CN108064175A

CN108064175A - Myh7b的抑制剂及其用途

Info

Publication number: CN108064175A
Application number: CN201580052358.1A
Authority: CN
Inventors: R.蒙哥马利; C.多尔比
Original assignee: Meter La Gen Medical Treatment Limited-Liability Co
Current assignee: Meter La Gen Medical Treatment Limited-Liability Co; Viridian Therapeutics Inc
Priority date: 2014-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2018-05-22
Also published as: WO2016022536A2; JP6637961B2; US10144930B2; CA2957618A1; US20180094262A1; JP2017528441A; TW201614069A; EP3177327A4; AU2015301221A1; KR20170042625A; MX2017001674A; WO2016022536A3; EP3177327A2; US9752144B2; US20160032286A1; AR101449A1; AU2015301221B2

Abstract

本发明提供MYH7B的核酸抑制剂及其组合物。本发明还提供通过向受试者施用MYH7B的抑制剂来治疗或预防受试者的心脏病症，如心脏肥大、心肌梗死或心脏衰竭的方法。本发明还提供通过向受试者施用MYH7B的抑制剂来调节受试者心脏细胞中β‑MHC的活性或表达的方法。

Description

MYH7B的抑制剂及其用途

对相关申请的交叉引用

本申请要求2014年8月4日提交的美国临时申请号62/033,018的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及肌球蛋白重链基因MYH7B的抑制剂，及其组合物。本发明还提供通过施用MYH7B抑制剂来治疗或预防心脏疾病，如心脏肥厚、心肌梗死和心力衰竭的方法。具体地，本发明公开了MYH7B的核酸抑制剂及其组合物，以及通过在有此需要的受试者中抑制MYH7B的表达或活性来治疗或预防心脏病症的方法。

发明背景

心脏病在美国是死亡的主要原因，并且对全世界数百万人提出了重大的健康风险。诊断、治疗和支持患有各种类型的心脏病(包括肥厚型心肌病、心肌梗死和心力衰竭)的患者的成本非常高，并且对医疗保健系统造成严重的负担。

肥厚型心肌病(HCM)是特别关注的，因为它是突然意外的心脏死亡的重要原因，并且在心脏骤停发作之前经常是无症状的。HCM的特征在于心肌细胞的增厚，其可以影响心室功能并引起心律不齐。HCM是心脏的原发性遗传疾病，其由许多肌节基因(sarcomericgenes)中的显性突变引起，其中8个已经被广泛研究(Teekakirikul et al.,“Hypertrophic cardiomyopathy:translating cellular cross talk intotherapeutics,”J.Cell.Biol.,2012,199(3),417-421)。在HCM中的这些显性突变中，大约40％是在β-肌球蛋白基因MYH7中的错义突变。遗传和药理学研究已经显示该显性等位基因的表达减少(即使是小程度减少)可以具有强力的表型效应(Jiang et al.,“Allele-specific silencing of mutant MYH6 transcripts in mice suppresses hypertrophiccardiomyopathy,”Science,2013,342(6154),111-114)。

肌球蛋白是心脏和骨骼肌细胞的主要收缩蛋白。心肌收缩取决于两种肌球蛋白重链(MHC)蛋白，即α-MHC(MYH6)和β-MHC(MYH7)的表达和相对比率。在啮齿类中，α-MHC(快速颤搐的MHC)是成年心脏中主要的肌球蛋白同种型，而β-MHC(缓慢颤搐的MHC)主要在发育中的心脏中表达，并在出生后下调(Morkin,E.,“Control of cardiac myosin heavy chaingene expression,”Microsc.Res.Tech.,2000,50,522-531)。相反，在人类心脏中，β-MHC同种型是高度表达的，并且α-MHC同种型占总心室MHC的小于8％(Miyata et al.,“Myosinheavy chain isoform expression in the failing and nonfailing human heart,”Circ.Res.,2000,86(4):386-90)。不管在不各种种中α-和β-肌球蛋白表达的差异，研究表明β-肌球蛋白在这些物种的心脏疾病中的表达上调，所述物种包括人、大鼠和兔。例如，在衰竭中(failing)的成年小鼠心脏中，通常观察到从正常情况下主导的α-MHC向β-MHC的转变(Harada et al.,Circulation,1999,100,2093-2099)。类似地，在大鼠中，充血性心脏衰竭与β-肌球蛋白的表达增加和α-MHC的表达降低相关。与啮齿类研究一致，在衰竭中的人心脏中β-肌球蛋白表达上调，而α-肌球蛋白表达显著下调(Miyata et al.,“Myosin heavychain isoform expression in the failing and nonfailing human heart”,CircRes.2000 Mar 3；86(4):386-90)。这些研究表明，尽管α和β肌球蛋白的表达是物种依赖性的，但下调β肌球蛋白的表达可能在各种物种中发挥心脏保护作用。例如，已显示使β-MHC表达的增加钝化和增加α-MHC表达在兔中是心脏保护的(James et al.,“Forced expressionof alpha-myosin heavy chain in the rabbit ventricle results incardioprotection under cardiomyopathic conditions,”Circulation,2005,111(18),2339-2346)。

编码α-MHC(MYH6)、β-MHC(MYH7)和相关的肌球蛋白MYH7B的基因也分别编码内含子miRNA、miR-208a，miR-208b和miR-499家族。这三种miR共享序列同源性并被称为“MyomiR”(van Rooji et al.,“A family of microRNAs encoded by myosin genesgoverns myosin expression and muscle performance,”Dev.Cell,2009,17,662-673)。MyomiR已经显示控制病理性心脏重塑，肌肉肌球蛋白含量，肌纤维身份和肌肉性能(Liuand Olson,“MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development,”Dev.Cell,2010,510-525)。

虽然已经广泛研究了α-MHC，β-MHC和myomiR(miR-208a，miR-208b和miR-499)在心脏和肌肉发育中的作用，但是第三肌球蛋白MYH7B的作用在很大程度上未知。MYH7B基因在骨骼肌，心脏中表达以及在脑中细胞的子集中表达，在那里它调节脑中的突触结构和功能(Yeung et al.,“Myh7b/miR-499gene expression is transcriptionally regulated byMRFs and Eos,”Nucleic Acids Res.,2012,40(15):7303-18)。最近的报道表明，在眼外肌中对应于慢紧张(slow-tonic)纤维的少量纤维群中，及肌梭的袋纤维(bag fibres)中检测到MYH7b蛋白(Rossi et al.,“Two novel/ancient myosins in mammalian skeletalmuscles:MYH14/7b and MYH15are expressed in extraocular muscles and musclespindles”,J Physiol.,Jan 15,2010；588(Pt 2):353-64)。然而，在人类心脏中，MYH7B基因被认为经历非生产性剪接，并且产生可能不编码功能性MYH7B蛋白的RNA(Bell et al.,“Uncoupling of expression of an intronic microRNA and its myosin host gene byexon skipping,”Mol.Cell.Biol.,30,1937-1945)。有趣的是，心脏细胞中MYH7B mRNA的非生产性剪接与内含子miR-499的表达改变无关。因此，直到本发明，MYH7B被认为是心脏细胞中miR-499的非功能性载体(Gerald Dorn,II,“MicroRNAs:redefining mechanisms incardiac disease,”J.Cardiovasc.Pharmacol.,2010,56(6),589–595)。此外，不像miR-499，MYH7B被认为在心脏和骨骼肌生物学中不起重要作用。

发明概述

本发明部分基于令人惊奇的发现，即MYH7B调节心脏细胞中β-MHC的表达，从而调节心脏收缩力和应激诱导的心脏重塑。特别地，对MYH7B的抑制导致心脏细胞中β-MHC mRNA和蛋白的下调。因此，在一个实施方案中，本发明提供MYH7B的抑制剂，其组合物，以及用于在有此需要的受试者中调节β-MHC的表达和/或活性的方法，包括向受试者施用MYH7B的抑制剂。在一个实施方案中，向受试者施用MYH7B抑制剂在施用后下调受试者的心脏细胞中MYH7B的表达或活性。在一个实施方案中，向受试者施用MYH7B抑制剂在施用后下调受试者心脏细胞中β-MHC(MYH7)的表达或活性。在另一个实施方案中，向受试者施用MYH7B抑制剂在施用后上调受试者心脏细胞中α-MHC(MYH6)的表达或活性。在另一个实施方案中，向受试者施用MYH7B抑制剂诱导肌球蛋白中的“转换”，由此在施用后受试者中β-MHC的表达或活性被下调，并且α-MHC的表达或活性被上调。在一个实施方案中，向受试者施用MYH7B抑制剂不改变受试者心脏细胞中miR-208a，miR-208b或miR-499的表达或活性。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防心脏疾病，如病理性心脏肥大、心肌梗死、心脏衰竭或肥厚型心肌病的组合物和方法，包括向受试者施用MYH7B抑制剂。在一个实施方案中，与健康受试者相比，具有心脏疾病的受试者在心脏细胞中具有增加的β-MHC水平。在另一个实施方案中，与健康受试者相比，具有心脏疾病的受试者在心脏细胞中具有改变的β-MHC/α-MHC比率。在一个实施方案中，向具有心脏疾病的受试者施用MYH7B抑制剂在施用后抑制受试者的心脏细胞中MYH7B的表达或活性和/或MYH7的表达或活性。在另一个实施方案中，向具有心脏疾病的受试者施用MYH7B抑制剂在施用后将受试者的心脏细胞中的β-MHC/α-MHC比率完全或部分地恢复到正常水平。在一个实施方案中，心脏疾病是心脏肥大、心肌梗死、心脏衰竭或肥厚型心肌病。

