CN108138191B

CN108138191B - 具有l-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产l-赖氨酸的方法

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Publication number: CN108138191B
Application number: CN201680049821.1A
Authority: CN
Inventors: 卞效情; 郑润熙; 金亨俊; 李善英; 南玹求; 朴善美; 李相穆
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2036-07-27
Also published as: BR112018003756A2; EP3342869A4; MY190149A; RU2685482C1; ES2795437T3; EP3342869A1; US10889843B2; EP3342869B1; KR20170025045A; WO2017034164A1; PL3342869T3; CN108138191A; HUE048849T2; JP6860565B2; KR101740807B1; US20180258452A1; JP2018523496A

Abstract

本发明涉及一种具有L‑赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产L‑赖氨酸的方法。

Description

具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产L- 赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产L-赖氨酸的方法。

背景技术

L-赖氨酸是一种必需氨基酸，在动物饲料、人类医药品及化学品产业中使用L-赖氨酸，通过利用棒状杆菌属或埃希氏菌属进行发酵来生产L-赖氨酸。

棒状杆菌属菌株(Corynebacterium)特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为在L-氨基酸生产中广泛利用的革兰氏阳性微生物。为了生产L-赖氨酸，主要利用如下的靶物质特异性处理方法：在棒状杆菌属菌株中主要增加对参与L-赖氨酸的生物合成的酶进行编码的基因的表达，或者去除L-赖氨酸的生物合成中不需要的基因。但是，除这种方法以外，进一步应用去除不参与L-赖氨酸生产的基因的方法，具体而言，进一步应用去除具有未知功能的基因的方法。

由此，本发明人为了持续探索能够增加赖氨酸生产能力的有效形质而进行了深入研究，其结果通过确认如下的事实而完成了本发明：即，通过使棒状杆菌属微生物的内源基因随机缺失而筛选出以高浓度生产L-赖氨酸的微生物，并且在该微生物中缺失对具有目前为止未被报告的功能的蛋白质进行编码的基因的情况下会增加L-赖氨酸生产能力。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1：KR10-0838035B1(公告日2008年06年12日)

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物。

此外，本发明的另一目的是提供一种利用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。

技术方案

为了实现如上所述的目的，本发明提供一种具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，其中，包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质失活。

此外，本发明提供一种L-赖氨酸生产方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的微生物；以及从所述微生物或所述培养基中回收L-赖氨酸。

发明效果

本发明通过在生产L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物中使具有未知功能的包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质失活而提供L-赖氨酸生产能力得到提高的重组棒状杆菌属微生物，并且由于所述重组棒状杆菌属微生物能够以高收率生产L-赖氨酸，因此在生产L-赖氨酸时能够产业上有效地利用该重组棒状杆菌属微生物。

具体实施方式

下面，对本发明进行详细说明。

作为本发明的第一方面，本发明提供一种具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，其中，包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质失活。

包含所述序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质为存在于棒状杆菌属微生物中的内源性蛋白质或具有未知功能的假定蛋白质(hypothetical protein)。

包含所述序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质可进一步包括含有如下氨基酸序列的蛋白质：相对于所述序列号1所示的氨基酸序列具有80％以上、具体而言90％以上、更具体而言95％以上、特别具体而言97％以上的同源性。作为与所述序列具有同源性的序列，只要与序列号1所示的氨基酸序列具有实质上相同或相应的生物学活性，则具有部分序列缺失、修饰、置换或附加的氨基酸序列的情况也同样包含在本发明的范畴中，这是显而易见的。

只要是能够对包含所述序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质进行编码的核苷酸序列，则包含在本发明的范畴中，但具体而言可具有序列号2所示的核苷酸序列。此外，相对于所述序列号2所示的核苷酸序列具有80％以上、具体而言90％以上、更具体而言95％以上、特别具体而言97％以上的同源性的核苷酸序列也可以包含在本发明中。此外，起因于遗传密码简并性(genetic code degeneracy)而对相同氨基酸序列进行编码的、所述序列的变异体也可以包含在本发明中。

