CN108064315B - 检测流感的方法 - Google Patents
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Abstract
提供检测流感的组合物和方法。
Description
1.发明领域
提供检测流感的组合物和方法。尤其是,提供用于流感检测的流感标志物和多组标志物。
2.背景
流感(influenza或flu),是呼吸道的传染性病毒感染。流感的传播主要是空气传播(即,咳嗽或打喷嚏);传播高峰常常发生在冬季月份。症状通常包括发热、发冷、头痛、肌痛、不适、咳嗽和鼻窦充血。也可以发生胃肠症状(即,恶心、呕吐、或腹泻),这主要在儿童中发生,但在成人中少见。症状通常在暴露于感染的人两天之内出现。作为流感感染的并发症,可以发展肺炎,引起儿童、老人和免疫缺陷的群体中发病率和死亡率增加。流感病毒分为甲型(type A)、乙型(type B)和丙型(type C),其中前两者引起最多的人感染。甲型流感是人中最常见的流感病毒类型,并且通常造成季节性流感流行并且偶然造成大流行。甲型流感病毒还可以感染动物,如鸟、猪和马。乙型流感病毒感染通常限于人,并且较少引起流行。基于两种表面蛋白:血凝素(H)和神经氨酸酶(N),甲型流感病毒进一步分为各亚型。季节性流感通常由亚型H1,H2,H3以及N1和N2引起。除了季节性流感,在2009早期在美国,在人中鉴定了新的H1N1株。
呼吸道合胞病毒(RSV),一种由两种病毒株(亚群A和B)组成的副粘病毒科的成员,也是主要折磨免疫缺陷的(例如,慢性肺病或心脏病或经历对降低其免疫系统的强度的疾病的治疗)婴儿和老人的传染性疾病的原因。在工作台和玩具上病毒可以存活数小时,并且引起上呼吸道感染(如感冒)以及下呼吸道感染(表现为支气管炎和肺炎)。4两岁时,大多数儿童已经受到RSV感染,但是由于仅有弱的免疫力,所以儿童和成人都可能再次感染。感染后症状通常表现四到六天。该疾病通常是自限性的,在婴儿中持续约一至两周。在成人中,感染持续约五天并且表现出与感冒一致的症状,如鼻液溢、疲劳、头痛和发热。RSV季与流感季重叠,某种程度因为感染在秋季期间开始上升并且继续直到早春。然而,RSV感染也在每年其他时间发生,尽管较少。
与感染控制预警联合的主动监督程序是预防流感和RSV的传播的重要组成部分。提供鉴定感染这些季节性感染的患者的快速结果的测定的使用也是有效控制、治疗的正确选择和大范围爆发的预防的重要因素。
流感病毒的基因组包含八个0.9-2.3kb的RNA片段,它们一起跨越约13.5kb并且编码11种蛋白。命名为PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,MP和NS的这8个片段在持续的选择压力下,这导致快速的序列变化(抗原性漂移(antigenic drift))。除了序列水平的改变,甲型流感还具有将整个片段与其他甲型流感病毒交换的能力(抗原性转变(antigenic shift))。该过程导致流行性流感株的出现(即甲型流感H1N1pdm09,猪源(swing origin)H3N2)。
两种蛋白,血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),确定甲型流感病毒的亚型(分别是H和N)。存在16种H亚型和9种N亚型。H1N1和H3N2亚型引起人中绝大部分的流感感染。乙型流感病毒具有类似的RNA片段结构;然而乙型流感病毒不具有亚型。
该连续抗原性漂移和抗原性转变使得难以维持季节间的流感检测测定。仍然存在对甚至在流感基因组经历遗传漂移时仍然准确的稳健的流感检测测定的需要。
3.概述
在一些实施方案中,提供检测在来自受试者的样品中存在或不存在流感的方法。在一些实施方案中,方法包括检测在样品中存在或不存在选自酸性聚合酶(PA)和碱性聚合酶2(PB2)的至少一种流感基因。
在一些实施方案中,提供确定受试者是否患有流感的方法。在一些实施方案中,方法包括检测在来自受试者的样品中存在或不存在选自酸性聚合酶(PA)基因和碱性聚合酶2(PB2)基因的至少一种流感基因。
在一些实施方案中,方法包括检测存在或不存在PA基因。在一些实施方案中,方法包括检测存在或不存在PB2基因。在一些实施方案中,方法包括检测存在或不存在PA基因和PB2基因。在一些实施方案中,PA基因和/或PB2基因是甲型流感基因。在一些实施方案中,PA基因的序列与SEQ ID NO:2的序列至少95%相同。在一些实施方案中,PB2基因的序列与SEQID NO:1的序列至少95%相同。
在一些实施方案中,所述方法还包括检测存在或不存在至少一种流感基质蛋白(MP)基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在甲型流感MP基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在乙型流感MP基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在甲型流感MP基因和乙型流感MP基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在禽流感MP基因。在一些实施方案中,所述禽流感MP基因是血凝素(H)5或H7亚型。在一些实施方案中,甲型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:3或4的序列至少95%相同。在一些实施方案中,乙型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:6的序列至少95%相同。
在一些实施方案中,所述方法还包括检测存在或不存在至少一种流感非结构(NS)基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在乙型流感NS基因。在一些实施方案中,乙型流感NS基因的序列与SEQ ID NO:7的序列至少95%相同。
在一些实施方案中,所述方法还包括检测存在或不存在至少一种流感血凝素(HA)基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在甲型流感HA基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在禽流感HA基因。在一些实施方案中,所述禽流感是H7亚型。在一些实施方案中,流感HA基因的序列与SEQ ID NO:5的序列至少95%相同。
在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在甲型流感PA基因,甲型流感PB2基因,甲型流感MP基因,禽流感MP基因,和禽流感HA基因。在一些实施方案中,甲型流感PA基因的序列与SEQ ID NO:2至少95%相同,甲型流感PB2基因的序列与SEQ ID NO:1至少95%相同,甲型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:3至少95%相同,禽流感MP基因的序列与SEQ ID NO:4至少95%相同,并且禽流感HA基因的序列与SEQ ID NO:5至少95%相同。
在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在乙型流感MP基因和乙型流感NS基因。在一些实施方案中,乙型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:6至少95%相同并且乙型流感NS基因的序列与SEQ ID NO:7至少95%相同。
在一些实施方案中,检测到存在流感基因中的任一种,表明在样品中存在流感。在一些实施方案中,所述方法区别甲型流感和乙型流感。在一些实施方案中,所述方法不区别甲型流感和乙型流感。
在一些实施方案中,所述方法包括在来自受试者的样品中检测存在或不存在呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在RSV A。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在RSV B。在一些实施方案中,所述方法包括检测存在或不存在RSV A和RSV B。
在一些实施方案中,其中受试者具有一种以上流感症状。在一些实施方案中,受试者具有选自发热,发冷,咳嗽,喉咙痛,流鼻涕,鼻塞,肌痛,头痛,疲劳,呕吐和腹泻的一种以上症状。
在一些实施方案中,所述方法包括PCR。在一些实施方案中,所述方法包括定量PCR。在一些实施方案中,PCR反应从初始变性步骤到最终延伸步骤耗费少于2小时。
在一些实施方案中,所述方法包括将来自所述样品的核酸与用于检测流感PA基因的第一引物对接触。在一些实施方案中,第一引物对包含第一引物和第二引物,其中第一引物包含与SEQ ID NO:2的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第二引物包含与SEQ ID NO:2的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第一引物对包含第一引物和第二引物,其中第一引物包含与SEQ IDNO:20的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第二引物包含与SEQ ID NO:21的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,或至少20个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第一引物具有SEQ ID NO:20的序列并且第二引物具有SEQ ID NO:21的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将来自所述样品的核酸与用于检测流感PB2基因的第二引物对接触。在一些实施方案中,第二引物对包含第三引物和第四引物,其中第三引物包含与SEQ ID NO:1的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第四引物包含与SEQ ID NO:1的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第二引物对包含第三引物和第四引物,其中第三引物包含与SEQ IDNO:17的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,或至少20个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第四引物包含与SEQ ID NO:18的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,或至少20个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第三引物具有SEQ ID NO:17的序列并且第四引物具有SEQ ID NO:18的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将来自所述样品的核酸与至少一个另外的引物对接触,其中每个另外的引物对用于检测选自甲型流感MP基因,禽流感MP基因,和禽流感HA基因的不同流感基因。在一些实施方案中,每个另外的引物对包含第五引物和第六引物,所述第五引物和第六引物独立地选自:(a)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:3的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:3的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(b)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:4的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:4的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(c)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:5的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:5的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(d)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:23的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:24的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(e)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:26的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:27的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;以及(f)第五引物,所述第五引物包含与SEQID NO:29的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:30的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将来自所述样品的核酸与至少一个另外的引物对接触,其中每个另外的引物对用于检测选自乙型流感MP基因和乙型流感NS基因的不同流感基因。在一些实施方案中,每个另外的引物对包含第七引物和第八引物,所述第七引物和第八引物独立地选自:(a)第七引物,所述第七引物包含与SEQ ID NO:6的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ ID NO:6的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(b)第七引物,所述第七引物包含与SEQ ID NO:7的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ ID NO:7的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(c)第七引物,所述第七引物包含与SEQ ID NO:32的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ ID NO:33的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;以及(d)第七引物,所述第七引物包含与SEQID NO:35的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ ID NO:36的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将来自所述样品的核酸与至少一个另外的引物对接触,其中每个另外的引物对用于检测RSV A或RSV B。在一些实施方案中,每个另外的引物对包含第九引物和第十引物,所述第九引物和第十引物独立地选自:(a)第九引物,所述第九引物包含与SEQ ID NO:38的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第十引物,所述第十引物包含与SEQ ID NO:39的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;和(b)第九引物,所述第九引物包含与SEQ ID NO:41的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第十引物,所述第十引物包含与SEQ ID NO:42的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将来自所述样品的核酸与用于检测甲型流感PA基因、甲型流感PB2基因、甲型流感MP基因、禽流感MP基因和禽流感HA基因的引物对接触。在一些实施方案中,所述方法还包括将来自所述样品的核酸与用于检测RSV A和RSV B的引物对接触。在一些实施方案中,所述方法包括将来自所述样品的核酸与用于检测外源性对照的对照引物对接触。在一些实施方案中,每个引物对产生50至500个核苷酸长,50至400个核苷酸长,50至300个核苷酸长,50至200个核苷酸长,或50至150个核苷酸长的扩增子。
在一些实施方案中,所述方法包括当存在引物对的靶标时从每个引物对形成扩增子。在一些实施方案中,所述方法包括形成选自甲型流感PA扩增子、甲型流感PB2扩增子的至少一种扩增子。在一些实施方案中,甲型流感PA扩增子具有SEQ ID NO:9的序列并且甲型流感PB2扩增子具有SEQ ID NO:8的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括形成选自甲型流感MP扩增子、禽流感MP扩增子和禽流感HA扩增子的至少一种扩增子。在一些实施方案中,甲型流感MP扩增子具有SEQ IDNO:10的序列,禽流感MP扩增子具有SEQ ID NO:11的序列,并且禽流感HA扩增子具有SEQ IDNO:12的序列。
在一些实施方案中,所述方法还包括形成乙型流感MP扩增子和/或乙型流感NS扩增子。在一些实施方案中,乙型流感MP扩增子具有SEQ ID NO:13的序列并且乙型流感NS扩增子具有SEQ ID NO:14的序列。在一些实施方案中,所述方法还包括形成RSV A扩增子和/或RSV B扩增子。在一些实施方案中,RSV A扩增子具有SEQ ID NO:15的序列并且RSV B扩增子具有SEQ ID NO:16的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将扩增子与选自甲型流感PA探针和甲型流感PB2探针的至少一种探针接触。在一些实施方案中,流感PA探针包含与SEQ ID NO:2的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且流感PB2探针包含与SEQID NO:1的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,流感PA探针包含与SEQ ID NO:19的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且流感PB2探针包含与SEQ ID NO:22的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将扩增子与选自甲型流感MP探针、禽流感MP探针和禽流感HA探针的至少一种探针接触。在一些实施方案中,流感MP探针包含与SEQ IDNO:3的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感MP探针包含与SEQ ID NO:4的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感HA探针包含与SEQ ID NO:5的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,流感MP探针包含与SEQ ID NO:25的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感MP探针包含与SEQ ID NO:28的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感HA探针包含与SEQ ID NO:31的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将扩增子与选自乙型流感MP探针和乙型流感NS探针的至少一种探针接触。在一些实施方案中,乙型流感MP探针包含与SEQ ID NO:6的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且乙型流感NS探针包含与SEQ ID NO:7的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,乙型流感MP探针包含与SEQ ID NO:34的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且乙型流感NS探针包含与SEQ ID NO:37的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括将扩增子与选自RSV A探针和RSV B探针的至少一种探针接触。在一些实施方案中,RSV A探针包含与SEQ ID NO:15的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且乙型流感NS探针包含与SEQ ID NO:16的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,RSVA探针包含与SEQ ID NO:40的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且RSV B探针包含与SEQ ID NO:43的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,每种探针包含可检测标记。在一些实施方案中,每种探针包含荧光染料和猝灭剂分子。在一些实施方案中,甲型流感探针和乙型流感探针包含在检测上相区别的可检测标记。在一些实施方案中,甲型流感探针和乙型流感探针包含不是在检测上相区别的可检测标记。在一些实施方案中,每种探针由15至30个核苷酸组成。
在一些实施方案中,所述方法包括形成外源性对照扩增子。在一些实施方案中,所述方法包括将外源性对照扩增子与能够选择性地与外源性对照扩增子杂交的对照探针接触。
在一些实施方案中,所述方法包括在单个多重反应中检测存在或不存在至少一种甲型流感亚型和至少一种乙型流感亚型以及外源性对照。在一些实施方案中,至少一种甲型流感亚型包括至少一种禽流感。在一些实施方案中,所述方法包括在同一个多重反应中检测RSV A和/或RSV B。
在一些实施方案中,样品选自鼻咽拭子样品、鼻吸出物样品和洗鼻样品。
在一些实施方案中,提供组合物。在一些实施方案中,组合物包含用于检测流感PA基因的第一引物对。在一些实施方案中,第一引物对包含第一引物和第二引物,其中第一引物包含与SEQ ID NO:2的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第二引物包含与SEQ ID NO:2的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第一引物对包含第一引物和第二引物,其中第一引物包含与SEQ IDNO:20的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第二引物包含与SEQ ID NO:21的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,或至少20个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第一引物具有SEQ ID NO:20的序列并且第二引物具有SEQ ID NO:21的序列。
在一些实施方案中,提供组合物,其包含用于检测流感PB2基因的第二引物对。在一些实施方案中,第二引物对包含第三引物和第四引物,其中第三引物包含与SEQ ID NO:1的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第四引物包含与SEQID NO:1的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第二引物对包含第三引物和第四引物,其中第三引物包含与SEQ ID NO:17的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,或至少20个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,并且其中第四引物包含与SEQ ID NO:18的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,或至少20个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,第三引物具有SEQ ID NO:17的序列并且第四引物具有SEQ ID NO:18的序列。