在一个实施方案中，MYH7B抑制剂是选自反义寡核苷酸，适体，核酶，小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)的核酸抑制剂。在另一个实施方案中，MYH7B抑制剂是特异性结合MYH7B蛋白的抗体或其结合片段。在一个具体的实施方案中，MYH7B抑制剂是包含与MYH7B编码序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。在本发明的组合物和方法中使用的反义寡核苷酸可以具有约6至约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个化学修饰，如糖，主链和/或碱基修饰。

在一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂具有8至18个核苷酸的长度，并且其中反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO：6的序列基本上互补。

在一些实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂具有8-18个核苷酸的长度，并且反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO：6的核苷酸4300-4335的序列基本上互补。

在一些其他实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO：6的核苷酸4300-4317的序列基本上互补。

在其它实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO：6的核苷酸4316-4333的序列基本上互补。

在一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂具有14个核苷酸的长度，并且反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO：6的核苷酸4302-4315的序列基本上互补。

在另一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂具有14个核苷酸的长度，并且反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO：6的核苷酸4318-4331的序列基本上互补。

在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸可以包括糖，碱基和/或主链修饰。

在一个实施方案中，经修饰的核苷酸是锁定的核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有1至6个锁定的核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂的5'端的至少前三个核苷酸是锁定的核苷酸。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂3'端的至少前三个核苷酸是锁定的核苷酸。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂的5'端的至少前三个核苷酸是锁定的或非锁定的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂的3'端的至少前三个核苷酸是锁定的或非锁定的核糖核苷酸。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个脱氧核糖核苷酸。在其他实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有2至8个脱氧核糖核苷酸。

在各种实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂可以包括选自下组的糖修饰：2'-O，4'-C亚甲基桥，2'-O，4'-C乙烯桥(4'-C ethylene bridge)，2'-CH₂-NH-CH₂-4'桥，2'-脱氧，2'-O-烷基和2'-卤素修饰。

在各种实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂可以包括主链修饰。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个硫代磷酸酯连接。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有两个或更多个硫代磷酸酯连接。在其它实施方案中，反义寡核苷酸是完全硫代磷酸酯连接的。

在一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂还包含通过接头连接的肽或糖部分。接头可以是3'硫醇修饰的C₃-二硫化物接头，(C6)₂二硫化物接头或1-3个磷酸二酯连接。

在某些实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂包含选自表1-5的序列。

在一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslTslGsdAsdTsdCsdTsdTsdGsdGsdCslCslTslC-3'(SEQ ID NO：146)或5'-1C1Ts1GsdCsdAsdGsdCsdTsdCsdCsdTslCs1Cs1A-3'(SEQ ID NO：148)的序列。

本发明还提供了包含MYH7B抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，MYH7B的抑制剂是反义寡核苷酸。在一个方面，药物组合物还包含第二治疗剂，其中第二治疗剂是miR-208a，miR-208b，miR-499，miR-15a，miR-15b，miR-16，miR-195的反义寡核苷酸抑制剂，或其混合物。

本发明还提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防病理性心脏肥大，心肌梗死或心脏衰竭的方法，包括向受试者施用MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂。在一个实施方案中，病理性心脏肥大是肥厚型心肌病。在一些实施方案中，根据本发明的方法可包括施用第二心脏治疗剂，如miR-208a，miR-208b，miR-499，miR-15a，miR-15b，miR-16，miR-195的反义寡核苷酸抑制剂，或其组合。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗具有病理性心脏肥大的风险的受试者的方法。在一个实施方案中，具有病理性心脏肥大风险的受试者在β肌球蛋白重链基因中具有突变。

在一个方面，施用MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂在施用后降低受试者的心脏细胞中MYH7B的表达或活性。在另一方面，施用MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂在施用后降低受试者的心脏细胞中β肌球蛋白重链的表达。在另一方面，施用MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂在施用后不显著改变受试者的心脏细胞中miR-499，miR-208a和/或miR-208b的表达。

在一些实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防病理性心脏肥大，心肌梗死或心脏衰竭的方法，包括向受试者施用MYH7B抑制剂。在各种实施方案中，MYH7B抑制剂是选自反义寡核苷酸，适体，核酶，小干扰RNA或小发夹RNA的核酸抑制剂。

在一个实施方案中，MYH7B的核酸抑制剂是小干扰RNA或小发夹RNA，其包含约10至约30个核苷酸的双链区，所述双链区包含(i)第一RNA链，其具有与人Myh7b基因的序列至少70％相同的序列，和(ii)与第一RNA链部分、基本上或完全互补的第二RNA链。在一个方面，siRNA或shRNA的第一RNA链具有与5'-GAGGCCAAGATCAA-3'(SEQ ID NO：4)的序列至少70％相同的序列。在另一方面，siRNA或shRNA的第一RNA链具有与5'-TGGAGGAGCTGCAG-3'(SEQID NO：5)的序列至少70％相同的序列。

附图简述

图1A显示用针对MYH7B的反义寡核苷酸转染后48小时，人iPS心肌细胞中MYH7BmRNA的水平。图1B显示用针对MYH7B的反义寡核苷酸转染后48小时，人iPS心肌细胞中MYH7(β-MHC)mRNA的水平。

图2A显示用针对MYH7B的反义寡核苷酸转染后48小时，人iPS心肌细胞中miR-208a的水平。图2B显示用针对MYH7B的反义寡核苷酸转染后48小时，人iPS心肌细胞中miR-499的水平。图2C显示在用针对MYH7B的反义寡核苷酸转染后48小时，人iPS心肌细胞中miR-208b的水平。

图3A显示用针对MYH7B的反义寡核苷酸转染后48小时，对照和HCM-R663H心肌细胞中MYH7(β-MHC)mRNA的水平。图3B显示用针对MYH7B的反义寡核苷酸转染后168小时(1周)，对照和HCM-R663H心肌细胞中MYH7(β-MHC)mRNA的水平。

图4显示了在处理后96小时来自对照和HCM iPS心肌细胞的MYH7(β-MHC)或GAPDH的Western印迹分析。

图5显示用针对MYH7B的测试ASO化合物转染后48小时的人iPS心肌细胞中MYH7BmRNA的水平。

图6A显示了在被动施用1，5或10μM靶向MYH7B的测试ASO化合物(SEQ ID NO：92，146，32，46和30)后168小时，人iPS心肌细胞中MYH7B mRNA的水平。图6B显示被动施用1，5或10μM测试ASO化合物后168小时，人iPS心肌细胞中MYH7(β-MHC)mRNA的水平。图6C显示了在被动施用1，5或10μM的测试ASO化合物后168小时，人iPS心肌细胞中MYH6(α-MHC)mRNA的水平。

图7显示被动施用5μM具有SEQ ID NO:148的序列的测试ASO后168小时的人iPS心肌细胞中MYH7B，MYH7(β-MHC)和MYH6(α-MHC)mRNA的水平。

图8显示每天注射25mg/kg测试ASO连续三天，并在最后一剂后48小时处死的大鼠的左心室中的MYH7B mRNA水平。

图9A显示用包含SEQ ID NO:146和148的序列的ASO化合物处理的兔的左心室中MYH7B mRNA的水平。图9B显示用包含SEQ ID NO:146和148的序列的ASO化合物处理的兔的右心室中MYH7B mRNA的水平。图9C显示用包含SEQ ID NO:146和148的序列的ASO化合物处理的兔的左心室中MYH7(β-MHC)mRNA的水平。图9D显示用包含SEQ ID NO:146和148的序列的ASO化合物处理的兔的右心室中MYH7(β-MHC)mRNA的水平。

图10A显示了被动施用基于包含SEQ ID NO：146的序列的化合物的ENA修饰的ASO后48小时，人iPS心肌细胞中MYH7B mRNA的水平。图10B显示了被动施用包含SEQ ID NO：146的序列的化合物的5-甲基胞苷和2'-O-甲基修饰的ASO后48小时，人iPS心肌细胞中MYH7BmRNA的水平。图10C显示了被动施用包含SEQ ID NO：146的序列的化合物的主链修饰的ASO后48小时，人iPS心肌细胞中MYH7B mRNA的水平。

