靶分子一起温育，并将结合的寡核苷酸从余下的潜在适体合并物中移除(Yan and Levy,RNA Bio.6(3):316-320(2009))。在迭代选择过程之后可以克隆和测序最终的剩余序列以表征适体。用于选择和制备这种RNA适体的方法是本领域已知的(参见例如Feigon et al.,Chem.Biol.3:611(1996)；Kelly et al.,J.Mol.Biol.256:417(1996)；Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.9:324(1999)；Herman andPatel,J.Science 287:820-825(2000))；Santosh and Yadava,Biomed Res Int.2014:540451(2014)；Szeitner et al.,J Pharm Biomed Anal.pii:S0731-7085(14)00209-X(2014)；Kong and Byun,Biomol Ther(Seoul).21(6):423-34(2013)。
制备和使用抑制性核酸
可以从多种来源分离用于实践本文所述方法的核酸序列(无论是RNA，cDNA，基因组DNA，载体，病毒或其杂合物)，将其基因工程化，扩增和/或表达/重组生成。可以单独分离或克隆重组核酸序列并测试所期望的活性。可以使用任何重组表达系统，包括例如体外，细菌，真菌，哺乳动物，酵母，昆虫或植物细胞表达系统。
本发明的核酸序列可以插入到递送载体中，并由载体内的转录单元表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。载体构建体的产生可以使用本领域熟知的任何合适的基因工程技术来完成，包括但不限于以下标准技术：PCR，寡核苷酸合成，限制性内切核酸酶消化，连接，转化，质粒纯化和DNA测序，例如如Sambrook et al.Molecular Cloning:ALaboratory Manual.(1989)),Coffin et al.(Retroviruses.(1997))和“RNA Viruses:APractical Approach”(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,(2000))中描述的。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，多种合适的载体可用于将本发明的核酸转移到细胞中。本领域普通技术人员不需要过度的实验就可以选择合适的载体来递送核酸并优化用于将所选择的表达载体插入细胞的条件。病毒载体包含具有用于在包装细胞中产生重组病毒的序列的核苷酸序列。表达本发明核酸的病毒载体可基于病毒主链来构建，所述病毒主链包括但不限于逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺伴随病毒，痘病毒或甲病毒(alphavirus)。能够表达本发明的核酸的重组载体可以如本文所述进行递送并且持续地存在于靶细胞(例如稳定的转化体)中。
用于实践本发明的核酸序列可以通过公知的化学合成技术在体外合成，如在以下描述的：例如Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661；Belousov(1997)Nucleic AcidsRes.25:3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33:7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859；美国专利号4,458,066。
诸如通过掺入修饰，例如核苷酸修饰可以稳定本发明的核酸序列以防止核溶解降解。例如，本发明的核酸序列包含在核苷酸序列的5’或3’端的硫代磷酸酯至少第一，第二或第三核苷酸间连接。作为另一个实例，核酸序列可以包括2’-经修饰的核苷酸，例如2’-脱氧，2’-脱氧-2’-氟代，2’-O-甲基，2’-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)，2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)，2’-O-二甲基氨基乙氧基(2’-O-DMAOE)，2’-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)，2’-O二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O--N-甲基乙酰胺基(2'-O--NMA)。作为另一个实例，核酸序列可以包括至少一个2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施方案中，所有的核苷酸包括2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，核酸是“锁定的”，即包含其中核糖环通过连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥“锁定”的核酸类似物(参见例如Kaupinnen et al.,Drug Disc.Today 2(3):287-290(2005)；Koshkin et al.,J.Am.Chem.Soc.,120(50):13252–13253(1998))。对于另外的修饰，参见US 20100004320，US 20090298916和US20090143326。
操作用于实践本发明的核酸的技术，诸如例如亚克隆，标记探针(例如使用Klenow聚合酶的随机引物标记，切口平移，扩增)，测序，杂交等在科学和专利文献中充分地描述，参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning；A Laboratory Manual第3版(2001)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.编(John Wiley&Sons,Inc.,New York 2010)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (1990)；Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen编Elsevier,N.Y.(1993)。