在本发明中，术语“同源性”是指与指定的氨基酸序列或核苷酸序列一致的程度，可用百分比来表示“同源性”。在本发明中，用“％同源性”来表示与指定的氨基酸序列或核苷酸序列具有相同或相似的活性的其同源性序列。

例如，可使用文献中记载的BLAST算法[参见Karlin及Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci(美国国家科学院学报).USA,90,5873(1993)]或由Pearson发表的FASTA算法[参见Methods Enzymol.(酶学方法),183,63(1990)]来确定相对于所述氨基酸或核苷酸序列的同源性。以这种BLAST算法为基础，已开发了称作BLASTN或BLASTX的程序[参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。

在本发明中，术语“失活”是指生成所述内源基因的表达与亲株、变异前菌株或野生型菌株相比减少至较低水平或完全不会表达的基因以及即使表达也没有其活性或具有减少的活性的基因，可通过本领域公知的任意失活方法来实现“失活”。在本发明中，作为失活方法可以是选自由向所述基因内插入一个以上的碱基对的插入(insertion)突变、在所述基因内缺失一个以上的碱基对的缺失(deletion)突变以及向所述基因内导入无义密码子的碱基对转换(transition)或颠换(transversion)突变组成的组中的一个以上的突变的方法，或者可以是将所述基因的内在启动子取代为更弱的启动子或者使所述基因的全部或一部分缺失的方法，但并不限于此。

作为使基因缺失的方法可使用本领域公知的基因缺失方法，但基因缺失方法并不受限制。作为一例，可利用如紫外线等的光或化学物质来诱发突变，并且从得到的突变体中筛选目标基因缺失的菌株。此外，所述基因缺失例如可通过将包含与目标基因具有同源性的核苷酸序列的核苷酸序列或载体注入到所述微生物并引起同源重组(homologousrecombination)来实现。此外，在所述注入的核苷酸序列或载体中可包含显性筛选标记。

所述载体只要能够用于目标蛋白质的失活，则可以是天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒及噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可使用pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A及Charon21A等，作为质粒载体，可使用pDZ载体、pBR类、pUC类、pBluescriptII类、pGEM类、pTZ类、pCL类及pET类等。可使用的载体并不受特别限制，可使用公知的表达载体。

可通过本领域的常规方法来容易执行所述重组载体的导入。通常具有氯化钙(CaCl₂)沉淀法、通过在CaCl2方法中使用DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲亚砜)这种还原物质而提高效率的Hanahan方法、电穿孔法(electroporation)、磷酸钾沉淀法、原生质体融合法、利用碳化硅纤维的搅拌法、利用PEG(聚乙二醇)的转化法、右旋葡聚糖、脂质体及干燥/抑制介导的转化法等。

在本发明中，术语“转化”是指能够通过将包含对目标蛋白质进行编码的多核苷酸的载体导入到宿主细胞内而在宿主细胞内使所述多核苷酸表达或失活。所述多核苷酸可包含对标的蛋白质进行编码的DNA及RNA、减少标的蛋白质表达的启动子或者能够使标的蛋白质表达失活的标记基因等。所述多核苷酸只要能够通过导入到宿主细胞内而实现表达，则可以以任何形式导入到宿主细胞内。作为包含所述序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质要被失活的亲株，只要是能够生产L-赖氨酸的微生物则可以不限制地使用，并且该亲株可以是属于棒状杆菌(Corynebacterium)、短杆菌(Brevibacterium)属、埃希氏菌(Escherichia)属、阴沟肠杆菌(Enterbacter)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷菌(Serratia)属及普罗威登斯菌(Providencia)的微生物。具体而言，作为待使包含所述序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质要被失活的亲株可使用棒状杆菌属微生物，更具体而言可使用谷氨酸棒状杆菌。