图11A-11D显示了被动施用针对MYH7B的测试ASO化合物后48小时的人iPS心肌细胞中MYH7B mRNA的水平。

发明详述

本发明人已经发现，迄今被认为仅作为miR-499的非功能性载体起作用的MYH7B在调节心脏细胞中β-MHC的表达中起重要作用。特别地，本发明人已经发现MYH7B的抑制下调心脏细胞中β-MHC mRNA和蛋白的表达。因此，本发明提供MYH7B作为用于心脏疾病，特别是心肌疾病的治疗性干预的新靶标。

本发明提供了抑制MYH7B的表达或活性的试剂。在各种实施方案中，抑制MYH7B的试剂是靶向MYH7B基因，mRNA或前体mRNA(pre-mRNA)的核酸抑制剂或靶向MYH7B蛋白的抗体或其结合片段。在某些实施方案中，MYH7B的核酸抑制剂选自反义寡核苷酸，适体，核酶，小干扰RNA或小发夹RNA。

在一个实施方案中，MYH7B的抑制剂是反义寡核苷酸(“ASO”)。在本发明的上下文中，术语“反义寡核苷酸”或“ASO”被广泛使用，并且包括抑制从基因到蛋白质的信息转移的包含核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，修饰的核糖核苷酸，修饰的脱氧核糖核苷酸或其组合的寡聚体。如本文所用的术语“反义寡核苷酸”或“ASO”还包括包含促进转录阻滞；在各种阶段时破坏从mRNA前体的mRNA合成，包括加帽，剪接，从核转运至细胞质；降解mRNA，如由gapmerASO或其它RNA酶H诱导的ASO介导的；翻译阻滞，其中ASO结合靶mRNA并使其不可用于翻译；或通过与其杂交来对靶mRNA进行空间阻断的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，修饰的核糖核苷酸，修饰的脱氧核糖核苷酸或其组合的寡聚体。如本文所用的术语“反义寡核苷酸”还包括反义寡核苷酸缀合物，其包含通过接头与肽或糖缀合或连接的天然和/或经修饰的核苷酸的寡聚体。下文更详细地描述了可用于制备反义寡核苷酸缀合物的肽或糖部分和接头。

在各种实施方案中，可用于抑制MYH7B活性的反义寡核苷酸为约5至约25个核苷酸的长度，约6至约22个核苷酸的长度，约10至约30个核苷酸的长度，约12至约20个核苷酸的长度，或约20至约25个核苷酸的长度。在某些实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸为约8至约18个核苷酸的长度，在其它实施方案中为约12至约18个核苷酸的长度，在其它实施方案中为约12至约16个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸为约8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，针对MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂的为约50至约150个核苷酸的长度，约60至约140个核苷酸的长度，约70至约130个核苷酸的长度，约80至约120个核苷酸的长度，约90至约110个核苷酸的长度，或约100至约120个核苷酸的长度。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂为约100至约120个核苷酸的长度。在某些实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂为约80，90，100，110或120个核苷酸的长度。

靶向MYH7B的反义寡核苷酸包含与MYH7B序列(DNA，mRNA或前体mRNA)至少部分或基本互补的序列，以便在生理条件下与MYH7B杂交并抑制受试者的细胞中MYH7B的表达或活性。例如，在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含与MYH7B基因，mRNA或前mRNA序列至少部分互补的序列，例如与MYH7B基因，mRNA或前mRNA序列至少约75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以与MYH7B基因，mRNA或前mRNA序列基本互补，即与靶多核苷酸序列至少约90％，95％，96％，97％，98％或99％互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与MYH7B基因，mRNA或前体mRNA序列100％或完全互补的序列。在某些实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸包含与人MYH7B基因的序列至少部分，基本上或完全互补的序列。在一些实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸包含与人MYH7B基因的编码序列(Genebank Accession No.NM_020884.4；SEQ ID NO:6)至少部分，基本上或完全互补的序列。

人MYH7B编码序列(SEQ ID NO:6)

应当理解，反义寡核苷酸抑制剂的序列被认为与MYH7B基因，mRNA或前体mRNA序列互补，即使反义寡核苷酸序列包括经修饰的核苷酸而不是天然存在的核苷酸。例如，如果MYH7B基因，mRNA或前mRNA序列在特定位置包含鸟苷核苷酸，则反义寡核苷酸抑制剂可以在对应位置包含修饰的胞苷核苷酸，如锁定的胞苷核苷酸或2'-氟-胞苷。

在一个实施方案中，本发明提供了MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸具有8至18个核苷酸的长度，并且其中所述反义寡核苷酸的序列基本上与SEQ IDNO：6的序列互补。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有8至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4300-4335的序列基本上互补的序列。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4300-4317，4300-4316，4301-4316，4301-4315，4302-4316或4302-4315的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4302-4315的序列基本上互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有14个核苷酸的长度，并且反义寡核苷酸的序列与SEQID NO：6的核苷酸4302-4315的序列基本上互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslTs1GsdAsdTsdCsdTsdTsdGsdGsdCslCslTslC-3'(SEQ ID NO：146)的序列，其中l＝锁定核酸修饰，d＝脱氧核苷酸和s＝硫代磷酸酯连接。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4316-4333，4316-4332，4317-4332，4317-4331，4318-4333，4318-4332或4318-4331的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4318-4331的序列基本互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸具有14个核苷酸的长度，并且反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO：6的核苷酸4318-4331的序列基本互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1CslTs1GsdCsdAsdGsdCsdTsdCsdCsdTslCs1CslA-3'(SEQ ID NO：148)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有8至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1762-1783的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1762-1779，1763-1779，1764-1781，1765-1780，或1766-1779的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1764-1777或1766-1779的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-lAslClCsdTsdGsdCsdTsdCsdCsdAsdCslAslCslT-3'(SEQ ID NO：62)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1CslCslAsdCsdCsdTsdGsdCsdTsdCsdCslAslCslA-3'(SEQ ID NO：64)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有8至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸511-538的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸511-532，512-530，513-526，514-528，514-527，515-530，515-529或515-528的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸513-526，514-527或515-528的序列基本互补的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸521-538，522-538，522-537，523-538，523-537或523-536的序列基本互补的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸522-537或523-536基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslCsIAsmdCsdTsmdCsdAsmdCsdAsdTsmdCslCslAslT-3'(SEQ ID NO：184)的序列，其中md＝5-甲基胞嘧啶。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslTslCsdAsmdCsdTsmdCsdAsmdCsdAsdTslCslCslA-3'(SEQ ID NO：186)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1GslTslTsmdCsdAsmdCsdTsmdCsdAsmdCsdAslTslCslC-3'(SEQ ID NO：188)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含序列5'-1CslTslCsmdCsmdCsmdCsdAsdAsdGsdTsdTslCsIAslC-3'(SEQ ID NO：204)的序列。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有8至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1640-1701的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的的核苷酸1643-1660，1648-1665，1653-1670或1694-1711的序列基本互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1645-1658，1650-1663，1655-1668或1696-1709的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1AslCslTsmdCsdTsmdCsdAsdGsdTsdGsmdCslCslAslT-3'(SEQ ID NO：230)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslCslAsdGsmdCsdAsmdCsdTsmdCsdTsmdCslAslGslT-3'(SEQ ID NO：238)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1CslCslTsdTsdGsdTsmdCsdAsdGsmdCsdAslCslTslC-3'(SEQ ID NO：244)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslTslTsdGsdAsdGsdGsdAsdGsdGsdTslCslCslC-3'(SEQ ID NO：272)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4280-4300的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4280-4297，4282-4295，4283-4300或4283-4296的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1CslTs1GsdAsdTsmdCsmdCsdTsmdCsdAsdTslAslGslG-3'(SEQ ID NO：304)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1GslCslTsdGsdAsdTsmdCsmdCsdTsmdCsdAslTslAslG-3'(SEQ ID NO：306)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸688-705，689-706，690-707或690-703的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslGslGsdTsmdCsdTsdTsdTsdGsdGsdTslCs1TslC-3'(SEQ ID NO：344)的序列。在其他实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸890-907，892-909或892-905的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1GslAslCsdTsdGsdGsdGsdAsdGsmdCsmdCslAslTslT-3'(SEQ ID NO：350)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1217-1234，1218-1235，1219-1236或1219-1232的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1AslTslTsmdCsmdCsdTsmdCsdAsdGsdGsdGslTslCslT-3'(SEQ ID NO：362)的序列。在其他实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与来SEQ ID NO：6的核苷酸1224-1241，1225-1242，1226-1243或1226-1239的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1AslGslTsdTsdAsdTsmdCsdAsdTsdTsmdCslCslTslC-3'(SEQ ID NO：370)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1415-1441的序列基本上互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1415-1432，1416-1433，1417-1434或1417-1430的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1AslGslAsmdCsdAsdGsdAsdAsdGsmdCsdAslGslCslA-3'(SEQ ID NO：396)的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸1422-1439，1423-1440，1424-1441或1424-1437的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1GslGslTsdTsmdCsdAsdTsdAsdGsdAsmdCslAslGslA-3'(SEQ ID NO：410)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有8至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2348-2371的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2348-2365，2349-2364，2348-2361，2349-2366，2350-2365，2351-2366，2352-2367，2352-2365，2353-2370，2354-2369或2354-2368的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2349-2362或2350-2363的序列基本上互补的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2350-2363或2351-2364的序列基本上互补的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2352-2365的序列基本上互补的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12-14个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2353-2366或2354-2367的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1AslTslTsmdCsdTsdGsdTsdGsdAsmdCsdTslTslCslT-3'(SEQ ID NO：474)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslAs1TsdTsmdCsdTsdGsdTsdGsdAsmdCslTslTslC-3'(SEQ ID NO：476)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1CslTslAsdTsdTsmdCsdTsdGsdTsdGsdAslCslTslT-3'(SEQ ID NO：478)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1GslCslCsdTsdAsdTsdTsmdCsdTsdGsdTslGslAslC-3'(SEQ ID NO：482)的序列。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2442-2462的序列基本上互补的序列。在某些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至14个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸2444-2457或2445-2458的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1AslTslGsmdCsdTsdGsmdCsmdCsdTsdTsmdCslTslTslA-3'(SEQ ID NO：508)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1GslAs1TsdGsmdCsdTsdGsmdCsmdCsdTsdTslCs1TslT-3'(SEQ ID NO：510)的序列。