药物组合物
本文所述的方法可包括施用包含靶向Tspan33的分子作为活性试剂的药物组合物和配制剂，例如如本文所述的抗Tspan33抗体，靶向Tspan33的小分子或抑制性核酸。
在一些实施方案中，组合物与药学上可接受的载体一起配制。药物组合物和配制剂可以胃肠外，表面，口服施用或通过局部施用，诸如通过气雾剂或经皮施用来施用。药物组合物可以以任何方式配制，并且可以根据病症或疾病和患病程度，每个患者的一般医学状况，所得到的优选的施用方法等以多种单位剂量形式施用。有关药物的配制和施用技术的详情在科学和专利文献中充分地描述，参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005。
活性化合物可以单独施用或作为药物配制剂(组合物)的组分施用。可以以用于人或兽用药物的任何便利的方式配制化合物来用于施用。润湿剂，乳化剂和润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，包衣剂(coating agent)，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
这些组合物的配制剂可以包括适合皮内，吸入，口/鼻，局部，胃肠外，直肠和/或阴道内施用的那些。配制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过制药领域中公知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分(例如本发明的核酸序列)的量将根据要治疗的宿主，特定的施用模式，例如皮内或吸入而改变。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果，例如抗原特异性T细胞或体液应答的化合物的量。
本发明的药物配制剂可以根据本领域已知用于制造药物的任何方法来制备。此类药物可以含有甜味剂，调味剂，着色剂和防腐剂。配制剂可以与适于制造的无毒的药学上可接受的赋形剂混合。配制剂可以包含一种或多种稀释剂，乳化剂，防腐剂，缓冲剂，赋形剂等，并且可以以以下形式提供，诸如液体，粉剂，乳剂，冻干粉，喷雾剂，乳膏剂，洗剂，控释配制剂，片剂，丸剂，凝胶剂，贴片上，植入物中，等等。
可以使用本领域熟知的药学上可接受的载体以适当的和合适的剂量配制用于口服施用的药物配制剂。此类载体使得药物能够以单位剂量形式配制成适合患者摄取的片剂，丸剂，粉剂，糖衣片，胶囊，液体，锭剂，凝胶剂，糖浆剂，浆剂，混悬剂等。可以将用于口服施用的药物制剂配制成固体赋形剂，任选研磨所得到的混合物，并且如果需要，在加入合适的其他化合物后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣片核心。合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填充剂，包括例如糖，其包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇；来自玉米，小麦，米，马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素诸如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶(gum)包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白质，例如明胶和胶原蛋白。可以加入崩解剂或增溶剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。推入式胶囊(Push-fit capsule)可含有与填充剂或粘合剂(诸如乳糖或淀粉)，润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性剂。在软胶囊中，可以将活性剂溶解或悬浮在有或没有稳定剂的合适的液体中，诸如脂肪油，液体石蜡或液体聚乙二醇。
水悬浮液可以含有与适用于制备水悬浮液的赋形剂混合的活性剂(例如本发明的核酸序列)，例如用于水性皮内注射液。此类赋形剂包括悬浮剂诸如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄蓍胶和阿拉伯树胶，以及分散剂或润湿剂，诸如天然存在的磷脂(phosphatide)(例如，卵磷脂)，烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七烷基乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯(polyoxyethylene sorbitol mono-oleate))，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(polyoxyethylene sorbitan mono-oleate))。水悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂诸如蔗糖，阿斯巴甜或糖精。可以调整配制剂的渗透性。
在一些实施方案中，基于油的药物用于施用本发明的核酸序列。基于油的悬浮液可以通过以下配制：将活性剂悬浮在植物油诸如花生油，橄榄油，芝麻油或椰子油中，或悬浮于矿物油诸如液体石蜡；或这些的混合物中。参见例如美国专利号5,716,928，其描述了使用精油或精油成分来提高生物利用度并降低口服施用的疏水性药物化合物的个体间和个体内变异性(也参见美国专利号5,858,401)。油悬浮液可以含有增稠剂，诸如蜂蜡，硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂，诸如甘油，山梨糖醇或蔗糖以提供适口的口服制剂。这些配制剂可以通过加入抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存。作为可注射的油载体的实例，参见Minto(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102。