在一些实施方案中,组合物包含至少一个另外的引物对,其中每个另外的引物对用于检测选自甲型流感MP基因、禽流感MP基因和禽流感HA基因的不同流感基因。在一些实施方案中,每个另外的引物对包含第五引物和第六引物,所述第五引物和第六引物独立地选自:(a)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:3的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:3的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(b)第五引物,所述第五引物包含与SEQ IDNO:4的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:4的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(c)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:5的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:5的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(d)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:23的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:24的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(e)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:26的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:27的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;以及(f)第五引物,所述第五引物包含与SEQ ID NO:29的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第六引物,所述第六引物包含与SEQ ID NO:30的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。
在一些实施方案中,组合物还包含至少一个另外的引物对,其中每个另外的引物对用于检测选自乙型流感MP基因和乙型流感NS基因的不同流感基因。在一些实施方案中,每个另外的引物对包含第七引物和第八引物,所述第七引物和第八引物独立地选自:(a)第七引物,所述第七引物包含与SEQ ID NO:6的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ ID NO:6的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(b)第七引物,所述第七引物包含与SEQ ID NO:7的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ IDNO:7的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;(c)第七引物,所述第七引物包含与SEQ ID NO:32的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ ID NO:33的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;以及(d)第七引物,所述第七引物包含与SEQ ID NO:35的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第八引物,所述第八引物包含与SEQ ID NO:36的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。
在一些实施方案中,组合物还包含至少一个另外的引物对,其中每个另外的引物对用于检测RSV A或RSV B。在一些实施方案中,每个另外的引物对包含第九引物和第十引物,所述第九引物和第十引物独立地选自:(a)第九引物,所述第九引物包含与SEQ ID NO:38的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第十引物,所述第十引物包含与SEQ ID NO:39的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列;以及(b)第九引物,所述第九引物包含与SEQ ID NO:41的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同的序列,和第十引物,所述第十引物包含与SEQ ID NO:42的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的序列。
在一些实施方案中,组合物包含用于检测甲型流感PA基因、甲型流感PB2基因、甲型流感MP基因、禽流感MP基因和禽流感HA基因的引物对。在一些实施方案中,组合物还包含用于检测RSV A和RSV B的引物对。在一些实施方案中,组合物还包含用于检测外源性对照的引物对。在一些实施方案中,外源性对照是样品处理对照。
在一些实施方案中,组合物包含选自甲型流感PA探针和甲型流感PB2探针的至少一种探针。在一些实施方案中,流感PA探针包含与SEQ ID NO:2的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且流感PB2探针包含与SEQ ID NO:1的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,流感PA探针包含与SEQ ID NO:19的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且流感PB2探针包含与SEQ ID NO:22的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,组合物还包含选自甲型流感MP探针、禽流感MP探针和禽流感HA探针的至少一种探针。在一些实施方案中,流感MP探针包含与SEQ ID NO:3的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感MP探针包含与SEQ IDNO:4的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感HA探针包含与SEQ ID NO:5的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,流感MP探针包含与SEQ ID NO:25的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感MP探针包含与SEQ ID NO:28的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且禽流感HA探针包含与SEQ ID NO:31的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,组合物还包含选自乙型流感MP探针和乙型流感NS探针的至少一种探针。在一些实施方案中,乙型流感MP探针包含与SEQ ID NO:6的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且乙型流感NS探针包含与SEQ ID NO:7的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,乙型流感MP探针包含与SEQ ID NO:34的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且乙型流感NS探针包含与SEQ ID NO:37的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,组合物还包含选自RSV A探针和RSV B探针的至少一种探针。在一些实施方案中,RSV A探针包含与SEQ ID NO:15的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且乙型流感NS探针包含与SEQ ID NO:16的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。在一些实施方案中,RSV A探针包含与SEQ ID NO:40的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列,并且RSV B探针包含与SEQ ID NO:43的至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列。
在一些实施方案中,组合物还包含用于检测外源性对照的探针。
在一些实施方案中,每种探针包含可检测标记。在一些实施方案中,每种探针包含荧光染料和猝灭剂分子。在一些实施方案中,每种探针由15至30个核苷酸组成。
在一些实施方案中,组合物是冻干的组合物。在一些实施方案中,组合物是在溶液中。在一些实施方案中,组合物包含来自受试者的样品的核酸,对所述来自受试者的样品测试存在或不存在流感。在一些实施方案中,样品选自鼻咽拭子样品、鼻吸出物样品和洗鼻样品。
在一些实施方案中,提供试剂盒。在一些实施方案中,试剂盒包含本文所述的组合物。在一些实施方案中,试剂盒还包含外源性对照。在一些实施方案中,外源性对照是RNA。在一些实施方案中,试剂盒包含dNTPs和/或热稳定性聚合酶。在一些实施方案中,试剂盒包含逆转录酶。
在一些实施方案中,提供由选自SEQ ID NOs:17至43的序列组成的寡核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸包含可检测标记。在一些实施方案中,寡核苷酸包含荧光染料和猝灭剂分子。在一些实施方案中,寡核苷酸是荧光共振能量转移(FRET)探针。
在一些实施方案中,提供这样的组合物,所述组合物包含由SEQ ID NO:17的序列组成的第一引物和由SEQ ID NO:18的序列组成的第二引物,其中第一引物和第二引物各自包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中,组合物包含由SEQ ID NO:19的序列组成的探针,其中探针包含至少一个修饰的核苷酸和/或可检测标记。
在一些实施方案中,提供这样的组合物,所述组合物包含由SEQ ID NO:20的序列组成的第一引物和由SEQ ID NO:21的序列组成的第二引物,其中第一引物和第二引物各自包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中,组合物包含由SEQ ID NO:22的序列组成的探针,其中探针包含至少一个修饰的核苷酸和/或可检测标记。在一些实施方案中,探针是荧光共振能量转移(FRET)探针。在一些实施方案中,探针包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中,组合物是冻干的组合物。在一些实施方案中,组合物是在溶液中。在一些实施方案中,组合物包含来自受试者的样品的核酸。
4.详细描述
4.1定义
为了促进对本发明的理解,下文定义了很多术语和词语:
如本文中使用的,术语“检测(detect)”,“检测(detecting)”或“检测(detection)”可以描述发现或辨别或具体观察可检测标记的组合物的一般动作。
如本文中使用的,术语“在检测上相区别”是指一组可以同时检测和区分的标记(如染料)。
如本文中使用的,术语“患者”和“受试者”可交替使用,指人。在一些实施方案中,本文所述的方法可以对来自非人的动物的样品使用。
如本文中使用的,术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”等,是指含有核酸的分子,包括但不限于,DNA或RNA。该术语包括包含DNA和RNA的任意已知碱基类似物的序列,所述碱基类似物包括,但不限于,4-乙酰基胞嘧啶,8-羟基-N6-甲基腺苷,氮丙啶基胞嘧啶,假异胞嘧啶,5-(羧羟基甲基)尿嘧啶,5-氟尿嘧啶,5-溴尿嘧啶,5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶,5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶,二氢尿嘧啶,次黄苷,N6-异戊烯基腺嘌呤,1-甲基腺嘌呤,1-甲基假尿嘧啶,1-甲基鸟嘌呤,1-甲基次黄苷,2,2-二甲基鸟嘌呤,2-甲基腺嘌呤,2-甲基鸟嘌呤,3-甲基胞嘧啶,5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤,7-甲基鸟嘌呤,5-甲基氨基甲基尿嘧啶,5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶,-D-甘露糖基Q核苷(queosine),5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶,5-甲氧基尿嘧啶,2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤,尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯,尿嘧啶-5-羟基乙酸,oxybutoxosine,假尿嘧啶,Q核苷,2-硫胞嘧啶,5-甲基-2-硫尿嘧啶,2-硫尿嘧啶,4-硫尿嘧啶,5-甲基尿嘧啶,N-尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯,尿嘧啶-5-羟基乙酸,假尿嘧啶,Q核苷,2-硫胞嘧啶,和2,6-二氨基嘌呤。
如本文中使用的,术语“寡核苷酸”是指具有少于500个核苷酸的单链多核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸是8至200,8至100,12至200,12至100,12至75,或12至50个核苷酸长。寡核苷酸可以以其长度命名,例如,24个残基的寡核苷酸可以称为“24-聚体”。
如本文中使用的,术语与靶RNA(或其靶区域)“互补”,以及探针序列与靶RNA序列的“互补性”的百分数是与靶RNA的序列或与靶RNA的序列反向互补物的“同一性”百分数。在用于本文中的组合物的探针(或其区域)与靶RNA(如本文中公开的那些)之间的“互补性”程度的确定中,“互补性”的程度表达为探针的序列(或其区域)和靶RNA或与其最佳比对的靶RNA的序列的反向互补物的序列之间的同一性百分数。百分数通过将这2条序列之间相同的比对碱基的数量计数,除以探针中连续核苷酸的总数,并且乘以100来计算。当使用术语“互补”时,对象寡核苷酸与靶分子至少90%互补,除非另有说明。在一些实施方案中,对象寡核苷酸与靶分子至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%互补。
如本文中使用的“引物”或“探针”,是指这样的寡核苷酸,其包含与靶核酸分子(如DNA(例如,靶基因)或mRNA(或从mRNA逆转录的DNA))的至少8个连续核苷酸的序列互补的区域。在一些实施方案中,引物或探针包含与靶分子的至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸的序列互补的区域。当引物或探针包含“与靶分子的至少x个连续核苷酸互补”的区域时,该引物或探针与靶分子的至少x个连续核苷酸至少95%互补。在一些实施方案中,引物或探针与靶分子至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%互补。
术语“核酸扩增”包括通过其至少一种靶核酸的至少一部分得到复制(通常以模板依赖性的方式)的任何方式,包括但不限于,宽范围的用于(线性地或指数地)扩增核酸序列的技术。进行扩增步骤的示例性方法包括聚合酶链式反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),连接酶检测反应(LDR),多重连接依赖性探针扩增(MLPA),连接接着Q-复制酶扩增,引物延伸,链替换扩增(SDA),超支化链替换扩增,多重替换扩增(MDA),基于核酸链的扩增(NASBA),两步骤多重扩增,滚环扩增(RCA)等,包括其多重版本和组合,例如但不限于,OLA/PCR,PCR/OLA,LDR/PCR,PCR/PCR/LDR,PCR/LDR,LCR/PCR,PCR/LCR(也称为组合链式反应--CCR),数字扩增等。这样的技术的描述可以在以下来源中找到,Ausbel等人;PCR Primer:ALaboratory Manual,Diffenbach,编辑,Cold Spring Harbor Press(1995);TheElectronic Protocol Book,Chang Bioscience(2002);Msuih等人,J.Clin.Micro.34:501-07(1996);The Nucleic Acid Protocols Handbook,R.Rapley,编辑,Humana Press,Totowa,N.J.(2002);Abramson等人,Curr Opin Biotechnol.1993年2月;4(1):41-7,美国专利号6,027,998;美国专利号6,605,451,Barany等人,PCT公开号WO 97/31256;Wenz等人,PCT公开号WO 01/92579;Day等人,Genomics,29(1):152-162(1995),Ehrlich等人,Science252:1643-50(1991);Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Academic Press(1990);Favis等人,Nature Biotechnology18:561-64(2000);和Rabenau等人,Infection 28:97-102(2000);Belgrader,Barany和Lubin,Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay,SixthInternational Symposium on Human Identification,1995(可在万维网上在以下网址获得:promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html);LCR试剂盒使用手册,Cat.#200520,Rev.#050002,Stratagene,2002;Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:188-93(1991);Bi和Sambrook,Nucl.Acids Res.25:2924-2951(1997);Zirvi等人,Nucl.AcidRes.27:e40i-viii(1999);Dean等人,Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66(2002);Barany和Gelfand,Gene 109:1-11(1991);Walker等人,Nucl.Acid Res.20:1691-96(1992);Polstra等人,BMC Inf.Dis.2:18-(2002);Lage等人,Genome Res.2003年2月;13(2):294-307,和Landegren等人,Science 241:1077-80(1988),Demidov,V.,Expert RevMol Diagn.2002Nov.;2(6):542-8.,Cook等人,J Microbiol Methods.2003年5月;53(2):165-74,Schweitzer等人,Curr Opin Biotechnol.2001年2月;12(1):21-7,美国专利号5,830,711,美国专利号6,027,889,美国专利号5,686,243,PCT公开号WO0056927A3,和PCT公开号WO9803673A1。
在一些实施方案中,扩增包括以下顺序步骤的至少一个循环:将至少一种引物与至少一种靶核酸中的互补的或基本上互补的序列退火;使用聚合酶以模板依赖性方式合成至少一条链的核苷酸;并且将新形成的核酸双链体变性以分开所述链。可以重复或可以不重复循环。扩增可以包含热循环或可以等温进行。
除非另有说明,在本文中使用术语“杂交”是指“特异性杂交”,其是核酸分子优先与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交(在一些实施方案中,在严格条件下)。术语“严格条件”是指在该条件下探针将优选与其靶序列杂交,并且与其他序列较低程度地杂交,或根本不杂交的条件。在核酸杂交(例如,如在阵列、DNA印迹或RNA印迹杂交中)的情况下的“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列-依赖性的并且在不同环境参数下是不同的。核酸杂交的详尽指导在,例如,Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes第I部分,第2章,“Overview of principles of hybrizations and the strategy of nucleic acidprobes assays,”Elsevier,NY(“Tijssen”)。通常,选择用于过滤杂交的高度严格的杂交和洗涤条件为比在限定的离子强度和pH下对特定序列的解链点(Tm)低5℃。Tm是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交所在的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格的条件选择为等于对特定探针的Tm。杂交严格性对缓冲液组成、温度和探针长度的依赖性对于本领域技术人员是公知的(参见,例如,Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版)第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,NY)。
如本文中使用的“样品”,包括各种鼻样品,如鼻咽拭子样品,鼻吸出物样品,洗鼻样品,和其他类型的人样品。在一些实施方案中,鼻样品包含缓冲液,如防腐剂。其他非限制性示例性样品包括鼻拭子、口咽拭子、喉拭子、支气管肺泡灌洗样品、支气管吸出物、支气管洗涤液、气管内吸出物、气管内洗涤液、气管吸出物、鼻分泌物样品、粘液样品、痰样品和肺组织样品。在一些实施方案中,样品包含缓冲液,如防腐剂。
如本文中使用的“内源性对照,”是指天然存在于要用于检测的样品中的部分。在一些实施方案中,内源性对照是“样品充足性对照”(SAC),其可以用于确定测定中是否使用了足够的样品,或样品是否包含足够的生物学材料,如细胞。在一些实施方案中,内源性对照是RNA(如mRNA,tRNA,核糖体RNA,等),如人RNA。非限制性示例性内源性对照包括ABLmRNA,GUSB mRNA,GAPDH mRNA,TUBB mRNA,和UPK1a mRNA。在一些实施方案中,选择这样的内源性对照,如SAC,其可以以与检测靶RNA相同的方式得到检测,在一些实施方案中,与靶RNA同时检测。
如本文中使用的“外源性对照”,是指加入样品或测定中的部分,如“样品处理对照”(SPC)。在一些实施方案中,外源性对照与测定试剂一起包括在其中。外源性对照通常选择为预期不存在于要用于检测的样品中,或以非常低的水平存在于样品中,从而天然存在于样品中的该部分的量作为外源性对照不可检测到或以远低于加入样品的量的水平被检测到。在一些实施方案中,外源性对照包含预期不存在于用于检测靶RNA的样品类型中的核苷酸序列。在一些实施方案中,外源性对照包含已知不存在于样品采自的物种中的核苷酸序列。在一些实施方案中,外源性对照包括来自与样品采自的受试者不同的物种的核苷酸序列。在一些实施方案中,外源性对照包括已知不存在于任意物种中的核苷酸序列。在一些实施方案中,外源性对照选择为可以与检测靶RNA相同的方式得到检测,并且,在一些实施方案中,与靶RNA同时检测。在一些实施方案中,外源性对照是RNA。在一些这样的实施方案中,外源性对照是Armored其包含包装在噬菌体保护壳中的RNA。参见,例如,WalkerPeach等人,Clin.Chem.45:12:2079-2085(1999)。
在本文中的序列中,“U”和“T”可交替使用,从而这两种字母表明在该位置的尿嘧啶或胸腺嘧啶。本领域技术人员从上下文和/或预期用途将理解尿嘧啶或胸腺嘧啶是否意在和/或应该在该序列中的该位置使用。例如,本领域技术人员会理解,天然RNA分子通常包括尿嘧啶,而天然DNA分子通常包括胸腺嘧啶。因此,在RNA序列包括“T”的情况下,本领域技术人员会理解,天然RNA中的位置可能是尿嘧啶。