在一些其它实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4408-4432的序列基本上互补的序列。在各种实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至18个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4408-4425，4409-4426，4410-4425，4411-4428，4411-4427，4412-4429，4412-4428或4413-4430的序列基本互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至16个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4409-4424或4410-4425的序列基本互补的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至16个核苷酸的长度，并且包含与SEQ IDNO：6的核苷酸4411-4426或4412-4427的序列基本上互补的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂具有12至16个核苷酸的长度，并且包含与SEQ ID NO：6的核苷酸4413-4428的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1AslTslCsdAsdGsdAsmdCsdAsmdCsdTsmdCslCslTslT-3'(SEQ ID NO：570)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1TslGslAsdTsmdCsdAsdGsdAsmdCsdAsmdCslTslCslC-3'(SEQ ID NO：572)的序列。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含5'-1ClTsGsdAsdTsmdCsdAsdGsdAsmdCsdAslCslTslC-3'(SEQ ID NO：574)的序列。

在一些实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：6中核苷酸1182至1213的人MYH7B基因的序列至少部分互补或完全互补的序列。在其他实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：6中核苷酸1365至1393的人MYH7B基因的序列至少部分互补或完全互补的序列。

在一个实施方案中，靶向MYH7B的反义寡核苷酸具有5'-GTGAATGCGGATGAA-3'(SEQID NO：1)的序列。在另一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸具有5'-GAAGTGGTAGTCATA-3'(SEQ ID NO：2)的序列。在另一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸具有5'-1GslTs1GsdAsdAsdTsdGsdCsdGsdGsdAsdTsdGslAslA-3'(SEQ ID NO：3)的序列。

本文所用的术语“约”包括+/-10％，更优选+/-5％的变化，因为这些变化适于实施本发明。

在一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个主链修饰，例如至少一个硫代磷酸酯，吗啉代或膦酰基羧酸酯核苷酸间连接(参见例如美国专利号6,693,187和7,067,641，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂含有两个或更多个硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂是完全硫代磷酸酯连接的。或者，反义寡核苷酸可以包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链而不是糖-磷酸主链。

在一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个经修饰的核苷酸，如锁定核苷酸或含有其它糖，碱基和/或主链经修饰的核苷酸。术语“锁定核苷酸”，“锁定核酸单元”，“锁定核酸残基”，“LNA单元”，“桥接核酸”，“桥接核苷酸”，“BNA”在整个公开中可互换使用，并指代双环核苷/核苷酸类似物。具体地，“桥接核酸”或“桥接核苷酸”是指在糖残基的2'，4'-位置或3'，4'-位置含有桥的核苷酸。例如，合适的反义寡核苷酸抑制剂可以包含一个或多个“构象约束(conformationally constrained)”或2'，4'-桥接的核苷酸修饰，其赋予在含有桥接的核苷酸的寡核苷酸与其互补靶链之间形成的复合物增强的热稳定性。在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有通常称为“锁定核苷酸”或“LNA”的2'-O，4'-C-亚甲基桥核糖核苷(结构A)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个2'，4'-C-桥接的2'脱氧核糖核苷(CDNA，结构B)。参见例如美国专利号6,403,566和Wanget al.(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,Vol.9:1147-1150，两者的全部内容通过引用并入本文。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个修饰的核苷，其具有结构C中示出的结构。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个2'O，4'-C-乙烯基桥核糖核苷(结构D)。含有2'O，4'-C-乙烯基桥的核酸或寡核苷酸或核苷酸也称为乙烯基桥接核酸(ENA)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个2'-CH₂-NH-CH₂-4'-桥接的核苷酸，也称为“氨基-2'-C-桥双环核苷酸”或“氨基-CBNBN”。靶向MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂可以含有上述桥接核苷酸或其他经修饰的核苷酸以及未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。

在本发明的上下文中，当提及通过其相应的桥接或锁定核苷酸取代DNA或RNA核苷酸时，术语“相应的桥接核苷酸”或“相应的锁定核苷酸”意指DNA/RNA核苷酸已经被桥接或锁定核苷酸替代，所述桥接或锁定核苷酸包含与其已经替换的DNA/RNA核苷酸相同的天然存在的含氮碱基或经化学修饰的相同含氮碱基。例如，含有含氮碱基C的DNA核苷酸的相应的桥接或锁定核苷酸可以包含相同的含氮碱基C或经化学修饰的相同的含氮碱基C，如5-甲基胞嘧啶。

术语“非桥接核苷酸”或“非锁定核苷酸”是指不同于桥接或锁定核苷酸的核苷酸，即术语“非桥接核苷酸”或“非锁定核苷酸”包括DNA核苷酸，RNA核苷酸以及经修饰的核苷酸，其中碱基和/或糖经修饰，只是该修饰不是桥或锁定修饰。

在一个实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂含有至少一个锁定核苷酸。在一些实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂含有一至六个锁定核苷酸。在一个实施方案中，来自反义寡核苷酸抑制剂的3'末端的至少前三个核苷酸是锁定核苷酸。在另一个实施方案中，来自反义寡核苷酸抑制剂的5'端的至少前三个核苷酸是锁定核苷酸。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂含有一至六个天然或修饰的核糖核苷酸。在一个实施方案中，来自反义寡核苷酸抑制剂的3'端的至少前三个核苷酸是天然或经修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，来自反义寡核苷酸抑制剂的5'端的至少前三个核苷酸是天然或经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，来自反义寡核苷酸抑制剂的3'端的前三个核苷酸是锁定核糖核苷酸。在其他实施方案中，来自反义寡核苷酸抑制剂的5'端的前三个核苷酸是锁定核糖核苷酸。

本发明的寡核苷酸抑制剂可以包括具有碱基修饰或取代的经修饰的核苷酸。天然或未修饰的碱基是嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。修饰的碱基，也称为杂环碱基部分，包括其它合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(包括5-溴，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。在一个实施方案中，本发明的反义寡核苷酸抑制剂包含一至五个5-甲基胞苷或5-甲基脱氧胞苷核苷酸。在某些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂包含与碱基修饰(例如5-甲基胞苷)组合的一个或多个桥接核酸修饰(例如LNA，ENA等)。

本发明的寡核苷酸抑制剂可以包括具有修饰的糖部分的核苷酸。代表性的修饰的糖包括碳环或无环糖，在其2'，3'或4'位置中的一个或多个处具有取代基的糖和具有取代基代替糖的一个或多个氢原子的糖。在某些实施方案中，通过在2'位具有取代基来修饰糖。在另外的实施方案中，通过在3'位置具有取代基来修饰糖。在其他实施方案中，通过在4'位具有取代基来修饰糖。还预期糖可以在多于一个这些位置处具有修饰，或者寡核苷酸抑制剂可以具有在一个位置具有糖修饰的一个或多个核苷酸，以及具有在不同位置具有糖修饰的一个或多个核苷酸。