药物配制剂也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是如上所述的植物油或矿物油，或它们的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶诸如阿拉伯树胶和黄蓍胶，天然存在的磷脂诸如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，诸如脱水山梨醇单油酸酯(sorbitan mono-oleate)，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，诸如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂也可以含有甜味剂和调味剂，如在糖浆剂和酏剂的配制剂中。此类配制剂还可以含有缓和剂，防腐剂或着色剂。在备选的实施方案中，本发明的这些可注射的水包油乳剂包含石蜡油，脱水山梨醇单油酸酯，乙氧基脱水山梨醇单油酸酯和/或乙氧基化脱水山梨醇三油酸酯。
药物化合物还可以通过鼻内，眼内和阴道内途径施用，包括栓剂，吹入剂，粉末和气雾剂配制剂(例如类固醇吸入剂，参见例如Rohatagi(1995)J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193；Tjwa(1995)Ann.Allergy Asthma Immunol.75:107-111)。栓剂配制剂可通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在常温下为固体，但在体温下为液体，并由此将在体内融化以释放药物。这种材料是可可油和聚乙二醇。
在一些实施方案中，药物化合物可以配制成敷药棒，溶液，悬浮液，乳剂，凝胶剂，乳膏，软膏，糊剂，胶冻剂，涂剂，粉剂和气雾剂通过局部途径透皮递送。
在一些实施方案中，也可以将药物化合物作为用于在体内缓释的微球递送。例如，微球可以通过在皮下缓慢释放的药物的皮内注射液施用；参见Rao(1995)J.BiomaterSci.Polym.Ed.7:623-645；作为可降解且可注射的凝胶配制施用，参见例如Gao(1995)Pharm.Res.12:857-863(1995)；或作为口服施用的微球施用，参见例如Eyles(1997)J.Pharm.Pharmacol.49:669-674。
在一些实施方案中，药物化合物可以经胃肠外施用，诸如通过静脉内(IV)施用或施用到体腔或器官的腔中。这些配制剂可以包含溶解在药学上可接受的载体中的活性剂溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂是水和林格溶液(Ringer's solution)，即等张氯化钠。另外，无菌的不挥发性油可以用作溶剂或悬浮介质。对于此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸也可以同样用于制备注射液。这些溶液是无菌的，并且通常没有不想要的问题。这些配制剂可以通过常规的，公知的灭菌技术进行灭菌。配制剂根据需要可以包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂，例如乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。这些配制剂中的活性剂的浓度可以在很宽的范围内变化，并且将主要根据流体体积，粘度，体重等并且根据所选的特定施用模式和患者的需要来选择。对于IV施用，配制剂可以是无菌可注射制剂，诸如无菌注射用水性悬浮液或油质的悬浮液。这种悬浮液可以使用那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来进行配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(诸如1,3-丁二醇溶液)中的悬浮液。施用可以通过推注或连续输注(例如，在指定的时间段基本上不间断地导入到血管)。
在一些实施方案中，可以冻干药物化合物和配制剂。包含抑制性核酸的稳定冻干制剂可以通过冻干包含本发明药物和填充剂(例如甘露醇，海藻糖，棉子糖和蔗糖或其混合物)的溶液来制备。制备稳定的冻干制剂的方法可包括将具有约2.5mg/mL蛋白质，约15mg/mL蔗糖，约19mg/mL NaCl和具有pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液冻干。参见例如U.S.20040028670。
组合物和配制剂可以通过使用脂质体递送。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面携带对靶细胞特异性的配体，或者在其它情况下优先针对特定器官的情况下，可以聚焦将活性剂在体内递送到靶细胞中。参见，例如美国专利号6,063,400；6,007,839；Al-Muhammed(1996)J.Microencapsul.13:293-306；Chonn(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708；Ostro(1989)Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587。如在本发明中使用，术语“脂质体”意指由一个双层或多个双层中排列的两亲性脂质组成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和含有待递送的组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电的脂质体，据信与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。据信pH敏感型或带负电荷的脂质体捕获DNA而不是与其形成复合物。阳离子脂质体和非阳离子脂质体两者都已经用于将DNA递送至细胞。
