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CN108135988A - 受体 - Google Patents

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CN108135988A
CN108135988A CN201680061278.7A CN201680061278A CN108135988A CN 108135988 A CN108135988 A CN 108135988A CN 201680061278 A CN201680061278 A CN 201680061278A CN 108135988 A CN108135988 A CN 108135988A
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CN
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receptor
nucleic acid
leu
chimerical
acid sequence
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CN201680061278.7A
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M.普莱
S.科多巴
M.里吉
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Otto Ruth Ltd
Autolus Ltd
Original Assignee
Otto Ruth Ltd
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Abstract

本发明提供了嵌合受体，其包含：配体结合外域；和内域，所述内域包含：(i)细胞因子受体内域；和(ii)胞内T细胞信号传导域。

Description

受体
发明领域
本发明涉及嵌合受体(CR)和表达此类嵌合受体的细胞。
发明背景
嵌合抗原受体(CAR)
已经描述了许多免疫治疗剂用于癌症治疗，包括治疗性单克隆抗体(mAb)、双特异性T细胞衔接剂(engager)和嵌合抗原受体(CAR)。
嵌合抗原受体是将单克隆抗体(mAb)的特异性嫁接到T细胞的效应器功能的蛋白质。它们的通常形式是I型跨膜域蛋白形式，具有均与复合内域(endodomain)连接的抗原识别氨基端、间隔物、跨膜域，所述复合内域传递T细胞存活和激活信号。
这些分子的最常见形式是源自识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)经由间隔物和跨膜域与信号传导内域融合的融合物。响应于scFv对其靶物的识别，此类分子导致T细胞的活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀死表达靶抗原的靶细胞。已经开发了针对肿瘤相关抗原的几种CAR，并且使用此类CAR表达T细胞的过继转移方法目前正在用于治疗各种癌症的临床试验中。
迄今为止，CAR T细胞在治疗液体肿瘤如白血病和淋巴瘤中的应用取得了一些成功。然而，由于对T细胞不利的免疫抑制性微环境，使用CAR T细胞治疗实体瘤更具挑战性。
可以通过施用细胞因子或通过组成性产生细胞因子的CAR T细胞增强CAR T细胞的持久性和活性。但是，这些方法具有局限性：系统性施用细胞因子可以是有毒的；细胞因子的组成性产生可导致不受控制的增殖和转化(Nagarkatti et al(1994)PNAS 91:7638-7642；Hassuneh et al(1997)Blood 89:610-620)。
因此需要替代的CAR T细胞方法，其促进T细胞的植入和扩增，这与上述缺点无关。
附图简述
图1：总结各种细胞因子受体的结构、产生细胞因子的细胞类型和表达细胞因子受体的细胞类型的示意图。
图2：本发明的双重嵌合受体系统的示意图
第一CR具有包含细胞因子受体内域(共同γ链)和胞内T细胞信号传导域(CD3zeta)的内域。第二CR具有包含细胞因子受体内域(IL2受体β链)和胞内T细胞信号传导域(包含CD28和OX40共刺激域)的内域。两种嵌合受体的抗原结合外域结合相同配体上的不同表位。当CR结合配体时，将每个分子上的细胞因子内域变得接近，使得它们可以联合并导致细胞因子样细胞活化。细胞活化也通过T细胞活化内域向细胞提供信号1和信号2发生。注意：尽管只显示一条链，但该系统中的CR是同二聚体。
图3：本发明的备选的双重CR系统的示意图
在该系统中，就内域等而言，第一和第二CR与图2中所示的CR具有相似的结构。差异在于两种嵌合受体的抗原结合外域(exodomain)结合配体上的相同表位。它们可以包含相同的抗原结合部分。在存在有紧密突触的情况下，通过两种嵌合受体独立结合抗原可以使内域变得足够接近，使得细胞因子内域联合，从而导致活化。注意：尽管只显示一条链，但该系统中的CR是同二聚体。
图4：本发明的CR:ZAP70系统的示意图
在该系统中，单个CR识别关联抗原，并且其内域不仅包含T细胞信号传导(其至少包含CD3-Zeta内域)，而且还包含细胞因子受体内域(例如来自共同γ链，或来自IL2受体β链的)。该受体与ZAP70 SH2域和互补的细胞因子受体内域之间的融合物共表达(例如如果CR含有共同γ链，则ZAP70 SH2域可以与IL2受体β链融合)。在识别抗原后，CR CD3-Zeta内域ITAMS被磷酸化并募集ZAP70融合蛋白。现在细胞因子受体的两个内域是非常接近的并且传递细胞因子信号。
图5：如图2所示的双重CR系统的氨基酸序列，显示了单独的组分。在此构建体中，两个CAR都识别CD22。第一CR包含基于LT22的结合剂和包含IL2受体β链的内域；第二CR包含基于RFB4的结合剂和包含IL2受体γ链和CD3 zeta内域的内域。
图6：显示了实施例3中所述的增殖/存活测定中测试的嵌合受体系统的示意图。一个嵌合受体包含R11 scFv，而另一个包含R12 scFv。R11和R12结合相同抗原：ROR1上不同的表位。
图7：显示当与配体包被的珠共培养时转导的细胞的倍数增加的图。R11-il2b-z-2A-R12-il2g-z是编码图6所示的第4代CAR系统的构建体，其包含细胞因子受体内域和CD3zeta内域两者；R11-z-2A-R12-z是编码缺乏细胞因子受体内域的等同嵌合受体系统的构建体。
图8：图表显示在3和6天后与ROR1包被的珠共培养后转导的细胞的数量。
图9：显示了实施例4中描述的杀伤测定中测试的嵌合受体系统的示意图。一个嵌合受体包含R11 scFv，而另一个包含R12 scFv。R11和R12结合相同抗原：ROR1上不同的表位。
图10：图显示以10:1的E:T比率温育48小时后的细胞靶细胞杀伤。R11-IL2B-Z-2A-R12-IL2G-z是编码图9所示的第4代CAR系统的构建体，所述第4代CAR系统包含细胞因子受体内域和CD3 zeta内域；R11-IL2B-2A-R12-IL2G是编码缺乏CD3 zeta内域的等同嵌合受体系统的构建体。
图11：图显示以10:1 E:T比率温育48小时后的细胞IFNγ分泌。R11-IL2RB-Z+R12-IL2RG-z表示表达图9所示的第4代CAR系统的细胞，所述第4代CAR系统包含细胞因子受体内域和CD3 zeta内域两者；R11-IL2RB+R12-IL2RG表示表达缺乏CD3 zeta内域的等同嵌合受体系统的细胞。
图12：显示实施例6中描述的增殖/存活测定中测试的嵌合受体系统的示意图。两种嵌合受体均包含R12 scFv，因此它们结合相同抗原：ROR1上的相同表位。第一个R12 scFv的DNA序列摆动以防止同源重组。
图13：图显示当与配体包被的珠共培养时转导的细胞的倍数增加。R12w-il2b-z-2A-R12-il2g-z是编码图12所示的第4代CAR系统的构建体，所述第4代CAR系统包含细胞因子受体内域和CD3 zeta内域两者；R12w-z-2A-R12-z是编码缺乏细胞因子受体内域的等同嵌合受体系统的构建体。
图14：图显示在3和6天后与ROR1包被的珠共培养后转导的细胞的数目。
发明概述
本发明人开发了一种新型嵌合受体(CR)，其将例如抗体的结合特异性植入到包含细胞因子受体内域和胞内T细胞信号传导组分两者的组合内域上。与常规CAR相比，受体的连接向细胞提供细胞因子型和T细胞受体型活化和增殖信号两者，引起增强的活化和增殖。
植入、增殖和存活的增强在实体瘤的治疗中特别有用，因为它使CR表达细胞能够在不利的肿瘤微环境中植入并扩充。
因此，在第一方面，本发明提供了嵌合受体，其包含：
配体结合外域；和
内域，其包含：
(i)细胞因子受体内域；和
(ii)胞内T细胞信号传导域。
配体结合外域可以包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。
细胞因子受体内域可包含I型细胞因子受体内域α-、β-或γ-链或由I型细胞因子受体内域α-、β-或γ-链组成。例如，细胞因子受体内域可以包含以下项或由以下项组成：
(i)IL-2受体β链内域
(ii)IL-7受体α链内域；或
(iii)共同的γ-链受体内域。
胞内T细胞信号传导域可以包括以下一种或多种：CD3 zeta内域、CD28内域、OX40内域、4-1BB内域、CD2内域、CD27内域、ICOS内域、CD40内域。
胞内T细胞信号传导域和细胞因子受体内域的排列可以使得当受体在细胞表面表达时，胞内T细胞信号传导域位于膜的远端，并且细胞因子受体内域位于膜内细胞表面上的膜的近端。
在第二方面，本发明提供了嵌合受体系统。
在本发明第二方面的第一个实施方案中，嵌合受体系统包含至少两个根据本发明第一方面的嵌合受体。
在该第一实施方案中，嵌合受体系统包含含有第一细胞因子受体内域的第一嵌合受体和含有第二细胞因子受体内域的第二嵌合受体。第一细胞因子受体内域与第二细胞因子受体内域互补。
第一嵌合受体和第二嵌合受体可以结合相同抗原的不同表位。
或者，第一嵌合受体和第二嵌合受体可以结合相同抗原的相同表位。
或者，第一嵌合受体的配体结合域和第二嵌合受体的配体结合域可以具有互补配体结合域，使得它们一起能够结合配体。
术语“互补”表示第一和第二细胞因子内域联合，导致细胞信号传导。
第一细胞因子受体内域可以是或包含1型细胞因子受体内域α-或β-链，而第二细胞因子受体内域可以是或包含1型细胞因子受体内域γ-链，使得当第一嵌合受体和第二嵌合受体与抗原结合，发生通过α-/β-链和γ-链的细胞因子信号传导。
第一嵌合受体可以包含CD3 zeta内域，并且第二嵌合受体可以包含选自CD28内域、OX40内域和4-1BB内域的一个或多个共刺激域。
或者，第一和第二嵌合受体两者都可以包含胞内信号传导域，例如CD3 zeta内域。
在本发明第二方面的第二个实施方案中，嵌合受体系统包含根据本发明第一方面的嵌合受体和胞内融合蛋白。
在该第二实施方案中，嵌合受体包含第一细胞因子受体内域，而胞内融合蛋白包含第二细胞因子受体内域。
第一细胞因子受体内域与第二细胞因子受体内域互补。
嵌合受体可以包含I型细胞因子受体内域α-或β-链，并且胞内融合蛋白可以包含I型细胞因子受体内域γ-链，反之亦然。
嵌合受体可以包含CD3 zeta内域，并且胞内融合蛋白可以包含选自CD28内域、OX40内域和4-1BB内域的一个或多个共刺激域，反之亦然。
嵌合受体可以包含CD3 zeta内域，并且胞内融合蛋白可以缺少胞内信号传导域。
胞内融合蛋白可以包含结合磷酸化CD3 zeta内域的域，例如ZAP70 SH2域。当嵌合受体结合靶抗原时，这导致CD3 zeta内域的磷酸化。胞内融合蛋白的ZAP70 SH2域与磷酸化的CD3 zeta内域结合，使第一和第二细胞因子受体内域在一起。
在本发明第二方面的第三个实施方案中，嵌合受体系统包含根据本发明第一方面的嵌合受体和跨膜蛋白。
嵌合受体包含第一细胞因子受体内域，且跨膜蛋白包含第二细胞因子受体内域。第一细胞因子受体内域与第二细胞因子受体内域互补。
跨膜蛋白可以缺乏配体结合外域。跨膜蛋白可以例如经由跨膜域或豆蔻酰化基团栓系至细胞膜。
嵌合受体可以包含I型细胞因子受体内域α-或β-链，并且跨膜蛋白可以包含I型细胞因子受体内域γ-链，反之亦然。
嵌合受体可以包含CD3 zeta内域，并且跨膜蛋白可以包含选自CD28内域、OX40内域和4-1BB内域的一个或多个共刺激域。
嵌合受体可以包含CD3 zeta内域，并且跨膜蛋白可以缺乏胞内信号传导域和/或共刺激域。
跨膜蛋白可以包含结合磷酸化CD3 zeta内域的域，例如ZAP70 SH2域。当嵌合受体结合靶抗原时，这导致CD3 zeta内域的磷酸化。跨膜蛋白的ZAP70 SH2域与磷酸化的CD3zeta内域结合，使第一和第二细胞因子受体内域在一起。
第三方面，本发明提供细胞，其包含根据本发明第一方面的嵌合受体或根据本发明第二方面的嵌合受体系统。
在本发明第三方面的第一个实施方案中，细胞包含细胞受体系统，其包含第一嵌合受体和第二嵌合受体。
细胞可以包含第一嵌合受体和第二嵌合受体，其结合相同抗原上的不同表位。
或者，该细胞可以包含第一嵌合受体和第二嵌合受体，其结合相同抗原上的相同表位。
或者，细胞可以包含第一嵌合受体和第二嵌合受体，它们具有互补配体结合域，使得第一嵌合受体的配体结合域和第二嵌合受体的配体结合域一起能够结合配体。
第一嵌合受体可以包含第一细胞因子受体内域，并且第二嵌合受体可以包含第二细胞因子受体内域，并且第一和第二细胞因子受体内域可以能够联合，导致细胞信号传导。