在本发明的寡核苷酸抑制剂中考虑的糖修饰包括但不限于选自以下的取代基：OH；F；O-，S-或N-烷基；O-，S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基，烯基和炔基可以被C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基取代或未取代。在一个实施方案中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH₂CH₂OCH₃，其也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)，即烷氧基烷氧基基团。另一种修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也称为2'-DMAOE和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂。

另外的糖取代基包括烯丙基(-CH₂-CH＝CH₂)，-O-烯丙基，甲氧基(-O-CH₃)，氨基丙氧基(-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和氟(F)。2'位(2'-)上的糖取代基可以在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。一种2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。也可以在糖部分的其它位置进行其它类似的修饰，特别是3'末端核苷上或2'-5'连接的寡核苷酸的糖的3’位置和5'末端核苷酸的5'位置。在某些实施方案中，糖修饰是2'-O-烷基(例如2'-O-甲基，2'-O-甲氧基乙基)，2'-卤代(例如2'-氟，2'-氯，2'-溴)和4'硫代修饰。

用于增强稳定性和改善功效的寡核苷酸抑制剂的其它修饰(如在美国专利号6,838,283中描述的那些，其通过引用以其整体并入本文)是本领域已知的，并且适合用于方法本发明。例如，为了促进体内递送和稳定性，寡核苷酸抑制剂可以在其3'端连接到类固醇，如胆固醇部分，维生素，脂肪酸，碳水化合物或糖苷，肽或其它小分子配体。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂附着到肽以增强靶细胞对抑制剂的摄取。例如，在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂的3'末端附着到具有序列“WLSEAGPVVTVRALRGTGSW”的肽。该肽描述于McGuire等人(“In vitro selection of a peptide with high selectivity forcardiomyocytes in vivo”,J.Mol.Bio,2004,vol.342,171-182)，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，肽通过接头如“硫醇C3”附着到反义寡聚物，由此在接头和寡聚物的SH基团和肽上的马来酰亚胺之间形成硫醚键。在一些实施方案中，反义寡核苷酸抑制剂的5'端可以直接或通过接头附着到糖部分。接头可以是C6-二硫化物接头或1-3磷酸二酯接头，如磷酸二酯dTdT接头。

在各种实施方案中，MYH7B的反义寡核苷酸具有选自表1-5的序列。

表1

l＝锁定核苷酸；d＝脱氧核苷酸；s＝硫代磷酸酯连接

表2

l＝锁定核酸；d＝脱氧核苷酸；mdC＝5-甲基胞嘧啶；m＝2’-O-甲基核苷酸；

s＝硫代磷酸连接

表3

表4

l＝锁定核酸；d＝脱氧核苷酸；mdC＝5-甲基胞嘧啶；f＝2’-氟代核苷酸；av＝氨基-CBBN核苷酸；s＝硫代磷酸酯连接；e＝乙烯基-桥接核苷酸

表5

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防其中受试者的心脏细胞中β-MHC的表达上调的心脏病症的方法，包括向受试者施用包含MYH7B抑制剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防其中受试者的心脏细胞中β-MHC/α-MHC的比例改变的心脏病症的方法，包括向受试者施用包含MYH7B抑制剂的组合物。例如，本发明提供了用于治疗或预防选自由病理性心脏肥大，心肌梗死，心力衰竭或肥厚型心肌病组成的组的心脏疾病的组合物和方法，其通过使用MYH7B抑制剂来抑制受试者的心脏细胞中β-MHC的表达或活性和/或改变β-MHC/α-MHC的比率。向受试者施用MYH7B抑制剂在施用后下调受试者的心脏细胞中MYH7B的表达或活性。在一个实施方案中，MYH7B抑制剂的施用不显著改变受试者心脏细胞中myomiR，特别是miR-499的表达或活性。因此，在一些实施方案中，在施用MYH7B抑制剂后，心脏细胞中miR-499，miR-208a和/或miR-208b的表达没有统计学差异。

在各种实施方案中，本发明提供的方法包括施用本文公开的一种或多种核酸抑制剂。例如，在一个实施方案中，本发明提供的方法包括施用选自表1-5的反义寡核苷酸抑制剂。在另一个实施方案中，根据本发明的方法包括施用包含SEQ ID NO:146的序列的反义寡核苷酸抑制剂。在另一个实施方案中，根据本发明的方法包括施用包含SEQ ID NO:148的序列的反义寡核苷酸抑制剂。

在具体的实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防肥厚型心肌病的方法，包括向受试者施用包含MYH7B抑制剂的组合物，其中在施用抑制剂后，受试者的心脏细胞中的MYH7B的表达或活性降低。在一个实施方案中，向受试者施用MYH7B抑制剂在施用后降低受试者心脏细胞中β-MHC的表达或活性。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防具有形成病理性心脏肥大或肥厚型心肌病风险的受试者的病理性心脏肥大或肥厚型心肌病的方法。具有形成病理性心脏肥大或肥厚型心肌病风险的患者可以表现出一种或多种风险因素，包括例如长期不受控制的高血压，未矫正的瓣膜病，慢性心绞痛，近期心肌梗死，先天性易患心脏疾病或病理性肥厚。在一些实施方案中，具有风险的受试者可以诊断为具有病理性心脏肥大或肥厚型心肌病的遗传倾向。例如，在某些实施方案中，具有风险的受试者可以在肌节基因中携带一个或多个突变，例如β-MHC(MYH7)基因中的突变。在一个实施方案中，有风险的受试者在β-MHC(MYH7)基因中具有选自Arg663His，Lys207Asn，Gly256Glu，Arg403Gln，Arg453Cys，Gly584Arg，Arg719Trp，Arg723Gly，Ile736Thr，Gly741Arg，Asp778Gly，Asp778Val，Asp906Gly，和Leu908Val的一个或多个突变。在某些实施方案中，具有风险的受试者在β-MHC(MYH7)基因中具有Arg403Gln，Arg453Cys或Arg719Trp突变。与肥厚型心肌病相关的肌节基因中的其它突变是本领域技术人员已知的(参见例如Moore et al.,CirculationResearch,Vol.111:375-385,2012，其通过引用整体并入本文)，并且可以用于鉴定具有形成病理性心脏肥大或肥厚型心肌病风险的受试者。在其他具体实施方案中，具有风险的受试者可能具有病理性心脏肥大或肥厚型心肌病的家族史。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于抑制受试者的心脏细胞中β-MHC的表达或活性的组合物和方法，包括向受试者施用MYH7B抑制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了用于调节受试者心脏细胞中β-MHC/α-MHC比率的组合物和方法，包括向受试者施用MYH7B抑制剂。与使用MYH7B抑制剂治疗前MYH7B和β-MHC的表达或活性相比，向受试者施用MYH7B抑制剂降低了受试者心肌细胞中MYH7B的表达或活性和/或β-MHC的表达或活性。在一个实施方案中，向受试者施用MYH7B抑制剂将受试者的心肌细胞中的β-MHC/α-MHC比率完全或部分恢复至健康受试者中发现的正常水平。

根据本发明的一个方面，向受试者施用MYH7B抑制剂导致心脏病症的一种或多种症状的改善。例如，在一个实施方案中，MYH7B抑制剂的施用导致受试者的病理性心脏肥大，心肌梗死或心脏衰竭的一种或多种症状的改善，或者从病理性心脏肥大向心脏衰竭的转变的延迟。在另一个实施方案中，施用MYH7B抑制剂导致受试者中病理性心脏肥大，心肌梗死或心脏衰竭发作的延迟。一种或多种改善的症状可以是例如增加的运动能力，增加的心脏射血量，降低的左心室舒张末期压力，减少的肺毛细血管楔压，增加的心输出，增加的心脏指数，降低的肺动脉压力，减少的左心室末期收缩和舒张内径，减少的心脏纤维化，心肌中减少的胶原沉积，降低的左心室壁和右心室壁应力，降低的壁张力，生活质量提高，和降低的疾病相关发病率或死亡率。

在一些实施方案中，MYH7B的抑制剂是适体。如本文所用的术语“适体”是指通过除经典Watson-Crick碱基配对之外的相互作用对特定靶分子具有特异性结合亲和力的核酸分子。适体可以通过结合靶分子来抑制靶分子的活性或功能。在一些实施方案中，本发明的适体结合MYH7B蛋白的一个或多个表位。在某些实施方案中，适体结合人MYH7B蛋白。抗MYH7B适体可以由核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，经修饰的核苷酸或其混合物组成。例如，适体可以含有一个或多个2'-O-烷基(例如2'-O-甲基)或2'-卤代(例如2'-氟)修饰。在一些实施方案中，适体可以与聚合物(例如PEG聚合物)缀合，以增强适体的循环半衰期。