脂质体还可以包括“空间稳定的”脂质体，即包含一种或多种特化(specialized)脂质的脂质体。当掺入到脂质体中时，相对于缺乏这种特化脂质的脂质体，这些特化的脂质导致循环寿命延长的脂质体。空间稳定的脂质体的实例是下述那些，其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂或是用一种或多种亲水聚合物诸如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的。脂质体及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860。
本发明的配制剂可以施用用于预防性和/或治疗性治疗。在一些实施方案中，对于治疗应用，将组合物以足以治愈，缓解或部分阻止病症或其并发症的临床表现的量施用于需要降低的甘油三酯水平的受试者，或有本文所述病症的风险或具有本文所述病症的受试者；这可以被称为治疗有效量。例如，在一些实施方案中，本发明的药物组合物以足以降低受试者中的甘油三酯血清水平的量施用。
足以实现这点的药物组合物的量是治疗有效剂量。对于该用途有效的剂量日程表和量，即给药方案将取决于多种因素，包括疾病或病症的阶段，疾病或病症的严重性，患者健康的一般状态，患者的身体状况，年龄等。在计算患者的剂量方案时，也考虑施用方式。
剂量方案还考虑到本领域公知的药代动力学参数，即活性剂的吸收速率，生物利用度，代谢，清除率等(参见例如Hidalgo-Aragones(1996)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.58:611-617；Groning(1996)Pharmazie 51:337-341；Fotherby(1996)Contraception 54:59-69；Johnson(1995)J.Pharm.Sci.84:1144-1146；Rohatagi(1995)Pharmazie 50:610-613；Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24:103-108；Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005)。现有技术允许临床医师针对每个个体患者、活性剂和治疗的疾病或病症确定剂量方案。提供用作药物的类似组合物的准则可用作确定剂量方案的准则，即实践本发明方法而施用的剂量日程表和剂量水平是正确且适当的。
取决于例如患者所需和患者耐受的剂量和频率，每次施用后产生的治疗效果的程度和量(例如对肿瘤大小或生长的效应)等等可以给出配制剂的单次或多次制剂。配制剂应提供足量的活性剂以有效治疗，预防或改善病症，疾病或症状。
在备选的实施方案中，用于口服施用的药物制剂的日量为每天每千克体重约1至100或更多mg。与口服施用相比，可以使用更低的剂量来进入血流，进入体腔或进入器官内腔。基本上更高的剂量可用于局部或口服施用或通过粉末，喷雾或吸入施用。用于制备胃肠外或非胃肠外施用的配制剂的实际方法对于本领域技术人员将是已知的或显而易见的，并且在此种出版物如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005中更详细地描述。
各种研究已经报道了使用互补核酸序列的成功哺乳动物给药。例如，Esau C.,etal.,(2006)Cell Metabolism,3(2):87-98报道了用miR-122反义寡核苷酸的每周两次范围在12.5至75mg/kg之间的腹膜内剂量对正常小鼠给药4周。处理结束时小鼠看起来健康和正常，没有体重减轻或食物摄取的减少。除75mg/kg剂量的miR-122ASO(显示ALT和AST水平非常轻微的增加)外，血浆转氨酶水平在所有剂量处于正常范围(AST 3/445,ALT 3/4 35)。他们得出结论：50mg/kg是有效的，无毒的剂量。Krützfeldt J.,et al.,(2005)Nature 438,685-689的另一项研究使用80、160或240mg/kg体重的总剂量注射anatgomir以沉默小鼠中的miR-122。最高剂量导致miR-122信号的完全丧失。在又一项研究中，将锁定核酸(“LNA”)成功应用于灵长类动物中以沉默miR-122。Elmen J.,et al.,(2008)Nature 452,896-899报道了通过三剂10mg kg-1 LNA-antimiR在灵长类动物中实现了miR-122的有效沉默，导致总血浆胆固醇的长效和可逆性降低，而没有针对研究动物中LNA相关的毒性或组织病理学变化的任何证据。
在一些实施方案中，本文所述的方法可以包括与其他药物或药品，例如用于提供胆固醇稳态(cholesterol homeostasis)的组合物共施用。例如，所述化合物可与用于治疗本文所述病症或降低本文所述病症的风险的药物，例如其他免疫疗法或抗癌治疗共施用。
实施例
在下面的实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
材料和方法
以下材料和方法用于下面给出的实施例中。
小鼠和体内研究
从Charles River(Wilmington，MA)购买C57Bl/6小鼠，并饲养在BIDMC的动物设施中。使用前将6-8周龄的体重大约17gm的雌性C57/BL6小鼠维持1周。在平均室温为20±1℃，湿度为50％±10％的有限接触区内，每只笼子饲养5只小鼠，自由获得食物和水。所有的实验都得到了动物审查委员会(institutional animal review board)的批准。用Pan02，E0771，RM-9或B16细胞(每只小鼠1x106个细胞)s.c.接种小鼠。如前所述测定肿瘤体积。
细胞分离和分析
