CN108103130A - 从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺,（1）海洋生物蛋白经酶解制得酶解液（2）海洋生物蛋白酶解液采用膜分离技术进行粗分离，获得小分子活性肽，（3）小分子活性肽经葡聚糖凝胶色谱分离，获得各个组分（4）获得各个组分分别经离子交换色谱进一步分离，获得不同组分的分离产物（5）分离产物经反向高效液相色谱纯化，最终得到一系列的小分子活性多肽化合物。本发明技术路线简单可行，易于实现，可直接从多种海洋蛋白资源中获得一系列的小分子活性多肽化合物，有助于开展不同来源不同类型的小分子活性肽化合物的结构鉴定、药理活性研究、构效关系研究及计算机模拟药物的筛选等研究工作。
Description
技术领域
本发明涉及活性肽领域，具体涉及从海洋生物蛋白酶解液中提取分离纯化小分子活性肽的联用工艺。
背景技术
海洋生物活性肽是一类存在于海洋生物体内或经蛋白酶解方法制得，具有多种特殊生理活性肽类物质的总称，它来源有两种，一是海洋生物体内固有的天然活性肽，二是通过海洋蛋白质资源水解获得具有各种生理功能的生物活性肽，但是天然的活性肽在生物体内含量较低，提取困难，所以海洋蛋白资源的酶解产物是获得活性肽的有效途径，目前研究和开发的活性多肽主要来源于陆生动植物，而对于海洋生物的活性肽没有进行很好的开发。多肽药物具有具有化学合成药物和蛋白药物的优点，随着多肽类药物研发速度的急剧增长，使得多肽药物成为21 世纪最有发展前途的药物之一，而海洋蛋白来源的多肽是开发研究海洋多肽药物与功能性保健食品的原料宝库
我国是海洋大国，海洋水产品资源丰富,水产品有鱼类、虾类、类类等，他们均含有丰富的蛋白质，是公认的高蛋白、低脂肪的健康食品，据此可以从丰富的海洋生物蛋白中经酶解获得多种类型的海洋活性多肽。
而海洋蛋白酶解液中含有蛋白、多糖及活性多肽等多种物质，种类繁多，性质各异，且分子量差异较大，需要先进行粗分离然后再进一步的精细分离，常用纯化方法有盐析法、超滤法、有机溶剂及聚乙二醇沉淀法、凝胶过滤法、离子交换层析、亲和层析、疏水层析等，其中膜分离法、葡聚糖凝胶柱层析、离子交换柱层析、反相高效液相色谱等方法应用较多。
目前已有从不同海洋水产蛋白的酶解液中分离出不同活性肽的报道，例如从贝类中分离的抗氧化活性肽（CN200510000032.2；CN 201510926722.4）,从牡蛎中分离的抗肿瘤活性肽（CN201310618049.9）,从鳀鱼发酵液中分离的抗神经细胞损伤活性肽（CN201410173125.4），从大鲵中分离得到的活性肽（CN 201610314751.X），从中可以看出海洋生物蛋白酶解液中含有多种生理活性的多肽，但是在这些活性肽的分离过程中所采用技术较为单一或者各种分离技术不能有效结合，而且只分离得到单一活性肽，整个提取分离过程较繁琐且效率不高。
多肽由于其所带电荷、氨基酸序列、分子量大小及结构的而具有不同的性质，需要根据多肽不同的性质而采用不同分离纯化方法，目前某一种分离纯化方法难以满足人们对样品纯度和制备量的要求。
发明内容
本发明的目的是解决上述不足问题，提供从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，将多种分离纯化方法有效的结合，建立一套系统化、标准化的多肽提取及分离纯化联用技术，不同分离方法取长补短、有效结合从而实现活性肽的有效分离，该技术可直接从多种海洋水产中获得一系列的小分子活性多肽化合物，从而获得不同来源多种类型的活性肽化合物。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案，从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，步骤如下：
步骤(一)、海洋生物蛋白酶解液的制备：海洋水产品加水匀浆或者干燥粉碎后，加入4-10 倍体积的水，然后加入总液体体积0.2％-0.5%的复合蛋白酶，在40-50℃下酶解3-6小时，酶反应pH 值控制在1-10，酶解结束后升温灭酶，得到海洋水产品蛋白酶解液；
步骤(二)、海洋生物蛋白酶解液的粗分离：将步骤（一）获得的蛋白酶解液离心去除颗粒状物质，然后采用膜分离技术进行粗分离，过滤液冷冻干燥得小分子活性肽粉；
步骤(三)、小分子活性肽的凝胶柱色谱分离：将步骤（二）中的小分子活性肽粉溶解于纯水中，用凝胶柱色谱进行分离，收集不同组分；
步骤（四）：小分子活性肽的离子交换色谱分离：步骤（四）得到不同组分分别进行离子交换柱层析分离，采用不同浓度的盐溶液洗脱，收集不同组分的分离产物；
步骤（五）：小分子活性肽的高效液相色谱纯化：步骤（四）中分离产物经脱盐后，采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱为C18，流动相A为乙腈，流动相B为含0.05%-0.5%三氟乙酸的纯水，采用不同浓度的流动相A和流动相B等度或者梯度洗脱，收集色谱峰，冷冻干燥即得小分子活性肽化合物。