在本公开内容中,“选自…的序列”包括“选自…的一条序列”和“选自…的一条以上序列”二者。因此当使用“选自…的序列”,要理解,可以选择所列序列中的一条,或多于一条。
在本公开内容中,包括检测“一组由…组成的甲型流感(fluA)标志物”的方法包括仅检测该组的fluA标志物,并且不检测任意其他fluA标志物。然而该方法可以包括另外的组分或步骤(如用于检测fluB,呼吸道合胞病毒(RSV),和/或内源性和/或外源性对照)。类似地,包含“一组甲型流感(fluA)标志物引物对”和/或“一组fluA标志物探针”的方法或组合物可以包括仅用于该组的fluA标志物,且不用于任何其他fluA标志物的引物对和/或探针。然而,该方法或组合物可以包含另外的成分,如一种以上fluB引物对,RSV引物对,内源性对照引物对和/或外源性对照引物对。
4.2检测甲型流感
本发明人开发了检测甲型流感的更灵敏测定。在一些实施方案中,该测定包括检测甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因和/或甲型流感酸性聚合酶(PA)基因。在一些实施方案中,测定包括检测PA和/或PB2,此外检测甲型流感基质蛋白(MP)基因。本测定依赖于聚合酶链式反应(PCR),并且可以以基本上自动的方式,使用可商购核酸扩增系统进行。可以用于进行本发明的方法的示例性的非限制性核酸扩增系统包括系统,Infinity系统,和Smartcycler System(Cepheid,Sunnyvale,CA)。本测定可以在3小时内完成,并且在一些实施方案中,使用自动系统,例如,系统在2小时内完成。
4.2.1一般方法
提供用于检测甲型流感的组合物和方法。在一些实施方案中,所述方法包括检测甲型流感PB2基因和/或PA基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测甲型流感PB2基因和PA基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测甲型流感PB2基因和/或PA基因,并且还检测甲型流感MP基因。在一些实施方案中,所述方法包括检测禽流感(如甲型流感2和/或甲型流感3),Flu B,RSV A,和RSV B中的一种以上。
在一些实施方案中,在受试者中检测甲型流感的方法包括在来自受试者的样品中检测甲型流感PB2基因和/或PA基因的存在。在一些实施方案中,所述方法包括在来自受试者的样品中检测甲型流感PB2基因和PA基因。在一些实施方案中,样品选自鼻咽拭子样品,鼻吸出物样品和洗鼻样品。
在一些实施方案中,检测甲型流感的方法还包括检测至少一种内源性对照,如样品充足性对照(SAC)。在一些实施方案中,检测甲型流感的方法还包括检测至少一种外源性对照,如样品处理对照(SPC)。在一些实施方案中,SPC是RNA。
在本公开内容中,术语“靶RNA”和“靶基因”可交替使用,指甲型流感PB2基因和甲型流感PA基因,并且还指其他Flu和RSV基因,以及外源性和/或内源性对照。因此,要理解,当关于靶基因存在讨论时,该讨论具体意在包括甲型流感PB2基因和甲型流感PA基因,其他Flu和RSV基因,任意一种或多种内源性对照(例如,SAC),和任意一种或多种外源性对照(例如,SPC)。
在一些实施方案中,在鼻样品中检测甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因的存在。在一些实施方案中,在鼻吸出物样品或洗鼻样品中检测靶基因。在一些实施方案中,在向其中加入缓冲液(如防腐剂)的样品中检测靶基因。在一些实施方案中,在鼻咽拭子样品中检测甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因的存在。在一些实施方案中,在置于缓冲液(如防腐剂)中的鼻咽拭子样品中检测靶基因。
在一些实施方案中,在来自受试者的样品中检测到甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因表明受试者中存在甲型流感。在一些实施方案中,在来自受试者的样品中检测到甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因表明在受试者中存在甲型流感1。在一些实施方案中,检测定量进行。在其他实施方案中,检测定性进行。在一些实施方案中,检测靶基因包括形成包含选自靶基因、从靶基因逆转录的cDNA、靶基因的DNA扩增子和靶基因的互补物的多核苷酸和核酸的复合物。在一些实施方案中,检测靶基因包括RT-PCR。在一些实施方案中,检测靶基因包括定量RT-PCR或实时RT-PCR。在一些实施方案中,在同一个测定中作为靶基因检测样品充足性对照(SAC)和/或样品处理对照(SPC)。在一些实施方案中,如果检测到甲型流感PB2基因或甲型流感PA基因,则认为检测到甲型流感,即使在测定中未检测到SPC。在一些实施方案中,如果未检测到甲型流感PB2基因和甲型流感PA基因,仅在测定中检测到SPC的情况下认为未检测到甲型流感。
在一些实施方案中,可以在一次或多次从受试者收集的样品中测量甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因的存在,以监视对受试者中Flu的治疗。在一些实施方案中,本测定可以用作对受试者的常规和/或预防性护理的一部分。在一些实施方案中,本测定可以季节性地用作对受试者的常规和/或预防性护理的一部分。在一些实施方案中,本测定可以用作对受试者的常规和/或预防性护理的一部分,所述受试者处于流感的特定风险中,如免疫缺陷的和老年的受试者。
在一些实施方案中,要检测的样品是鼻吸出物样品或洗鼻样品,或源自鼻吸出物样品或洗鼻样品。在一些实施方案中,将缓冲液(如防腐剂)加入至鼻吸出物样品或洗鼻样品中。在一些实施方案中,在收集样品的5分钟,10分钟内,30分钟内,1小时内,或2小时内将缓冲液加入鼻吸出物样品或洗鼻样品中。
在一些实施方案中,要测试的样品是鼻咽拭子样品。在一些实施方案中,将拭子置于缓冲液中。在一些实施方案中,将拭子立即置于缓冲液中。在一些实施方案中,在收集样品5分钟内,10分钟内,30分钟内,1小时内,或2小时内将拭子置于缓冲液中。
在一些实施方案中,少于5ml,少于4ml,少于3ml,少于2ml,少于1ml,或少于0.75ml的样品或缓冲的样品用于本方法中。在一些实施方案中,0.1ml至1ml的样品或缓冲的样品用于本方法中。
在一些实施方案中,要测试的样品是另一种体液,如唾液,鼻拭子,口咽拭子,喉拭子,支气管肺泡灌洗样品,支气管吸出物,支气管洗涤液,气管内吸出物,气管内洗涤液,气管吸出物,鼻分泌物样品,粘液样品,痰样品,肺组织样品等。
要测试的临床样品,在一些实施方案中,是新鲜的(即,未冷冻)。在其他实施方案中,样品是冷冻样本。在一些实施方案中,样品是组织样品,如福尔马林固定的蜡包埋样品。在一些实施方案中,样品是液体细胞学样品。
在一些实施方案中,要测试的样品获自具有流感感染的一种以上症状的个体。流感的非限制性示例性症状包括发热,发冷,咳嗽,喉咙痛,流鼻涕,鼻塞,肌痛,头痛,疲劳,呕吐,腹泻,和那些症状的任意组合。在一些实施方案中,要测试的样品获自之前诊断患有流感的个体。在一些这样的实施方案中,监视个体中流感的复发。
在一些实施方案中,本文中所述方法可以用于常规筛选没有风险因素的健康个体。在一些实施方案中,本文中所述方法用于例如,在常规或预防性护理期间筛查无症状个体。在一些实施方案中,本文中所述方法用于筛查怀孕或试图怀孕的女性。
在一些实施方案中,本文中所述方法可以用于评估对患者中流感感染的治疗的有效性。
在一些实施方案中,提供酸性聚合酶(PA)基因和/或碱性聚合酶2(PB2)基因用于检测甲型流感的用途。在一些实施方案中,提供PA基因和/或PB2基因用于检测甲型流感的用途。在一些实施方案中,提供PA基因和/或PB2基因,并且任选地,选自基质蛋白(MP)基因和非结构蛋白(NP)基因中的一种以上基因用于检测甲型流感的用途。在一些实施方案中,提供PA基因,PB2基因,MP基因,和NP基因用于检测甲型流感和乙型流感的用途。
在本文中所述的任意实施方案中,酸性聚合酶(PA)基因和/或碱性聚合酶2(PB2)基因可以作为样品处理对照(SPC)在同一个测定反应中检测。
在一些实施方案中,提供促进受试者中甲型流感感染的检测的方法。所述方法包括在来自受试者的样品中检测存在或不存在甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因。在一些实施方案中,将关于在来自受试者的样品中存在或不存在甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因的信息传达给执业医生。如本文中使用的“执业医生”,是指诊断和/或治疗患者的个体或实体,如医院、诊所、医生办公室、医生、护士或任意前述实体和个体的机构。在一些实施方案中,存在或不存在甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因的检测在从执业医生或执业医生的机构接收受试者的样品的实验室进行。实验室通过任意方法(包括本文中所述的那些)进行检测,并且然后向执业医生传达结果。当将其通过任何方式提供给执业医生时,如本文中使用的,“传达”结果。在一些实施方案中,这种传达可以是口头的或书面的,可以通过电话、亲自、通过电子邮件、通过邮件或其他信差,或可以通过直接将信息储存在例如,执业医生可以获得的数据库来进行,包括不受执业医生控制的数据库。在一些实施方案中,信息以电子形式维持。在一些实施方案中,信息储存在内存或其他计算机可读介质中,如RAM,ROM,EEPROM,闪存,计算机芯片,数字视频光盘(DVD),压缩磁盘(CDs),硬盘(HDD),磁带等中。
在一些实施方案中,提供检测甲型流感的方法。在一些实施方案中,提供诊断甲型流感感染的方法。在一些实施方案中,所述方法包括获得来自受试者的样品和将样品提供给实验室用于在样品中检测甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因。在一些实施方案中,所述方法还包括从实验室接收表明样品中存在或不存在甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因的传达信息。如本文中使用的“实验室”是通过任何方法检测样品中的靶基因的任何设施,包括本文中所述方法,并将结果传达给执业医生。在一些实施方案中,实验室在执业医生的控制下。在一些实施方案中,实验室不在执业医生的控制下。
当实验室将检测存在或不存在甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因的结果传达给执业医生时,在一些实施方案中,实验室表明在样品中是否检测到甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因。在一些实施方案中,实验室通过指示例如,“流感阳性”或“流感阴性”或“存在流感”或“不存在流感”等,表明样品是否包含甲型流感。
如本文中使用的,当方法涉及检测甲型流感,确定甲型流感的存在,监视甲型流感,和/或诊断甲型流感感染时,所述方法包括其中进行所述方法的步骤的活动,但结果对于甲型流感的存在是阴性的。即,检测、确定、监视和诊断甲型流感或甲型流感感染包括进行导致阳性或阴性结果的方法的情形。
在一些实施方案中,至少一种内源性对照(例如,SAC)和/或至少一种外源性对照(例如,SPC)与甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因一起在单个反应同时检测。在一些实施方案中,至少一种外源性对照(例如,SPC)与甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因一起在单个反应中同时检测。
在本文中所述的任意实施方案中,甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因可以与一种以上另外的流感基因一起检测,包括但不限于,甲型流感1MP,甲型流感2MP,甲型流感3血凝素(HA),和乙型流感MP。在本文所述的任意实施方案中,甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因可以与一种以上另外的流感基因(如上文所列的),和RSV,如RSV A和/或RSV B一起检测。
4.2.2示例性的对照
在一些实施方案中,本文所述的测定包括检测甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因以及至少一种内源性对照。在一些实施方案中,内源性对照是样品充足性对照(SAC)。在一些这样的实施方案中,如果在样品中既未检测到甲型流感PB2基因,也未检测到甲型流感PA基因,并且在样品中也未检测到SAC,则测定结果被认为“无效”,因为样品可能是不足的。不意在受任何理论限制,不足的样品可能是太稀,含有太少的细胞材料,含有测定抑制剂等。在一些实施方案中,未能检测到SAC可能表明测定反应失败。在一些实施方案中,内源性对照是RNA(如mRNA,tRNA,核糖体RNA等)。非限制性示例性内源性对照包括ABL mRNA,GUSB mRNA,GAPDH mRNA,TUBB mRNA,和UPK1a mRNA。
在一些实施方案中,本文所述的测定包括检测甲型流感PB2基因和/或甲型流感PA基因以及至少一种外源性对照。在一些实施方案中,外源性对照是样品处理对照(SPC)。在一些这样的实施方案中,如果在样品中未检测到PB2基因和/或PA基因,并且在样品中也未检测到SPC,则测定结果被认为是“无效的”,因为样品处理中可能存在错误,包括但不限于,测定失败。样品处理中的非限制性示例性错误包括,不充分的样品处理,测定抑制剂的存在,核酸酶(如RNA酶)的存在,受损的试剂等。在一些实施方案中,将外源性对照(如SPC)加入样品中。在一些实施方案中,在进行测定期间将外源性对照(如SPC)加入如与一种以上缓冲液或试剂一起。在一些实施方案中,当使用系统时,SPC包括在筒中。在一些实施方案中,外源性对照(如SPC)是Armored其由噬菌体外壳保护。
在一些实施方案中,如在检测PA基因和/或PB2基因的同一个测定中同时检测内源性对照和/或外源性对照。在一些实施方案中,测定包括在同一测定反应中同时检测PA基因和/或PB2基因以及外源性对照的试剂。在一些这样的实施方案中,例如,测定反应包括用于扩增PA基因的引物组和/或用于扩增PB2基因的引物组,以及,扩增外源性对照的引物组,和检测扩增产物的标记的探针(如,例如,探针)。
4.2.3示例性的样品制备
4.2.3.1示例性的缓冲液
在一些实施方案中,将缓冲液加入至样品中。在一些实施方案中,在收集样品的时间的一小时、两小时、三小时、或六小时内加入缓冲液。在一些实施方案中,在将样品用本文中所述方法分析前一小时、两小时、三小时、或六小时内将缓冲液加入至样品中。
在一些实施方案中,将拭子样品置于缓冲液中。在一些实施方案中,在收集拭子样品的时间的一小时、两小时、三小时、或六小时内将拭子样品置于缓冲液中。在一些实施方案中,在将样品用本文中所述方法分析前一小时、两小时、三小时、或六小时内将拭子样品置于缓冲液中。
非限制性示例性商业缓冲液包括与Nasal Pharyngeal Collection试剂盒(Cepheid,Sunnyvale,CA);通用运送培养基(UTMTM,Copan,Murrieta,CA);通用病毒运送培养基(UVT,BD,Franklin Lakes,NJ);M4,M$RT,M5,和M6(Thermo Scientific)一起提供的病毒运送培养基。进一步的非限制性示例性缓冲液包括液体Amies培养基,PBS/0.5%BSA,PBS/0.5%明胶,Bartel BiraTransTM培养基,EMEM,PBS,EMEM/1%BSA,磷酸蔗糖,TrypticaseTM大豆肉汤(有或没有0.5%明胶或0.5%BSA),改进的Stuart’s培养基,牛肉浸液肉汤(有或没有0.5%BSA),以及盐水。
4.2.3.2示例性的RNA制备
靶RNA可以通过任意适当的方法制备。总RNA可以通过任意方法分离,包括,但不限于,Wilkinson,M.(1988)Nucl.Acids Res.16(22):10,933;和Wilkinson,M.(1988)Nucl.Acids Res.16(22):10934中所述方案,或通过使用可商购试剂盒或试剂,如试剂(Invitrogen),总RNA提取试剂盒(iNtRON Biotechnology),总RNA纯化试剂盒(NorgenBiotek Corp.),RNAqueousTM(Ambion),MagMAXTM(Ambion),RecoverAllTM(Ambion),RNAeasy(Qiagen)等分离。
在一些实施方案中,在RNA未首先从细胞中纯化的样品中测量RNA水平。在一些这样的实施方案中,将细胞进行裂解步骤以释放RNA。非限制性示例性裂解方法包括超声(例如,2-15秒,在36kHz 8-18μm);化学裂解,例如,使用去污剂;以及各种可商购裂解试剂(如RNAeasy裂解缓冲液,Qiagen)。在一些实施方案中,在其中分离了RNA的样品中测量RNA水平。
在一些实施方案中,在检测靶RNA之前修饰RNA。在一些实施方案中,样品中的所有RNA都被修饰。在一些实施方案中,仅要分析的特定靶RNA,例如,以序列-特异性方式被修饰。在一些实施方案中,将RNA逆转录。在一些这样的实施方案中,使用MMLV逆转录酶将RNA逆转录。使用MMLV逆转录酶逆转录RNA的非限制性示例性条件包括在40℃至50℃孵育5至20分钟。
当将靶RNA逆转录时,形成靶RNA的DNA互补物。在一些实施方案中,检测靶RNA的互补物而不是靶RNA本身(或RNA本身的DNA拷贝)。因此,当本文中讨论的方法表明检测到靶RNA,或确定了靶RNA的水平时,该检测或确定可以在靶RNA的互补物上进行,而不是靶RNA本身(或除了RNA本身之外)。在一些实施方案中,当检测靶RNA的互补物而不是靶RNA时,使用用于检测的多核苷酸,其与靶RNA的互补物互补。在一些这样的实施方案中,用于检测的多核苷酸包含与靶RNA序列上相同的至少一部分,尽管其可以含有胸腺嘧啶来替代尿嘧啶,和/或包含其他修饰的核苷酸。
4.2.4示例性的分析方法
如上文所述的,提供检测流感,并且任选地,检测呼吸道合胞病毒(RSV)的方法。所述方法包括检测来自受试者的样品中存在甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因和/或酸性聚合酶(PA)基因。在一些实施方案中,所述方法还包括检测选自甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,乙型流感非结构蛋白(NS)基因,RSV A基因组,或RSV B基因组,并且任选地,至少一种外源性对照(如SPC)中的一种以上另外的靶基因。在一些实施方案中,检测到选自甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因,酸性聚合酶(PA)基因,甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,和乙型流感非结构蛋白(NS)基因的一种以上基因表明存在流感,即使在测定中未检测到内源性对照和/或外源性对照。在一些实施方案中,检测到RSV A或RSV B表明存在RSV,即使在测定中未检测到内源性对照和/或外源性对照。在一些实施方案中,如果未检测到任一种流感靶基因(如甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因,酸性聚合酶(PA)基因,甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,和乙型流感非结构蛋白(NS)基因),只有如果检测到对照,才认为对于流感是阴性的。
能够允许特异检测靶基因的任何分析步骤可以用于本文提供的方法中。示例性的非限制性分析步骤包括,但不限于,核酸扩增方法,PCR方法,等温扩增方法,和本领域技术人员已知的其他分析检测方法。
在一些实施方案中,检测靶基因,如甲型流感1基质蛋白(MP)基因或甲型流感2基质蛋白(MP)基因的方法,包括扩增基因和/或其互补物。这样的扩增可以通过任何方法实现。示例性的方法包括,但不限于,等温扩增,实时RT-PCR,终点RT-PCR,以及使用T7聚合酶从与DNA退火的T7启动子扩增,如由可在Implen,德国获得的SenseAmp PlusTM试剂盒提供。
当扩增靶基因时,在一些实施方案中,形成靶基因的扩增子。扩增子可以是单链或双链。在一些实施方案中,当扩增子为单链时,扩增子的序列在正义或反义方向上与靶基因相关。在一些实施方案中,检测靶基因的扩增子而不是靶基因本身。因此,当本文中讨论的方法表明检测靶基因时,该检测可以在靶基因的扩增子(而不是靶基因本身,或除了靶基因本身之外)上进行。在一些实施方案中,当检测靶基因的扩增子而不是靶基因时,使用用于检测的多核苷酸,其与靶基因的互补物互补。在一些实施方案中,当检测靶基因的扩增子而不是靶基因时,使用用于检测的多核苷酸,其与靶基因互补。此外,在一些实施方案中,可以使用用于检测的多重多核苷酸,并且一些多核苷酸可以与靶基因互补并且一些多核苷酸可以与靶基因的互补物互补。
在一些实施方案中,检测靶基因,如甲型流感1基质蛋白(MP)基因或甲型流感2基质蛋白(MP)基因的方法,包括PCR,如下文所述的。在一些实施方案中,检测一种以上靶基因包括实时监视PCR反应,其可以通过任意方法实现。所述方法包括,但不限于,使用分子信标,或Scorpion探针(即,能量转移(ET)探针,如FRET探针)和使用嵌入染料,如SYBR绿,EvaGreen,噻唑橙,YO-PRO,TO-PRO等。
扩增从靶RNA逆转录的cDNA的非限制性示例性条件如下。示例性的循环包括最初在90℃至100℃变性20秒至5分钟,接着循环,所述循环包括在90℃至100℃变性1至10秒,接着在60℃至75℃退火并扩增10至40秒。进一步的示例性的循环包括在94℃20秒,接着在95℃的1秒,在62℃35秒的3个循环,在95℃的1秒,在62℃20秒的20个循环,和在95℃的1秒,在62℃35秒的14个循环。在一些实施方案中,对于初始变性步骤后的第一个循环,省略循环变性步骤。在一些实施方案中,Taq聚合酶用于扩增。在一些实施方案中,循环进行至少10次,至少15次,至少20次,至少25次,至少30次,至少35次,至少40次,或至少45次。在一些实施方案中,使用具有热启动功能的Taq。在一些实施方案中,扩增反应在筒中发生,并且靶基因和外源性对照的扩增在同一个反应中发生。在一些实施方案中,靶基因的检测从初始变性到最后延伸在少于3小时,少于2.5小时,少于2小时,少于1小时,或少于30分钟内发生。
在一些实施方案中,靶基因的检测包括形成包含与靶基因或其互补物互补的多核苷酸,和选自靶基因、靶基因的DNA扩增子和靶基因的互补物的核酸的复合体。因此,在一些实施方案中,多核苷酸形成与靶基因的复合体。在一些实施方案中,多核苷酸与靶RNA的互补物(如从靶RNA逆转录的cDNA)形成复合体。在一些实施方案中,多核苷酸与靶基因的DNA扩增子形成复合体。当双链DNA扩增子是如本文中使用的复合体的一部分时,复合体可以包含DNA扩增子的一条或两条链。因此,在一些实施方案中,复合体仅包含DNA扩增子的一条链。在一些实施方案中,复合体是三链体,并且包含所述多核苷酸和DNA扩增子的两条链。在一些实施方案中,通过多核苷酸和靶基因,靶基因的互补物,或靶基因的DNA扩增子之间的杂交,形成复合体。多核苷酸,在一些实施方案中,是引物或探针。
在一些实施方案中,方法包括检测复合体。在一些实施方案中,复合体在检测时不必须关联。即,在一些实施方案中,形成复合体,随后复合体以某种方式解离或破坏,并且检测来自复合体的成分。这样的系统的实例是测定。在一些实施方案中,当多核苷酸是引物时,复合体的检测可以包括扩增靶基因,靶基因的互补物,或靶基因的DNA扩增子。
在一些实施方案中,本文所述方法中用于检测至少一种靶基因的分析方法包括实时定量PCR。在一些实施方案中,用于检测至少一种靶基因的分析方法包括使用探针。测定使用能量转移(“ET”),如荧光共振能量转移(“FRET”),来检测和定量合成的PCR产物。通常探针包含连接于5’-端的荧光染料分子和连接于3’-端的猝灭剂分子,从而该染料和猝灭剂紧邻,使得猝灭剂通过FRET抑制染料的荧光信号。当聚合酶复制探针结合的嵌合扩增子模板时,聚合酶的5’-核酸酶切割探针,使染料与猝灭剂解偶联,从而检测到染料的信号(如荧光)。信号(如荧光)随每次PCR循环与切割的探针的量成比例增加。
在一些实施方案中,如果在PCR循环中从TaqMan探针产生任何信号,则认为检测到靶基因。例如,在一些实施方案中,如果PCR包括40个循环,如果在扩增过程中在任意循环产生信号,则认为存在和检测到靶基因。在一些实施方案中,如果在PCR循环的最后没有产生信号,则认为不存在以及未检测到靶基因。
在一些实施方案中,实时PCR测定结果的定量通过从已知浓度的核酸构建标准曲线并且然后推算未知浓度的靶基因的定量信息来进行。在一些实施方案中,用于产生标准曲线的核酸是DNA(例如,内源性对照,或外源性对照)。在一些实施方案中,用于产生标准曲线的核酸是体外产生的纯化的双链质粒DNA或单链DNA。