例如，第一嵌合受体可以包含I型细胞因子受体内域α-或β-链，并且第二嵌合受体可以包含I型细胞因子受体内域γ-链，使得当第一嵌合受体和第二嵌合受体结合抗原时，发生通过α/β链和γ链的联合信号传导。
第一嵌合受体可以包含CD3 zeta内域；并且第二嵌合受体可以包含选自例如CD3zeta内域、CD28内域、OX40内域、4-1BB内域、CD2内域、CD27内域、ICOS内域和CD40内域的一个或多个共刺激域。
根据本发明第二方面的细胞还可以包含第二受体，其包含：
配体结合外域；和
内域，其包含与嵌合受体的细胞因子受体内域互补的细胞因子受体内域；
所述第二受体缺乏胞内T细胞信号传导域。
在本发明第三方面的第二个实施方案中，细胞包含根据本发明第一方面的嵌合受体和如上定义的胞内融合蛋白。
胞内融合蛋白可以包含ZAP70 SH2域。
在本发明第三方面的第三个实施方案中，细胞包含根据本发明第一方面的嵌合受体和如上定义的跨膜蛋白。
在第四方面，本申请提供了能够编码根据本发明第一方面的嵌合受体的核酸序列。
在第五方面，提供了编码根据本发明第二方面的嵌合受体系统的核酸构建体。
在本发明第五方面的第一个实施方案中，核酸构建体包含编码第一嵌合受体的第一核酸序列和编码第二嵌合受体的第二核酸序列。
核酸构建体可以具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2
在其中
AgB1是编码所述第一嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer1是编码所述第一嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码所述第一嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码所述第一嵌合受体内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达两种嵌合受体的核酸序列
AgB2是编码所述第二嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer2是编码所述第二嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM2是编码所述第二嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码所述第二嵌合受体内域的核酸序列。
在本发明第五方面的核酸构建体中，endo1可以包含编码细胞因子受体内域的第一链的核酸序列和编码第一胞内T细胞信号传导域的核酸序列；并且endo 2可以包含编码细胞因子受体内域的第二链的核酸序列和编码第二胞内T细胞信号传导域的核酸序列。
coexpr可以编码包含自身切割肽的序列。
可以在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用替代密码子(alternativecodon)，以避免同源重组。
在本发明第五方面的第二个实施方案中，提供了核酸构建体，其包含编码根据本发明第一方面的嵌合受体的第一核酸序列和编码胞内融合蛋白的第二核酸序列。
核酸构建体可以具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-domain2-endo2
其中
AgB1是编码所述嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer 1是编码所述嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码所述嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo 1是编码所述嵌合受体内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达所述嵌合受体和所述胞内融合蛋白两者的核酸序列；
domain2是编码所述胞内融合蛋白的第二域的核酸序列；和
endo 2是编码所述胞内融合蛋白的细胞因子受体内域的核酸序列。
第二域“domain2”可以编码能够结合磷酸化CD3 zeta域的序列。在这方面，“domain2”可以是编码ZAP70 SH2域的核酸序列“ZAP70”。
在本发明第五方面的第三个实施方案中，提供了包含编码嵌合受体的第一核酸序列和编码跨膜蛋白的第二核酸序列的核酸构建体。
核酸构建体可以具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-TM2-endo2
其中
AgB1是编码所述嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer1是编码所述嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码所述嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码所述嵌合受体内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达所述嵌合受体和所述跨膜蛋白两者的核酸序列，
TM2是编码所述跨膜域的跨膜定位序列(transmembrane localisationsequence)的核酸序列，
endo2是编码所述跨膜蛋白的细胞因子受体内域的核酸序列。
在第六方面，本发明提供了包含根据本发明第四方面的核酸序列或根据本发明第五方面的核酸构建体的载体。
载体可以是例如逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
在第七方面，提供了试剂盒，其包括：
i)载体，所述载体包含编码如本发明第一方面所定义的第一嵌合受体的核酸序列；和
ii)载体，所述载体包含编码本发明第一方面中定义的第二嵌合受体的核酸序列。
还提供了试剂盒，其包括：
i)载体，所述载体包含编码本发明第一方面中定义的嵌合受体的核酸序列；和
ii)载体，所述载体包含编码如上定义的第二受体或胞内融合蛋白的核酸序列。
还提供了试剂盒，其包括：
i)载体，所述载体包含编码本发明第一方面中定义的嵌合受体的核酸序列；和
ii)载体，所述载体包含编码如上定义的跨膜蛋白的核酸序列。
在第八方面中，提供了制备根据本发明第三方面的细胞的方法，其包括以下步骤：将根据本发明第四方面的核酸序列；根据本发明第五方面的核酸构建体；根据本发明第六方面的载体；或根据本发明第七方面的载体试剂盒导入细胞中。
细胞可以来自从受试者分离的样品。
在第九方面中，提供了包含多个根据本发明第三方面的细胞的药物组合物。
在第十方面，提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括对受试者施用根据本发明第九方面的药物组合物的步骤。
该方法可以包括以下步骤：
(i)从受试者中分离含有细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染细胞：根据本发明第四方面的核酸序列；根据本发明第五方面的核酸构建体；根据本发明第六方面的载体；或根据本发明第七方面的载体试剂盒；和
(iii)对受试者施用来自(ii)的细胞。
样品可以是含有T细胞的样品。
疾病可以是癌症。
还提供了根据本发明第九方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
还提供了根据本发明第三方面的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
发明详述
嵌合受体(CR)
嵌合受体(CR)是包含细胞因子受体内域和异源配体结合外域的分子。嵌合受体的内域也可以包含胞内T细胞信号传导域。
因此，嵌合受体可以包括：
(i)配体结合外域；
(ii)可选的间隔物；
(iii)跨膜域；
(iv)细胞因子受体内域；和
(v)胞内T细胞信号传导域。
细胞因子受体和信号
许多细胞功能受到细胞因子受体超家族成员的调节。这些受体的信号传递依赖于它们与Janus激酶(JAK)的联合，其将配体结合与募集到受体复合物的信号传导蛋白的酪氨酸磷酸化偶联。信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators oftranscription，STAT)在这些之中，其是促成细胞因子应答多样性的转录因子家族。
当本发明的嵌合受体结合其配体时，可以启动一个或多个以下胞内信号传导途径：
(i)JAK-STAT途径
(ii)MAP激酶途径；和
(iii)磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)途径。
JAK-STAT系统由三个主要组件组成：(1)受体、(2)Janus激酶(JAK)和(3)信号转导和转录激活因子(STAT)。
具有酪氨酸激酶活性的JAK与细胞表面细胞因子受体结合。配体与受体的结合触发JAK的激活。随着激酶活性的增加，它们磷酸化受体上的酪氨酸残基并创建与含有结合磷酸酪氨酸的SH2域的蛋白质相互作用的位点。将拥有能够结合这些磷酸酪氨酸残基的SH2域的STAT募集到受体，并且它们自身由JAK进行酪氨酸磷酸化。然后，这些磷酸酪氨酸作为其他STAT的SH2域的结合位点作用，介导它们的二聚化。不同的STAT形成异或同二聚体。活化的STAT二聚体在细胞核中积累并激活其靶基因的转录。
细胞因子受体内域
本发明的嵌合受体包含当外域结合其配体时引起“细胞因子型”细胞信号传导(单独或当在存在另一种嵌合受体的情况下时)的内域。
细胞因子受体内域可以源自I型细胞因子受体。I型细胞因子受体在邻近细胞膜的胞外部分中共享共同的氨基酸基序(WSXWS)。
细胞因子受体内域可以源自II型细胞因子受体。II型细胞因子受体包括结合I型和II型干扰素的那些受体，以及结合白介素-10家族成员(白介素-10、白介素-20和白介素-22)的那些受体。
I型细胞因子受体包括：
(i)白介素受体，例如IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-9,IL-11,IL-12,IL13,IL-15,IL-21,IL-23和IL-27的受体；
(ii)集落刺激因子受体，诸如促红细胞生成素，GM-CSF和G-CSF的受体；和
(iii)激素受体/神经肽受体，如激素受体和催乳素受体。
I型细胞因子受体家族的成员包含不同的链，其中一些参与配体/细胞因子相互作用而其它参与信号转导。例如，IL-2受体包含α链、β链和γ链。
在IL-2受体、IL-4受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-13受体和IL-15受体之间共享IL-2受体共同γ链(也称为CD132)。
IL-2
IL-2结合IL-2受体，所述IL-2受体具有三种形式，由三种不同蛋白质(通常称为“链”：α、β和γ)的不同组合产生；这些亚基也是其他细胞因子受体的部分。IL-2R的β和γ链是I型细胞因子受体家族的成员。
三种受体链在各种细胞类型上分别且差异地表达，并且可以以不同组合和顺序组装以产生低、中、高亲和力的IL-2受体。
α链以低亲和力结合IL-2，β和γ的组合一起形成以中等亲和力结合IL-2的复合物，主要在记忆T细胞和NK细胞上；并且所有三种受体链在活化的T细胞和调节T细胞上形成以高亲和力(Kd～10-11M)结合IL-2的复合物。
三种IL-2受体链跨越细胞膜并延伸到细胞中，从而将生化信号递送到细胞内部。α链不参与信号传导，但β链与酪氨酸磷酸酶JAK1复合。类似地，γ链与称作JAK3的另一种酪氨酸激酶复合。这些酶通过IL-2对IL-2R的外部域的结合激活。
当初始T细胞也被抗原刺激时，IL-2信号传导促进T细胞分化成效应T细胞并分化成记忆T细胞。通过它们在T细胞免疫记忆的发展中的作用(其依赖于抗原选择的T细胞克隆的数量和功能的扩张)，它们在长期细胞介导的免疫中也具有关键作用。
本发明的嵌合受体可以包含IL-2受体β链和/或IL-2受体(即共同的)γ链
IL-2β链和共同γ链的内域的氨基酸序列以SEQ ID No.1和2所示。
SEQ ID No.1：源自人共同γ链的内域：
ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET
SEQ ID No.2：源自人IL-2Rβ的内域：
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
术语“源自”是指本发明的嵌合受体的内域具有与内源分子的野生型序列相同的序列或其保留与JAK-1或JAK-3形成复合物并激活上述信号途径之一的能力的变体。
与野生型序列(例如SEQ ID No.1或2)具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的“变体”序列，条件是变体序列保留野生型序列的功能，即与JAK-1或JAK-3形成复合物并激活例如JAK-STAT信号传导途径的能力。
两个多肽序列之间的百分比同一性可以容易地通过例如可从http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得的程序BLAST确定。
IL-7