使用从带有肿瘤和不带有肿瘤的小鼠收集的脾来分离T细胞，NK细胞和MDSC。为了分离肿瘤浸润性淋巴细胞，将肿瘤样本用PBS洗涤，用剪刀切碎并在37℃用0.1％IV型胶原酶，0.2mg/ml V型透明质酸酶和0.01％DNA酶I(来自Sigma-Aldrich)消化30分钟。通过加入过量的含有热灭活的10％FCS的RPMI 1640培养基终止消化。然后将细胞悬浮液顺序通过100mm，70mm和40mm的细胞滤器(BD Falcon)，用含有10％FCS的RPMI 1640培养基洗涤3次。通过密度梯度(Ficoll-Hypaque PLUS，GE Healthcare)纯化淋巴细胞，并对其染色，以用于分析流式细胞术，制备性FACS分选或用磁珠分离。对于细胞毒性测定，通过消减CD3+细胞和随后分离NK1.1+细胞用磁珠分离肿瘤浸润性NK细胞。通过流式细胞术分析确定的群体的纯度通常>93％。
髓样衍生的抑制细胞的分离
为了纯化CD11b+Gr-1+细胞，按照制造商的说明(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，使用抗CD19和抗CD11c微珠和LD柱通过磁性选择首先从消减了红细胞的脾细胞消减CD11bGr-1细胞。总MDSC群体或MDSC亚级分的纯度通常高于90％。
患者，分析MDSC
根据在先批准的IRB方案从前列腺癌患者收集血液样品。通过Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)密度梯度离心从新鲜抽取的血液中分离PBMC并冷冻保存。通过在37℃温育(1-2分钟)来解冻PBMC，然后在RPMI 1640中再悬浮并离心。用台盼蓝评估细胞沉淀的存活力，并在使用适当的抗体染色后立即使用多色流式细胞术进行评估，如下节“单克隆抗体和流式细胞术”所描述的。
单克隆抗体和流式细胞术
用经荧光染料缀合的抗体进行的细胞表面染色和胞质内染色实验按照标准程序(35)进行。使用以下抗体：PE，FITC，APC缀合的抗Gr1和抗CD11b，PE缀合的CD4，CD8；PE，APC，PE-Cy5.5缀合的Ly6C和Ly6G；和FITC结合的NOS2。全部购自BD Biosciences(San Diego，CA)或BioLegend(San Diego，CA)。用来自Abcam(Cambridge，MA)的兔Tspan33抗体(ab79130)或来自Abnova(Walnut，CA)的兔多克隆抗体进行Tspan33的PE，FITC缀合。用Lightning-Link抗体记试剂盒(Lightning-Link antibody labeling kits)(Novus，Littleton，CO)进行Tspan33抗体的FITC和PE连接。涉及前列腺癌患者的所有研究均使用来自R&D Systems(Minneapolis，MN)的人Tspan33单克隆抗体(MAB8405)进行。如制造商所述使用CD33微珠(Miltenyi，Auburn，CA)分离人CD33+细胞。抗人CD4，CD8，HLA-DR，CD14，CD33抗体购自BDBiosciences和eBioscience(San Diego，CA)。用FACSAria II分选仪(BectonDickinson，San Jose，CA)进行细胞分选，并用BD FACSCanto流式细胞仪进行分析测量。使用FloJo软件(Tree Star，Ashland，OR)进行数据分析。
MDSC抑制测定
对从不具有肿瘤的C57Bl/6小鼠分离的脾T细胞进行T细胞的MDSC抑制。使用T细胞富集柱(R&D Systems)分离T细胞。用与经辐照的MDSC(5x104)一起培养的αCD3/α-CD28活化不同比例的分离的T细胞(2x104)。使用Alamar蓝或用CFSE染色分析CD4T细胞增殖。如前所述(24)进行人T细胞增殖测定。
微阵列分析
三周后从具有皮下Pan02肿瘤的小鼠中分离脾细胞。将从对照和具有肿瘤的动物的脾细胞中分离的MDSC(如前节所述)用于RNA分离(NucleoSpin RNA II,Machery-Nagel,Duren,Germany)，然后进行线性T7扩增并杂交至Agilent全鼠基因组寡核苷酸微阵列(Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray)。使用为质量控制分析和标准化开发的定制R语言脚本(customized R language script)分析扫描的阵列图像。使用来自bioconductor的线性模型微阵列分析软件包(limma)的Loess和分位数标准化程序(quantile normalization routine)对原始探针水平数据进行标准化，以调整染料偏差和阵列之间的变化。为了鉴别差异表达的基因，使用limma实施线性模型(36)。Limma通过拟合线性模型来评估肿瘤和对照MDSC之间的差异，并使用经验贝叶斯方法(empirical Bayesmethod)来减少来自每个探针组的表达值的估计对数倍数变化的标准差。根据绝对倍数变化以及Benjamini和Hochberg校正的P值(37)鉴定差异表达的探针。
交互式网络分析
为了破译基因之间的相互作用，我们进行了交互式网络分析。使用已知的蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，共表达和蛋白质-RNA相互作用产生交互式网络。相互作用的信息是使用文献检索和公开的数据库获得的。
细胞毒性分析
使用NK细胞分离试剂盒(NK Cell Isolation Kit)(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分离NK细胞。如早前所述(24)测量NK的细胞毒活性。在一些实验中，使用CellaTox非放射性测定(CellaTox non-radioactive assay)(Cell Technology，Mountain View，CA)测量NK细胞毒性，并且根据制造商的说明计算靶向细胞裂解。
体外细胞因子诱导的MDSC