在本发明中，术语“具有L-赖氨酸生产能力的微生物”可以是通过以能够生产L-赖氨酸的方式操作普遍公知的基因而获取的微生物，例如可以是通过强化选自由参与L-氨基酸生产的棒状杆菌属微生物的内源aspB(对天冬氨酸氨基转移酶进行编码的基因)、lysC(对天冬氨酸激酶进行编码的基因)、asd(对天冬氨酸半醛脱氢酶进行编码的基因)、dapA(对二氢吡啶二羧酸合成酶进行编码的基因)、dapB(对二氢吡啶还原酶进行编码的基因)及lysA(对二氨基二庚二酸脱羧酶进行编码的基因)等的L-赖氨酸生物合成结构基因组成的组的基因中的一个或一个以上的表达而得到的微生物。此外，“具有L-赖氨酸生产能力的微生物”可以是通过突变处理，例如通过用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)对导入L-赖氨酸营养缺陷型的变异菌株进行处理而得到的微生物。

作为本发明的第二方面，本发明提供一种L-赖氨酸生产方法，包括以下步骤：在培养基中培养所述本发明的微生物；以及从所述微生物或所述培养基中回收L-赖氨酸。

所述本发明的微生物如前述所述。

在本发明的方法中，棒状杆菌属微生物的培养可使用本领域公知的任意培养条件及培养方法。

作为能够为了培养棒状杆菌菌株而使用的培养基，例如可使用Manual ofMethods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology(华盛顿D.C.,USA,1981)中公开的培养基。

作为能够在培养基中使用的糖源，包含如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等的碳水化合物、如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等的油及脂肪、如软脂酸、十八酸、亚油酸等的脂肪酸、如丙三醇、乙醇等的醇、或者如乙酸等的有机酸。这种物质可单独使用或者作为混合物来使用，但并不限定于此。

作为能够使用的氮源，包含蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸出液、大豆粉以及尿素或者例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵等的无机化合物。氮源也可以单独使用或者作为混合物来使用，但并不限定于此。

作为能够使用的磷源，可包含磷酸二氢钙、磷酸氢二钙或者相应的含钠盐。此外，培养基可含有生长中所需要的如硫酸镁或硫酸铁等的金属盐。最后，在所述物质基础上可使用如氨基酸及维生素等的生长必需物质。此外，可使用适合培养基的前驱体。可以在培养过程中通过适合培养物的方式按分批式或连续式添加所述原料。

在所述微生物的培养过程中，能够通过以适当方式使用如氢氧化钠、氢氧化钾、氨等的基础化合物或者如磷酸或硫酸等的氧化物来调节培养物的pH。此外，可通过使用如脂肪酸聚乙二醇酯等的消泡剂来抑制气泡生成。为了维持优良状态，可向培养物内注入氧气或含氧气体(例如，空气)。培养物的温度通常可以是20℃至45℃，具体而言可以是25℃至40℃。培养时间可持续到直至获得所需的L-氨基酸的生成量为止，具体而言，培养时间可以是10至160小时。

在本发明的方法中，可通过如批量工序、分批引入及反复分批引入工序等的连续式或分批式来实现培养。这种培养方法为本领域中公知的方法，可使用由本领域技术人员选择的任意方法。

可通过阴离子交换色谱法及后续茚三酮衍生物化来分离及分析L-赖氨酸。此外，本发明的方法包括回收L-赖氨酸的步骤。从微生物或培养基中回收L-赖氨酸的方法为在本领域中广为人知的方法。在所述L-赖氨酸回收方法中可使用过滤、阴离子交换色谱法、结晶化及HPLC(高效液相色谱法)等，但并不限定于这些例。

下面，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，这些实施例只是用于举例说明本发明，本发明的范围并不限定于这些实施例。

[实施例]