白介素-7受体由两条链构成：白介素-7受体-α链(CD127)和共同γ链受体(CD132)。共同γ链受体与各种细胞因子共享，包括白介素-2、-4、-9和-15。白介素-7受体在各种细胞类型上表达，包括幼稚和记忆T细胞。
白介素-7受体在淋巴细胞发育中起关键作用，特别是在V(D)J重组中。IL-7R还通过STAT5和组蛋白乙酰化来控制含有T细胞受体γ基因的基因组区域的可接近性。小鼠中的敲除研究提示了，阻断凋亡是该蛋白质在T淋巴细胞的分化和活化过程中的基本功能。
本发明的嵌合受体可以包含IL-7受体α链和/或IL-7受体(即，共同的)γ链或其变体。
IL-7α链内域的氨基酸序列以SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.3–源自人IL-7Rα的内域：
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
单体嵌合受体系统
嵌合抗原受体通常是两条相同链的同二聚体。
本发明的嵌合受体可以是同二聚体或在配体存在下与另一个嵌合受体单体联合的单体。
特别地，嵌合受体可以是包含以下的单体：
(i)外域；
(ii)跨膜域；
(iii)细胞因子受体内域；和
(v)胞内T细胞信号传导域。
外域可以包括配体结合域，如scFv。细胞可以包含两种单体CR，其中第一CR的配体结合域和第二CR的配体结合域与相同配体上的不同表位结合。
或者，外域可以包含当与另一种嵌合受体的外域一起时产生功能性配体结合域的域。例如，一个单体嵌合受体可以包含VH，并且第二嵌合受体包含抗体的VL。
单体细胞因子受体还可以包含一个或多个胞内T细胞信号传导域。例如，受体可以包含以下一种或多种：CD3 zeta内域、CD28内域、OX40内域、4-1BB内域、CD2内域、CD27内域、ICOS内域、CD40内域。
双重嵌合受体系统
当细胞包含两个同二聚体或单体嵌合受体时，它们可以具有“互补的”细胞因子受体内域。互补的细胞因子受体内域能够彼此联合以诱导细胞因子型信号传导。
下表中给出了互补细胞因子受体内域的例子。在本发明的双重CR系统中，一个CR可以包含第一细胞因子受体内域，而另一个CR可以包含第二细胞因子受体内域
第一细胞因子受体内域 第二细胞因子受体内域
IL2受体β链 共同的γ链
IL7受体α链 共同的γ链
本发明的双重嵌合受体系统包含一个或多个胞内T细胞信号传导域。胞内T细胞信号传导域可以在两个同二聚体或单体嵌合受体之间“共享”，或者一个受体可以包含胞内T细胞信号传导域，而另一个不然。下表中总结了一些可能的组合：
例如，一个受体可以包含CD3 zeta内域，而另一个受体可以包含一个或多个共刺激域，如CD3 zeta内域、CD28内域、OX40内域、4-1BB内域、CD2内域、CD27内域、ICOS内域和/或CD40内域。
ZAP70嵌合受体系统
在本发明的一个实施方案中，嵌合受体与胞内融合蛋白一起在细胞中表达。胞内融合蛋白包含细胞因子受体内域。胞内融合蛋白可以包含结合磷酸化CD3 zeta内域的域，例如ZAP 70SH2域。该实施例在图4中示意性地示出。
ZAP70是一种通常在T细胞和自然杀伤细胞的表面膜附近表达的蛋白质。它是T细胞受体(TCR)的一部分，并且在T细胞信号传导中起着关键作用。它的分子量为70kDa，并且由2个N端SH2域和1个C端激酶域构成。它是蛋白酪氨酸激酶家族的成员。
T细胞激活中最早的步骤是通过TCR识别靶细胞上的肽MHC复合物。该初始事件引起Lck激酶与TCR复合物中CD3-zeta的胞质尾部紧密联合。然后，Lck使CD3-zeta的胞质尾部中的酪氨酸残基磷酸化，其允许ZAP70募集。ZAP70是含有SH2的激酶，其在TCR接合后在T细胞活化中起关键作用。ZAP70中的串联SH2域与磷酸化的CD3结合，导致ZAP70被Lck或其他ZAP70分子反式磷酸化和活化。然后，活性ZAP70能够磷酸化下游膜蛋白，其中关键的是活化的T细胞接头(LAT)蛋白。LAT是一种支架蛋白，并且其在多个残基上的磷酸化允许其与含SH2域的几种其它蛋白质，包括Grb2、PLC-g和Grap相互作用，所述含SH2域的蛋白质识别LAT中的磷酸化肽并向下游传递T细胞激活信号，最终导致一系列T细胞应答。
一个实例ZAP70蛋白是具有UniProtKB登录号P43403的人ZAP70蛋白。该示例的序列的长度为619个氨基酸，并且以SEQ ID NO:22所示。
ZAP70氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA
以SEQ ID No.22所示的ZAP70序列包含串联SH2域。SH2 1包含此序列的氨基酸No10-102，并且SH2 2包含此序列的氨基酸No 163-254。ZAP70 SH2域可以包含SH2 1、SH2 2或者这两种SH2域。
融合蛋白可以包含串联ZAP70 SH2域。例如，融合蛋白可以包含以SEQ ID NO:23所示的序列。
ZAP70 SH2域(SEQ ID NO:23)
MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHP
融合蛋白可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的SEQ ID NO:23的变体，条件是所述变体序列是具有所需性质的SH2域序列。换句话说，变体序列必须能够结合CD3-zeta细胞质尾部中的磷酸化酪氨酸残基，其允许募集ZAP70。
在某些实施方案中，融合蛋白可以包含ZAP70 SH2域和ZAP70激酶域。例如，融合蛋白可以包含以SEQ ID NO:22所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体。
融合蛋白还包含细胞因子受体内域。如上定义，融合蛋白的细胞因子受体内域可以与嵌合受体的细胞因子受体内域“互补”。互补的细胞因子受体内域能够彼此联合以诱导细胞因子型信号传导。
跨膜蛋白质
在本发明的另一个实施方案中，嵌合受体与跨膜蛋白一起在细胞中表达。嵌合受体和跨膜蛋白包含互补的细胞因子受体内域。
跨膜蛋白可以与细胞膜栓系或联合。例如，跨膜蛋白可以包含跨膜域，其将蛋白质锚定到细胞的膜。或者，跨膜蛋白可以包含肉豆蔻酰基。
肉豆蔻酰化是一种脂化修饰，其中源自肉豆蔻酸的肉豆蔻酰基团通过酰胺键共价附着至N-末端甘氨酸残基的α-氨基。
跨膜蛋白还可以包含一个或多个共刺激域。
跨膜蛋白可以缺乏配体结合外域。
间隔物
本发明的嵌合受体可以包含间隔物以将抗原结合域与跨膜域连接并且将抗原结合域与内域在空间上分开。柔性间隔物允许抗原结合域在不同的方向上定向以实现抗原结合。
当本发明的细胞包含两种或更多种嵌合受体时，间隔物可以是相同的或不同的。
间隔物序列可以例如包含IgG1Fc区域、IgG1铰链或CD8茎。或者，接头可以包含备选接头序列，其具有与IgG1Fc区域、IgG1铰链或CD8茎相似的长度和/或域间隔特性。
可以改变人IgG1间隔物以除去Fc结合基序。
下文给出了这些间隔物的氨基酸序列的例子：
SEQ ID No.4(人IgG1的铰链-CH2CH3)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
SEQ ID No.5(人CD8茎):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
SEQ ID No.6(人IgG1铰链)：
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
间隔物可以是单体的。单体间隔物可通过二硫键形成的半胱氨酸残基突变而产生(Bridgeman et al(2010)J.Immunol.184:6938-6949)。
跨膜域
跨膜域是CR跨越膜的序列。它可以包含疏水性α螺旋。跨膜域可以源自CD28，其提供良好的受体稳定性。
或者，跨膜域可以源自细胞因子受体，例如衍生内域的相同细胞因子。
跨膜域可以例如源自IL-2R、IL-7R或IL-15R。
SEQ ID No.7–源自人共同γ链的跨膜：
VVISVGSMGLIISLLCVYFWL
SEQ ID No.8-源自人IL-2Rβ的跨膜：
IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI
SEQ ID No.9-源自人IL-7Rα的跨膜：
PILLTISILSFFSVALLVILACVLW
SEQ ID No.10-源自人IL-15Rα的跨膜：
AISTSTVLLCGLSAVSLLACYL
配体结合外域
术语“配体结合域”是指CR参与配体结合的细胞外部分。单一嵌合受体的配体结合域可以自身能够结合配体(例如，如果它是基于scFv的话)。或者，配体结合域在与另一个嵌合受体联合时可以能够结合配体(例如，其中一个CR包含VH，一个CR包含抗体的VL)。
术语“配体”与“抗原”同义使用，意指被CR的抗原结合域或互补CR配体结合域的组合特异性识别和结合的实体。
本领域已知许多抗原结合域，包括基于抗体、抗体模拟物和T细胞受体的的抗原结合位点。例如，抗原结合域可以包含：源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；来自靶抗原的天然受体的结合域；对靶配体具有足够亲和力的肽；单域结合剂如骆驼科的(camelid)；单个作为Darpin的人工结合剂；或源自T细胞受体的单链。
图5中显示的氨基酸序列包含两个CAR，每个CAR具有CD22结合配体结合域。一个基于scFv LT22，而一个基于scFv RFB4。
配体
本发明的CR或CR系统结合配体。
配体可以是可溶性配体，如肿瘤分泌因子或趋化因子。
或者，配体可以是膜结合配体，如细胞表面抗原。
术语“可溶性配体”用于表示不是细胞的一部分或附着于细胞但是在胞外空间中，例如在感兴趣组织的体液中自由移动的配体或抗原。可溶性配体可以在个体的血清、血浆或其他体液中以无细胞状态存在。
可溶性配体可以与特定疾病如癌症的存在或病理有关。
可溶性配体可以是癌症分泌物组(secretome)的一部分，所述癌症分泌物组即肿瘤分泌的因子集合，它可以来自癌症干细胞、非干细胞或周围基质。可溶性配体可以由肿瘤细胞分泌或脱落(参见下一节)。
可溶性配体可以是疾病或患病组织特征性的。在具有疾病的受试者对健康受试者中，或者在患病组织对健康组织中，它可以排他性存在或以更高水平存在。在具有疾病的受试者对健康受试者中，或者在患病组织对健康组织中，可溶性配体可以以高至少2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或100,000倍的水平表达。
术语“细胞表面抗原”和“细胞表面配体”与“膜结合抗原”和“膜结合配体”同义使用，表示附着到细胞表面或在细胞表面上表达的配体。细胞表面配体可以是例如跨膜蛋白。
细胞表面配体存在于其上的细胞可以是靶细胞，例如癌细胞。
细胞表面配体可以与特定疾病如癌症的存在或病理有关。或者，细胞表面配体可以是靶细胞(例如B细胞)的细胞类型特征性的，而不一定与疾病状态相关。
在细胞表面配体对于疾病或疾病组织为特征性的情况下，在具有疾病的受试者对健康受试者中，或者在患病组织对健康组织中，它可以在相关细胞上排他性存在或以更高水平存在。在具有疾病的受试者对健康受试者中，或者在患病组织对健康组织中，细胞表面配体可以以高至少2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或100,000倍的水平表达。
肿瘤分泌因子
由CR识别的配体可以是由肿瘤分泌或脱落的可溶性配体。
例如，该“肿瘤分泌因子”可以是前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、血管内皮生长因子(VEGF)或癌抗原-125(CA-125)。
细胞表面抗原
CR或CR系统可识别细胞表面抗原，即在靶细胞(例如肿瘤细胞)表面上表达的实体，例如跨膜蛋白。
CR或CR系统可特异性结合肿瘤相关细胞表面抗原。
各种肿瘤相关抗原(TAA)是已知的，其中一些示于表1中。本发明中使用的抗原结合域可以是能够结合如本文所示的TAA的域。
表1
前列腺癌相关抗原
CR可特异性结合与前列腺癌相关的细胞表面抗原，例如前列腺干细胞抗原(PSCA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
PSCA是糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol)锚定的细胞膜糖蛋白。它在大部分前列腺癌中上调，并且也在膀胱癌和胰腺癌中检测到。
已知有多种抗PSCA抗体，例如7F5(Morgenroth et al(Prostate(2007)67:1121-1131)；1G8(Hillerdal et al(2014)BMC Cancer 14:30)；和Ha1-4.117(Abate-Daga et al(2014)25:1003-1012)。
本发明的CR表达细胞可以包含基于这些抗体之一的抗原结合域。
PSMA是一种存在于膜中的锌金属酶。PSMA在人类前列腺中强烈表达，比大多数其他组织中的表达高百倍。在癌症中，它的表达上调，并且已被称为前列腺癌中第二位上调(second-most-upregulated)的基因，与非癌性前列腺相比，增加了8至12倍。除了在人类前列腺和前列腺癌中的表达之外，还发现PSMA在所有类型的实体瘤如肾、乳腺、结肠等的肿瘤新血管系统但不是正常血管系统中高度表达。