通过Ficoll密度梯度离心(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)从健康志愿者的血液中分离人PBMC。在RPMI培养基中培养PBMC(5x105细胞/ml)，所述RPMI培养基含有10％FCS，2mML-谷氨酰胺，100U/青霉素和100ug/ml链霉素，并补充有GM-CSF(10ng/ml；R&D Systems，Minneapolis，MN)和IL-6(R&D Systems)。
共聚焦显微镜检查
在适当时收集来自小鼠的肿瘤，固定并准备用于恒冷箱切片(cryostatsection)。将组织切片(5μm)与对Gr1，Tspan33特异的大鼠抗小鼠mAb一起温育。用AlexaFluor 555抗大鼠或Alexa Fluor 488抗兔IgG标记切片。DAPI(Sigma，St.Louis，MO)用于核染色。共焦显微镜检查在Zeiss LSM510垂直共焦系统(Zeiss LSM510垂直ConfocalSystem)上进行。
统计分析
通过使用不配对的学生t检验(unpaired Student’s t test)进行组间差异的统计分析。认为p<0.05的值是统计学上显著的。
实施例1.Tspan33基因表达与小鼠MDSC相关
对从正常和具有胰腺癌(Pan02)的小鼠的脾中分离的CD11b+Gr-1+细胞的基因表达的微阵列分析揭示大量基因的差异表达。为了鉴定可用于MDSC的分离/治疗靶向的潜在MDSC标志物，我们关注以下基因：(1)最大程度差异表达，(2)可能编码细胞表面抗原(基于前导序列和跨膜区的存在)，(3)可能具有小鼠人直系同源物，(4)表达上是受组织限制的，(5)在另外两种肿瘤模型中的MDSC中也差异表达，(6)在体外形成的MDSC培养物中表达，和(7)在体外测定中标记了免疫抑制群体。这个分析中出现了代表潜在的新型候选MDSC标志物的一组基因的鉴定。
基于此分析，我们将Tspan33鉴定为识别MDSC的新的标志物，所述MDSC来自具有肿瘤的小鼠，来自小鼠骨髓细胞(图1)和来自通过GM-CSF和IL-6或癌细胞条件化培养基转化为免疫抑制细胞的人PBMC。Tspan33是一种跨膜蛋白，属于由具有富含半胱氨酸的长细胞外环(LEL)的保守结构域结构所限定的四跨膜蛋白(tetraspanin)超家族，所述长细胞外环含有高度保守的半胱氨酸-半胱氨酸-甘氨酸(CCG)基序(Maecker et al.,FASEB J.1997May；11(6):428-42)。最近的报道提示Tspan33在活化的B细胞中表达(Luu et al.,ClinImmunol.2013Dec；149(3):388–399)。Tspan33的表达是受到组织限制的(图2)，并且还与多个同基因原位移植的小鼠肿瘤模型中的髓样免疫抑制细胞群体相关(图3)。这些细胞表达与T细胞抑制相关的基因(Arg1，NOS2)，并且也表达IL-6，VEGF，EP2和EP4。
实施例2.在来自多个小鼠肿瘤模型的MDSC中检测Tspan33蛋白表达
已经证明，MDSC在人肿瘤和各种动物肿瘤模型中积聚。从在移植有E0771乳腺癌细胞的小鼠中或者在发展了自发性乳腺肿瘤的转基因小鼠中的肿瘤浸润性MDSC分离的MDSC的流式细胞术分析(图3)揭示了明显的Tspan33阳性细胞群。这支持Tspan33是具有乳腺癌的小鼠中MDSC的标志物的事实。
先前已经报道MDSC在具有肿瘤的动物的多个部位，包括脾，肝脏和肿瘤中积聚。注射后3周切除肿瘤(Pan02，E0771)，并用胶原酶和透明质酸酶消化以分离浸润性细胞。发现MDSC(通过染色CD11b+Gr-1+细胞测定)在Pan02肿瘤中以肿瘤浸润物(51.2％)存在。在此群体中观察到独特的CD11bhi细胞亚群，与此群体不太能区分的脾MDSC形成对比。肿瘤浸润性MDSC的染色显示Tspan33+细胞的独特群体(23.5％)，指示Tspan33是肿瘤浸润性MDSC的标志物。其他肿瘤模型中肿瘤浸润性细胞的分析揭示CD11b+Gr-1+细胞的相似的频率。浸润性细胞的染色显示它们对Tspan33+也是阳性的。肿瘤浸润物中Tspan33+细胞的频率对于B16黑素瘤是62％，对于E0771为55.3％和对于Her2转基因小鼠为68.6％(图3)。
实施例3.基因工程化小鼠模型中的胰腺肿瘤和乳腺肿瘤携带Tspan33+MDSC
我们还检查了在胰腺癌遗传模型(LSL-KrasG12D,Pdx-1-Cre小鼠)中分离的髓样衍生的抑制细胞中的Tspan33表达。在该模型中，CD11b+Gr-1+阳性细胞构成在具有肿瘤的动物中出现的大的粒细胞的群体，并且这些CD11b+Gr-1+细胞表达Tspan33，如在移植肿瘤模型中观察到的。
作为分开的遗传模型，我们产生了二转基因MMTV-rtTA/TetO-NeuNT小鼠的集落(colony)，所述小鼠以多西环素依赖性方式表达乳腺特异性活化的Neu。慢性诱导Neu后，动物在2个月内发展出类似于人类乳腺癌的侵袭性结节性癌(nodular carcinomas)。令人感兴趣的是，在撤回多西环素后，肿瘤迅速消退，并且即使Neu的去诱导，仅在一小部分亚群中发生复发。在慢性Neu诱导的动物以及来自经历多西环素撤回72小时并显示消退的迹象的独立的一组动物中，当肿瘤达到<200mm2时收获肿瘤。如(24)所述用酶消化肿瘤组织，并且用合适的抗体染色后分析肿瘤浸润性淋巴细胞的各种亚组的频率。观察到Neu诱导的肿瘤具有由CD11b+Gr1+细胞组成并且也针对Tspan33染色的大量浸润细胞。令人感兴趣的是，从消退的肿瘤中分离出的TIL证实MDSC从68.6％至19.3％的显著降低。免疫荧光染色揭示肿瘤切片中Tspan33+细胞的表达以及在消退的肿瘤中该群体减少的趋势(图4)。
实施例4.MDSC的消减降低了肿瘤负荷并且与Tspan33+MDSC的较低频率相关
为了在体内消减MDSC，在明显出现相当大的肿瘤(100–125mm3)之后，用i.p.施用的10mg/kg的mLy6G单克隆抗体处理具有Her2/neu肿瘤的小鼠。
发现MDSC频率的降低与两者中的肿瘤负荷降低相关。而且，从MDSC消减的肿瘤中分离的肿瘤浸润细胞证明Tsopan33+细胞的频率以及CD11b+Gr-1+细胞的频率降低超过50％。(图5)。
实施例5.在体外从小鼠骨髓产生的MDSC表达Tspan33