在一些实施方案中,为了测定以表明样品中不存在流感,用于内源性对照(如SAC)和/或外源性对照(如SPC)的Ct值必需在之前确定的有效范围内。即,在一些实施方案中,不能确认不存在流感,除非检测到对照,其表明测定成功。在一些实施方案中,该测定包括外源性对照。Ct值与样品中核酸靶标的量成反比。
在一些实施方案中,之前确定对于靶基因(包括内源性对照和/或外源性对照)的阈值Ct(或“截取值Ct”)值(低于它,认为检测到基因)。在一些实施方案中,使用基本上相同的测定条件和在其上将测试样品的系统(如)来确定阈值Ct。
除了测定,用于在本文中所述的方法中检测和定量PCR产物的其他实时PCR化学包括,但不限于,分子信标,Scorpion探针和嵌入染料,如SYBR Green,EvaGreen,噻唑橙,YO-PRO,TO-PRO等,其在下文讨论。
在各种实施方案中,实时PCR检测在单个多重反应中用于检测流感靶基因,并且任选地,一种以上RSV靶基因,内源性对照,和外源性对照。在一些多重实施方案中,使用多种探针,如探针,其各自对不同靶标特异。在一些实施方案中,每种靶基因特异性探针与用于同一个多重反应的其他探针可在光谱上区分。非限制性示例性七色多重系统例如,在Lee等人,BioTechniques,27:342-349中描述。
在一些实施方案中,实时RT PCR产物的定量使用结合双链DNA产物的染料(如SYBRGreen,EvaGreen,噻唑橙,YO-PRO,TO-PRO等)完成。在一些实施方案中,测定是来自Qiagen的QuantiTect SYBR Green PCR测定。在该测定中,首先从样品分离总RNA。然后将总RNA在3’-端多腺苷酸化并且使用在5’-端具有多聚-dT的通用引物逆转录。在一些实施方案中,单次逆转录反应足以测定多个靶RNAs。然后使用靶RNA-特异性引物和miScript Universal引物(其在5’-端包含多聚-dT序列)完成实时RT-PCR。SYBR Green染料非特异性地结合双链DNA并且在激发时发光。在一些实施方案中,促进引物与PCR模板(例如,可从来自Qiagen的QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒中获得)的高特异性退火的缓冲条件可以用于避免将结合SYBR Green并且消极影响定量的非特异性DNA双链体和引物二聚体的形成。因此,作为PCR产物积累,来自SYBR Green的信号增加,允许定量特异性产物。
使用本领域可获得的任何PCR仪器进行实时PCR。通常,用于实时PCR数据收集和分析的仪器包括热循环仪,用于荧光激发和发射收集的光学器件,以及任选地计算机和数据获得和分析软件。
在一些实施方案中,使用结合双链DNA产物的染料(如SYBR Green,EvaGreen,噻唑橙,YO-PRO,TO-PRO等)完成实时PCR产物的检测和/或定量。在一些实施方案中,用于本文中所述方法的分析方法是(DNA-介导的退火、选择、延伸和连接)测定。在一些实施方案中,通过任意方法从要分析的样品中分离总RNA。然后可以将总RNA多腺苷酸化(在反应混合物中将>18个A残基加入至RNA的3’-端)。使用生物素-标记的DNA引物逆转录RNA,所述引物从5’到3’端包含包括PCR引物位点和结合样品RNA的多聚-dA尾的多聚-dT区域的序列。然后将得到的生物素化的cDNA转录本通过生物素-链霉亲和素相互作用与固体支持物杂交并且与一种以上靶RNA-特异性多核苷酸接触。靶RNA-特异性多核苷酸从5’-端到3’-端包含以下各项:包含PCR引物位点的区域,包含地址序列的区域和靶RNA-特异性序列。
在一些实施方案中,靶RNA-特异性序列包含具有与靶RNA、内源性对照RNA、或外源性对照RNA的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19个连续核苷酸相同或互补的序列的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19个连续核苷酸。
杂交后,将靶RNA-特异性多核苷酸延伸,并且然后将延伸的产物从固定化的cDNA阵列洗脱。使用荧光-标记的通用引物的第二PCR反应产生包含靶RNA-特异性序列的荧光-标记的DNA。然后将标记的PCR产物与用于检测和定量的微珠阵列杂交。
在一些实施方案中,在本文中所述方法中用于检测和定量靶基因的分析方法是基于珠子的流式细胞术测定。参见Lu J.等人(2005)Nature435:834-838,其通过参考以其整体并入本文。基于珠子的流式细胞术测定的实例是Luminex,Inc.的技术。参见www.luminexcorp.com/technology/index.html。在一些实施方案中,从样品分离总RNA并且随后用生物素标记。然后将标记的RNA与共价结合于微珠的靶RNA-特异性捕获探针(例如,由Luminex,Inc.在www.luminexcorp.com/products/assays/index.html出售的FlexmiRTM产品)杂交,每种所述捕获探针标记有具有不同荧光强度的2种染料。链霉亲和素-结合的报告分子(例如,链霉亲和素-藻红蛋白,也称为“SAPE”)连接于捕获的靶RNA并且每种珠子的独特信号使用流式细胞术读取。在一些实施方案中,首先将RNA样品多腺苷酸化,并且随后使用与样品RNA的多聚-dA尾的3’-端以及与连接于生物素化的树枝状聚合物的多核苷酸的5’-端互补的桥接多核苷酸,用生物素化的3DNATM树枝状聚合物(即,其上结合有多个生物素分子的多臂DNA)标记。然后将链霉亲和素-结合的报告分子连接生物素化的树枝状聚合物,之后通过流式细胞术分析。在一些实施方案中,首先将生物素-标记的RNA暴露于SAPE,并且随后将RNA/SAPE复合体暴露于连接于DNA树枝状聚合物(其可以结合多至900个生物素分子)的抗-藻红蛋白抗体。这使得多个SAPE分子通过生物素-链霉亲和素相互作用结合生物素化的树枝状聚合物,因此增加来自测定的信号。
在一些实施方案中,在本文中所述方法中用于检测和定量至少一种靶基因的水平的分析方法是通过凝胶电泳和利用标记的探针(例如,用放射性或化学发光标签标记的探针),如通过RNA印迹检测进行。在一些实施方案中,从样分离品总RNA,并且然后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按尺寸分离。然后将分离的RNA印迹在膜上并且与放射标记的互补探针杂交。在一些实施方案中,示例性的探针含有一种以上如下文讨论的亲和力增强的核苷酸类似物,如锁定核酸(“LNA”)类似物,其含有双环糖部分,替代脱氧核糖或核糖。参见例如,Várallyay,E.等人(2008)Nature Protocols 3(2):190-196,其通过参考以其整体并入本文。
在一些实施方案中,一种以上靶基因的检测和定量使用微流体装置和单分子检测实现。在一些实施方案中,分离的总RNA样品中的靶RNA与两种探针杂交,其中一种与靶RNA的5’-端的核酸互补并且第二种与靶RNA的3’-端互补。在一些实施方案中,每种探针包含一种以上亲和力-增强的核苷酸类似物,如LNA核苷酸类似物并且各自用具有不同荧光发射谱的不同荧光染料(即,在检测上相区分的染料)标记。然后将样品流过微流体毛细管,在其中多种激光激发荧光探针,从而光子的独特重合爆裂鉴别特定靶RNA,并且可以计数特定的光子独特重合爆裂数以定量样品中靶RNA的量。在一些备选实施方案中,靶RNA-特异性探针可以用选自,例如,荧光团、电子自旋标记等的3种以上不同标签标记,并且然后与RNA样品杂交。
任选地,在杂交前修饰样品RNA。然后将靶RNA/探针双链体通过微流体装置的通道,所述通道包含记录3种标记的独特信号的检测器。以这种方式,通过其独特的信号检测个体分子并计数。参见Fuchs等人,U.S.Genomics,Inc.的美国专利号7,402,422和7,351,538,其各自通过参考以其整体并入本文。
4.2.5示例性的自动化和系统
利用GeneXpert系统对本发明描述。示例性的样品制备和分析方法在下文描述。然而,本发明不限于特定检测方法或分析平台。本领域技术人员认识到可以利用任意数量的平台和方法。
利用自包含的,单用途筒(cartridge)。样品提取、扩增和检测可以全部在该自包含的“筒中实验室”内进行(参见例如,美国专利5,958,349,6,403,037,6,440,725,6,783,736,6,818,185;其各自通过参考以其整体在本文中结合)。
筒的组件包括,但不限于,含有试剂的处理室,过滤器,和用于提取、纯化和扩增靶核酸的捕获技术。阀使得流体能够在室之间转移并且含有核酸裂解和过滤组件。光学窗口使得能够实时光学检测。反应管使得能够非常快速地热循环。
将样品加入至筒中后,将样品与裂解缓冲液接触并且释放的DNA结合于DNA-结合基质如二氧化硅或玻璃基质。然后将样品上清移除并且将DNA在洗脱缓冲液如Tris/EDTA缓冲液中洗脱。然后可以将洗脱物在筒中处理以检测如本文所述的靶基因。在一些实施方案中,使用洗脱物重构以冻干的颗粒存在于筒中的至少一些PCR试剂。
在一些实施方案中,RT-PCR用于扩增和分析靶基因的存在。在一些实施方案中,逆转录使用MMLV逆转录酶并且在40℃至50℃孵育5至20分钟。在一些实施方案中,PCR使用具有热启动功能的Taq聚合酶,如AptaTaq(Roche)。在一些实施方案中,初始变性在90℃至100℃20秒至5分钟;循环变性温度是90℃至100℃1至10秒;循环退火和扩增温度是60℃至75℃10至40秒;并且进行多至50个循环。
在一些实施方案中,双变性方法用于扩增低拷贝数靶标。在一些实施方案中,双变性方法包括,第一变性步骤,接着加入用于检测靶基因的引物和/或探针。然后将所有或大部分含DNA的样品(如DNA洗脱物)第二次变性,之后,在某些情况下,将一部分样品等分,用于循环和检测靶基因。不希望受任何特定理论限制,双变性方案可以增加低拷贝数靶基因(或其互补物)将存在于选择用于循环和检测的等分部分中的机会,因为在选择等分部分用于循环之前,第二次变性有效使靶标数翻倍(即,其将靶标和其互补物分为两个模板)。在一些实施方案中,第一变性步骤包括加热至90℃至100℃的温度达30秒至5分钟的总时间。在一些实施方案中,第二变性步骤包括加热至90℃至100℃的温度达5秒至3分钟的总时间。在一些实施方案中,第一变性步骤和/或第二变性步骤通过分开加热样品的等分部分来进行。在一些实施方案中,每个等分部分可以加热如上文所列次数。作为非限制性实例,用于含DNA样品(如DNA洗脱物)的第一变性步骤可以包括将样品的至少一个,至少两个,至少三个,或至少四个等分部分各自(顺序或同时)分开加热至90℃至100℃的温度达60秒。作为非限制性实例,含有酶、引物和探针的含DNA样品(如DNA洗脱物)的第二变性步骤可以包含将洗脱物的至少一个,至少两个,至少三个,或至少四个等分部分各自分开(顺序或同时)加热至90℃至100℃的温度达5秒。在一些实施方案中,等分部分是整个含DNA的样品(如DNA洗脱物)。在一些实施方案中,等分部分少于整个含DNA的样品(如DNA洗脱物)。
在一些实施方案中,使用以下方案检测含DNA的样品,如DNA洗脱物中的靶基因:将含DNA的样品的一个以上等分部分各自分开加热至95℃达60秒。将酶和引物以及探针加入至含DNA的样品中并且将一个以上等分部分各自分开加热至95℃达5秒。然后将含有酶、引物和探针的含DNA的样品的至少一个等分部分加热至94℃达60秒。然后利用以下2-步骤循环将等分部分循环45次:(1)94℃5秒,(2)66℃30秒。
本发明不限于特定引物和/或探针序列。示例性的扩增引物和检测探针在实施例中描述。
在一些实施方案中,使用离线离心,例如,利用具有低细胞含量的样品。将样品(添加或不添加缓冲液)离心并且将上清去除。然后将沉淀重悬在更小体积的上清液或缓冲液中。然后如本文所述的分析重悬的沉淀。
4.2.6示例性的数据分析
在一些实施方案中,如果流感靶基因(如PA,PB2,MP,或NS)中的任一个的Ct值低于某阈值,则检测到流感的存在。在一些实施方案中,Ct值的有效范围是12至39.9Ct。在一些这样的实施方案中,如果在40个循环后未观察到来自流感-特异性引物的超过背景的扩增,则认为样品是流感阴性的。在一些这样的实施方案中,如果仅外源性对照(SPC)的扩增超过背景,则认为样品是流感阴性的。
在一些实施方案中,基于计算机的分析程序用于将由检测测定产生的原始数据翻译为临床医生的预测值数据。临床医生可以使用任何适当的方式获取预测数据。因此,在一些实施方案中,本发明提供进一步的这样的益处:临床医生(他可能没有经过遗传学或分子生物学的培训)不需要理解原始数据。数据以其最有用的形式直接提供给临床医生。然后临床医生能够立即利用该信息,从而优化对受试者的护理。
本发明考虑能够向和从进行测定、信息提供的实验室,医学个体和受试者接收、处理和传递信息的任何方法。例如,在本发明的一些实施方案中,样品(例如,活检或血清或尿液样品)获自受试者并且提供给分析服务商(例如,在医疗设施处的临床实验室、基因组分析业务等)(位于世界上任何部分(例如,不同于受试者所在的或信息最终使用的国家的国家))以产生原始数据。在样品包含组织或其他生物样品的情况下,受试者可以访问医学中心以获得样品并且发送至分析中心,或受试者可以自己收集样品(例如,尿样品或痰样品)并且直接将其发送至分析中心。在样品包含之前确定的生物信息的情况下,可以由受试者将信息直接发送至分析服务商(例如,含有信息的信息卡可以由计算机扫描并且使用电子通讯系统将数据传送至分析中心的计算机)。一旦分析中心接收到,将样品进行处理并且产生对受试者所需的诊断或预后信息而言具体的分析结果(即,表达数据)。
然后将分析数据以适于由治疗临床医生解释的形式制备。例如,不是提供原始表达数据,而是制备的形式可以代表对受试者的诊断或风险评估(例如,存在流感)(在有或没有对特定治疗选择的建议的情况下)。数据可以由临床医生通过任何合适的方法展示。例如,在一些实施方案中,分析服务商产生可以为临床医生(例如,在护理点)打印的或在计算机监视器上展示给临床医生的报告。
在一些实施方案中,首先在护理点或在区域设施处分析信息。然后将原始数据发送至中央处理设施用于进一步分析和/或将原始数据转变为临床医生或患者可用的信息。中央处理设施提供数据分析的私密性(所有数据储存在具有规格一致的安全性方案的中央设施中)、速度和一致性的优势。然后中央处理设施可以控制治疗受试者后数据的命运。例如,使用电子通讯系统,中央设施可以将数据提供给临床医生、受试者,或研究人员。
在一些实施方案中,受试者能够使用电子通讯系统直接获得数据。可以基于结果选择受试者以进一步干预或咨询。在一些实施方案中,数据用于研究使用。例如,数据可以用于进一步优化标志物(作为特定病况或疾病阶段的有用指征或作为确定作用的治疗过程的伴随诊断剂)的包括或排除。
4.2.7示例性的多核苷酸
在一些实施方案中,提供多核苷酸。在一些实施方案中,提供合成的多核苷酸。如本文中使用的合成的多核苷酸是指体外化学或酶合成的多核苷酸。多核苷酸的化学合成包括,但不限于,使用多核苷酸合成仪,如OligoPilot(GE Healthcare),ABI 3900DNA合成仪(Applied Biosystems)等合成。酶合成包括,但不限于,通过酶法扩增,例如,PCR,产生多核苷酸。多核苷酸可以包含本文中讨论的一种以上核苷酸类似物(即,修饰的核苷酸)。
在一些实施方案中,提供多核苷酸,其包含与甲型流感酸性聚合酶(PA)基因的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补的区域。在一些实施方案中,提供多核苷酸,其包含与甲型流感酸性聚合酶(PA)基因的6至100,8至100,8至75,8至50,8至40,或8至30个连续核苷酸跨度至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域。非限制性示例性多核苷酸示在表A中。
在一些实施方案中,提供多核苷酸,其包含与甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补的区域。在一些实施方案中,提供多核苷酸,其包含与甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因的6至100,8至100,8至75,8至50,8至40,或8至30连续核苷酸的跨度至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域。非限制性示例性多核苷酸示在表A中。
在一些实施方案中,提供多核苷酸,其包含与甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,乙型流感非结构蛋白(NS)基因,RSVA基因组,或RSV B基因组的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补的区域。在一些实施方案中,提供多核苷酸,其包含与甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,乙型流感非结构蛋白(NS)基因,RSV A基因组,或RSV B基因组的6至100,8至100,8至75,8至50,8至40,或8至30个连续核苷酸的跨度至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域。非限制性示例性多核苷酸示在表B中。
在各种实施方案中,多核苷酸包含少于500,少于300,少于200,少于150,少于100,少于75,少于50,少于40,或少于30个核苷酸。在各种实施方案中,多核苷酸是6至200,8至200,8至150,8至100,8至75,8至50,8至40,8至30,15至100,15至75,15至50,15至40,或15至30个核苷酸长。
在一些实施方案中,多核苷酸是引物。在一些实施方案中,引物用可检测部分标记。在一些实施方案中,引物未标记。引物,如本文中使用的,能够选择性地与靶RNA或与从靶RNA逆转录的cDNA或与从靶RNA或cDNA扩增的扩增子(统称为“模板”)杂交的多核苷酸,并且,在模板的存在下,聚合酶和适当的缓冲液和试剂,可以从引物延伸产物延伸。
在一些实施方案中,多核苷酸是探针。在一些实施方案中,探针用可检测部分标记。可检测部分,如本文中使用的,包括直接可检测部分,如荧光染料,以及间接可检测部分,如结合对的成员。在一些实施方案中,当可检测部分是结合对的成员时,可以通过将探针与结合于结合对的第二成员的可检测标记孵育来检测探针。在一些实施方案中,探针是未标记的,如当探针是捕获探针,例如,在微阵列或珠子上时。在一些实施方案中,探针是不可延伸的(例如,通过聚合酶)。在其他实施方案中,探针可延伸。
在一些实施方案中,多核苷酸是在一些实施方案中在5’-端用荧光染料(供体)标记并且在3’-端用猝灭剂(受体)标记的FRET探针,所述猝灭剂是一种当基团紧邻(即,连接于同一探针)时吸收(即,抑制)从染料发出的荧光的化学基团。因此,在一些实施方案中,染料的发射谱应该与猝灭剂的吸收谱相当大地重叠。在其他实施方案中,染料和猝灭剂不在FRET探针的末端。
4.2.7.1示例性的多核苷酸修饰
在一些实施方案中,本文所述的检测至少一种靶基因的方法利用一种以上修饰的多核苷酸,如包含一种以上亲和力-增强的核苷酸类似物的多核苷酸。用于本文中所述方法的修饰的多核苷酸包括用于逆转录的引物,PCR扩增引物和探针。在一些实施方案中,与仅含有脱氧核糖核苷酸的多核苷酸相比,亲和力-增强的核苷酸的掺入增加多核苷酸对其靶核酸的结合亲和力和特异性,并且允许使用更短的多核苷酸或多核苷酸和靶核酸之间的更短的互补性区域。
在一些实施方案中,亲和力-增强的核苷酸类似物包括包含一种以上碱基修饰,糖修饰和/或骨架修饰的核苷酸。
在一些实施方案中,用于亲和力-增强的核苷酸类似物的修饰的碱基包括5-甲基胞嘧啶,异胞嘧啶,假异胞嘧啶,5-溴尿嘧啶,5-丙炔基尿嘧啶,6-氨基嘌呤,2-氨基嘌呤,次黄苷,二氨基嘌呤,2-氯-6-氨基嘌呤,黄嘌呤和次黄嘌呤。
在一些实施方案中,亲和力-增强的核苷酸类似物包括具有修饰的糖如2’-取代的糖的核苷酸,如2’-O-烷基-核糖糖类,2’-氨基-脱氧核糖糖类,2’-氟-脱氧核糖糖类,2’-氟-阿拉伯糖糖类,和2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’MOE)糖类。在一些实施方案中,修饰的糖是阿拉伯糖糖类,或d-阿拉伯-己糖醇糖。
在一些实施方案中,亲和力-增强的核苷酸类似物包括骨架修饰如肽核酸(PNA;例如,包括通过氨基酸骨架连接在一起的核碱基的寡聚物)的使用。其他骨架修饰包括硫代磷酸酯连接,磷酸二酯修饰的核酸,磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合,膦酸甲酯,膦酸烷基酯,磷酸酯,硫代膦酸烷基酯,磷酰胺,氨基甲酸酯,碳酸酯,磷酸三酯,乙酰胺,羧甲基酯,硫代磷酸甲酯,二硫代磷酸酯,p-乙氧基和它们的组合。
在一些实施方案中,多核苷酸包括至少一种具有修饰的碱基的亲和力-增强的核苷酸类似物,至少具有修饰的糖和/或至少一种非天然存在的核苷酸间连接的核苷酸(其可以是同一核苷酸)。
在一些实施方案中,亲和力-增强的核苷酸类似物含有锁定的核酸(“LNA”)糖,其是双环糖。在一些实施方案中,用于本文中所述方法的多核苷酸包含一种以上具有LNA糖的核苷酸。在一些实施方案中,多核苷酸含有一个以上由具有LNA糖的核苷酸组成的区域。在其他实施方案中,多核苷酸含有具有散布有脱氧核糖核苷酸的LNA糖的核苷酸。参见,例如,Frieden,M.等人(2008)Curr.Pharm.Des.14(11):1138-1142。
4.2.7.2示例性的引物
在一些实施方案中,提供引物。在一些实施方案中,引物与甲型流感酸性聚合酶(PA)基因的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补。在一些实施方案中,提供引物,其包含与甲型流感酸性聚合酶(PA)基因的6至100,8至100,8至75,8至50,8至40,或8至30个连续核苷酸的跨度至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域。非限制性示例性引物示在表A中。在一些实施方案中,引物还可以包含与靶基因不相同或不互补的部分或区域。在一些实施方案中,与靶基因至少90%,至少95%,或100%相同或互补的引物的区域是相邻的,从而引物的与靶基因不相同或不互补的任何区域不破坏所述相同或互补的区域。
在一些实施方案中,提供引物。在一些实施方案中,引物与甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补。在一些实施方案中,提供引物,其包含与甲型流感碱性聚合酶2(PB2)基因的6至100,8至100,8至75,8至50,8至40,或8至30个连续核苷酸的跨度至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域。非限制性示例性引物示在表A中。在一些实施方案中,引物还可以包含与靶基因不相同或不互补的部分或区域。在一些实施方案中,引物的与靶基因至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域是相邻的,从而引物的与靶基因不相同或不互补的区域不破坏所述相同或互补区域。
在一些实施方案中,提供引物。在一些实施方案中,引物与甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,乙型流感非结构蛋白(NS)基因,RSV A基因组,或RSV B基因组的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补。在一些实施方案中,提供引物,其包含与甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,乙型流感非结构蛋白(NS)基因,RSV A基因组,或RSV B基因组的6至100,8至100,8至75,8至50,8至40,或8至30个连续核苷酸的跨度至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域。非限制性示例性引物示在表B中。在一些实施方案中,引物还可以包含与靶基因不相同或不互补的部分或区域。在一些实施方案中,引物的与靶基因至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域是相邻的,从而引物的与靶基因不相同或不互补的区域不破坏所述相同或互补区域。
在一些实施方案中,引物包含与靶基因的区域至少90%,至少95%,或100%相同的部分。在一些这样的实施方案中,包含与靶基因的区域至少90%,至少95%,或100%相同的区域的引物能够选择性地与从RNA逆转录的cDNA,或与通过扩增靶基因产生的扩增子杂交。在一些实施方案中,引物与cDNA或扩增子的足够部分互补,从而其在使用的特定测定条件下选择性地与cDNA或扩增子杂交。
如本文中使用的,“选择性地杂交”意为,与其存在于相同样品中的、在杂交区域具有不同核苷酸序列的另一核酸杂交相比,多核苷酸如引物或探针将以至少5-倍大的亲和力与样品中的特定核酸杂交。示例性的杂交条件在本文中讨论,例如,在逆转录反应或PCR扩增反应的情况下。在一些实施方案中,与其与存在于相同样品中的、在杂交区域中具有不同核苷酸序列的另一核酸杂交相比,多核苷酸将以至少10-倍大的亲和力与样品中的特定核酸杂交。