各种抗PSMA抗体是已知的，例如7E11、J591、J415、和Hybritech PEQ226.5和PM2J004.5，其各自结合PSMA的不同表位(Chang et al(1999)Cancer Res 15:3192-8)。
本发明的CR可以包含基于这些抗体之一的抗原结合域。
例如，CR可以包含基于J591的scFv，其具有如SEQ ID No.11所示的序列。
SEQ ID No.11(J591scFv)
EVQLQQSGPELKKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKR
信号肽
本文所述的CR或跨膜蛋白可以包含信号肽，使得当它/它们在细胞如T细胞中表达时，将新生蛋白导向内质网并随后导向细胞表面，在那里它得以表达。
信号肽的核心可以含有疏水性氨基酸的长区段，其倾向于形成单个α-螺旋。信号肽可以以短的带正电荷的氨基酸区段开始，这有助于在移位期间强化多肽的适当拓扑结构。在信号肽的末端，通常存在被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位完成期间或之后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白质。游离信号肽然后被特定的蛋白酶消化。
信号肽可以在分子的氨基末端。许多信号肽在本领域中是已知的，它们适用于本发明的CR。
CR内域
内域是嵌合受体或跨膜蛋白位于膜胞内侧的部分。
内域是典型CAR的信号传输部分。在通过抗原结合域进行抗原识别后，单独的CAR分子簇集，从突触排除天然CD45和CD148，并且将信号传递到细胞。对于本发明的嵌合受体也适用相同的原理。嵌合受体通过动力学分离的簇集允许细胞信号传导通过细胞内T细胞信号传导域发生
最常用的信号传导域组件是CD3-zeta内域的，它包含3个ITAM。这在抗原结合后向T细胞传递激活信号。CD3-zeta可以不提供完全有效的激活信号，并且可以需要额外的共刺激信号传导。例如，嵌合CD28和OX40可以与CD3-Zeta一起使用以传递增殖/存活信号，或者所有三种可以一起使用。
CR可以包含单独的CD3-Zeta内域、CD3-Zeta内域与CD28或OX40的内域或CD28内域和OX40和CD3-Zeta内域。
当细胞包含两种或更多种嵌合受体时，胞内信号传导域可以在CR分子之间“共享”。例如，一个CR可以包含CD3 zeta内域，并且另一个CR可以包含一个或多个共刺激域，例如来自CD28、OX40或4-1BB。
当细胞包含嵌合受体和跨膜蛋白时，胞内信号传导域可以在CR和跨膜蛋白之间“共享”。例如，CR可以包含CD3 zeta内域，并且跨膜蛋白可以包含一个或多个共刺激域，例如来自CD28、OX40或4-1BB。
CR或跨膜蛋白内域可包含以下一种或多种：ICOS内域、CD27内域、BTLA内域、CD30内域、GITR内域和HVEM内域。
内域可以包含一个或多个以SEQ ID No.12-20所示的序列或其具有至少80％序列同一性的变体中。
SEQ ID No.12-CD3 Z内域
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.13-CD28和CD3 Zeta内域
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.14-CD28,OX40和CD3 Zeta内域
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.15-ICOS内域
CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
SEQ ID No.16-CD27内域
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
SEQ ID No.17-BTLA内域
RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS
SEQ ID No.18-CD30内域
HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
SEQ ID No.19-GITR内域
QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
SEQ ID No.20-HVEM内域
CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH
变体序列可以与SEQ ID No.12-20具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性，条件是该序列提供有效的胞内信号传导域。
核酸
本发明还提供了编码本发明的CR的核酸。
核酸可以具有以下结构：
AgB-spacer-TM-endo
其中
AgB1是编码CR的抗原结合域的核酸序列；
spacer 1是编码CR的间隔物的核酸序列；
TM1是编码CR的跨膜域的核酸序列；
endo 1是编码CR内域的核酸序列。
核酸构建体
本发明还提供了编码本发明的嵌合受体系统的核酸构建体。
核酸构建体可以包含编码如结合本发明第一方面所定义的第一CR的第一核酸序列；和编码如结合本发明第一方面定义的第二CR的第二核酸序列。
核酸构建体可以具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2
其中
AgB1是编码第一嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer 1是编码第一嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码第一嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo 1是编码第一嵌合受体的内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达两种嵌合受体的核酸序列
AgB2是编码第二嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer 2是编码第二嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM2是编码第二嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo 2是编码第二嵌合受体内域的核酸序列。
当核酸构建体在细胞例如T细胞中表达时，其编码在切割位点切割的多肽，使得第一和第二CR在细胞表面共表达。
第一和第二CR可以结合相同抗原上的不同表位。或者，第一和第二CR可以包含互补配体结合域，其一起能够结合抗原。
第一和第二CR可以具有互补的细胞因子受体内域，例如一个源自细胞因子受体的α或β链，而一个源自相同细胞因子受体的γ链。
或者，核酸构建体可以包含编码根据本发明第一方面的嵌合受体的第一核酸序列和编码胞内融合蛋白的第二核酸序列。
核酸构建体可以具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-domain2-endo2
其中
AgB1是编码嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer 1是编码嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo 1是编码嵌合受体的内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达嵌合受体和胞内融合蛋白两者的核酸序列
domain2是编码胞内融合蛋白的第二域的核酸序列；
endo 2是编码胞内融合蛋白的细胞因子受体内域的核酸序列。
第二域“domain2”可以是编码ZAP70 SH2域的核酸序列“ZAP70”。
或者，核酸构建体可以包含编码嵌合受体的第一核酸序列和编码跨膜蛋白的第二核酸序列。
核酸构建体可以具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-TM2-endo2
其中
AgB1是编码嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer1是编码嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码嵌合受体的内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达嵌合受体和跨膜蛋白两者的核酸序列，
TM2是编码跨膜域的膜定位域的核酸序列，
endo2是编码跨膜蛋白的细胞因子受体内域的核酸序列。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应该理解的是，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本文描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子选择。
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包含合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。本领域已知许多不同类型的寡核苷酸修饰。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或多聚赖氨酸链。为了如本文所述使用的目的，应该理解，多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法修饰。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
与核苷酸序列有关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括对序列的一个(或多个)核酸的任何取代、改变、修饰、替换、缺失或添加。
在上述结构中，“coexpr”是使得能够共表达第一和第二CR两者的核酸序列。它可以是编码切割位点的序列，使得核酸构建体产生包含两个或更多个通过切割位点连接的CR。切割位点可以是自身切割的，使得当产生多肽时，其立即切割成单独的肽而不需要任何外部切割活性。
切割位点可以是使第一和第二CR能够分离的任何序列。
术语“切割”在本文中为了方便而使用，但切割位点可以通过不同于经典切割的机制将肽分离成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(FMDV)2A自身切割肽(参见下文)，已提出了各种模型来解释“切割”活性：宿主-细胞蛋白酶的蛋白水解、自体溶解或翻译效应(Donnelly et al(2001)J.Gen.Virol.82:1027-1041)。此类“切割”的确切机制对于本发明的目的并不重要，只要切割位点当位于编码蛋白质的核酸序列之间时引起蛋白质作为单独的实体表达时。
切割位点可以是弗林蛋白酶切割位点。
弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的酶。该家族的成员是将潜在前体蛋白加工成其生物活性产物的前蛋白转化酶。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其可以在其配对的碱性氨基酸加工位点有效切割前体蛋白。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素原、转化生长因子beta 1前体、前白蛋白，前-β-分泌酶、膜型-1基质金属蛋白酶、神经生长因子原的β亚基和von Willebrand因子。弗林蛋白酶就在碱性氨基酸靶序列(典型地，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg')的下游切割蛋白质并富集在高尔基体中。
切割位点可以是烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点。
TEV蛋白酶是高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，它是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。它对其靶切割位点非常特异，因此经常用于在体外和体内的融合蛋白的受控切割。共有的TEV切割位点是ENLYFQ\S(其中“\”表示切割的肽键)。哺乳动物细胞如人类细胞不表达TEV蛋白酶。因此，在本核酸构建体包含TEV切割位点且在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，外源TEV蛋白酶也必须在哺乳动物细胞中表达。
切割位点可以编码自身切割肽。
“自身切割肽”是指下述肽，其发挥功能使得当产生包含蛋白质和自身裂解肽的多肽时，其立即被“切割”或分离成截然不同且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。
自身切割肽可以是来自口蹄疫病毒或心病毒的2A自身切割肽。口蹄疫病毒或心病毒的主要2A/2B切割由在其自身C端的2A“切割”介导。在口蹄疫病毒(例如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎甲型病毒)中，2A区是约18个氨基酸的短区域，其与蛋白质2B的N-末端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表能够在其自身C端介导“切割”的自主元件(Donelly et al(2001)，如上)。