我们以前已经显示小鼠骨髓细胞可以在体外转化为免疫抑制细胞。我们已经在体外产生了此类MDSC(命名为BM-MDSC)：我们从小鼠骨髓细胞起始并用GM-CSF/IL-6培养其4天，并以许多方式表征这些细胞。BM-MDSC表现出NOS2和Arg1的增加的表达，并且是高度免疫抑制性的，这如通过其抑制用抗CD3和抗CD28活化的CD4细胞的增殖和抑制CD8细胞中的IFNγ和穿孔素产生的能力所证实。它们还抑制NK细胞毒性。简而言之，在经抗CD3/CD28包被的平板中将BM-MDSC与CD4T细胞以不同的比率共培养。用Alamar Blue或CFSE染色对细胞染色后测定增殖。将CD8细胞与BM-MDSC以1:1的比率培养24小时，并且然后染色IFNγ并通过FACS分析穿孔素水平。
重要的是，在GM-CSF/IL-6中培养BM细胞4天，导致这些免疫抑制细胞的产生，所述细胞可以通过CD11b+Gr-1+染色或用Tspan33来限定(图6)。
实施例6.肿瘤生长的药理学调控与MDSC频率降低相关
已显示MDSC的去除减轻了抗肿瘤免疫和整体疾病结果。我们的数据提示，用“节律性”低剂量环磷酰胺(每日口服施用)和cox-2抑制剂(Tongu et al.,CancerImmunol.Immunother.62(2):383-91(2013)，导致与MDSC和Treg的较少数量相关的肿瘤的较慢生长。我们使用这种治疗方案(CTX-30mg/kg/天；塞来昔布-20mg/kg/天)对具有Pan02的肿瘤的动物给药，并监测肿瘤大小以及经处理和对照动物的脾中的Tspan33+MDSC水平。我们观察到减少的肿瘤生长和相关的MDSC数量的降低(如通过接受该治疗的动物的脾中的Tspan33+细胞频率所测定的)。因此，在接受联合治疗的动物中，Tspan33+细胞的频率从37.8％降至11.6％(图7)，同时伴随着肿瘤体积的减少(从131.2至11.7mm3)。
实施例7.在前列腺癌患者中循环Tspan33+MDSC的频率
确定从健康供体(HD)和前列腺癌患者(PD)分离的PBMC中Tspan33阳性MDSC的频率通过如下的FACS进行分析。从健康供体(n＝2)和多个前列腺癌患者(n＝7)收集血液。如材料和方法中所述，通过差别密度梯度分离(Ficoll-Hypaque；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)分离PBMC。用缀合了荧光染料的HLA-DR，CD33和Tspan33或同种型对照抗体标记细胞。为了计算Tspan33+细胞的百分比，在Lin-,HLA-DRlo区域中进行门控，并且在减去用同种型对照测量的背景之后，认为阳性细胞是Tspan33+细胞。进行学生t检验以测量显著性水平。
图8中呈现的结果显示与健康供体(HD)相比，所有测试的前列腺癌患者(PD)具有显著更高的(p<0.01)循环Tspan33+MDSC水平。
实施例8.靶向MDSC的抗体减少肿瘤生长和大小
在异种移植人乳腺癌模型中评估基于抗体的MDSC消减的效果。为了体内消减MDSC，用mLy6G(Gr-1)单克隆抗体处理具有E0771移植肿瘤的小鼠；Gr-1已经被用作靶向小鼠中MDSC的研究中的鉴定标志物(9)。
以10mg/kg施用抗体(在在C57BL/6小鼠体侧注射106个E0771细胞后i.p.施用)。在肿瘤细胞注射后的第7、10和14天进行3次抗体注射。对动物实施安乐死后第21天收集脾和肿瘤。
在最初的实验中，在消减Ab处理后的2-3天处死动物，并且通过抗体染色分析脾中Ly6G特异性细胞的存在以监测MDSC的消减。
作为MDSC在肿瘤生长和免疫逃逸中的作用的核心主题的一部分，我们使用抗Gr-1抗体处理来消减移植有E0771乳腺癌细胞的动物中的MDSC。发现MDSC频率(CD11bGr-1+细胞频率)的降低与肿瘤负荷的减少相关(图9A-C)。这些结果证实用针对MDSC表面标志物的抗体靶向MDSC可导致肿瘤生长和大小的减少。
实施例9.肝癌中Tspan33的表达
进行荧光免疫组织化学以进一步验证Tspan33在细胞中的原位表达。在室温下使用10μg/mL的单克隆抗体(目录号#ab87543；abcam,Cambridge,MA)3小时在浸入固定HepG2细胞系中检测Tspan33。细胞用一抗(Alexa Fluor 647red/Alexa Fluor 488抗兔IgG绿色)染色，并用DAPI(蓝色；Sigma,St.Louis,MO)复染。共焦显微镜检查在Zeiss LSM510垂直共焦系统上进行。
结果证实在肝癌细胞系HepG2中Tspan33的细胞溶质和膜表达两者。
实施例10.肺癌中Tspan33的表达
在来自几个患者的正常和肺癌样品中测定Tspan33表达。通过western印迹发分析了Tspan33表达的匹配的正常人和癌症组织样品以来自Protein Biotechnologies(Protein Biotechnologies，CA)的RIPA缓冲液中的裂解物获得。来自大多数人肺癌样品的组织裂解物的western印迹分析揭示存在对应于人Tspan33的蛋白质条带(如通过在HepG2细胞裂解物上表达的相同大小的条带，最后的泳道)。此外，与正常组织(N)相比，Tspan33蛋白在肿瘤(T)中更丰富地表达。这提示在来自具有肺癌的患者的肿瘤样品中存在Tspan33+细胞。
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其他实施方案
应该理解的是，虽然本发明已经结合其详细说明描述，但是前述说明书旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面，优点和修改在以下权利要求书的范围内。

Claims (30)

1.治疗受试者中的癌症或选择用于治疗的受试者的方法，所述方法包括：
检测来自所述受试者的样品中Tspan33+MDSC的水平，优选其中所述样品包含血液、血清、尿液或癌性组织；
比较所述样品中Tspan33+MDSC的水平与Tspan33+MDSC的参考水平；和
选择具有高于参考水平的Tspan33+MDSC水平的受试者以用靶向MDSC的免疫疗法进行治疗，并且任选地将所述靶向MDSC的免疫疗法施用于所述受试者；或者