所述步骤（一）中蛋白酶质量比为中性蛋白酶:碱性蛋白酶:风味蛋白酶=3~5：3~5：3~5复配的复合蛋白酶
所述步骤（二）中膜的截留分子量为5000 Da。
所述步骤（三）中凝胶柱色谱的填料为葡聚糖凝胶，常采用的填料为Sephadex G-15、Sephadex G-25、 Sephadex LH-20等。
所述步骤（四）中离子交换树脂为阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、强离子交换树脂或弱型离子交换树脂。
所述步骤（五）中色谱柱选择C4、C8填料色谱柱或者氨基型亲水色谱柱。
本发明建立从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，该技术根据活性多肽所带电荷、氨基酸序列、分子量大小及结构的不同，将蛋白中多种提取分离纯化方法高效的结合，不同分离技术取长补短、相互补充。该技术是系统化的多肽分离纯化技术，技术路线简单可行，易于实现，可直接从多种海洋水产中获得一系列的小分子活性多肽化合物，解决了目前活性肽分离中所采用方法单一及无系统合理技术路线及获得活性多肽较少的问题，可获得大量海洋来源的活性多肽化合物，有助于后续开展活性肽的结构鉴定、药理活性研究、构效关系研究及计算机模拟药物的筛选等工作，有利于推进活性肽在生物医药领域的发展。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明从海洋生物蛋白资源中分离纯化活性肽的联用工艺作更详细的说明：
实施例一：
从海洋生物蛋白资源中分离纯化活性肽的联用工艺，具体步骤如下：
步骤(一)、紫贻贝蛋白酶解液的制备：紫贻贝内脏肉加水匀浆后，加入4倍体积的水，然后加入总液体体积0.2％的复合蛋白酶（质量比：中性蛋白酶：碱性蛋白酶：风味蛋白酶=3：3：4），在50℃下酶解3小时，酶反应pH 值控制在9，酶解结束后升温至80℃灭酶15分钟，得到紫贻贝蛋白酶解液。
步骤(二)、酶解液的粗分离：将步骤（一）获得的蛋白酶解液离心去除颗粒状物质及变形的大分子蛋白，然后采用截留分子量为5000 Da超滤膜分离，除去多糖及蛋白等大分子物质，过滤液冷冻干燥得紫贻贝肽粉。
步骤(三)、小分子活性肽的凝胶柱色谱分离：将步骤（二）中的小分子活性肽粉用超纯水中配成10mg/ml的溶液，用Sephadex LH-20凝胶层析柱进行分离，以超纯水为流动相，用紫外分光光度计测定多肽的吸光度，依据吸光度收集洗脱峰，浓缩冻干备用。
步骤（四）：小分子活性肽的离子交换色谱分离：步骤（四）得到组分用超纯水溶解后，经CM Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析柱分离，上样后用缓冲液洗脱到出现基线，然后0-0.5M氯化钠进行梯度洗脱,根据吸光度数值收集洗脱峰。
步骤（五）：小分子活性肽的高效液相色谱纯化：步骤（四）中分离产物经透析袋脱盐后，采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱为ZORBAX SB-C18，流动相A为乙腈，流动相B为含0.05%三氟乙酸的纯水，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为220 nm，不同分离产物根据特性采用不同浓度的流动相A和流动相B等度或者梯度洗脱，收集色谱峰，冷冻干燥，共获得15个小分子活性肽化合物。
实施例二：
从海洋生物蛋白资源中分离纯化活性肽的联用工艺，具体步骤如下：
步骤(一)、牡蛎贝蛋白酶解液的制备：牡蛎干粉碎后加入20倍体积的水，然后加入总液体体积0.4％的复合蛋白酶（质量比：中性蛋白酶：碱性蛋白酶：风味蛋白酶=4：3：3），在40℃下酶解6小时，酶反应pH 值控制在8.5，酶解结束后升温至90℃灭酶10分钟，得到牡蛎蛋白酶解液。
步骤(二)、酶解液的粗分离：将步骤（一）获得的蛋白酶解液离心去除颗粒状物质及变形的大分子蛋白，然后采用截留分子量为5000 Da超滤膜粗分离，除去多糖及蛋白等大分子物质，过滤液冷冻干燥得小分子牡蛎肽粉。
步骤(三)、小分子活性肽的凝胶柱色谱分离：将步骤（二）中的小分子活性肽粉用超纯水中配成10mg/ml的溶液，用Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，以超纯水为流动相，用紫外分光光度计测定多肽的吸光度，依据吸光度收集洗脱峰，浓缩冻干备用。
步骤（四）：小分子活性肽的离子交换色谱分离：步骤（四）得到组分用超纯水溶解后，经阴离子琼脂糖凝胶DEAE-Sepharose–FF柱层析分离，上样后用缓冲液洗脱到出现基线，然后0-0.3M的氯化钠进行梯度洗脱,据吸光度数值收集洗脱峰。
步骤（五）：小分子活性肽的高效液相色谱纯化：步骤（四）中分离产物经凝胶柱脱盐后，采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱为Symmetry C18，流动相A为乙腈，流动相B为含0.1 %三氟乙酸的纯水，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为280 nm，不同分离产物根据特性采用不同浓度的流动相A和流动相B等度或者梯度洗脱，收集色谱峰，冷冻干燥，共获得21个小分子活性肽化合物。