已经在除口蹄疫病毒或心病毒外的小核糖核酸病毒(picornaviruses)、“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒、C型轮状病毒以及锥虫属种(Trypanosoma spp)内的重复序列和细菌序列中发现了“2A样”序列。切割位点可以包含这些2A样序列之一，例如：
SEQ ID No.21：RAEGRGSLLTCGDVEENPGP。
本发明还提供了试剂盒，其包含编码根据本发明第一方面的第一和第二CR的一个或多个核酸序列。
载体
本发明还提供载体或载体的试剂盒，其包含编码根据本发明的第一方面的一种或多种CR的一种或多种核酸序列。可以使用此类载体将核酸序列导入宿主细胞中以使其表达根据本发明的第一方面的CR。
载体可以例如是质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成mRNA。
载体可以能够转染或转导T细胞或NK细胞。
细胞
本发明提供了包含一种或多种本发明的CR的细胞。该细胞可以包括如上定义的CR系统。
细胞可以包含一种或多种本发明的核酸或载体。
细胞可以是细胞溶解性免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。
T细胞或T淋巴细胞是一类在细胞介导的免疫中起中心作用的淋巴细胞。它们可以通过细胞表面上的T细胞受体(TCR)的存在而与其他淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分开来。如下文总结，有各种类型的T细胞。
辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中辅助其他白细胞，包括将B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面上表达CD4。当通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子给TH细胞呈递肽抗原时，TH细胞被活化。这些细胞可分化成分泌不同细胞因子以促进不同类型的免疫应答的几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH。
细胞溶解性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植物排斥。CTL在其表面表达CD8。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类联合的抗原来识别它们的靶物。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，可以使CD8+细胞失活至无反应性状态，从而预防自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是感染消退后长期持续的抗原特异性T细胞的子集。当再次暴露于其关联抗原时，它们迅速扩张成大量的效应T细胞，从而给免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包含三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
调节性T细胞(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，对维持免疫耐受至关重要。它们的主要作用是朝向免疫反应结束关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃脱胸腺中的负选择过程的自身反应性T细胞。
已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞-天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。
天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)在胸腺中出现并且与发育中的T细胞与已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突细胞之间的相互作用联系起来。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的胞内分子的存在与其他T细胞区分开来。FOXP3基因突变可阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫疾病IPEX。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫反应期间起源。
细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞构成先天免疫系统的一部分。NK细胞以不依赖于MHC的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速响应。
NK细胞(属于先天性淋巴样细胞组)定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从产生B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化并成熟，然后它们在那里进入循环。
本发明的CR表达细胞可以是上述任何细胞类型。
根据本发明第一方面的T或NK细胞可以从患者自身外周血(第一方)离体产生，或者在来自供体外周血的造血干细胞移植体(第二方)，或者来自无关捐赠者的外周血(第三方)的背景中离体产生。
或者，根据本发明第一方面的T或NK细胞可以源自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为T或NK细胞。或者，可以使用保留其裂解功能并可以充当治疗剂的永生化T细胞系。
在所有这些实施方案中，通过包括用病毒载体转导，用DNA或RNA转染的许多手段之一导入编码CR或每个CR的DNA或RNA来产生CR表达细胞。
本发明的细胞可以是来自受试者的离体T或NK细胞。T或NK细胞可以来自外周血单个核细胞(PBMC)样品。在用编码提供根据本发明第一方面的CR的分子的核酸转导之前，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理，可以将T或NK细胞活化和/或扩增。
本发明的T或NK细胞可以通过以下方法制备：
(i)从受试者或上文列出的其他来源分离含有T或NK细胞的样品；并且
(ii)用一种或多种编码CR的核酸序列转导或转染T或NK细胞。
然后，可以通过基于抗原结合多肽的抗原结合域的表达来纯化，例如选择T或NK细胞。
药物组合物
本发明还涉及含有多个根据本发明的细胞的药物组合物。
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种其他药学活性多肽和/或化合物。例如，此类配制剂可以是适合于静脉内输注的形式。
治疗方法
本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的细胞(例如在如上所述的药物组合物中)施用于受试者的步骤。
治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗用途。在本文中，可以对患有现有疾病或病症的受试者施用细胞以减轻、降低或改善至少一种与疾病相关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。
预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防性使用。在本文中，可以对尚未感染疾病和/或未显示任何疾病症状的受试者施用此类细胞，以预防或削弱疾病的起因，或减少或预防至少一种与此类病有关的症状的形成。受试者可以具有疾病的素因，或认为有形成疾病的风险。
方法可以包括以下步骤：
(i)分离含T或NK细胞的样品；
(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；
(iii)对受试者施用来自(ii)的细胞。
含有T或NK细胞的样品可以从受试者或其它来源分离，例如如上所述。T或NK细胞可以从患者自身外周血(第一方)分离，或者在来自供体外周血的造血干细胞移植体(第二方)，或者来自无关捐赠者的外周血(第三方)的背景中分离。
本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的本发明的CR或CR系统表达细胞。
本发明还涉及本发明的CR或CR系统表达细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌性疾病，例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
在由CR识别的配体是PSA、PSMA或PSCA的情况下，癌症可以是前列腺癌。
本发明的细胞可以能够杀死靶细胞，如癌细胞。靶细胞的特征可以在于在靶细胞附近存在肿瘤分泌的配体或趋化因子配体。靶细胞的特征可以在于存在可溶性配体以及肿瘤相关抗原(TAA)在靶细胞表面的表达。
本发明的细胞和药物组合物可以用于治疗和/或预防上述疾病。
本发明的细胞和药物组合物可以用于上述任何方法中。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-体外测试
用编码标准CAR或传递细胞因子信号的CAR的逆转录病毒载体转导T-细胞。用表达CR关联靶物的靶细胞攻击(challenge)未转导的和转导的T细胞。可以通过使用胞内抗体染色和流式细胞术来测量PI3激酶、MAP激酶和JAK-STAT途径中已知媒介物的磷酸化水平，从而直接检测响应于靶抗原的细胞因子途径的激活。可以通过流式细胞术测量T细胞增殖、凋亡和表型来间接确定细胞因子信号传导。
实施例2-产生具有针对靶抗原的不同表位的抗原结合域的“第四代”CAR系统
第4代CAR系统设计为具有与抗原ROR1的不同表位结合的scFv(图6)。第一嵌合受体具有包含R11 scFv的抗原结合域、人Fc间隔物、IL2受体β内域和CD3 zeta内域；第二嵌合受体具有包含R12 scFv的抗原结合域、CD8茎间隔物、IL2受体γ内域和CD3 zeta内域。还设计了两种对照受体系统：一种缺乏细胞因子受体内域(图6)；和一种缺乏CD3 zeta域(图9)，但是其它方面与上述系统相同。
实施例3-第四代CAR系统比缺乏细胞因子受体内域的等同CAR系统显示增加的增 殖/存活
为了研究包含细胞因子内域的嵌合受体系统的存在是否提供增殖/存活信号，使用需要IL2进行生长的CTLL2鼠细胞毒性T细胞系(TIB-214TM)。用表达图6所示的两种嵌合受体系统中的一种或另一种的载体转导CTLL细胞。在与ROR1包被的珠或未包被的珠培养3和6天后评估细胞增殖。
图7和8中显示了结果。如图7所示，包括细胞因子受体和CD3 zeta内域的第4代CAR在转导的细胞中在与配体共培养时在第3天和第6天两者都比缺乏细胞因子受体内域的等同嵌合受体系统显示更大的倍数富集。如图8所示，对于表达第4代CAR的细胞，在第3天和第6天配体的存在都大大增加了细胞的存活/增殖，而配体的存在对表达缺乏细胞因子受体内域的等同嵌合受体系统的细胞的增殖/存活几乎没有影响。
实施例4-第四代CAR系统比缺乏CD3 zeta内域的等同CAR系统显示增加的靶细胞 杀伤和IFNg释放
接下来研究包括细胞因子受体和CD3 zeta内域的第四代CAR是否能够杀死靶细胞。用表达图9所示的两种嵌合受体系统中的一种或另一种的载体转导健康供体PBMC。将转导的细胞与SupT1细胞或表达ROR1的SupT1靶细胞以10:1的E:T比率共培养48小时。然后通过FACS分析对靶细胞的杀伤，并使用ELISA来测定IFNγ分泌。
如图10所示，包括细胞因子受体和CD3 zeta内域的第4代CAR能够杀死表达ROR1的靶细胞并且与缺乏CD3 zeta内域的等同嵌合受体系统相比有效得多地杀死。
表达第4代CAR的PBMC与表达ROR1的靶细胞的共培养导致显著的IFNγ释放水平，不同于表达缺乏CD3 zeta内域的等同嵌合受体系统的PBMC(图11)。
实施例5-产生具有针对靶抗原的相同表位的抗原结合域的第四代CAR系统
第四代CAR系统设计为具有与抗原ROR1的相同表位结合的scFv(图12)。第一嵌合受体具有包含R12 scFv的抗原结合域、人Fc间隔物、IL2受体β内域和CD3 zeta内域；第二嵌合受体具有包含R12 scFv的抗原结合域、CD8茎间隔物、IL2受体γ内域和CD3 zeta内域。第一嵌合受体的R12 ScFv的DNA序列摆动以避免同源重组。还设计了对照受体系统，其缺乏细胞因子受体内域，但其他方面相同(也在图12中显示)。
实施例6-具有针对靶抗原的相同表位的抗原结合域的第四代CAR系统比缺乏细胞 因子受体内域的等同CAR系统显示增加的增殖/存活