可以使用指数富集配体系统演化(SELEX)来鉴定MYH7B的适体(Tuerk&Gold,Science 249:505-510,1990；Ellington&Szostak,Nature 346:818-822,1990)，例如如美国专利号5,270,163中描述的。核酸文库可以与靶MYH7B接触，并且特异性结合靶标的那些核酸与文库中不特异性结合靶标的核酸的其余部分分开。扩增分区(partitioned)的核酸以产生富含配体的合并物。结合、分区和扩增(即选择)的多个循环导致鉴定具有所需活性的一种或多种适体。也可以使用修改的方法，如美国专利公开号20090264508中所述的激光SELEX或deSELEX。

在某些实施方案中，可用于抑制MYH7B的表达或活性的适体的长度为约10至约30个核苷酸，约15至约35个核苷酸，约20至约35个核苷酸，约20至约40个核苷酸，或约25至约50个核苷酸。

在一些实施方案中，MYH7B的抑制剂是核酶。术语“核酶”是指具有催化活性的RNA分子。已知具有各种活性的核酶。或者，可以设计具有靶标特异性RNA切割活性的核酶。在某些实施方案中，可用作MYH7B抑制剂的核酶包括已知或人工创建的RNA酶P核酶，如组I和组II内含子型核酶，锤头(hammerhead)核酶和发夹核酶。在一些实施方案中，可用作MYH7B抑制剂的核酶具有约200至约500个核苷酸或约300至约450个核苷酸的长度。在其它实施方案中，MYH7B的核酶抑制剂可以具有约30至约100个核苷酸，约40至约80个核苷酸或约40至约60个核苷酸的长度。

在一个实施方案中，MYH7B的抑制剂是小干扰RNA。如本文所用，术语“小干扰RNA”或“短干扰RNA”或“siRNA”是指靶向MYH7B基因并能够抑制MYH7B基因表达的核苷酸的RNA双链体。在某些实施方案中，可用作MYH7B抑制剂的siRNA包含约10至约30个核苷酸的两条互补单链RNA，特别是15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或30个核苷酸，其形成15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或30个碱基对并具有一个或两个核苷酸的5'和/或3'突出。siRNA双链体包含具有与MYH7B基因序列基本上相同的序列的第一链和具有与第一链部分，基本上或完全互补的序列的第二链。在某些实施方案中，MYH7B siRNA的第一链包含与MYH7B基因的序列至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，98％，99％或100％相同的序列，并且第二链包含与第一链基本或完全互补的序列。在一些实施方案中，靶向MYH7B基因的siRNA的第一RNA链与人MYH7B基因的编码区(SEQ ID NO：6)至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％相同。在某些实施方案中，靶向MYH7B基因的siRNA的第一RNA链与5'-GAGGCCAAGATCAA-3(SEQ ID NO：4)的序列至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％相同。在其它实施方案中，靶向MYH7B基因的siRNA的第一RNA链与5'-TGGAGGAGCTGCAG-3'(SEQ ID NO：5)的序列至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％相同。可以将MYH7B的siRNA抑制剂施用至心脏细胞，或在心脏细胞中从一种或多种载体表达。

在另一个实施方案中，MYH7B的抑制剂是小发夹RNA(shRNA)。如本文所用，术语“shRNA”是指RNA双链体，其中双链体的一部分是发夹结构(shRNA)的一部分。除了双链体部分，发夹结构可以包含位于形成双链体的两条第一链和第二链之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环为5，6，7，8，9，10，11，12或13个核苷酸长。发夹结构还可以含有3'或5'突出部分。在一些方面，突出为0，1，2，3，4或5个核苷酸长的3'或5'突出。靶向MYH7B的shRNA的双链体部分或双链区域的长度为约10至约30个核苷酸，并且包含与MYH7B基因的序列至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，98％，99％或100％相同的第一RNA链和与第一链基本上或完全互补的第二RNA链。在某些实施方案中，靶向MYH7B基因的shRNA的双链区部分的第一RNA链与人MYH7B基因的编码区(SEQ ID NO：6)至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％相同。在一些实施方案中，靶向MYH7B基因的shRNA双链体部分的第一RNA链与5'-GAGGCCAAGATCAA-3'的序列(SEQ ID NO：4)至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％相同。在其它实施方案中，靶向MYH7B基因的shRNA的第一RNA链与5'-TGGAGGAGCTGCAG-3的序列(SEQ ID NO：5)至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％相同。MYH7B的shRNA抑制剂可以施用至心脏细胞或在心肌细胞中从载体表达。

与反义寡核苷酸类似，本文所述的其他抑制性核苷酸分子(适体，核酶，siRNA，shRNA)可以含有一个或多个上述化学经修饰的核苷酸。例如，靶向MYH7B的抑制性核苷酸分子可以含有双环糖核苷(BSN)修饰，锁定核酸(LNA)修饰，糖修饰，如2'-O-烷基(例如2'-O-甲基，2'-O-甲氧基乙基)，2-卤代(例如2'-氟，2'-氯，2'-溴)和4'硫修饰，主链修饰，如一个或多个硫代磷酸酯，吗啉代或膦酰基羧酸连接，碱基修饰，如5-甲基胞苷或2'-4'-桥接的双环核苷修饰。

在另一个实施方案中，MYH7B抑制剂是特异性结合MYH7B蛋白的一个或多个表位的抗体或其结合片段。例如，在某些实施方案中，MYH7B抑制剂是特异性结合MYH7B蛋白的一个或多个表位的单克隆或多克隆抗体。单克隆抗体可以是嵌合的或人源化的。在另一个实施方案中，MYH7B抑制剂是衍生自MYH7B特异性抗体的片段，其中所述片段特异性结合MYH7B蛋白的一个或多个表位。此类结合片段可以包括Fab片段，scFv片段或工程改造的抗体片段，例如双抗体(diabody)，三抗体(triabody)，微型抗体或单结构域抗体。抗MYH7B抗体包括所有免疫球蛋白类别，例如IgM，IgG，IgD，IgE和IgA或其亚类，包括IgG亚类(例如IgG₁，IgG₂，IgG_2a，IgG_2b，IgG₃或IgG_M)。优选地，抗MYH7B抗体或其结合片段具有对MYH7B的结合亲和力范围为约1×10^-7M至约1×10^-12M，约1×10^-8M至约1×10^-11M，或约1×10^-9M至约5×10^-10M。

本文所用的术语“受试者”或“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于人和其他灵长类动物(例如黑猩猩和其他猿猴和猴物种)，农场动物(例如牛，绵羊，猪，山羊和马)，家养哺乳动物(例如狗和猫)，实验室动物(例如啮齿动物如小鼠，大鼠和豚鼠)，飞禽(例如，家禽，野生禽和猎禽例如鸡，火鸡和其他鹑鸡类飞禽，鸭，鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，受试者是人且抑制性分子靶向人MYH7B基因，mRNA，前体mRNA或蛋白质。

本文所述的任何MYH7B的核酸抑制剂可以通过向细胞递送编码MYH7B抑制剂的表达载体而递送至靶细胞(例如心脏细胞和骨骼肌细胞)。“载体”是可用于将感兴趣的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸，与离子或两亲化合物相关的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体等。在一个具体实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或腺病毒载体。表达构建体可以在活细胞中复制，或者其可以合成制备。为了本申请的目的，术语“表达构建体”，“表达载体”和“载体”可互换使用，以一般的说明性意义来说明本发明的应用，并且不意在限制本发明。

在一个实施方案中，用于表达MYH7B抑制剂的表达载体包含可操作地连接于编码包含5'-TTGATCTTGGCCTC-3'序列的反义寡核苷酸的多核苷酸的启动子。在另一个实施方案中，用于表达MYH7B抑制剂的表达载体包含可操作地连接于编码包含5'-CTGCAGCTCCTCCA-3'序列的反义寡核苷酸的多核苷酸的启动子。本文所用的短语“可操作地连接”或“在转录控制下”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以控制通过RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

如本文所用，“启动子”是指由启动基因的特异性转录所需的细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。合适的启动子包括但不限于RNA pol I，pol II，pol III和病毒启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子，SV40早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复)。在一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。特别感兴趣的是肌肉特异性启动子，更特别是内皮和心脏特异性启动子。这些包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz etal.(1994)Cardioscience,Vol.5(4):235-43；Kelly et al.(1995)J.Cell Biol.,Vol.129(2):383-396)，α肌动蛋白启动子(Moss et al.(1996)Biol.Chem.,Vol.271(49):31688-31694)，肌钙蛋白1启动子(Bhavsar et al.(1996)Genomics,Vol.35(1):11-23)；Na+/Ca2+交换启动子(Barnes et al.(1997)J.Biol.Chem.,Vol.272(17):11510-11517)，肌营养不良蛋白启动子(Kimura et al.(1997)Dev.Growth Differ.,Vol.39(3):257-265)，α7整联蛋白启动子(Ziober and Kramer(1996)J.Bio.Chem.,Vol.271(37):22915-22)，脑利钠肽启动子(LaPointe et al.(1996)Hypertension,Vol.27(3Pt 2):715-22)和αB-晶状体蛋白/小热休克蛋白启动子(Gopal-Srivastava(1995)J.Mol.Cell.Biol.,Vol.15(12):7081-7090)，α肌球蛋白重链启动子(Yamauchi-Takihara et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86(10):3504-3508)和ANF启动子(LaPointe et al.(1988)J.Biol.Chem.,Vol.263(19):9075-9078)。