实施例三
从海洋生物蛋白资源中分离纯化活性肽的联用工艺，具体步骤如下：
步骤(一)、虾蛋白酶解液的制备：虾干粉碎后加入20倍体积的水，然后加入总液体体积0.5％的复合蛋白酶（质量比：中性蛋白酶：碱性蛋白酶：风味蛋白酶=4：4：2），在40℃下酶解5小时，酶反应pH 值控制在8.8，酶解结束后升温至90℃灭酶10分钟，得到虾蛋白酶解液。
步骤(二)、酶解液的粗分离：将步骤（一）获得的蛋白酶解液离心去除颗粒状物质及变形的大分子蛋白，然后采用截留分子量为5000 Da超滤膜粗分离，除去多糖及蛋白等大分子物质，过滤液冷冻干燥得小分子虾肽粉。
步骤(三)、小分子活性肽的凝胶柱色谱分离：将步骤（二）中的小分子活性肽粉用超纯水中配成10mg/ml的溶液，用Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，以超纯水为流动相，用紫外分光光度计测定多肽的吸光度，依据吸光度收集洗脱峰，浓缩冻干备用。
步骤（四）：小分子活性肽的离子交换色谱分离：步骤（四）得到组分用超纯水溶解后，经阴离子琼脂糖凝胶DEAE-Sepharose–FF柱层析分离，上样后用缓冲液洗脱到出现基线，然后0-0.3M的氯化钠进行梯度洗脱,据吸光度数值收集洗脱峰。
步骤（五）：小分子活性肽的高效液相色谱纯化：步骤（四）中分离产物经凝胶柱脱盐后，采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱为Symmetry C18，流动相A为乙腈，流动相B为含0.1 %三氟乙酸的纯水，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为280 nm，不同分离产物根据特性采用不同浓度的流动相A和流动相B等度或者梯度洗脱，收集色谱峰，冷冻干燥，共获得21个小分子活性肽化合物。
以上所述仅用以说明本发明的技术方案，凡是基于本发明权利要求书内容的技术方案，均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(一)、海洋生物蛋白酶解液的制备：海洋水产品加水匀浆或者干燥粉碎后，加入4-20 倍体积的水，然后加入总液体体积0.2％-0.5%的复合蛋白酶，在40-50℃下酶解3-6小时，酶反应pH 值控制在1-10，酶解结束后升温灭酶，得到海洋水产品蛋白酶解液；
步骤(二)、海洋生物蛋白酶解液的粗分离：将步骤（一）获得的蛋白酶解液离心去除颗粒状物质，然后采用膜分离技术进行粗分离，过滤液冷冻干燥得小分子活性肽粉；
步骤(三)、小分子活性肽的凝胶柱色谱分离：将步骤（二）中的小分子活性肽粉溶解于纯水中，用凝胶柱色谱进行分离，收集不同组分；
步骤（四）：小分子活性肽的离子交换色谱分离：步骤（四）得到不同组分分别进行离子交换柱层析分离，采用不同浓度的盐溶液洗脱，收集不同组分的分离产物；
步骤（五）：小分子活性肽的高效液相色谱纯化：步骤（四）中分离产物经脱盐后，采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱为C18，流动相A为乙腈，流动相B为含0.05%-0.5%三氟乙酸的纯水，采用不同浓度的流动相A和流动相B等度或者梯度洗脱，收集色谱峰，冷冻干燥即得小分子活性肽化合物。
2.按权利要求1所述的从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，其特征在于：所述步骤（一）中蛋白酶质量比为中性蛋白酶:碱性蛋白酶:风味蛋白酶=3~5：3~5：3~5复配的复合蛋白酶。
3.按权利要求1所述的从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，其特征在于：所述步骤（二）中膜的截留分子量为5000 Da。
4.按权利要求1所述的从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，其特征在于：所述步骤（三）中凝胶柱色谱的填料为葡聚糖凝胶，采用的填料为Sephadex G-15、Sephadex G-25或 Sephadex LH-20。
5.按权利要求1所述的从海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，其特征在于：所述步骤（四）中离子交换树脂为阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、强离子交换树脂或弱离子交换树脂。
6.按权利要求1所述的一种海洋生物蛋白资源中提取分离小分子活性肽的联用工艺，其特征在于：所述步骤（五）中色谱柱选择C4、C8填料色谱柱或氨基亲水型色谱柱。
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