对于实施例5中开发的构建体进行等同的存活/增殖测定，如实施例3中所述，并且图13和14中显示了结果。如图13所示，包括细胞因子受体和CD3 zeta内域的第四代CAR当与配体共培养3天时比缺乏细胞因子受体内域的等同嵌合受体系统显示转导细胞的更大倍数富集。如图8所示，在表达第4代CAR的细胞培养三天后，配体的存在大大增加了细胞存活/增殖，而配体的存在对表达缺乏细胞因子受体内域的等同嵌合受体系统的细胞的增殖/存活几乎没有影响。
因此，可以使用本发明的嵌合受体系统靶向抗原，所述嵌合受体系统使用结合靶抗原的相同表位的两个抗原结合域。这潜在地简化了嵌合受体系统的设计并且避免了为每种靶抗原找到相互排他的表位的需要。
在上述说明书中提到的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应该理解，所要求保护的本发明不应该过度限于这些具体实施方案。事实上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于分子生物学或相关领域的技术人员来说是显而易见的，这些修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 奥托路斯有限公司
<120> 受体
<130> P108498PCT
<150> GB 1518816.2
<151> 2015-10-23
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人共同gamma链的内域
<400> 1
Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly
50 55 60
Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Pro Glu Thr
85
<210> 2
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人IL-2Rbeta的内域
<400> 2
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 3
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人IL-7Ralpha的内域
<400> 3
Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
1 5 10 15
Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val
20 25 30
Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp
35 40 45
Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
50 55 60
Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val
65 70 75 80
Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser
85 90 95
Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala
100 105 110
Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu
115 120 125
Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu
130 135 140
Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser
165 170 175
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
180 185 190
Gln Asn Gln
195
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1的铰链-CH2CH3
<400> 4
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp
225 230
<210> 5
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8茎
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1铰链
<400> 6
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人共同gamma链的跨膜
<400> 7
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
1 5 10 15
Val Tyr Phe Trp Leu
20
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人IL-2Rbeta的跨膜
<400> 8
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile
20 25
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人IL-7Ralpha的跨膜
<400> 9
Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp
20 25
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人IL-15Ralpha的跨膜
<400> 10
Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Ala Cys Tyr Leu
20
<210> 11
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于J591的scFv
<400> 11
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser
130 135 140
Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly
145 150 155 160
Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
165 170 175
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe
180 185 190
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val
195 200 205
Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr
210 215 220
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Asp Leu Lys Arg
225 230 235
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 Z内域
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28和CD3 Zeta内域
<400> 13
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
35 40 45
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
50 55 60
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
65 70 75 80
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
85 90 95
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
100 105 110
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
115 120 125
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
130 135 140
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 14
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28, OX40和CD3 Zeta内域
<400> 14
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp
35 40 45
Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu
50 55 60
Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe
65 70 75 80
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
85 90 95
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
100 105 110
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
115 120 125
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
130 135 140
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
145 150 155 160
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
165 170 175
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
180 185
<210> 15
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS内域
<400> 15
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 16
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27内域
<400> 16
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTLA内域
<400> 17
Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
1 5 10 15
Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala
20 25 30
Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr
35 40 45
Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val
50 55 60
Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala
65 70 75 80
Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn
85 90 95
Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
100 105 110
<210> 18
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD30内域
<400> 18
His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg
20 25 30
Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu
35 40 45
Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr
50 55 60
Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp
65 70 75 80
Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro
85 90 95
Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile
100 105 110
Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro
115 120 125
Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu
130 135 140
Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro
145 150 155 160
Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly
165 170 175
Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR 内域
<400> 19
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 20
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVEM 内域
<400> 20
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点，2A样序列
<400> 21
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 619
<212> PRT
<213> 人
<400> 22
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn
275 280 285
Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys
290 295 300
Pro Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser
305 310 315 320
Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn
325 330 335
Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val
340 345 350
Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile
355 360 365
Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met
370 375 380
Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg
385 390 395 400
Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met
405 410 415
Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu
420 425 430
Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly
435 440 445
Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala
450 455 460
Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe
465 470 475 480
Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg
485 490 495
Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn
500 505 510
Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
515 520 525
Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys
530 535 540
Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys
545 550 555 560
Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp
565 570 575
Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg
580 585 590
Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro
595 600 605
Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
610 615
<210> 23
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZAP70 SH2域
<400> 23
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro
275 280
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I型细胞因子受体基序
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 24
Trp Ser Xaa Trp Ser
1 5
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是 Arg或Lys
<400> 25
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点
<400> 26
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 27
<211> 1166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双重CR系统的氨基酸序列
<400> 27
Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala
1 5 10 15
Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Phe Thr Asn Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
210 215 220
Ser Thr Val Tyr Leu Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Thr Gln Glu Arg Ser Trp Tyr Phe Asp
245 250 255
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Asp Pro Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp Val Val Ile
305 310 315 320
Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe
325 330 335
Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu
340 345 350
Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val
355 360 365
Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu
370 375 380
Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly
385 390 395 400
Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro
405 410 415
Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
420 425 430
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
435 440 445
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
450 455 460
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
465 470 475 480
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
485 490 495
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
500 505 510
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
515 520 525
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser
530 535 540
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Leu Pro Val
545 550 555 560
Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro
565 570 575
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
580 585 590
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ile Tyr
595 600 605
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
610 615 620
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
625 630 635 640
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Asp
645 650 655
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
660 665 670
Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr
675 680 685
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
690 695 700
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
705 710 715 720
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
725 730 735
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln
740 745 750
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu
755 760 765
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
770 775 780
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
785 790 795 800
Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
805 810 815
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys
820 825 830
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Asp Pro Lys Ala Cys Asp Ile
835 840 845
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Leu Gly His Leu Leu
850 855 860
Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu
865 870 875 880
Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys
885 890 895
Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His
900 905 910
Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser
915 920 925
Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu
930 935 940
Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro
945 950 955 960
Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr
965 970 975
Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu
980 985 990
Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro
995 1000 1005
Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro
1010 1015 1020
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro
1025 1030 1035
Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly
1040 1045 1050
Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu
1055 1060 1065
Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp
1070 1075 1080
Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu
1085 1090 1095
Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly
1100 1105 1110
Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro
1115 1120 1125
Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala
1130 1135 1140
Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu
1145 1150 1155
Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu
1160 1165

Claims (47)

1.嵌合受体，所述嵌合受体包含：
配体结合外域；和
内域，所述内域包含：
(i)细胞因子受体内域；和
(ii)胞内T细胞信号传导域。
2.根据权利要求1的嵌合受体，其中所述配体结合外域包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。
3.根据前述权利要求中任一项的嵌合受体，其中所述细胞因子受体内域包含I型细胞因子受体内域α-、β-或γ-链或由I型细胞因子受体内域α-、β-或γ-链组成。
4.根据权利要求3的嵌合受体，其中所述细胞因子受体内域包含以下项或由以下项组成：
(i)IL-2受体β链内域，
(ii)IL-7受体α链内域；或
(iii)共同的γ-链受体内域。
5.根据前述权利要求中任一项的嵌合受体，其中所述胞内T细胞信号传导域包含以下中的一种或多种：CD3zeta内域、CD28内域、OX40内域、4-1BB内域、CD2内域、CD27内域、ICOS内域、CD40内域。
6.根据前述权利要求中任一项的嵌合受体，其中所述胞内T细胞信号传导域和所述细胞因子受体内域的排列使得当所述受体在细胞表面表达时，所述胞内T细胞信号传导域定位在膜的远端，并且所述细胞因子受体内域定位在所述胞内细胞表面上的膜的近端。
7.嵌合受体系统，其包含根据权利要求1至6中任一项的第一和第二嵌合受体；
其中所述第一嵌合受体包含第一细胞因子受体内域，并且所述第二嵌合受体包含第二细胞因子受体内域，以及
并且其中所述第一细胞因子受体内域与所述第二细胞因子受体内域互补。
8.根据权利要求7的嵌合受体系统，其中所述第一嵌合受体和所述第二嵌合受体结合相同抗原的不同表位。
9.根据权利要求7的嵌合受体系统，其中所述第一嵌合受体和所述第二嵌合受体结合相同抗原的相同表位。
10.根据权利要求7的嵌合受体系统，其中所述第一嵌合受体的配体结合域和所述第二嵌合受体的配体结合域具有互补配体结合域，使得它们一起能够结合配体。
11.根据权利要求7至10中任一项的嵌合受体系统，其中所述第一和第二细胞因子内域联合，导致细胞信号传导。
12.根据权利要求11的嵌合受体系统，其中所述第一细胞因子受体内域是1型细胞因子受体内域α-或β-链，并且所述第二细胞因子受体内域是1型细胞因子受体内域γ-链，使得当所述第一嵌合受体和所述第二嵌合受体结合所述抗原时，发生经由α-/β-链和γ-链的细胞因子信号传导。
13.根据权利要求7至12中任一项的嵌合受体系统，其中所述第一嵌合受体包含CD3zeta内域，并且所述第二嵌合受体包含选自以下的一个或多个共刺激域：CD28内域、OX40内域和4-1BB内域。
14.根据权利要求7至12中任一项的嵌合受体系统，其中所述第一嵌合受体和所述第二嵌合受体两者包含CD3zeta内域。
15.嵌合受体系统，其包含根据权利要求1至6中任一项的嵌合受体和胞内融合蛋白，
其中所述嵌合受体包含第一细胞因子受体内域，并且所述胞内融合蛋白包含第二细胞因子受体内域，
并且其中所述第一细胞因子受体内域与所述第二细胞因子受体内域互补。
16.根据权利要求15的嵌合受体系统，其中所述嵌合受体包含I型细胞因子受体内域α-或β-链，并且所述胞内融合蛋白包含I型细胞因子受体内域γ-链。
17.根据权利要求15的嵌合受体系统，其中所述嵌合受体包含I型细胞因子受体内域γ链，并且所述胞内融合蛋白包含I型细胞因子受体内域α-或β-链。
18.根据权利要求15或16的嵌合受体系统，其中所述嵌合受体包含CD3zeta内域，并且所述胞内融合蛋白缺乏胞内信号传导域。
19.根据权利要求15至18中任一项的嵌合受体系统，其中所述胞内融合蛋白包含ZAP70SH2域。
20.嵌合受体系统，其包含根据权利要求1至6中任一项的嵌合受体和跨膜蛋白，
其中所述嵌合受体包含第一细胞因子受体内域，并且所述跨膜蛋白包含第二细胞因子受体内域，
其中所述第一细胞因子受体内域与所述第二细胞因子受体内域互补。
21.根据权利要求20的嵌合受体系统，其中所述嵌合受体包含I型细胞因子受体内域α-或β-链，并且所述跨膜蛋白包含I型细胞因子受体内域γ-链。
22.根据权利要求20的嵌合受体系统，其中所述嵌合受体包含I型细胞因子受体内域γ链，并且所述跨膜蛋白包含I型细胞因子受体内域α-或β-链。
23.根据权利要求20或21的嵌合受体系统，其中所述嵌合受体包含CD3zeta内域，并且所述跨膜蛋白缺乏胞内信号传导域和配体结合外域。
24.细胞，其包含根据权利要求1至6中任一项的嵌合受体或根据权利要求7至23中任一项的嵌合受体系统。
25.编码根据权利要求1至6中任一项的嵌合受体的核酸序列。
26.编码根据权利要求7至23中任一项的嵌合受体系统的核酸构建体。
27.根据权利要求26的核酸构建体，其包含编码第一嵌合受体的第一核酸序列和编码第二嵌合受体的第二核酸序列，所述核酸构建体具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2
其中
AgB1是编码所述第一嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer1是编码所述第一嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码所述第一嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码所述第一嵌合受体内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达两种嵌合受体的核酸序列
AgB2是编码所述第二嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer2是编码所述第二嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM2是编码所述第二嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo2是编码所述第二嵌合受体内域的核酸序列。
28.根据权利要求27的核酸构建体，其中endo1包含编码细胞因子受体内域的第一链的核酸序列和编码第一胞内T细胞信号传导域的核酸序列；并且endo2包含编码细胞因子受体内域的第二链的核酸序列和编码第二胞内T细胞信号传导域的核酸序列。
29.根据权利要求27或28的核酸构建体，其中coexpr编码包含自身切割肽的序列。
30.根据权利要求27至29中任一项的核酸构建体，其中在编码相同或相似氨基酸序列的序列的区域中使用替代密码子，以避免同源重组。
31.根据权利要求26的核酸构建体，其包含编码嵌合受体的第一核酸序列和编码胞内融合蛋白的第二核酸序列，所述核酸构建体具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-domain2-endo2
其中
AgB1是编码所述嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer1是编码所述嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码所述嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo 1是编码所述嵌合受体内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达所述嵌合受体和所述胞内融合蛋白两者的核酸序列；
domain2是编码所述胞内融合蛋白的第二域的核酸序列；和
endo 2是编码所述胞内融合蛋白的细胞因子受体内域的核酸序列。
32.根据权利要求31的核酸构建体，其中domain2是编码ZAP70SH2域的核酸序列。
33.根据权利要求26的核酸构建体，其包含编码嵌合受体的第一核酸序列和编码跨膜蛋白的第二核酸序列，所述核酸构建体具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-TM2-endo2
其中
AgB1是编码所述嵌合受体的抗原结合域的核酸序列；
spacer1是编码所述嵌合受体的间隔物的核酸序列；
TM1是编码所述嵌合受体的跨膜域的核酸序列；
endo1是编码所述嵌合受体内域的核酸序列；
coexpr是使得能够共表达所述嵌合受体和所述跨膜蛋白两者的核酸序列，
TM2是编码所述跨膜域的跨膜域的核酸序列，
endo2是编码所述跨膜蛋白的细胞因子受体内域的核酸序列。
34.载体，其包含根据权利要求25的核酸序列或根据权利要求26到33中任一项的核酸构建体。
35.根据权利要求34的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
36.试剂盒，其包含：
i)载体，所述载体包含编码如权利要求1至6中任一项所定义的第一嵌合受体的核酸序列；和
ii)载体，所述载体包含编码如权利要求1至6中任一项所定义的第二嵌合受体的核酸序列。
37.试剂盒，其包含：
i)载体，所述载体包含编码如权利要求1至6中任一项所定义的嵌合受体的核酸序列；和
ii)载体，所述载体包含编码如权利要求15至19中任一项所定义的胞内融合蛋白的核酸序列。
38.试剂盒，其包含：
i)载体，所述载体包含编码如权利要求1至6中任一项所定义的嵌合受体的核酸序列；和
ii)载体，所述载体包含编码如权利要求20至23中任一项所定义的跨膜蛋白的核酸序列。
39.用于制备根据权利要求24的细胞的方法，其包括以下步骤：将根据权利要求25的核酸序列；根据权利要求26至33中任一项的核酸构建体；根据权利要求34或35的载体；或根据权利要求36至38中任一项所述的载体的试剂盒导入细胞中。
40.根据权利要求39的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。
41.药物组合物，其包含多个根据权利要求24的细胞。
42.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括对受试者施用根据权利要求41的药物组合物的步骤。
43.根据权利要求42的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者中分离含有细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染细胞：根据权利要求25的核酸序列；根据权利要求26至33中任一项的核酸构建体；根据权利要求34或35的载体；或根据权利要求36至38中任一项的载体的试剂盒；并且
(iii)对所述受试者施用来自(ii)的细胞。
44.根据权利要求43的方法，其中所述样品是含有T细胞的样品。
45.根据权利要求42至44中任一项的方法，其中所述疾病是癌症。
46.根据权利要求41的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
47.根据权利要求24的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
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