在一些实施方案中,引物用于逆转录靶RNA,例如,如本文中讨论的。在一些实施方案中,引物用于扩增靶RNA或从其逆转录的cDNA。在一些实施方案中,该扩增是定量PCR,例如,如本文中讨论的。
在一些实施方案中,引物包含可检测部分。
在一些实施方案中,提供引物对。设计所述引物对以扩增靶基因,如甲型流感PA基因,甲型流感PB2基因,甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2基质蛋白(MP)基因,甲型流感3血凝素(HA)基因,乙型流感非结构蛋白(NS)基因,RSV A基因组,或RSV B基因组,或内源性对照(如样品充足性对照(SAC)),或外源性对照(如样品处理对照(SPC))的一部分。在一些实施方案中,设计引物对以产生扩增子,所述扩增子为50至1500个核苷酸长,50至1000个核苷酸长,50至750个核苷酸长,50至500个核苷酸长,50至400个核苷酸长,50至300个核苷酸长,50至200个核苷酸长,50至150个核苷酸长,100至300个核苷酸长,100至200个核苷酸长,或100至150个核苷酸长。非限制性示例性引物对示在表A和B中。
4.2.7.3示例性的探针
在各种实施方案中,检测流感,并且任选地,RSV的存在的方法包括将样品的核酸与探针杂交。在一些实施方案中,探针包含与靶基因,如甲型流感PA基因或甲型流感PB2基因,或内源性对照(如样品充足性对照(SAC)),或外源性对照(如样品处理对照(SPC))互补的部分。在一些实施方案中,探针包含与靶基因的区域至少90%,至少95%,或100%相同的部分。在一些这样的实施方案中,与靶基因至少90%,至少95%,或100%互补的探针与靶基因的足够部分互补,从而其在使用的特定测定条件下选择性地与靶基因杂交。在一些实施方案中,与靶基因互补的探针包含与靶基因的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的区域。非限制性示例性探针示在表A和B中。与靶基因至少90%,至少95%,或100%互补的探针还可以包含与靶基因不互补的部分或区域。在一些实施方案中,探针的与靶基因至少90%,至少95%,或100%互补的区域是相邻的,从而探针的与靶基因不互补的任何区域不破坏互补区域。
在一些实施方案中,探针包含与靶基因的区域,或内源性对照(如样品充足性对照(SAC)),或外源性对照(如样品处理对照(SPC))至少90%,至少95%,或100%相同的部分。在一些这样的实施方案中,包含与靶基因的区域至少90%,至少95%,或100%相同的区域的探针能够选择性与从靶基因逆转录的cDNA或与通过扩增靶基因产生的扩增子杂交。在一些实施方案中,探针与cDNA或扩增子的足够部分至少90%,至少95%,或100%互补,从而其在使用的特定测定条件下选择性地与cDNA或扩增子杂交。在一些实施方案中,与cDNA或扩增子互补的探针包含与cDNA或扩增子的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,至少25,至少26,至少27,至少28,至少29,或至少30个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%互补的区域。与cDNA或扩增子至少90%,至少95%,或100%互补的探针还可以包含与cDNA或扩增子不互补的部分或区域。在一些实施方案中,探针的与cDNA或扩增子至少90%,至少95%,或100%互补的区域是相邻的,从而探针的与cDNA或扩增子不互补的任何区域不破坏互补区域。
在一些实施方案中,检测一种以上靶基因的方法包括:(a)逆转录靶RNA以产生与靶RNA互补的cDNA;(b)从(a)扩增cDNA;和(c)使用实时RT-PCR和检测探针(其可以与扩增步骤(b)同时)检测靶RNA的量。
如上文所述的,在一些实施方案中,实时RT-PCR检测可以使用FRET探针进行,其包括,但不限于,探针,分子信标探针和Scorpion探针。在一些实施方案中,利用探针进行实时RT-PCR检测,所述探针即通常具有在DNA的一个末端共价结合的荧光染料和其他处(如在DNA的另一末端)共价结合猝灭剂分子的线性探针。FRET探针包含与cDNA或扩增子的区域互补的序列,从而,当FRET探针与cDNA或扩增子杂交时,染料荧光被猝灭,并且当探针在cDNA或扩增子的扩增期间被消化时,染料从探针释放并且产生荧光信号。在一些实施方案中,样品中靶基因的量与扩增期间测量的荧光的量成比例。
探针通常包含具有与靶基因或从靶RNA模板逆转录的其互补cDNA的区域至少90%,至少95%,或100%相同或互补的序列的连续核苷酸区域(即,探针区域的序列与要检测的靶RNA互补或相同存在于要检测的靶RNA中),从而探针可与靶基因的区域的PCR扩增子选择性杂交。在一些实施方案中,探针包含具有与从靶基因逆转录的cDNA的区域完全互补或相同存在于从靶基因逆转录的cDNA的区域中的序列的至少6个连续核苷酸的区域。在一些实施方案中,探针包含与具有与从要检测的靶基因逆转录的cDNA的区域互补或相同存在于从要检测的靶基因逆转录的cDNA的区域中的序列的至少8个连续核苷酸,至少10个连续核苷酸,至少12个连续核苷酸,至少14个连续核苷酸,或至少16个连续核苷酸至少90%,至少95%,或100%相同或互补的区域。
在一些实施方案中,具有与探针序列至少90%,至少95%,或100%互补的序列的扩增子区域在扩增子分子的中心或附近。在一些实施方案中,在互补性区域的5’-端和3’-端独立地存在扩增子的至少2个核苷酸,如至少3个核苷酸,如至少4个核苷酸,如至少5个核苷酸。
在一些实施方案中,分子信标可以用于检测PCR产物。和探针类似,分子信标经由具有连接在探针的末端的荧光染料和猝灭剂的探针使用FRET来检测PCR产物。不同于探针,在PCR循环期间分子信标仍然保持完整。当游离在溶液中时,分子信标探针形成茎环结构,从而允许染料和猝灭剂足够接近,以引起荧光猝灭。当分子信标杂交于靶标时,茎环结构消除,从而染料和猝灭剂在空间上分开,并且染料发出荧光。分子信标可从,例如,Gene LinkTM获得(参见www.genelink.com/newsite/products/mbintro.asp)。
在一些实施方案中,Scorpion探针可以用作序列-特异性引物和用于PCR产物检测。像分子信标一样,在不与靶核酸杂交时,Scorpion探针形成茎环结构。然而,不同于分子信标,Scorpion探针实现序列-特异性引发和PCR产物检测二者。荧光染料分子连接于Scorpion探针的5’-端,并且猝灭剂连接在其他地方,如3’-端。探针的3’部分与PCR引物的延伸产物互补,并且该互补部分与探针的5’-端通过不可扩增部分连接。在Scorpion引物延伸后,探针的靶标-特异性序列结合延伸的扩增子内的其互补物,因此打开茎环结构并且允许5’-端的染料发荧光并产生信号。Scorpion探针可从,例如,Premier BiosoftInternational获得(参见www.premierbiosoft.com/tech_notes/Scorpion.html)。
在一些实施方案中,可以用在FRET探针上的标记包括比色和荧光染料如AlexaFluor染料,BODIPY染料,如BODIPY FL;Cascade Blue;Cascade Yellow;香豆素和其衍生物,如7-氨基-4-甲基香豆素,氨基香豆素和羟基香豆素;青色素染料,如Cy3和Cy5;曙红和真曙红;荧光素和其衍生物,如异硫氰酸荧光素;镧系离子的大环螯合物,如Quantum DyeTM;Marina Blue;Oregon Green;罗丹明染料,如罗丹明红,四甲基罗丹明和罗丹明6G;德克萨斯红(Texas Red);荧光能量转移染料,如噻唑橙-乙锭异二聚物;和,TOTAB。
染料的具体实例包括,但不限于,上文所述的那些和以下的:Alexa Fluor 350,Alexa Fluor 405,Alexa Fluor 430,Alexa Fluor 488,Alexa Fluor 500.Alexa Fluor514,Alexa Fluor 532,Alexa Fluor 546,Alexa Fluor 555,Alexa Fluor 568,AlexaFluor 594,Alexa Fluor 610,Alexa Fluor 633,Alexa Fluor 647,Alexa Fluor 660,Alexa Fluor 680,Alexa Fluor 700,和,Alexa Fluor 750;胺反应性BODIPY染料,如BODIPY493/503,BODIPY 530/550,BODIPY 558/568,BODIPY 564/570,BODIPY 576/589,BODIPY 581/591,BODIPY 630/650,BODIPY650/655,BODIPY FL,BODIPY R6G,BODIPY TMR,和,BODIPY-TR;Cy3,Cy5,6-FAM,异硫氰酸荧光素,HEX,6-JOE,Oregon Green 488,OregonGreen 500,Oregon Green 514,Pacific Blue,REG,罗丹明绿,罗丹明红,Renographin,ROX,SYPRO,TAMRA,2’,4’,5’,7’-四溴砜荧光素,和TET。
染料/猝灭剂对(即,供体/受体对)的实例包括,但不限于,荧光素/四甲基罗丹明;IAEDANS/荧光素;EDANS/dabcyl;荧光素/荧光素;BODIPY FL/BODIPY FL;荧光素/QSY 7或QSY 9染料。当供体和受体相同时,在一些实施方案中可以通过荧光去极化检测FRET。染料/猝灭剂对(即,供体/受体对)的某些具体实例包括,但不限于,Alexa Fluor350/AlexaFluor488;Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 546;Alexa Fluor488/Alexa Fluor 555;AlexaFluor 488/Alexa Fluor 568;Alexa Fluor488/Alexa Fluor 594;Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 647;Alexa Fluor546/Alexa Fluor 568;Alexa Fluor 546/Alexa Fluor594;Alexa Fluor546/Alexa Fluor 647;Alexa Fluor 555/Alexa Fluor 594;AlexaFluor555/Alexa Fluor 647;Alexa Fluor 568/Alexa Fluor 647;Alexa Fluor594/AlexaFluor 647;Alexa Fluor 350/QSY35;Alexa Fluor 350/dabcyl;Alexa Fluor 488/QSY35;Alexa Fluor 488/dabcyl;Alexa Fluor 488/QSY 7或QSY 9;Alexa Fluor 555/QSY 7或QSY9;Alexa Fluor 568/QSY 7或QSY 9;Alexa Fluor 568/QSY 21;Alexa Fluor 594/QSY 21;和Alexa Fluor 647/QSY 21。在一些情况中,相同的猝灭剂可以用于多种染料,例如,光谱猝灭剂,如Iowa猝灭剂(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)或Black Hole QuencherTM(BHQTM;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。
在一些实施方案中,例如,在其中两个以上部分(如扩增子)同时检测的多重反应中,每个探针包含在检测上相区分的染料,从而当在同一个反应中同时检测时,可以区分染料。本领域技术人员可以选择一组在检测上相区分的染料,用在多重反应中。
可用于制备用在本文中所述方法的一些实施方案中的PCR探针的荧光标记的核糖核苷酸的具体实例可从Molecular Probes(Invitrogen)获得,并且这些包括,Alexa Fluor488-5-UTP,荧光素-12-UTP,BODIPY FL-14-UTP,BODIPY TMR-14-UTP,四甲基罗丹明-6-UTP,Alexa Fluor 546-14-UTP,德克萨斯红-5-UTP,和BODIPY TR-14-UTP。其他荧光核糖核苷酸可从Amersham Biosciences(GE Healthcare)获得,如Cy3-UTP和Cy5-UTP。
用于制备用于本文中所述方法的PCR探针的荧光标记的脱氧核糖核苷酸的实例包括二硝基苯基(DNP)-1’-dUTP,Cascade Blue-7-dUTP,Alexa Fluor 488-5-dUTP,荧光素-12-dUTP,Oregon Green 488-5-dUTP,BODIPY FL-14-dUTP,罗丹明绿-5-dUTP,Alexa Fluor532-5-dUTP,BODIPY TMR-14-dUTP,四甲基罗丹明-6-dUTP,Alexa Fluor 546-14-dUTP,Alexa Fluor 568-5-dUTP,德克萨斯红-12-dUTP,德克萨斯红-5-dUTP,BODIPY TR-14-dUTP,Alexa Fluor 594-5-dUTP,BODIPY630/650-14-dUTP,BODIPY 650/665-14-dUTP;Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP,Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP,Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP,Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP。荧光标记的核苷酸可商购并且可以从例如,Invitrogen购买。
在一些实施方案中,将染料和其他部分,如猝灭剂,通过修饰的核苷酸引入用于本文中所述方法的多核苷酸,如FRET探针中。“修饰的核苷酸”是指化学修饰的、但仍然作为核苷酸起作用的核苷酸。在一些实施方案中,修饰的核苷酸具有共价连接的化学部分如染料或猝灭剂,并且可以例如通过固相合成多核苷酸的方式引入多核苷酸中。在其他实施方案中,修饰的核苷酸包括一种以上在将修饰的核苷酸结合入核酸之前、期间或之后与染料或猝灭剂反应的反应性基团。在具体实施方案中,修饰的核苷酸是胺-修饰的核苷酸,即,修饰以具有反应性胺基团的核苷酸。在一些实施方案中,修饰的核苷酸包含修饰的碱基部分,如尿苷,腺苷,鸟苷,和/或胞嘧啶。在具体实施方案中,胺-修饰的核苷酸选自5-(3-氨基烯丙基)-UTP;8-[(4-氨基)丁基]-氨基-ATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-ATP;N6-(4-氨基)丁基-ATP,N6-(6-氨基)丁基-ATP,N4-[2,2-氧基-二-(乙基胺)]-CTP;N6-(6-氨基)己基-ATP;8-[(6-氨基)己基]-氨基-ATP;5-炔丙基氨基-CTP,5-炔丙基氨基-UTP。在一些实施方案中,将具有不同核碱基部分的核苷酸类似地修饰,例如,5-(3-氨基烯丙基)-GTP替代5-(3-氨基烯丙基)-UTP。很多胺修饰的核苷酸可从例如,Applied Biosystems,Sigma,Jena Bioscience和TriLink商购。
示例性的可检测部分还包括,但不限于,结合对的成员。在一些这样的实施方案中,结合对的第一成员连接于多核苷酸。结合对的第二成员连接于可检测标记,如荧光标记。当连接于结合对的第一成员的多核苷酸与连接于可检测标记的结合对的第二成员一起孵育时,结合对的第一和第二成员缔合并且可以检测多核苷酸。示例性的结合对包括,但不限于,生物素和链霉亲和素,抗体和抗原等。
在一些实施方案中,在单个多重反应中检测多个靶基因。在一些这样的实施方案中,当从探针释放时,靶向独特的扩增子的每种探针在光谱上可区分,在此种情况下,通过独特的荧光信号检测每种靶基因。在一些实施方案中,使用相同的荧光信号检测两种以上靶基因,在该情况下,该信号的检测表明存在靶基因之一或二者。
本领域技术人员可以选择适当的检测方法用于选择的测定,例如,实时RT-PCR测定。选择的检测方法不需要是上文所述的方法,并且可以是任意方法。
4.3示例性的组合物和试剂盒
在另一方面,提供组合物。在一些实施方案中,提供组合物用于本文中所述方法。
在一些实施方案中,提供组合物,其包含至少一种靶基因-特异性引物。术语“靶基因-特异性引物”和“靶RNA-特异性引物”可交替使用并且包括具有以下各项的序列的连续核苷酸区域的引物:(i)与靶基因的区域至少90%,至少95%,或100%相同,或(ii)与靶基因中存在的连续核苷酸区域的序列至少90%,至少95%,或100%互补的序列。在一些实施方案中,提供组合物,其包含至少一个靶基因-特异性引物对。术语“靶基因-特异性引物对”包括适于扩增限定的靶基因区域的引物对。靶基因-特异性引物对通常包括:包含与靶基因的区域的序列至少90%,至少95%,或100%相同的序列的第一引物和包含与靶基因的区域至少90%,至少95%,或100%互补的序列的第二引物。引物对通常适于扩增50至1500个核苷酸长,50至1000个核苷酸长,50至750个核苷酸长,50至500个核苷酸长,50至400个核苷酸长,50至300个核苷酸长,50至200个核苷酸长,50至150个核苷酸长,100至300个核苷酸长,100至200个核苷酸长,或100至150个核苷酸长的靶基因的区域。非限制性示例性引物就引物对示在表A和B中。
在一些实施方案中,组合物包含至少一种靶基因-特异性引物对。在一些实施方案中,组合物另外包含用于扩增内源性对照(如SAC)的靶基因-特异性引物对和/或一对用于扩增外源性对照(如SPC)的靶基因-特异性引物。
在一些实施方案中,组合物包含至少一种靶基因-特异性探针。术语“靶基因-特异性探针”和“靶RNA-特异性探针”可交替使用,并且包括具有以下序列的连续核苷酸区域的探针:(i)与靶基因的区域至少90%,至少95%,或100%相同,或(ii)与靶基因中存在的连续核苷酸区域的序列至少90%,至少95%,或100%互补。非限制性示例性靶标-特异性探针示在表A和B中。
在一些实施方案中,组合物(包括包含一种以上靶基因-特异性引物对的上文描述的组合物)包含一种以上用于检测靶基因的探针。在一些实施方案中,组合物包含用于检测内源性对照(如SAC)的探针和/或用于检测外源性对照(如SPC)的探针。
在一些实施方案中,组合物是组合物水溶液。在一些实施方案中,组合物水溶液包含缓冲成分,如磷酸盐,tris,HEPES,等,和/或另外的成分,如下文讨论的。在一些实施方案中,组合物是干燥的,例如,冻干的,并且适于通过加入液体重构。干燥组合物可以包括一种以上缓冲成分和/或另外的组分。
在一些实施方案中,组合物还包含一种以上另外的成分。所述另外的成分包括,但不限于,盐,如NaCl,KCl和MgCl2;聚合酶,包括热稳定性聚合酶如Taq;dNTPs;逆转录酶,如MMLV逆转录酶;RNA酶抑制剂;牛血清白蛋白(BSA)等;还原剂,如β-巯基乙醇;EDTA等;等。本领域技术人员可以根据组合物的预期用途选择适当的组合物成分。
在一些实施方案中,提供组合物,其包含用于检测至少一种靶基因的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中,多核苷酸用作用于逆转录酶反应的引物。在一些实施方案中,多核苷酸用作用于扩增的引物。在一些实施方案中,多核苷酸用作用于PCR的引物。在一些实施方案中,多核苷酸用作用于检测至少一种靶基因的探针。在一些实施方案中,将多核苷酸可检测地标记。在一些实施方案中,多核苷酸是FRET探针。在一些实施方案中,多核苷酸是探针,分子信标,或Scorpion探针。
在一些实施方案中,组合物包含具有与靶基因(如甲型流感PA基因或甲型流感PB2基因)的区域至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补的序列的至少一种FRET探针。在一些实施方案中,将FRET探针用供体/受体对标记,从而当在PCR反应期间消化探针时,其产生与特定靶基因相关的独特荧光发射。在一些实施方案中,当组合物包含多重FRET探针时,将每种探针用不同供体/受体对标记,从而当在PCR反应期间消化探针时,每一种产生与特定探针序列和/或靶基因相关的独特荧光发射。在一些实施方案中,FRET探针的序列与靶基因的靶区域互补。在其他实施方案中,FRET探针具有包含一种以上碱基错配(当与靶基因的最佳比对的靶区域的序列相比时)的序列。
在一些实施方案中,组合物包含由至少8,至少9,至少10,至少11,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个核苷酸组成的FRET探针,其中序列的至少一部分与靶基因,如甲型流感PA基因或甲型流感PB2基因的区域至少90%,至少95%,或100%相同,或至少90%,至少95%,或100%互补。在一些实施方案中,FRET探针的至少8,至少9,至少10,至少11,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个核苷酸相同地存在于靶基因(如甲型流感PA基因或甲型流感PB2基因)的区域中,或与靶基因(如甲型流感PA基因或甲型流感PB2基因)的区域互补。在一些实施方案中,当与靶基因的序列或互补物相比时,FRET探针具有含有一个、两个或三个碱基错配的序列。
在一些实施方案中,试剂盒包含上文讨论的多核苷酸。在一些实施方案中,试剂盒包含上文讨论的至少一种引物和/或探针。在一些实施方案中,试剂盒包含至少一种聚合酶,如热稳定性聚合酶。在一些实施方案中,试剂盒包含dNTPs。在一些实施方案中,用于本文中所述的实时RT-PCR方法中的试剂盒包含一种以上靶基因-特异性FRET探针和/或一种以上用于逆转录靶RNA的引物和/或一种以上用于扩增靶基因或从其逆转录的cDNA的引物。
在一些实施方案中,一种以上引物和/或探针是“线性的”。“线性的”引物是指单链分子的多核苷酸,并且通常不包括例如,至少3,4或5个连续核苷酸的短区域(其与相同多核苷酸内的另一区域互补从而引物形成内部双链体)。在一些实施方案中,用于逆转录的引物在3’-端包含至少4,如至少5,如至少6,如至少7或更多个连续核苷酸的区域,其具有与靶基因的5’-端的至少4,如至少5,如至少6,如至少7或更多个连续核苷酸的区域互补的序列。
在一些实施方案中,试剂包含一种以上用于扩增靶基因或从其逆转录的cDNA的线性引物对(“正向引物”和“反向引物”)。因此,在一些实施方案中,第一引物包含至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸的区域,其具有与在靶基因的第一位置处的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸的区域的序列至少90%,至少95%,或100%相同的序列。此外,在一些实施方案中,第二引物包含至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸的区域,其具有与在靶基因的第二位置处的至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少21,至少22,至少23,至少24,或至少25个连续核苷酸的区域的序列至少90%,至少95%,或100%互补的序列,从而使用所述两种引物的PCR反应得到从靶基因的第一位置到靶基因的第二位置延伸的扩增子。
在一些实施方案中,试剂盒包含至少两组,至少三组,或至少四组引物,每组用于扩增不同靶基因或从其逆转录的cDNA。在一些实施方案中,试剂盒还包含至少一组用于扩增对照RNA,如内源性对照和/或外源性对照的引物。
在一些实施方案中,用于本文所述的组合物的探针和/或引物包含脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中,用于本文所述的组合物的探针和/或引物包含脱氧核糖核苷酸和一种以上核苷酸类似物,如上文所述的LNA类似物或其他双链体-稳定的核苷酸类似物。在一些实施方案中,用于本文所述的组合物的探针和/或引物包含所有核苷酸类似物。在一些实施方案中,探针和/或引物在互补性区域包含一种以上双链体-稳定的核苷酸类似物,如LNA类似物。
在一些实施方案中,本文中所述实时RT-PCR方法的试剂盒还包含用于逆转录和扩增反应的试剂。在一些实施方案中,试剂盒包含酶,如逆转录酶或热稳定性DNA聚合酶,如Taq聚合酶。在一些实施方案中,试剂盒还包含用于逆转录和/或扩增的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。在其他实施方案中,试剂盒包含对探针和引物的特异杂交优化的缓冲液。
试剂盒一般包括具有一个以上容纳试剂的容器的包装,作为一种以上分离的组合物或,任选地,作为其中允许试剂的相容性的混合物。试剂盒还可以包括从用户的角度可能需要的其他一种或多种材料,如一种或多种缓冲液、一种或多种稀释剂、一种或多种标准物,和/或用于样品处理、洗涤或进行测定的任何其他步骤的任何其他材料。