选择具有处于或低于参考水平的Tspan33+MDSC水平的受试者以用不靶向MDSC的疗法，例如，不靶向MDSC的免疫疗法或非免疫疗法抗癌疗法进行治疗；并且任选地施用所述不靶向MDSC的疗法。
2.在受试者中治疗癌症或减少MDSC数量的方法，所述方法包括施用治疗有效量的特异性结合Tspan33的抗体并降低所述受试者中Tspan33+髓样衍生的抑制细胞的数量或活性。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体是人类的、人源化的、嵌合的、双特异性的或双功能性的。
4.权利要求2的方法，其中所述抗体偶联于细胞毒性肽或蛋白质、放射性同位素或抗癌药物。
5.权利要求2的方法，其还包括对所述受试者施用抗癌疗法。
6.权利要求1或5的方法，其中在与Tspan33特异性结合的所述抗体之后将所述抗癌疗法施用于所述受试者。
7.权利要求1或5的方法，其中所述抗癌疗法选自下组：用冷仪器或激光手术切除、放疗、光疗、生物疗法、射频消融术(RFA)、放射性栓塞法、化学疗法和免疫疗法，如本文所述。
8.权利要求7的方法，其中所述抗癌疗法包括施用检查点抑制剂和/或癌症疫苗。
9.权利要求1或2的方法，其中所述癌症是上皮起源的实体癌。
10.权利要求1或2的方法，其中所述癌症的特征在于癌组织中存在Tspan33+髓样衍生的抑制细胞(MDSC)。
11.权利要求2的方法，其还包括从所述受试者获得样品，优选地包含血液、尿液、CSF或癌性组织的样品；
检测所述样品中Tspan33+MDSC的存在；和
选择具有癌组织中存在的高于Tspan33+MDSC参考水平的Tspan33+MDSC水平的受试者，并且然后施用治疗有效量的所述抗体。
12.随时间监测受试者中癌症治疗效力的方法，所述方法包括：
测定来自所述受试者的第一样品中的Tspan33+MDSC的第一水平，优选包含血液、尿液、CSF或癌性组织的样品；
测定来自所述受试者的后续样品中的Tspan33+MDSC的后续水平，优选包含血液或癌性组织的样品；
比较Tspan33+MDSC的第一水平和后续水平，和
当Tspan33+MDSC的后续水平低于Tspan33+MDSC的第一水平时鉴定治疗为有效的。
13.权利要求12的方法，其中所述治疗特异性或非特异性地消减所述受试者中的Tspan33+MDSC。
14.权利要求12的方法，其中所述治疗是免疫疗法。
15.权利要求14的方法，其中所述治疗包括施用检查点抑制剂和/或TLR激动剂。
16.鉴定用于治疗癌症的候选化合物的方法，所述方法包括：
选择结合Tspan33的测试化合物；
使所述测试化合物与包含表达Tspan33的髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的样品接触；
检测所述测试化合物对所述细胞的影响，其中所述影响选自：Tspan33+MDSC的存活力、Tspan33+MDSC的寿命、Tspan33+MDSC的免疫抑制能力或Tspan33+MDSC的增殖；和
选择降低Tspan33+MDSC的存活力、寿命、免疫抑制或增殖的测试化合物作为候选化合物。
17.权利要求16的方法，其中选择结合Tspan33的测试化合物包括提供包含Tspan33的样品，任选地其中所述样品包含表达Tspan33的细胞或纯化的Tspan33蛋白；
使所述样品与测试化合物接触；
检测测试化合物与所述样品中Tspan33的结合；和
选择结合Tspan33的测试化合物。
18.权利要求16的方法，其还包括将所选择的候选化合物施用于病症的体内模型，优选其中所述模型是动物肿瘤模型；
检测对所述模型中的病症的一种或多种症状，例如，对肿瘤或脾中Tspan33+MDSC的数目、肿瘤生长或转移的影响；和
选择改善一种或多种症状，例如减少肿瘤或脾中的Tspan33+MDSC的数量、减少肿瘤生长或减少转移的候选化合物作为候选治疗剂。
19.权利要求18的方法，其中所述病症的所述动物肿瘤模型是人类肿瘤异种移植物模型。
20.确定随时间治疗对受试者中MDSC水平的影响的方法，所述方法包括：
测定来自所述受试者的第一样品中的Tspan33+MDSC的第一水平，优选其中所述样品包含血液、尿液、CSF或癌性组织；
测定来自所述受试者的后续样品中的Tspan33+MDSC的后续水平；
比较Tspan33+MDSC的第一水平和后续水平，和
当Tspan33+MDSC的后续水平高于Tspan33+MDSC的第一水平时鉴定治疗为增加MDSC，或
当Tspan33+MDSC的后续水平低于Tspan33+MDSC的第一水平时鉴定治疗为降低MDSC。
21.权利要求20的方法，其中所述治疗是用于癌症的治疗。
22.权利要求20的方法，其中所述治疗特异性地或非特异性地消减所述受试者中的Tspan33+MDSC。
23.确定受试者中MDSC的存在或水平的方法，所述方法包括：
任选地从所述受试者获得样品，优选地其中所述样品包含血液、尿液、CSF或癌性组织或肿瘤裂解物；
任选地富集所述样品的髓样细胞，优选使用流式细胞术并选择HLA-DR1o，CD33+细胞；
使所述样品与结合Tspan33的抗体接触；
检测所述抗体与所述样品的结合；和
基于所述抗体与所述样品的结合来确定样品中MDSC的水平。
24.前述权利要求中任一项，其中所述癌症不是髓样癌，不是血液恶性肿瘤，不是与激活的B细胞相关的血液恶性肿瘤，或者不是B细胞淋巴瘤。
25.抗体用于在受试者中治疗癌症或减少MDSC数目的用途，所述抗体特异性结合Tspan33并减少Tspan33+髓样衍生的抑制细胞的数目或活性。
26.权利要求25的用途，其中所述抗体是人的、人源化的、嵌合的、双特异性的或双功能性的。
27.权利要求25的用途，其中所述抗体偶联于细胞毒性肽或蛋白质、放射性同位素或抗癌药物。
28.权利要求25的用途，其中所述癌症是上皮起源的实体癌。
29.权利要求25的用途，其中所述癌症的特征在于在所述癌组织中存在Tspan33+髓样衍生的抑制细胞(MDSC)。
30.权利要求25的用途，其中所述癌症不是髓样癌，不是血液恶性肿瘤，不是与激活的B细胞相关的血液恶性肿瘤，或者不是B细胞淋巴瘤。
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