实施例1：利用转座子制作随机突变文库

为了得到赖氨酸生产能力增加的菌株，利用下述方法制作载体文库。

首先，以谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(韩国授权专利号第10-0159812号；所述微生物以KFCC10881被公开之后，被重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构且授予的保藏号为KCCM11016P)为亲株，利用电脉冲法对使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>TnpTransposome^TM试剂盒(Epicentre)而得到的质粒进行转化，并且涂抹到包含卡那霉素(25mg/L)的复合平板培养基后确保约20000个菌落。

<复合平板培养基(pH7.0)>

葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉提取物5g、酵母提取物5g、脑心浸出液(Brain HeartInfusion)18.5g、氯化钠(NaCl)2.5g、尿素2g、山梨醇91g、琼脂20g(以蒸馏水1L为基准)

实施例2：利用转座子来筛分随机突变文库

将上述实施例1中确保的约20000个菌落分别接种到300μL的下述筛选培养基并在96深孔板(96-deep well plate)中以32℃、1000rpm培养约24小时。

<筛选培养基(pH8.0)>

葡萄糖10g、硫酸铵(ammonium sulfate)5.5g、七水硫酸镁(MgSO₄7H₂O)1.2g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.8g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)16.4g、生物素100μg、硫胺素盐酸盐(thiaminehcl)1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg(以1L蒸馏水为基准)。

为了分析培养液中生产出的L-赖氨酸的生产量，利用茚三酮方法(Moore,S.,Stein,W.H.,Photometric ninhydrin method for use in the chromatography ofamino acids.J.Biol.Chem.1948,176,367-388)。

在完成培养之后，使上清液10μl和茚三酮反应溶液190μl在65℃下反应30分钟，然后利用分光光度计(spectrophotometer)在波长570nm下测量吸光度，并且通过与作为对照区的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株比较而筛选作为呈现高吸光度的变异菌株的约60余种的菌落。除此之外的菌株呈现与用作对照区的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株类似或减少的吸光度。

在利用与上述相同的方法再次培养上述筛选出的60余种菌株之后反复执行茚三酮方法，其结果筛选出作为亲株的相对于谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株而具有提高的L-赖氨酸生产能力的上位十种的突变株。

实施:例3：分析筛选出的随机突变株的L-赖氨酸生产能力

为了以上述实施例2中筛选出的十种突变株为对象而最终筛选L-赖氨酸生产能力再现性地增加的菌株，实施利用下述培养基的烧瓶培养。在完成培养之后利用HPLC来分析培养液内的L-赖氨酸浓度，并且将各突变株的L-赖氨酸生产浓度表示于下述表1中。

<种子培养基(pH7.0)>

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)8g、七水硫酸镁(MgSO₄7H₂O)0.5g、生物素100μg、硫胺素盐酸盐(thiaminehcl)1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg(以1L蒸馏水为基准)。

<生产培养基(pH7.0)>

葡萄糖100g、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸渍固体(Corn SteepSolids)5g、尿素3g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g、七水硫酸镁(MgSO₄7H₂O)0.5g、生物素100μg、硫胺素盐酸盐(thiamine hcl)1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺3000μg、碳酸钙(CaCO₃)30g(以1L蒸馏水为基准)。

[表1]

筛选出的十种随机突变株的L-赖氨酸生产浓度

作为筛选出的十种变异株中的L-赖氨酸生产能力有意义地提高的菌株而最终筛选KCCM11016P/mt-10。

实施例4：在最终筛选株中查明L-赖氨酸生产能力增加的原因

在本实施例中，以从上述实施例3中最终筛选出的突变株为对象，判断因转座子的随机插入而缺损的基因。

在提取并切断KCCM11016P/mt-10的基因组DNA之后进行连接而转化到大肠菌DH5α，并且涂抹到包含卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。在筛选转化后的20种菌落之后，获取包含一部分未知基因的质粒，并且使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome^TM试剂盒的引物1(序列号3)及引物2(序列号4)来分析碱基序列，其结果以由美国国立基因研究院的基因银行(NIH Genbank)报告的碱基序列为基础可知包含序列号2所示的核苷酸序列的基因失活。