在某些实施方案中，可操作地连接于编码MYH7B抑制剂的多核苷酸的启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子是本领域已知的，且包括但不限于四环素启动子，金属硫蛋白IIA启动子，热休克启动子，类固醇/甲状腺激素/视黄酸应答元件，腺病毒晚期启动子和诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒LTR。

将表达构建体和核酸递送至细胞的方法是本领域已知的，并且可包括例如磷酸钙共沉淀，电穿孔，显微注射，DEAE-葡聚糖，脂质转染，采用多胺转染试剂的转染，细胞超声处理，使用高速微颗粒的基因轰击和受体介导的转染。

本发明还包括包含MYH7B抑制剂(例如反义寡核苷酸，适体，核酶，siRNA，shRNA或抗体)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。例如，本发明提供了包含MYH7B的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。

在一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的MYH7B抑制剂和药学上可接受的载体。例如，药物组合物包含有效剂量的靶向MYH7B的反义寡核苷酸或有效剂量的靶向MYH7B的修饰的反义寡核苷酸，如本文中描述。在一个实施方案中，药物组合物包含具有5'-1TslTs1GsdAsdTsdCsdTsdTsdGsdGsdCslCs1TslC-3'(SEQ ID NO：146)的序列的反义寡核苷酸。在其他实施方案中，药物组合物包含具有5'-1CslTslGsdCsdAsdGsdCsdTsdCsdCsdTslCslCslA-3'(SEQ ID NO：148)的序列的反义寡核苷酸。在一些其他实施方案中，药物组合物包含反义寡核苷酸，具有选自表1-5中所列序列的序列的修饰的反义寡核苷酸。

“有效剂量”是足以实现有益或期望的临床结果的量。本发明的MYH7B抑制剂的有效剂量可以是约1mg/kg至约100mg/kg，约2.5mg/kg至约50mg/kg或约5mg/kg至约25mg/kg。将被认为是有效剂量的精确测定可以基于每个患者个体的因素，包括其体格，年龄，病症类型(例如营养性心肌病，心肌梗死，心脏衰竭或心脏肥大)和抑制剂的性质(例如反义寡核苷酸，siRNA，shRNA，表达构建体，抗体等)。因此，本领域普通技术人员根据本公开和本领域的知识可以容易地确定剂量。

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防病理性心脏肥大，心肌梗死，心脏衰竭或肥厚型心肌病的方法，包括施用MYH7B抑制剂和第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是心脏治疗剂，如miR-208a，miR-208b，miR-499，miR-15a，miR-15b，miR-16，miR-195的反义寡核苷酸抑制剂或其组合。此类miRNA的示例性抑制剂描述于WO 2012/083005和WO2013/192486中，其通过引用以其整体并入本文。在包括第二治疗剂的实施方案中，第二试剂可以同时但以分开的制剂或序贯施用。在其他实施方案中，第二治疗剂可以在施用MYH7B抑制剂之前或之后的不同时间施用。在前施用包括例如在施用第二试剂之前约1周至直到30分钟的范围内施用第一试剂。在前施用还可以包括例如在施用第二试剂之前约2周至直到30分钟的范围内施用第一试剂。之后或随后施用包括例如在施用第一试剂后约1周至直到30分钟的范围内给予第二药剂。之后或随后施用还可包括例如在施用第一试剂后约2周至直到30分钟的范围内施用第二试剂。

本发明包括包含MYH7B抑制剂，第二治疗剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物可以包含两种或更多种MYH7B抑制剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是心脏治疗剂，例如miR-208a，miR-208b，miR-499，miR-15a，miR-15b，miR-16，miR-195的反义寡核苷酸抑制剂或其组合。在这些实施方案中，第二治疗剂可以包含在与MYH7B抑制剂相同的制剂中或在单独的制剂中。当考虑临床应用时，药物组合物将以适于预期应用的形式制备。通常，这将需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其它杂质的组合物。

胶体分散系统，如大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂，胶束，混合胶束和脂质体，可以用作MYH7B寡核苷酸抑制剂的递送载体，或表达MYH7B核苷酸抑制剂的构建体。适于将本发明的核酸递送至心脏和骨骼肌组织的市售脂肪乳剂包括 II,III,Nutrilipid和其它类似的脂质乳剂。用作体内递送载体的优选胶体系统是脂质体(即人工膜囊泡)。此类系统的制备和使用是本领域公知的。示例性制剂也公开于US 5,981,505；US 6,217,900；US 6,383,512；US 5,783,565；US 7,202,227；US 6,379,965；US 6,127,170；US 5,837,533；US 6,747,014；和WO03/093449，其全部内容通过引用并入本文。

在某些实施方案中，用于递送的脂质体是两性脂质体，如(Marina Biotech,Inc.)，其在美国授权前公开号20110076322中有详细描述。上的表面电荷是完全可逆的，其使得它们特别适合于递送核酸。可通过注射递送，保持稳定，自由聚集和穿过细胞膜递送核酸。

在一些实施方案中，适当的盐和缓冲液用于使递送载体稳定并允许靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含有效量的递送载体，其包含溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中的抑制剂多核苷酸(例如脂质体或其它复合物或表达载体)。短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利，过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括对于用于配制药物(如适于施用于人类的药物)可接受的溶剂，缓冲液，溶液，分散介质，涂层，抗菌剂和抗真菌剂，等张剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以掺入组合物中，只要它们不使组合物的载体或多核苷酸失活。

本发明的活性组合物可以包括经典的药物制剂。根据本发明的这些组合物的施用可以通过任何常见途径，只要靶组织通过该途径可用。这包括口服，鼻(吸入)或颊内。或者，可以通过皮内，皮下，肌内，腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射入心脏组织施用。包含MYH7B抑制剂或包含MYH7B抑制剂的表达构建体的药物组合物也可通过导管系统或分离冠状循环以将治疗剂递送至心脏的系统来施用。用于将治疗剂递送到心脏和冠状动脉血管系统的各种导管系统是本领域已知的。适用于本发明的基于导管的递送方法或冠状动脉分离方法的一些非限制性实例公开于美国专利号6,416,510；美国专利6,716,196；美国专利号6,953,466，WO 2005/082440，WO 2006/089340，美国专利公开号2007/0203445，美国专利公开号2006/0148742和美国专利公开号2007/0060907，其全部通过引用以其整体并入本文。此类组合物通常作为如本文所述的药学上可接受的组合物施用。

在本发明的另一个实施方案中，如本文所述的包含MYH7B抑制剂的组合物可以配制为用于医疗装置(例如支架，气囊或导管)的涂层。在治疗受试者的心脏疾病的方法中特别有用，MYH7B抑制剂可用于涂覆金属支架以产生药物洗脱支架(drug-eluting stent)。药物洗脱支架是保持开放的狭窄或患病动脉并释放化合物以防止细胞增殖和/或炎症的支架。MYH7B的抑制剂可以应用于嵌入在薄聚合物中的金属支架，用于随时间释放抑制剂。用于基于装置的递送方法和涂覆装置的方法是本领域公知的，药物洗脱支架和其它可植入装置也是如此。参见例如，美国专利号7,294,329，7,273,493，7,247,313，7,236,821，7,232,573，7,156,869，7,144,422，7,105,018，7,087,263，7,083,642，7,055,237，7,041,127，6,716,242和6,589,286以及WO 2004/004602，其通过引用整体并入本文。因此，本发明包括用MYH7B抑制剂涂覆的医疗装置，例如球囊，导管或支架。在一些实施方案中，MYH7B抑制剂可以与其它治疗剂(例如抗再狭窄化合物)组合使用以产生用于掺入药物洗脱支架的制剂。

活性化合物也可以肠胃外或腹膜内施用。作为说明，作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散剂也可以在甘油，液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备。在正常储存和使用条件下，这些制剂通常含有防腐剂以防止微生物的生长。

适合于注射使用或导管递送的药物形式包括例如无菌水溶液或分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。通常，这些制剂是无菌的和流体性的，在存在易注射性的程度上。制剂在制造和储存条件下应当是稳定的，并且应当针对微生物例如细菌和真菌的污染作用提供防护。合适的溶剂或分散介质可以含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和植物油。可以例如通过使用涂层(例如卵磷脂)，在分散剂的情况下通过维持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，山梨酸，硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌可注射溶液可以通过根据需要与任何其它成分(例如如上文所列)一起将活性化合物以合适的量掺入溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和所需其它成分(例如上面列举的)的无菌载体中制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前之前无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。