试剂盒优选包括用于进行本文中所述的一种以上方法的使用说明。包括在试剂盒中的使用说明可以附加于包装材料或可以作为包装插页包括在其中。而使用说明通常是手写的或打印的材料,它们不限于此。本发明考虑能够储存该使用说明并且将它们传达给终端用户的任何介质。这样的介质包括,但不限于,电子储存介质(例如,磁盘、磁带、磁筒、磁芯片),光学介质(例如,CD ROM)等。如本文中使用的,术语“使用说明”可以包括提供该使用说明的网址。
在一些实施方案中,试剂盒可以包含上文所述的在一种以上筒中提供的试剂。这些筒允许在该自含的“筒中实验室”内进行提取、扩增和检测(参见例如,美国专利5,958,349,6,403,037,6,440,725,6,783,736,6,818,185;其各自通过参考以其整体在本文中结合)。可以在试剂盒内的分开的筒中提供用于测量基因组拷贝数水平和检测病原体的试剂或可以在单个筒中提供这些试剂(适于多重检测)。
在一些实施方案中,本文描述的任意试剂盒可以包括用于鼻吸出物/洗涤样品和/或拭子的容器,用于收集鼻咽拭子样品。
以下实例仅是为了说明的目的,并且不意在以任何方式限制。
5.实施例
5.1实施例1:甲型流感(FluA)的检测
很多已有流感测试依赖于对流感基质蛋白(MP)基因的检测。流感病毒的不断抗原性漂移和转变使其难以在季节之间维持测定灵敏度,导致测定性能随时间恶化。为了设计较不可能失去灵敏度,或以比已有测试低的速率失去灵敏度的稳健的流感测定,研究了能够补充MP的另外的甲型流感靶标。
首先通过使用欧洲分子生物学实验室(EMBL)-欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute)(EBI)序列比对软件,ClustalW产生RNA区段的序列比对,鉴定用于设计引物和探针的适当的基因片段。ClustalW是用于核酸或蛋白的一般目的多重序列比对程序,其计算对于选择的序列的最佳匹配,并且将它们进行比对,从而可以比较同一性、相似性和差异。对于每个潜在的靶标,选择区分靶标的序列区域(长度100-200nt)。还基于多态碱基置换的频率选择区域;选择高度保守的区域。
使用DNA Software,Inc.’s Visual OMP(寡核苷酸建模平台(OligonucleotideModeling Platform))进行用于扩增选择的区域中的RNA片段的引物和探针的设计。VisualOMP通过结合所有公共结构域热动力学参数以及对于DNA,RNA,PNA和次黄苷的专有近邻和多态热动力学参数在计算机上对单链核酸的折叠和杂交进行建模。这使得能够对于复合体测定如微阵列、微流体应用和多重PCR有效设计引物和探针。计算机实验对于靶标(最佳和次佳),引物(最佳和次佳),同源二聚体,以及靶标和引物异源二聚体,给定的具体条件来模拟二级结构。计算对于所有种类的解链温度(Tm),自由能(ΔG),结合百分数以及浓度的值。此外,Visual OMP预测单个或多重反应中引物和探针与一个或多个靶标之间的结合效率。
使用该软件工具,热动力学评估寡核苷酸和不同流感靶标之间的预测的相互作用并且最小化不希望的相互作用。
然后将选择的引物和探针进行BLAST检索。单独和组合地查询代表预期的全长扩增子序列的寡核苷酸。
基于该分析,鉴定两个新的甲型流感靶基因能够改善已有流感测定的灵敏度:碱性聚合酶2(PB2)基因和酸性聚合酶(PA)基因。示例性的PB2和PA基因序列分别在SEQ IDNOs:1和2中显示。如上文所述设计用于检测两种新的甲型流感靶基因的引物和探针并且示在表A中。
表A:用于检测甲型流感1PB2和PA基因的引物和探针
此外,如上文所述设计引物和探针以检测甲型流感1基质蛋白(MP)基因,甲型流感2(禽分离株)MP基因,甲型流感3(H7N9)血凝素(HA)基因,乙型流感MP基因,乙型流感NS基因,和呼吸道合胞病毒(RSV)A和B。示例性的甲型流感1MP,甲型流感2MP,甲型流感3HA,乙型流感MP,和乙型流感NS基因序列分别示在SEQ ID NOs:3至7中。那些引物和探针示在表B中。
表B:用于检测甲型流感1MP,甲型流感2MP,甲型流感3HA,乙型流感MP,乙型流感
NS,RSV A,和RSV B的引物和探针
F1,F2,F3,F4和F5是在检测上相区分的染料,其可以在多重反应中同时被检测和区分。每种探针还包含猝灭剂(例如,Q1或Q2,上述)。
多重测定的最终引物和探针组合物示在表B中。
表B:引物和探针浓度
每个反应含有50-90mM KCl,3-5mM MgCl2,400-825μM dNTPs,20mM Tris,pH 8.5,0.01%叠氮化钠,和1单位/μl的RNA酶抑制剂。MMLV逆转录酶(2单位/μl)和AptaTaq(3单位/μl;Roche)分别用于逆转录和扩增。
对于NP拭子,将拭子样品置于含有3mL运送培养基的管中。对于NA/W样品,将600μLNA/W样品加入至3mL运送培养基中。
将300μL的缓冲的鼻咽拭子(NP)或鼻吸出物/洗涤样品(NA/W)样品装载入筒中用于分析。将样品与裂解试剂混合以释放核酸。裂解后,将从样品释放的核酸捕获在DNA-结合基材上。将核酸从基材上洗脱并且用于重构(reconstitute)用于实时PCR的试剂(上文所述)。使用的反应循环是:使用筒在系统中94℃20秒,接着95℃1秒、62℃35秒的多至3个循环,95℃1秒、62℃20秒的多至20个循环,和95℃1秒、62℃35秒的14个循环。
用于靶标的Ct值的有效范围是12-39.9Ct。
Xpert Flu/RSV XC测定具有三个通道(甲型流感1,甲型流感2,和甲型流感3)以检测最多的甲型流感株。甲型流感1通道中的引物和探针与人甲型流感株具有100%同源性。甲型流感2通道中的引物和探针与甲型禽流感株具有>95%同源性并且与人甲型流感株具有约80%同源性。甲型流感3通道中的引物和探针检测甲型禽流感H7N9株的血凝素基因区段(分亚型能力)。通过Xpert Flu/RSV XC测定检测的所有甲型流感株(人和禽)报告为甲型流感阳性。
在Xpert Flu/RSV XC测定中甲型流感结果调取算法需要甲型流感1或甲型流感2通道是阳性的,从而报告甲型流感阳性测试结果。甲型流感3通道阳性,阳性甲型流感1或甲型流感2结果非阳性,报告为无效。下表1列出对于甲型流感的所有可能测试结果。
表1.对于甲型流感1、甲型流感2和甲型流感3通道的甲型流感的可能测试结果
所有可能结果显示在表2和3中。
表2.对于Xpert Flu-RSV XC选择测定的所有可能最终测试结果
表3.Xpert Flu-RSV XC测定结果和解释
5.2实施例2:临床表现
在美国的六个机构评价Xpert Flu/RSV XC测定的性能特性。由于流感病毒的低流行和难以获得新鲜流感和RSV阳性样本,将该研究的样本群体补充以冷冻保存的样本。
受试者包括呼吸道感染迹象和症状,并且其需要收集鼻吸出物/洗涤物(NA/W)样本或鼻咽(NP)拭子样本用于流感和RSV测试的常规护理的个体。对于合适的受试者,获得剩余样本的等分部分用于利用Xpert Flu/RSV XC测定的测试和参考测试,并且按照其标准实践在该地点继续患者管理。
将Xpert Flu/RSV XC测定性能与FDA-明确的比较测定相比较。在Xpert Flu/RSVXC测定和比较测定有差异时,在样本上进行双向测序。
5.2.1鼻吸出物/洗涤(NA/W)样品
通过Xpert Flu/RSV XC测定和参考测定,对总共657NA/W个样本测试甲型流感、乙型流感和RSV。657个NA/W样本中,581个是新鲜的,前瞻性收集的,并且76个是冷冻储存的样本。
总体而言,利用NA/W样本,相对于参考测定,Xpert Flu/RSV XC测定对于甲型流感的检测分别表明98.6%,100%和99.8%的阳性符合率(PPA),阴性符合率(NPA),和总体符合率(OPA)(表4)。Xpert Flu/RSV XC测定对于乙型流感的PPA,NPA和OPA分别是99.2%,100%和99.8%(表4)。Xpert Flu/RSV XC测定对于RSV的PPA,NPA和OPA分别是97.2%,99.6%和99.1%(表4)。
对于新鲜的、前瞻性收集的NA/W样本,相对于参考测定,Xpert Flu/RSV XC测定对于甲型流感的检测分别表现出100%,100%和100%的PPA,NPA和OPA(表4)。Xpert Flu/RSVXC测定对于乙型流感的PPA,NPA和OPA分别是99.2%,100%和99.8%(表4)。Xpert Flu/RSVXC测定对于RSV的PPA,NPA和OPA分别是98.5%,99.6%和99.3%(表4)。
对于冷冻储存的NA/W样本,相对于参考测定,Xpert Flu/RSV XC测定对于甲型流感的检测分别表现出97.1%,100%和98.7%的PPA,NPA和OPA(表4)。Xpert Flu/RSV XC测定对于乙型流感的PPA,NPA和OPA分别是100%,100%和100%(表4)。Xpert Flu/RSV XC测定对于RSV的PPA,NPA和OPA分别是84.6%,100%和97.4%(表4)。
表4.对NA/W样本的Xpert Flu/RSV XC测定性能
a.通过测序测试结果:NA:样品未测序。
b.通过测序测试结果:2个中的2个是RSV阳性。
c.通过测序测试结果:2个中的1个是RSV阳性;2个中的1个是RSV阴性。
d.通过测序测试结果:1个中的1个是甲型流感阴性。
e.通过测序测试结果:2个中的1个是RSV阳性;2个中的1个是RSV阴性。
f.通过测序测试结果:1个中的1个是甲型流感阴性。
g.通过测序测试结果:NA:样品未测序。
h.通过测序测试结果:2个中的2个是RSV阳性。
i.通过测序测试结果:4个中的2个是RSV阳性;4个中的2个是RSV阴性。
5.2.2鼻吸出物/洗涤(NA/W)样品
通过Xpert Flu/RSV XC测定和参考测定,对总共593个NP拭子样本检测甲型流感,乙型流感和RSV。593个NP拭子样本中,190个是新鲜的、前瞻性收集的并且403个是冷冻的储存的样本。
总体上,利用NP拭子样本,与参考测定相比,Xpert Flu/RSV XC测定对甲型流感的检测分别表现出98.1%,95.1%和95.6%的PPA,NPA和OPA(表5)。Xpert Flu/RSV XC测定对乙型流感的PPA,NPA和OPA分别是98.9%,100%和99.8%(表5)。Xpert Flu/RSV XC测定对于RSV的PPA,NPA和OPA分别是91.9%,99.4%和98.7%(表5)。
对于新鲜的、前瞻性收集的NP拭子样本,相对于参考测定,Xpert Flu/RSV XC测定对于甲型流感的检测分别表现出85.7%,98.9%和98.4%的PPA,NPA和OPA(表5)。XpertFlu/RSV XC测定对乙型流感的PPA,NPA和OPA分别为100%,100%和100%(表5)。XpertFlu/RSV XC测定对于RSV的PPA,NPA和OPA分别为100%,100%和100%(表5)。
对于冷冻的、储存的NP拭子样本,相对于参考测定,Xpert Flu/RSV XC测定对于甲型流感的检测分别表现出99.0%,92.8%,和94.3%的PPA,NPA和OPA(表5)。Xpert Flu/RSVXC测定对于乙型流感的PPA,NPA和OPA分别为98.8%,100%和99.8%(表5)。Xpert Flu/RSVXC测定对于RSV的PPA,NPA和OPA分别为90.4%,99.1%和98.0%(表5)。
表5.对NP拭子样本的Xpert Flu/RSV XC测定性能
a.通过测序测试结果:2个中的2个是甲型流感(Flu A)阳性。
b.通过测序测试结果:1个的1个甲型流感阴性。
c.通过测序测试结果:22中的17个是甲型流感阳性;22个中的5个是甲型流感阴性。
d.通过测序测试结果:1个中的1个是甲型流感阴性。
e.通过测序测试结果:1个中的1个是乙型流感(Flu B)阴性。
f.通过测序测试结果:3个中的2个是RSV阳性;3个中的1个是RSV阴性。
g.通过测序测试结果:5个中的1个是RSV阳性;5个中的4个是RSV阴性。
h.通过测序测试结果:24个中的19个是甲型流感阳性;24个中的5个是RSV阴性。
i.通过测序测试结果:2个中的2个是甲型流感阴性。
j.通过测序测试结果:1个中的1个是乙型流感阴性。
k.通过测序测试结果:3个中的2个是RSV阳性;3个中的1个是RSV阴性。
l.通过测序测试结果:5个中的1个是RSV阳性;5个中的4个是RSV阴性。
利用合格的样本进行的Xpert Flu/RSV XC测定运行中,这些样本中的98.6%(1236/1254)对于第一次尝试是成功的。剩余18个对于第一次尝试给出不确定的结果(11个错误,3个无效和4个无结果)。对18个样本中的十七个重新测试,在单次重新测试后,其中14个得到有效结果。在重新测试后存在四个结果不确定的NA/W样本,在分析中将它们排除。
5.3.实施例3:分析灵敏度(检测极限)
进行研究以利用两个批次的试剂跨三个测试日确定Xpert Flu/RSV XC测定的检测的分析极限(LoD)。选择对于每株和每批次观察到的最大LoD用于验证。对于跨最小三个测试日的一个试剂批次进行估计的LoD要求的验证。使用稀释在阴性汇集的临床基质中的两个甲型流感H3N2株,两个甲型流感2009H1N1株,两个乙型流感株,两个呼吸道合胞病毒A(RSV A)株和两个呼吸道合胞病毒B(RSV B)株建立LoD。LoD定义为以95%置信度可重复地与阴性样品相区分的每个样品的最低浓度(组织培养感染剂量,TCID50/mL)或20个重复中的19个是阳性的最低浓度。每个病毒浓度以20个重复测试每个株。
凭经验确定LoD为具有19/20或20/20个阳性结果的第一浓度。对于每个测试株的LoD点值总结在表6至表11中。
表6.确认的LoD(TCID50/mL):甲型流感2009H1N1
表7.确认的LoD(TCID50/mL):甲型流感H3N2
表8.确认的LoD(TCID50/mL):乙型流感
表9.确认的LoD(TCID50/mL):呼吸道合胞病毒A
表10.确认的LoD(TCID50/mL):呼吸道合胞病毒B
表11.确认的LoD(TCID50/mL):甲型流感H7N9
尽管已经显示该测试检测新的甲型禽流感(H7N9)培养材料,但是尚未建立该装置关于对新的甲型禽流感(H7N9)病毒阳性的临床样本的性能特性。Xpert Flu/RSV测定可以区分甲型流感和乙型流感病毒,但其不能区分流感亚型。
5.4.实施例4:分析特异性(排他性)
通过测试一组44个培养物(由16种病毒,26种细菌和两种酵母组成,代表常见呼吸系统病原体或在鼻咽中可能遇到的那些)评价Xpert Flu/RSV XC测定的分析特异性。所有细菌和酵母株在≥106CFU/mL的浓度测试三个重复。所有病毒的三个重复在≥105TCID50/mL的浓度测试。分析特异性是100%。结果在表12中显示。
表12.Xpert Flu/RSV XC测定的分析特异性
a对于鲍氏不动杆菌,在初步测试后,1/3重复对于甲型流感是阳性的,Ct为39.2(截止值=40)。以>1x 106CFU/mL测试另外23个重复;23/23重复被正确地报道为甲型流感阳性;乙型流感阴性;RSV阴性。
5.5实施例5:分析反应性(包含性)
针对多个甲型流感H1N1株(2009年以前季节性的),甲型流感H1N1(2009年流行的),甲型流感H3N2(季节性的),甲型禽流感(H5N1,H5N2,H6N2,H7N2,H7N3,H2N2,和H7N9),以及H9N2),乙型流感(来自Victoria和Yamagata系的代表株),和呼吸道合胞病毒A/B(RSVA和RSV B)在接近分析LoD的水平评估Xpert Flu/RSV XC测定的分析反应性。在该研究中利用Xpert Flu/RSV XC测定测试总共64株(包含54株流感病毒和10株RSV病毒)。
对于每个株测试三个重复。结果显示在表13中。
表13.Xpert Flu/RSV XC测定的分析反应性(包含性)
表13.Xpert Flu/RSV XC测定的分析反应性(包含性)(续)
表13.Xpert Flu/RSV XC测定的分析反应性(包含)(续)
a在5×LoD(80.0TCID50/mL)测试甲型流感/Washington/24/2012以获得甲型流感阳性结果调用的3/3重复。
b由于生物安全性控制,在模拟的背景基质中纯化的病毒RNA用于甲型禽流感病毒。
c由于生物安全性控制,将没有病毒滴度的灭活甲型禽流感(H7N9)病毒100,000倍稀释在模拟的背景基质中并测试。
d已知的Victoria系。
e在5×LoD(3.0TCID50/mL)测试乙型流感/Panama/45/90以获得乙型流感阳性结果调用的3/3重复。
f已知的Yamagata系。
g在10×LoD(20.0TCID50/mL)测试RSV-B/CH93(18)-18以获得RSV阳性结果调用的3/3重复。
5.6.实施例6:干扰物质
在非临床研究中,直接相对于Xpert Flu/RSV XC测定的性能评估可以存在于鼻咽中的潜在干扰物质。鼻咽中的潜在干扰物质可以包括,但不限于:血液、鼻分泌物或粘液,和用于缓解充血、鼻干燥、刺激或哮喘和过敏症状的鼻和喉药物,以及抗生素和抗病毒物质。对每种物质测试阴性样品(n=8)以确定对样品处理对照(SPC)的性能的影响。以2X对于每株确定的分析LoD掺加(spiked),将六种流感(四种甲型流感和两种乙型流感)以及四种RSV(两种RSV A和两种RSV B)株,对每种物质测试阳性样品(n=8)。将所有结果与阳性和阴性通用运送培养基(UTM)对照相比较。
这些评价的物质在表14中列出,显示测试的活性成分和浓度。在存在该研究中测试的浓度的物质的情况下,没有测定干扰。使用Xpert Flu/RSV XC测定正确地鉴别了所有阳性和阴性重复。FluMist疫苗样品正确地报告为甲型流感阳性;流感阳性;RSV阴性,如所预期的。含有FluMist的样品可以引起假阳性结果。
表14.Xpert Flu/RSV XC测定中潜在的干扰物质
5.7.实施例7:携带(carry-over)污染研究
进行研究以表明,单独使用的、自含的GeneXpert筒防止在同一GeneXpert模块中在极高阳性样品后运行的阴性样品中的携带污染。该研究由相同GeneXpert模块中在紧接着极高甲型流感样品(约106TCID50/测试)后的处理的阴性样品组成。该测试方案在四个GeneXpert模块上重复20次达总共41次运行,得到20个阳性和21个阴性样本。所有20个阳性样品正确报告为甲型流感阳性;乙型流感阴性;RSV阴性。所有21个阴性样品正确报告为甲型流感阴性;乙型流感阴性;RSV阴性。
5.8.实施例8:新鲜相对冷冻样品的等效研究
通过测试代表在模拟的背景基质中低阳性(2X LoD),中等阳性(5X LoD),和高阳性(10X LoD)的三个不同浓度的单个流感和RSV株,评价Xpert Flu/RSV XC测定中新鲜和冷冻(≥-70℃)样本的等效性。阴性样品仅由模拟的背景基质组成。使用一个季节性甲型流感H3N2株(A/Victoria/361/2011),一个乙型流感株(B/Wisconsin/01/11),一个RSV A株(RSVA/Long/MD/56),和一个RSV B株(RSV B/9320/MA/77)确定新鲜和冷冻样本的等效性。对于每个样本类型和浓度,测试20个重复。测试新鲜的、一次冻融循环后的、和两次冻融循环后的所有阳性和阴性样本。
对于阳性和阴性样品,在新鲜病毒稀释液和两个顺序冻融循环之间不存在XpertFlu/RSV测定性能的差异。使用Xpert Flu/RSV XC测定正确鉴别了所有阳性和阴性重复。
5.9.实施例9:再现性
在十个不同日,由两个不同操作者,在三个地点中的每个测试具有不同浓度的甲型流感、乙型流感和RSV的一组10个样本(10样本×1次/天×10天×2个操作者×3个地点)。在3个测试地点的每个处使用一个批次的Xpert Flu/RSV XC测定筒。根据Xpert Flu/RSVXC测定步骤进行Xpert Flu/RSV XC测定。结果总结在表15中。
还关于对于每个检测的靶标的以Ct值表达的荧光信号,评估Xpert Flu/RSV XC测定的再现性。对于每组成员的地点之间、日期之间、操作者之间以及测定内的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)提供在表16中。
5.10.实施例10:预期的测定覆盖率
为了确定预期的流感株覆盖率,使用Xpert Flu/RSV测定,通过序列分析从2009年1月1日到2014年5月21日的流感分离株,以鉴别表A中引物和探针序列的错配。假定与引物和探针中的任一种具有错配的株影响测定的灵敏度,但是由于对于每种流感类型多个引物和探针序列的冗余性增加而存在较高的被检测到的机会。错配对测定灵敏度的影响依赖于错配的本体和位置。表15显示分析的结果。
如表15中所示,仅检测MP导致不能检测到1.8%的甲型流感H1N1pdm09分离株,1.2%的甲型流感H1N1季节性分离株,和0.6%的甲型流感H3N2分离株。将PA和PB2加入至测定导致检测到100%的分析的甲型流感分离株,这提示:相对于MP引物和探针序列具有错配的流感分离株在PA或PB2引物和探针序列中的至少一种中不具有错配。此外,Xpert Flu/RSV测定检测到98.5%的乙型流感分离株,96.2%的禽流感H5分离株,和100%的禽流感H7分离株(或98.4%的禽流感H5+H7分离株)。
数据在下表16中总结:
表16:预期测定覆盖率的总结
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件,为了所有目的在此通过参考结合,就像指示每个单个出版物、专利、专利申请或其他文件为了所有目的通过参考分别结合的程度一样。
尽管已经说明和描述了各种具体实施方案,但是将理解的是,可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行改变。
某些序列的表格
序列表
<110> CEPHEID
<120> 检测流感的方法
<130> CEPHD-33847/WO-1/PRI
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3151
<212> DNA
<213> 甲型流感
<400> 1
atggagagaa taaaagaact aagagatcta atgtcgcagt ctcgcactcg cgagatactc 60
actaagacca ctgtggacca tatggccata atcaaaaagt acacgtcagg aaggcaggag 120
aagaaccccg cactcagaat gaaatggatg atggcaatga aatacccaat tacagcagac 180
aggagaataa tggacatgat tccagagagg aatgaacaag gacaaaccct ctggagcaaa 240
acaaccgatg ctggatcgga ccgtgtgatg gtatcacccc tggccgtaac atggtggaat 300
aggaatggcc caacaacaag cacagttcac taccctaagg tatacaaaac ttatttcgaa 360
aaagtcgaaa ggttaaaaca tggtaccttt ggccctgtcc acttcagaaa tcaagttaaa 420
ataagaagga gggttgacac aaaccccggt catgcagatc tcagtgccaa ggaggcacag 480
gatgtgatca tggaagttgt tttcccaaac gaagtggggg caagaatact gacatcagag 540
tcacagctga caataacaaa agaaaagaaa gaagagctcc aggattgtaa aattgctccc 600
ttgatggtgg catacatgct agaaagagaa ttggttcgta agacgaggtt tcttccggtg 660
gctggtggaa caagcagtgt ttatattgaa gtgctgcact taactcaggg aacatgttgg 720
gaacaaatgt acactccagg aggagaagtg agaaatgatg atgttgacca aagtttgatt 780
atcgccgcta gaaacatagt aagaagagca gcagtgtcag cagacccatt agcatctctc 840
ttggaaatgt gccacagcac acaaattgga gatggagaga ataaaagaac taagagatct 900
aatgtcgcag tctcgcactc gcgagatact cactaagacc actgtggacc atatggccat 960
aatcaaaaag tacacgtcag gaaggcagga gaagaacccc gcactcagaa tgaaatggat 1020
gatggcaatg aaatacccaa ttacagcaga caggagaata atggacatga ttccagagag 1080