引物1(序列号3)：ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC

引物2(序列号4)：CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

实施例5：为了使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失而制作重组载体

为了制作能够在棒状杆菌属菌株的染色体上使上述实施例4中确认到的包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的重组载体，合成引物3至6以便制作用于上述基因缺失的片段，并将其表示于表2。

[表2]

用于制作用于基因缺失的片段的引物3至6

根据序列号2，为了ORF部位的缺失而合成引物(序列号5)、引物4(序列号6)、引物5(序列号7)和引物6(序列号8)，并且以野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA为模板，执行PCR(聚合酶链式反应)[桑布鲁克等，分子克隆实验指南(1989)，美国冷泉港实验室，Sambrook et al,Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989),Cold SpringHarbor Laboratories]。由此获取对由序列号2所示的核苷酸序列编码的蛋白质进行编码的部分的上段364bp和下段375bp连接而成的DNA片段。此时，在变性95度下变性5分钟之后反复进行于95度变性30秒、于56度退火30秒、于72度聚合1分钟的30次循环，然后在72度下执行聚合反应7分钟。在谷氨酸棒状杆菌内利用染色体导入用限制酶XbaI对由不可复制的pDZ载体(韩国专利授权号第10-0924065号)和PCR来增幅的上述片段进行处理之后，利用DNA接合酶连接它们，然后转化到大肠菌DH5α并涂抹于包含卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基。

在通过PCR来筛选插入有上述目标基因的质粒的菌落之后，利用质粒提取法来获取质粒，并将该质粒命名为pDZ-△MT10DS1。

实施例6：制作包含来源于谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P的序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的菌株及评价L-赖氨酸的生产能力

根据染色体同源重组，将由上述实施例5制作的重组质粒pDZ-△MT10DS1转化到作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P中(van der Rest et al.,ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545,1999)。

然后，在包含4％的蔗糖的固体平板培养基中进行二次重组。以完成二次重组的所述谷氨酸棒状杆菌转化株为对象，利用引物3和引物6且通过PCR法来获取染色体中缺失序列号2所示的基因的菌株。将所述重组菌株命名为谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-△MT10DS1。

为了分析上述制作出的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-△MT10DS1的L-赖氨酸生产能力，利用如下所述的方法与作为亲株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株一同培养。

在含有下述的种子培养基

的三角振荡烧瓶中接种作为亲株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P和由实施例6制作的菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-△MT10DS1，并且在30℃下以200rpm摇动培养20小时。然后，在含有生产培养基

的

的三角振荡烧瓶中接种

的种子培养液，并且在30℃下以200rpm摇动培养72小时。上述种子培养基和生产培养基的组分分别如下所述。

<种子培养基(pH7.0)>

<生产培养基(pH7.0)>

葡萄糖100g、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸渍固体(Corn SteepSolids)5g、尿素3g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g、七水硫酸镁(MgSO₄7H₂O)0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺3000μg、碳酸钙(CaCO₃)30g(以1L蒸馏水为基准)。

在培养结束后，利用HPLC(高效液相色谱法)(Waters 2478)来测量L-赖氨酸的生产量，并且将分析出的L-赖氨酸浓度表示于下述表3中。

[表3]

分析来源于KCCM11016P的KCCM11016P-△MT10DS1的L-赖氨酸生产能力

如上述结果那样，在从作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P中使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的情况下，确认相对于亲株而L-赖氨酸生产能力增加平均19％。

因此，确认能够通过在棒状杆菌属微生物中使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失而提高L-赖氨酸生产能力。

从上述结果确认通过在L-赖氨酸生产菌株中使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失以使具有未知功能的假定蛋白(hypothetical protein)失活而有效地增加L-赖氨酸生产能力，将上述菌株KCCM11016P-△MT10DS1命名为CA01-2285，并且在2014年12月5日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)并授予了保藏号KCCM11626P。

实施例7：制作包含来源于谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P的序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的菌株及评价L-赖氨酸生产能力

为了确认在生产L-赖氨酸的属于其他谷氨酸棒状杆菌的菌株中也是否具有与上述相同的效果，利用与上述实施例6相同的方法且以作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P(所述微生物以KFCC10750被公开之后，被重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构且授予的保藏号为KCCM11347P。韩国授权专利第10-0073610号)为对象制作包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的菌株，并将其命名为KCCM11347P-△MT10DS1。

以与上述实施例6相同的方法培养该包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的菌株，在结束培养之后通过HPLC(Waters 2478)来测量L-赖氨酸生产能力，并且将分析的L-赖氨酸浓度表示于下述表4中。

[表4]

分析由KCCM11347P衍生的KCCM11347P-△MT10DS1的L-赖氨酸生产能力

如上述结果那样，在以作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P为对象使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的情况下，确认L-赖氨酸生产能力增加平均20％。

因此，如实施例6的结果那样，确认能够通过在棒状杆菌属微生物中使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失而提高L-赖氨酸生产能力。

实施例8：制作来源于谷氨酸棒状杆菌CJ3P的序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的菌株及评价L-赖氨酸生产能力

为了确认在生产L-赖氨酸的属于其他谷氨酸棒状杆菌的菌株中也是否具有与上述相同的效果，利用与上述实施例6相同的方法在野生株中导入三种变异[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]并以具有L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌CJ3P(宾德等，影响因子，2012,13:R40，Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)为对象制作包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的菌株，并将其命名为CJ3P-△MT10DS1。

以上述实施例6相同的方法培养该包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的菌株，在培养结束之后利用HPLC(Waters 2478)来测量L-赖氨酸生产能力，并且将分析的L-赖氨酸浓度表示于下述表5中。

[表5]

由CJ3P衍生的CJ3P-△MT10DS1的L-赖氨酸生产能力

如上述结果那样，在以作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌CJ3P为对象使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失的情况下，确认L-赖氨酸生产能力增加平均17％。

因此，如实施例6及实施例7的结果那样，确认能够通过在棒状杆菌属微生物中使包含序列号2所示的核苷酸序列的基因缺失而提高L-赖氨酸生产能力。

[保藏号]

保藏机关名称：韩国微生物保藏中心(国外)

保藏号：KCCM11626P

保藏日期：2014年12月05日

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产L-赖氨酸的方法

<130> PP16-0104

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

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<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 1

Met Ile Val Asn His Phe Phe Ser Gly Val Ser Pro Leu Ile Val Ala

1 5 10 15

Ile Ile Leu Gly Ile Ile Leu Thr Asn Leu Ile Gln Leu Pro Ala Ser

20 25 30

Thr Ser Pro Gly Ile Thr Leu Ala Ser Lys Lys Leu Leu Arg Leu Gly

35 40 45

Ile Val Phe Leu Gly Leu Gln Leu Val Phe Ser Asp Ile Leu Ser Leu

50 55 60

Gly Phe Pro Met Leu Ala Val Ile Val Cys Ile Val Ala Gly Gly Ile

65 70 75 80

Phe Gly Thr Ile Leu Met Gly His Leu Leu Arg Met Lys Pro Thr Gln

85 90 95

Val Leu Leu Ile Ala Cys Gly Phe Ser Ile Cys Gly Ala Ala Ala Val

100 105 110

Ala Gly Val Glu Gly Val Thr Asp Ser Glu Glu Glu Glu Val Val Thr

115 120 125

Ala Val Ala Leu Val Val Ile Phe Gly Thr Leu Met Ile Pro Phe Ile

130 135 140

Pro Phe Ala Thr Lys Val Leu Gly Leu Ser Pro Glu Ile Gly Gly Met

145 150 155 160

Trp Ala Gly Gly Ser Ile His Glu Ile Ala Gln Val Val Ala Ala Gly

165 170 175

Gly Val Ile Gly Gly Gly Ala Leu Gly Val Ala Val Val Val Lys Leu

180 185 190

Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Pro Ile Ala Ala Ile Leu Ser Phe Arg