gaatgaacaa ggacaaaccc tctggagcaa aacaaccgat gctggatcgg accgtgtgat 1140
ggtatcaccc ctggccgtaa catggtggaa taggaatggc ccaacaacaa gcacagttca 1200
ctaccctaag gtatacaaaa cttatttcga aaaagtcgaa aggttaaaac atggtacctt 1260
tggccctgtc cacttcagaa atcaagttaa aataagaagg agggttgaca caaaccccgg 1320
tcatgcagat ctcagtgcca aggaggcaca ggatgtgatc atggaagttg ttttcccaaa 1380
cgaagtgggg gcaagaatac tgacatcaga gtcacagctg acaataacaa aagaaaagaa 1440
agaagagctc caggattgta aaattgctcc cttgatggtg gcatacatgc tagaaagaga 1500
attggttcgt aagacgaggt ttcttccggt ggctggtgga acaagcagtg tttatattga 1560
agtgctgcac ttaactcagg gaacatgttg ggaacaaatg tacactccag gaggagaagt 1620
gagaaatgat gatgttgacc aaagtttgat tatcgccgct agaaacatag taagaagagc 1680
agcagtgtca gcagacccat tagcatctct cttggaaatg tgccacagca cacaaattgg 1740
aggaataagg atgatggaca tccttagaca gaacccaacg gaggaacaag ccgtagacat 1800
atgcaaggca gcaatggggc tgaggattag ctcctctttc agctttggtg ggttcacctt 1860
caaaaggaca agcggatcat ctgttaagaa agaagaagaa gtgctcacgg gcaacctcca 1920
aacactgaaa ataagagtac atgaaggata tgaggaattc acaatggtcg ggagaagagc 1980
aacagctatt ctcagaaaag caaccaggag attgatccag ttaatagtaa gtggaagaga 2040
cgatcaatca attgctgagg caataattgt ggccatggta ttttcacaag aggattgcat 2100
gatcaaagca gttaggggcg atctgaactt tgtcaatagg gcaaaccagc gactgaatcc 2160
catgcaccaa ctcttgaggc atttccaaaa ggatgcaaaa gtgcttttcc agaactgggg 2220
gattgaaccc atcgacagtg taatgggaat gatcggaata ttgcctgata tgaccccaag 2280
cacggaaatg tcactgagag gtataagagt cagcaaaatg ggagtagatg aatattccag 2340
tacggagaga gtggtagtga gcattgaccg atttttgaga gttcgggatc aacgagggaa 2400
cgtactattg tcccccgaag aggtcagcga gacacaggga actgagaaat tgaccataac 2460
ttattcgtca tcaatgatgt gggagatcaa tggtcctgag tcagtgctgg tcaacactta 2520
tcaatggatc ataaggaact gggaaagctt gaaaattcaa tggtcacagg atcccacgat 2580
gttatacaac aaaatggaat ttgaaccatt ccagtctctt gtccctaagg caaccagaag 2640
tcgttacagt ggattcgtga ggacactgtt ccagcaaatg cgggatgtgc ttggaacatt 2700
tgatactgtc caaataataa agcttctccc ctttgctgca gctccaccgg aacagagtag 2760
gatgcagttc tcctcgctga ctgtgaatgt aagaggatca gggctgagga tactggtaag 2820
aggcaattct ccagtgttca attacaataa agcaaccaaa aggcttacaa ttcttggaaa 2880
agatgcaggt gcattgactg aagatccaga tgaaggcaca gctggagtgg agtctgctgt 2940
cctgagggga ttcctcattt tgggtaaaga agacaagaga tatggcccag cattaagcat 3000
caatgaactg agcaatcttg caaaaggaga gaaggctaat gtgctaattg ggcaaggaga 3060
cgtggtgttg gtaatgaaac ggaaacggga ctctagcata cttactgaca gccagacagc 3120
gaccaaaagg attcggatgg ccatcaatta g 3151
<210> 2
<211> 2587
<212> DNA
<213> 甲型流感
<400> 2
atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgatcg tcgagcttgc ggaaaaggca 60
atgaaagaat atggggaaga tccgaaaatc gaaactaaca agtttgctgc aatatgcaca 120
catttggaag tttgtttcat gtattcggat ttccatttca tcgacgaacg gggtgaatca 180
ataattgtag aatctggtga cccgaatgca ctattgaagc accgatttga gataattgaa 240
ggaagagacc gaatcatggc ctggacagtg gtgaacagta tatgtaacac aacaggggta 300
gagaagccta aatttcttcc tgatttgtat gattacaaag aaaaccggtt cattgaaatt 360
ggagtaacac ggagggaagt ccacatatat tacctagaga aagccaacaa aataaaatct 420
gagaagacac acattcatgg aagactttgt gcgacaatgc ttcaatccga tgatcgtcga 480
gcttgcggaa aaggcaatga aagaatatgg ggaagatccg aaaatcgaaa ctaacaagtt 540
tgctgcaata tgcacacatt tggaagtttg tttcatgtat tcggatttcc atttcatcga 600
cgaacggggt gaatcaataa ttgtagaatc tggtgacccg aatgcactat tgaagcaccg 660
atttgagata attgaaggaa gagaccgaat catggcctgg acagtggtga acagtatatg 720
taacacaaca ggggtagaga agcctaaatt tcttcctgat ttgtatgatt acaaagaaaa 780
ccggttcatt gaaattggag taacacggag ggaagtccac atatattacc tagagaaagc 840
caacaaaata aaatctgaga agacacacat tcacatcttt tcattcactg gagaggagat 900
ggccaccaaa gcagactaca cccttgacga agagagcagg gcaagaatca aaactaggct 960
tttcactata agacaagaaa tggccagtag gagtctatgg gattcctttc gtcaatccga 1020
aagaggcgaa gagacaattg aagaaaaatt tgagattaca ggaactatgc gcaagcttgc 1080
cgaccaaagt ctcccaccga acttctccag ccttgaaaac tttagagcct atgtagatgg 1140
attcgagccg aacggctgca ttgagggcaa gctttcccaa atgtcaaagg aagtgaacgc 1200
caaaattgaa ccattcttga ggacgacacc acgccccctc agattgcctg atgggcctct 1260
ttgccatcag cggtcaaagt tcctgctgat ggatgctctg aaattaagta ttgaagaccc 1320
gagtcacgag ggagagggaa taccactata tgatgcaatc aaatgcatga agacattctt 1380
tggctggaaa gagcctaaca tagtcaaacc acataagaaa ggcataaatc ccaattacct 1440
tatggcttgg aagcaggtgc taacagagct acaggacatt gaaaatgaag agaagatccc 1500
aaggacaaag aacatgaaga gaacaagcca attgaagtgg gcactcggtg aaaatatggc 1560
accagaaaaa gtagactttg atgactgcaa agatgttgga gaccttaaac agtatgacag 1620
tgatgagcca gagcccagat ctctagcaag ctgggtccaa aatgaattca ataaggcatg 1680
tgaattgact gattcaagct ggatagaact tgatgaaata ggagaagatg ttgccccgat 1740
tgaacatatc gcaagcatga ggaggaacta ttttacagca gaagtgtccc actgcagggc 1800
tactgaatac ataatgaagg gagtgtacat aaatacggcc ttgctcaatg catcctgtgc 1860
agccatggat gactttcagc tgatcccaat gataagcaaa tgtaggacca aagaaggaag 1920
acggaaaaca aacctgtatg ggttcattat aaaaggaagg tctcatttga gaaatgatac 1980
tgatgtggtg aactttgtaa gtatggagtt ctcactcact gacccgagac tggagccaca 2040
caaatgggaa aaatactgtg ttcttgaaat aggagacatg ctcttgagga ctgcgatagg 2100
ccaagtgtcg aggcccatgt tcctatatgt gagaaccaat ggaacctcca agatcaagat 2160
gaaatggggc atggaaatga ggcgctgcct tcttcagtcc cttcagcaga ttgagagcat 2220
gattgaggcc gagtcttctg tcaaagagaa agacatgacc aaggaattct ttgaaaacaa 2280
atcagaaaca tggccaatcg gagagtcacc cagaggagtg gaggaaggct ctattgggaa 2340
agtgtgcagg accttactgg caaaatctgt gttcaacagt ctatatgcgt ctccacaact 2400
tgaggggttt tcggctgaat cgagaaaatt gcttctcatt gttcaggcac ttagggacaa 2460
cctggaacct ggaaccttcg atcttggggg gctatatgaa gcaatcgagg agtgcctgat 2520
taatgatccc tgggttttgc ttaatgcatc ttggttcaac tccttcctca cacatgcact 2580
gaagtag 2587
<210> 3
<211> 982
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctttcta tcataccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcgcagag actggaaagt gtctttgcag gaaagaacac agatcttgag 120
gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcttgtcac ctttgactaa gggaatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc taaatgggaa tggggaccca aacaacatgg atagagcagt taaactatac 300
aagaagctca aaagagaaat aacgttccat ggggccaagg aggtgtcact aagctattca 360
actggtgcac ttgccagttg catgggcctc atatacaaca ggatgggaac agtgaccaca 420
gaagctgctt ttggtctagt gtgtgccact tgtgaacaga ttgctgattc acagcatcgg 480
tctcacagac agatggctac taccaccaat ccactaatca ggcatgagaa cagaatggtg 540
ctggctagca ctacggcaaa ggctatggaa cagatggctg gatcgagtga acaggcagcg 600
gaggccatgg aggttgctaa tcagactagg cagatggtac atgcaatgag aactattggg 660
actcatccta gctccagtac tggtctgaaa gatgaccttc ttgaaaattt gcaggcctac 720
cagaagcgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtgat cctctcgcca ttgcagcaaa 780
tatcattggg atcttgcacc tgatattgtg gattactgat cgtctttttt tcaaatgtat 840
ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acagaaggag tgcctgagtc 900
catgagggaa gaatatcaac aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960
tgtcaacata gagctagagt aa 982
<210> 4
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
cgtacgttct atctatcatt ccatcaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg cagagacttg 60
aggatgtttt tgcagggaag aacgcagatc tcgaggctct catggagtgg ataaagacaa 120
gaccaatcct gtcacctctg actaagggga ttttagggtt tgtgttcacg ctcaccgtgc 180
ccagtgagcg aggactgcag cgtagacggt ttgtccaaaa cgccctaaat gggaatggag 240
acccaaacaa catggacaag gcagttaaat tatacaagaa actgaagagg gaaatgacat 300
tccatggagc aaaggaagtt gcactcagtt actcaactgg tgcgcttgcc agctgcatgg 360
gtctcatata caacaggatg gggacagtaa ctgcagaagg ggctcttgga ttggtatgtg 420
ccacttgtga gcagattgct gacgcacaac atcggtccca caggcagatg gcaactacta 480
ccaacccact aattaggcat gagaatagaa tggtactagc cagtactacg gctaaggcta 540
tggagcagat ggctggatca agtgaacagg cagcggaagc catggaagtt gcaagccagg 600
ctaggcaaat ggtgcaggct atgagaacag tcgggactca ccctaactcc agtacaggtc 660
taaaggatga tcttattgaa aatttgcagg cttaccagaa ccggatggga gtgcaactgc 720
agcggttcaa gtgatcctct cgttgttgca gctaacatta ttgggatatt gcacttgata 780
ttgtggattc ttgatcgtct tttcttcaaa tgcatttatc gtcgctttaa atacggtttg 840
aaaagagggc cttctacgga aggaatgcct gagtctatga gggaagaata tcggcaggaa 900
cagcagaatg ctgtggatgt tgacgatggt c 931
<210> 5
<211> 1683
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60
atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120
ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacatccc caggatctgc 180
tcaaaaggga aaatgacagt tgacctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240
ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcagccgatt taattattga gaggcgagaa 300
ggaagtgatg tctgttatcc tgggaaattc gtgaatgagg aagctctgag gcaaatactc 360
agagaatcag gcggaattga caaggaagca atgggattca catacagtgg aataagaact 420
aatggagcaa ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480
ctcctgtcaa acacagataa tgctgcattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540
agaaaaagcc cagctctaat agtatggggg atccatcatt ccgtatcaac tgcagagcaa 600
accaagctat atgggagtgg aaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660
tcttttgtac cgagtccagg agcgagacca caagttaatg gtctatctgg aagaattgac 720
tttcattggc taatgctaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780
atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840
caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagtaac 900
ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960
aggagtctgc tgctagcaac agggatgaag aatgttcctg agattccaaa gggaagaggc 1020
ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080
tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140
caatcggcaa ttgatcaaat aacaggaaaa ttaaaccggc ttatagaaaa aaccaaccaa 1200
caatttgagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260
aattggacca gagattctat aacagaagtg tggtcataca atgctgaact cttggtagca 1320
atggagaacc agcatacaat tgatctggct gattcagaaa tggacaaact gtacgaacga 1380
gtgaaaagac agctgagaga gaatgctgaa gaagatggca ctggttgctt tgaaatattt 1440
cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagcaaa 1500
tacagggaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560
tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620
gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtaaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680
taa 1683
<210> 6
<211> 1139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
atgtcgctgt ttggagacac aattgcctac ctgctttcat tgacagagga tggagaaggc 60
aaagcagaac tagcagaaaa attacactgt tggtttggtg ggaaagaatt tgacctagac 120
tctgccttgg aatggataaa aaacaaaaga tgcttaactg atatacaaaa agcactaatt 180
ggtgcctcta tatgcttttt aaaacccaaa gaccaggaaa gaaaaagaag attcatcaca 240
gagcccttat caggaatggg aacaacagca acaaaaaaga aaggcctgat tctggctgag 300
agaaaaatga gaagatgtgt gagctttcat gaagcatttg aaatagcaga aggccatgaa 360
agctcagcgc tactatactg tctcatggtc atgtacctga atcctggaaa ttattcaatg 420
caagtaaaac taggaacgct ctgtgcttta tgcgagaaac aagcatcaca ttcacacagg 480
gctcatagca gagcagcgag atcttcagtg cctggagtga gacgagaaat gcagatggtc 540
tcagctatga acacagcaaa aacaatgaat ggaatgggaa aaggagaaga cgtccaaaag 600
ctggcagaag agttgcaaag caacattgga gtgctgagat ctcttggagc aagccaaaag 660
aatggggaag ggattgcaaa ggatgtaatg gaagtgctaa agcagagctc catgggaaat 720
tcagctcttg tgaagaaata tctataatgc tcgaaccatt tcagattctt acaatttgtt 780
cttttatctt atcagctctc catttcatgg cttggacaat agggcatttg aatcaaataa 840
aaagaggaat aaacatgaaa atacgaataa aaggtccaaa caaagagaca ataaacagag 900
aggtatcaat tttgagacac agttaccaaa aagaaatcca ggccaaagaa acaatgaagg 960
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 7
atggcgaaca acaacatgac cacaacacaa attgaggtgg gtccgggagc aaccaatgcc 60
accataaact ttgaagcagg aattctggag tgctatgaaa ggctttcatg gcaaagagcc 120
cttgactacc ccggtcaaga ccgcctaaac agactaaaga gaaaattaga gtcaagaata 180
aagactcaca acaaaagtga gcctgaaagt aaaaggatgt cccttgaaga gagaaaagca 240
attggagtaa aaatgatgaa agtactccta tttatgaatc cgtctgctgg aattgaaggg 300
tttgagccat actgtatgaa cagttcctca aatagcaact gtacgaaata caattggacc 360
gattaccctt caacaccaga gaggtgcctt gatgacatag aggaagaacc agaggatgtt 420
gatggcccaa ctgaaatagt attaagggac atgaacaaca aagatgcaag gcaaaagata 480
aaggaggaag taaacactca gaaagaaggg aagttccgtt tgacaataaa aagggatatg 540
cgtaatgtat tgtccttgag agtgttggta aatggaacat tcctcaaaca ccccaatgga 600
tacaagtcct tatcaactct gcatagattg aatgcatatg accagagtgg aaggcttgtt 660
gctaaacttg ttgccactga tgatcttaca gtggaggatg aagaagatgg ccatcggatc 720
ctcaactcac tcttcgagcg tcttaatgaa ggacattcaa agccaattcg agcagctgaa 780
actgcggtgg gagtcttatc ccaatttggt caagagcacc gattatcacc agaagaggga 840
gacaattaga ctggtcacgg aagaacttta tcttttaagt aaaagaattg atgataacat 900
actattccac aaaacagtga tagctaacag ctccataata gctgacatgg ttgtatcatt 960
atcattatta gaaacattgt atgaaatgaa ggatgtggtt gaagtgtaca gcaggcagtg 1020
cttgtgaatt taaaataaaa atcctgttac tact 1054
<210> 8
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
aaacgggact ctagcatact tactgacagc cagacagcga ccaaaaggat tcggatggcc 60
atcaatta 68
<210> 9
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
atcttggggg gctatatgaa gcaatcgagg agtgcctgat taatgatccc tgggttttgc 60
ttaatgcatc ttggttcaac tccttcct 88
<210> 10
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
ttctaaccga ggtcgaaacg tacgttcttt ctatcatacc gtcaggcccc ctcaaagccg 60
agatcgcgca gagactggaa agtgtctttg caggaaagaa cacagatctt gaggctctca 120
tggaatggct aaagacaaga ccaat 145
<210> 11
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
caagaccaat cctgtcacct ctgactaagg ggattttagg gtttgtgttc acgctcaccg 60
tgcccagtga gcgaggactg cagcgtagac g 91
<210> 12
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
gaaatgaaat ggctcctgtc aaacacagat aatgctgcat tcccgcagat gactaagtca 60
tataaaaata caagaaaaag c 81
<210> 13
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
tttggagaca caattgccta cctgctttca ttgacagagg atggagaagg caaagcagaa 60
ctagcagaaa aattacactg ttggtttggt gggaaagaat ttgacct 107
<210> 14
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
gatggccatc ggatcctcaa ctcactcttc gagcgtctta atgaaggaca ttcaaagcca 60
attcgagcag ctgaaactgc ggtgggagtc ttatcccaat ttggtcaaga gc 112
<210> 15
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
tacactcaac aaagatcaac ttctgtcatc cagcaaatac accatccaac ggagcacagg 60
agatagtatt gatactccta attatgatgt gcagaaacac atcaacaagt tatgtggcat 120
g 121
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
cattaaataa ggatcagctg ctgtcatcca gcaaatacac tattcaacgt agtacaggag 60
ataatattga cactcccaat tatgatgtgc aaaaacacct aaacaaacta tgtggtatgc 120
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
aaacgggact ctagcatact 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 18
taattgatgg ccatccgaat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
agccagacag cgaccaaaag 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 20
atcttggggg gctatatgaa gcaat 25
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
aggaaggagt tgaaccaaga 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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aatgatccct gggttttgct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
ttctaaccga ggtcgaaacg 20
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<212> DNA
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<400> 24
attggtcttg tctttagcca 20
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<212> DNA
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tcaggccccc tcaaagccga 20
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<212> DNA
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<220>
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caagaccaat cctgtcacct 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 27
cgtctacgct gcagtcctcg 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 28
acgctcaccg tgcccagtga 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 29
gaaatgaaat ggctcctgtc 20
<210> 30
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<212> DNA
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<220>
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ggctttttct tgtattttta tatga 25
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<212> DNA
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<220>
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<400> 31
ctgcattccc gcagatgac 19
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ttggagacac gattgcctac 20
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aggtcaaatt ctttcccacc 20
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atggagaagg caaagcagaa 20
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<212> DNA
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gatggccatc ggatcctcaa 20
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gctcttgacc aaattgggat 20
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aaagccaatt cgagcagctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tacactcaac aaagatcaac ttctgtc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 39
catgccacat aacttattga tgtgt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
caccatccaa cggagcacag gaga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
cattaaataa ggatcagctg ctgtc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
gcataccaca tagtttgttt aggtgtt 27
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
taatattgac actcccaatt atgatgtgc 29
Claims (48)
1.检测样品中存在或不存在选自酸性聚合酶(PA)和碱性聚合酶2(PB2)的至少一种流感基因的试剂在制备用于检测来自受试者的样品中存在或不存在流感的试剂盒或组合物中的用途,其中所述试剂包括酸性聚合酶(PA)的第一引物对和第一探针,其中所述第一探针用于接触由第一引物对产生的扩增子,其中所述第一引物对包括第一引物和第二引物,和其中所述第一引物由SEQ ID NO:20的序列组成,和所述第二引物由SEQ ID NO:21的序列组成。
2.权利要求1所述的用途,其中在所述样品中存在至少一种流感基因表明所述受试者患有流感。
3.权利要求1所述的用途,其中所述PA基因和/或PB2基因是甲型流感基因。
4.权利要求1所述的用途,其中PA基因的序列与SEQ ID NO:2的序列相同。
5.权利要求1所述的用途,其中PB2基因的序列与SEQ ID NO:1的序列相同。
6.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括检测存在或不存在至少一种流感基质蛋白(MP)基因的试剂,其中所述MP基因是甲型流感MP基因、乙型流感MP基因、和/或禽流感MP基因。
7.权利要求6所述的用途,其中所述禽流感MP基因是血凝素(H)5或H7亚型。
8.权利要求6所述的用途,其中所述甲型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:3或4的序列相同,并且乙型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:6的序列相同。
9.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括检测存在或不存在至少一种流感非结构(NS)基因的试剂。
10.权利要求9所述的用途,其中所述NS基因是乙型流感NS基因,并且其中乙型流感NS基因的序列与SEQ ID NO:7的序列相同。
11.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括检测存在或不存在至少一种流感血凝素(HA)基因的试剂,其中所述HA基因是甲型流感HA基因和/或禽流感HA基因。
12.权利要求11所述的用途,其中所述禽流感是H7亚型。
13.权利要求11所述的用途,其中流感HA基因的序列与SEQ ID NO:5的序列相同。
14.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括检测存在或不存在甲型流感PA基因,甲型流感PB2基因,甲型流感MP基因,禽流感MP基因,和禽流感HA基因的试剂,其中甲型流感PA基因的序列与SEQ ID NO:2相同,甲型流感PB2基因的序列与SEQ ID NO:1相同,甲型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:3相同,禽流感MP基因的序列与SEQ ID NO:4相同,并且禽流感HA基因的序列与SEQ ID NO:5相同。
15.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括检测存在或不存在乙型流感MP基因和乙型流感NS基因的试剂。
16.权利要求15所述的用途,其中乙型流感MP基因的序列与SEQ ID NO:6相同并且乙型流感NS基因的序列与SEQ ID NO:7相同。
17.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括检测在来自所述受试者的样品中存在或不存在呼吸道合胞病毒(RSV)的试剂。
18.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物包括检测外源性对照的试剂。
19.权利要求1所述的用途,其中用于检测所述流感PB2基因的试剂是第二引物对。
20.权利要求19所述的用途,其中所述第二引物对包含第三引物和第四引物,其中所述第三引物由SEQ ID NO:17的序列组成,并且所述第四引物由SEQ ID NO:18的序列组成。
21.权利要求19所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括至少一个另外的引物对,其中每个所述另外的引物对用于检测选自甲型流感MP基因、禽流感MP基因和禽流感HA基因的不同流感基因。
22.权利要求21所述的用途,其中每个另外的引物对包含第五引物和第六引物,所述第五引物和第六引物独立地选自:
a)所述第五引物由SEQ ID NO:23的序列组成,和所述第六引物由SEQ ID NO:24的序列组成;
b)所述第五引物由SEQ ID NO:26的序列组成,和所述第六引物由SEQ ID NO:27的序列组成;
c)所述第五引物由SEQ ID NO:29的序列组成,和所述第六引物由SEQ ID NO:30的序列组成。
23.权利要求19所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括至少一个另外的引物对,其中每个另外的引物对用于检测选自乙型流感MP基因和乙型流感NS基因的不同流感基因。
24.权利要求23所述的用途,其中每个另外的引物对包含第七引物和第八引物,所述第七引物和第八引物独立地选自:
a)所述第七引物由SEQ ID NO:32的序列组成,和所述第八引物SEQ ID NO:33的序列组成;
b)所述第七引物由SEQ ID NO:35的序列组成,和所述第八引物由SEQ ID NO:36的序列组成。
25.权利要求19所述的用途,其中所述组合物或试剂盒还包括至少一个另外的引物对,其中每个另外的引物对用于检测RSV A或RSV B。
26.权利要求25所述的用途,其中每个另外的引物对包含第九引物和第十引物,所述第九引物和第十引物独立地选自:
a)所述第九引物由SEQ ID NO:38的序列组成,和所述第十引物由SEQ ID NO:39的序列组成;
b)所述第九引物由SEQ ID NO:41的序列组成,和所述第十引物由SEQ ID NO:42的序列组成。
27.权利要求1所述的用途,其中所述试剂盒或组合物包括用于检测甲型流感PA基因、甲型流感PB2基因、甲型流感MP基因、禽流感MP基因、禽流感HA基因的引物对和任选地用于检测乙型流感MP基因和/或乙型流感NS基因的引物对,和任选地用于检测RSV A和/或RSV B的引物对。
28.权利要求27所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括用于检测外源性对照的对照引物对。
29.权利要求27所述的用途,其中每个引物对产生50至500个核苷酸长,50至400个核苷酸长,50至300个核苷酸长,50至200个核苷酸长,或50至150个核苷酸长的扩增子。
30.权利要求29所述的用途,其中至少一种扩增子选自甲型流感PA扩增子、甲型流感PB2扩增子,其中所述甲型流感PA扩增子包含SEQ ID NO:9的序列并且所述甲型流感PB2扩增子包含SEQ ID NO:8的序列。
31.权利要求29所述的用途,其中至少一种扩增子选自甲型流感MP扩增子、禽流感MP扩增子和禽流感HA扩增子,其中所述甲型流感MP扩增子包含SEQ ID NO:10的序列,所述禽流感MP扩增子包含SEQ ID NO:11的序列,并且所述禽流感HA扩增子包含SEQ ID NO:12的序列。
32.权利要求29所述的用途,其中所述扩增子是乙型流感MP扩增子和/或乙型流感NS扩增子,其中所述乙型流感MP扩增子包含SEQ ID NO:13的序列并且所述乙型流感NS扩增子包含SEQ ID NO:14的序列。
33.权利要求29所述的用途,其中所述扩增子是RSV A扩增子和/或RSV B扩增子,其中所述RSV A扩增子包含SEQ ID NO:15的序列并且所述RSV B扩增子包含SEQ ID NO:16的序列。
34.权利要求30所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括选自甲型流感PA探针和甲型流感PB2探针的至少一种探针,其中每种探针任选地包含可检测标记,其中所述可检测标记可以相同或不同。
35.权利要求34所述的用途,其中所述流感PA探针由SEQ ID NO:22的序列组成,并且所述流感PB2探针由SEQ ID NO:19的序列组成。
36.权利要求31所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括选自甲型流感MP探针、禽流感MP探针和禽流感HA探针的至少一种探针接触,其中每种探针任选地包含可检测标记,其中所述可检测标记可以相同或不同。
37.权利要求36所述的用途,其中所述流感MP探针由SEQ ID NO:25的序列组成,并且所述禽流感MP探针由SEQ ID NO:28的序列组成,并且所述禽流感HA探针由SEQ ID NO:31的序列组成。
38.权利要求32所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括选自乙型流感MP探针和乙型流感NS探针的至少一种探针,其中每种探针任选地包含可检测标记,其中所述可检测标记可以相同或不同。
39.权利要求38所述的用途,其中所述乙型流感MP探针由SEQ ID NO:34的序列组成,并且所述乙型流感NS探针由SEQ ID NO:37的序列组成。
40.权利要求33所述的用途,其中所述试剂盒或组合物还包括选自RSV A探针和RSV B探针的至少一种探针,其中每种探针任选地包含可检测标记,其中所述可检测标记可以相同或不同。
41.权利要求40所述的用途,其中所述RSV A探针由SEQ ID NO:40的序列组成,并且所述RSV B探针由SEQ ID NO:43的序列组成。
42.权利要求1所述的用途,其中所述样品选自鼻咽拭子样品、鼻吸出物样品和洗鼻样品。
43.组合物,其包含:
(a)用于检测流感PA基因的第一引物对,其中所述第一引物对包含第一引物和第二引物,其中所述第一引物由SEQ ID NO:20的序列组成;并且其中所述第二引物由SEQ ID NO:21的序列组成;和
(b)用于检测流感PB2基因的第二引物对,其中所述第二引物对包含第三引物和第四引物,其中所述第三引物由SEQ ID NO:17的序列组成,并且其中所述第四引物由SEQ ID NO:18的序列组成;
(c)酸性聚合酶(PA)的第一探针,其中所述第一探针用于接触由第一引物对产生的扩增子;和
(d)碱性聚合酶(PB2)的第二探针,其中所述第二探针用于接触由第二引物对产生的扩增子。
44.权利要求43所述的组合物,其还包括至少一个另外的引物对,其中每个另外的引物对用于检测选自甲型流感MP基因、禽流感MP基因、禽流感HA基因、乙型流感MP基因、乙型流感NS基因、RSV A基因和RSV B基因的不同流感基因。
45.权利要求43所述的组合物,包含甲型流感PA探针和甲型流感PB2探针。
46.权利要求45所述的组合物,其中所述甲型流感PA探针由SEQ ID NO:22的序列组成,并且所述流感PB2探针由SEQ ID NO:19的序列组成。
47.权利要求45所述的组合物,其还包含选自甲型流感MP探针、禽流感MP探针、禽流感HA探针、乙型流感MP探针、乙型流感NS探针、RSV A探针和RSV B探针的至少一种探针,其中每种探针包含可检测标记。
48.试剂盒,其包含权利要求45所述的组合物,其中所述试剂盒任选地还包含外源性对照。
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