195 200 205

Gln Arg Arg Gln Gly Tyr Thr Ser Pro Asp Gly Lys Arg Pro Pro Val

210 215 220

Val Pro Leu Phe Ile Leu Gly Phe Leu Ala Met Val Val Leu Arg Ser

225 230 235 240

Thr Val Ala Leu Pro Asp Glu Val Ile Ala Ala Gly Gly Phe Leu Gln

245 250 255

Thr Ala Leu Leu Ser Ala Ala Met Phe Gly Leu Gly Cys Gly Val Lys

260 265 270

Ile Gln Asn Leu Ile His Val Gly Val Lys Pro Phe Ile Leu Ala Phe

275 280 285

Gly Ser Thr Thr Leu Val Thr Ser Ile Ala Leu Ala Gly Thr Leu Leu

290 295 300

Thr His Leu Gly

305

<210> 2

<211> 927

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 2

atgatcgtga atcacttttt ctctggtgtg agtccgctta tcgtcgcgat cattcttggc 60

atcatcctga ccaacctgat tcagctccca gcatcgacct cacccggcat cacgttggcg 120

tcgaaaaagc ttttgcggct gggaatcgtc ttccttggtc tgcagttagt tttctcagat 180

attttgtcac ttggtttccc catgctggcg gtgattgtgt gcatcgttgc cggtggtatt 240

tttgggacca tcctcatggg acacctgctc agaatgaaac caacccaagt tctgttgatt 300

gcttgtggct tttctatttg tggcgctgcg gccgtggcag gtgttgaagg agtaactgat 360

tccgaagaag aagaggtcgt tactgcggtt gcacttgttg ttattttcgg aacgctgatg 420

attcctttta tcccattcgc aaccaaagtc ttggggttat cccctgaaat cggtgggatg 480

tgggcaggcg gatccatcca tgaaatcgcc caagtagtag cagctggagg agtcattggt 540

ggtggagcat taggtgttgc agttgtggtg aaactcgccc gagtactcct acttgcaccc 600

attgctgcca ttttaagttt tcgccagcgc cgccagggtt acacgtcccc cgatggaaag 660

agaccaccgg tcgttcccct atttatcctt ggattcttgg cgatggtagt tttgcgctcc 720

actgttgcgc tcccagacga ggtaattgcg gctggaggtt tcctacagac agccttgctc 780

tctgcagcaa tgtttggtct cgggtgtggc gtaaaaatcc agaacctgat ccatgttggg 840

gtcaagcctt tcattctggc tttcggatcc acgacacttg tcaccagtat cgcacttgca 900

ggcaccctac tcacccacct cggatag 927

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物1

<400> 3

acctacaaca aagctctcat caacc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物2

<400> 4

ctaccctgtg gaacacctac atct 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物3

<400> 5

cgctctagat ttcatgtctg cctcaagc 28

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物4

<400> 6

tactggtgac aaactagtcg gactcacacc agagaaa 37

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物5

<400> 7

ggtgtgagtc cgactagttt gtcaccagta tcgcact 37

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物6

<400> 8

cgctctagac gctgataacg atgaggtc 28

Claims

1.一种修饰的谷氨酸棒状杆菌微生物，其与未修饰的微生物相比具有增加的L-赖氨酸生产能力，其中，包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质失活。

2.根据权利要求1所述的修饰的微生物，其中，所述蛋白质由具有SEQ ID NO：2所示的碱基序列的基因来编码。

3.根据权利要求1所述的修饰的微生物，其中，所述增加的L-赖氨酸生产能力是由含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质失活而引起的。

4.一种生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：

在培养基中培养权利要求1至3中的任一项所述的微生物；以及

从所述微生物或所述培养基中回收L-赖氨酸。