本发明的组合物通常可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括例如衍生自无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等)的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与蛋白质的游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(例如钠，钾，铵，钙或氢氧化铁)或有机碱(例如异丙胺，三甲胺，组氨酸，普鲁卡因等)。

在配制时，优选以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量施用溶液。制剂可以以多种剂型容易地施用，例如可注射溶液，药物释放胶囊，滴眼剂，玻璃体内注射剂，药物洗脱支架或其它涂覆的血管装置等。对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，溶液通常适当地缓冲，并且液体稀释剂首先例如用足够的盐水或葡萄糖变得等张。此类水溶液可以用于例如静脉内，肌内，皮下，玻璃体内和腹膜内施用。优选地，采用无菌水性介质，如本领域技术人员已知，特别是根据本公开内容。作为说明，单一剂量可以溶解在1ml等张NaCl溶液中，并且加入到1000ml皮下输注液中或在提出的输注部位注射(参见例如"Remington'sPharmaceutical Sciences"15th Edition,第1035-1038和1570-1580页)。取决于被治疗的受试者的状况，剂量中的一些变化将必然发生。负责施用的人将在任何情况下确定对于个体受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应当满足管理机构要求的无菌性，致热原性，一般安全性和纯度标准。

在本发明的某些实施方案中，本发明的药物组合物与用于施用的装置包装在一起或储存在用于施用的装置中。用于可注射制剂的装置包括但不限于注射口，自动注射器，注射泵和注射笔。用于雾化或粉末制剂的装置包括但不限于吸入器，吹入器，抽吸器等。因此，本发明包括包含本发明的药物组合物的施用装置，用于治疗或预防本文所述的一种或多种病症。

本发明通过以下实施例进一步说明，其不应被解释为限制。根据本公开内容，本领域技术人员应当理解在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。

贯穿本公开引用的所有专利和非专利文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

实施例

实施例1：对MYH7B的抑制下调MYH7

将人iPS心肌细胞用对照寡核苷酸或靶向MYH7B的反义寡核苷酸(抗7b#1(5'-GTGAATGCGGATGAA-3'；SEQ ID NO：1)和抗7b#2(5'-GAAGTGGTAGTCATA-3'；SEQ ID NO：2)转染。在48小时使用实时PCR测量MYH7B和MYH7(β-MHC)mRNA的水平。将用甲状腺激素T3处理的人iPS心肌细胞用作阳性。已知T3下调β-MHC的表达，从转染的细胞中分离的RNA的实时PCR分析显示对MYH7B的抑制导致MYH7B以及MYH7(β-MHC)的下调(图1)。正如预期的，T3下调MYH7(β-MHC)(图1B)，但不影响MYH7B或miR-208a，miR-208b和miR-499的水平(图1A和2)。

MYH7B敲低导致肌球蛋白转换的观察结果可能部分是通过肌球蛋白内含子miRNA(MYH7B，miR-499；MYH7，miR-208b；MYH6，miR-208a)的调节。因此，我们测试人iPS心肌细胞中MYH7B的抑制是否影响myomiR，miR-208a，miR-208b或miR-499的表达。

具体来说，为了确定MYH7B的下调是否对myomiR(miR-208a，miR-499和miR-208b)的表达有任何影响，在转染后48小时测量miR-208a，miR-499和miR-208b水平。没有观察到对miR-208a，miR-499或miR-208b表达的显著的影响(图2)。随着时间，由于MYH7的下调而可以存在miR-208b的下调；然而，图2中的数据显示针对MYH7B的反义寡核苷酸不直接或立即影响myomiR的表达。因此，通过抑制MYH7B来调节肌球蛋白转换代表在心脏细胞中的新的，不依赖于miRNA的机制。

已经显示miR-208a作用于miR-499的上游，并且是啮齿类中出生后miR-499，MYH7B和β-MHC表达所需的(van Rooji et al.,“Control of stress-dependent cardiacgrowth and gene expression by a microRNA,”Science,2007,316(5824),575-579；Montgomery et al.,“Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiacfunction and survival during heart failure,”Circulation,2011,124(14),1537-1547)。在啮齿类的心脏中，miR-499和MYH7B的丧失是β-MHC下调所必需的(an Rooji etal.,“A family of microRNAs encoded by myosin genes governs myosin expressionand muscle performance,”Dev.Cell,2009,17,662-673)。虽然这些研究表明在α-MHC优势物种如啮齿类中myomiR在调节β-MHC表达中发挥重要作用，在β-MHC优势物种如猪，兔和人类中的研究表明在调节β-MHC优势物种中β-MHC的表达中可能涉及替代机制。

实施例2：在来源于患有肥厚型心肌病的患者的iPS心肌细胞中对MYH7B的抑制下调MYH7

用对照寡核苷酸或MYH7B反义寡核苷酸(抗7b#1和抗7b#2；SEQ ID NO：1和2)转染对照iPS心肌细胞和来源于具有突变R663H的肥厚型心肌病(HCM)的患者的iPS心肌细胞。使用实时PCR在转染后48小时和1周(168小时)测量MYH7(β-MHC)mRNA的水平。实时PCR分析显示对MYH7B的抑制导致HCM心肌细胞中MYH7(β-MHC)表达的下调(图3A)。此外，MYH7(β-MHC)表达的下调持续至治疗后1周(图3B)。

实施例3：MYH7B的抑制下调β-MHC蛋白

为了确定对MYH7B的抑制是否导致MYH7在蛋白水平的下调，用对照寡核苷酸，MYH7B ASO#1(SEQ ID NO：1)，MYH7B ASO和TINY转染对照和HCM R663H人iPS心肌细胞。TINY是与miR-208a，miR-208b和miR-499的种子区域(seed region)互补的8聚体寡聚物。通过Western印迹分析评估MYH7(β-MHC)蛋白的水平。结果显示，使用MYH7B反义寡核苷酸处理对照或HCM iPS心肌细胞在处理后96小时显著下调MYH7(β-MHC)蛋白(图4)。对照寡聚物显示无作用。T3用作阳性对照。

实施例4：筛选针对MYH7B的反义寡核苷酸(ASO)

用对照寡核苷酸(Mock)或1.5nM靶向MYH7B的测试ASO转染人iPS心肌细胞。在48小时使用实时PCR测量MYH7B mRNA的水平(图5)。许多ASO显示对MYH7B水平的大于50％的抑制。具体地，测试了以下ASO化合物：

表6

实施例5：被动施用ASO后对MYH7B的抑制

进一步测试在实施例4中显示超过50％的MYH7B水平抑制的ASO当被动摄取时的抑制潜力。具体地，以1，5或10μM ASO的浓度将选择的ASO与人iPS心肌细胞温育168小时。在168小时使用实时PCR测量MYH7B，MYH7(β-MHC)和MYH6(α-MHC)mRNA的水平。实时PCR分析显示许多ASO下调MYH7B mRNA水平(图6A)。此外，具有SEQ ID NO:146的序列的反义寡核苷酸显示出肌球蛋白水平中的“转换”，其中在抑制MYH7B后β-MHC下调并且α-MHC上调(图6B和6C)。一些其它ASO在β和α-MHC的水平中也显示出相似的趋势(图6B和6C)。

还测试了具有SEQ ID NO:146的序列的另一种ASO化合物当被动吸收时的抑制活性。将人iPS心肌细胞与5μM浓度的具有SEQ ID NO:146的化合物温育168小时，并使用实时PCR测量MYH7B，MYH7(β-MHC)和MYH6(α-MHC)mRNA的水平。如图7所示，具有SEQ ID NO:146的化合物在肌球蛋白水平中也显示出“转换”，其中在抑制MYH7B后，β-MHC下调而α-MHC上调。

实施例6：测试ASO的体内活性

进一步测试显示体外抑制MYH7B的ASO的体内的抑制潜力。具体地，将选择的ASO以25mg/kg每天的剂量皮下注射到大鼠中，持续连续三天，并且在最后一次剂量后48小时处死大鼠。使用实时PCR测量大鼠左心室中的MYH7B mRNA水平(图8)。如图8所示，经由被动施用显示强的活性的反义寡核苷酸化合物(例如SEQ ID NO:146)也显示体内MYH7B的下调，而经由被动施用显示无活性的化合物(例如SEQ ID NO:32)体内也显示无活性。

选择在大鼠中显示出强活性的具有SEQ ID NO:146和148的序列的化合物用于兔研究以评价β-MHC优势物种。兔在第1，3，5，10和17天皮下注射10，15，20或25mg/kg的具有SEQ ID NOs:146和148的化合物，并在第18天处死。MYH7B的实时PCR数据显示在两个心室中MYH7B的剂量依赖性降低(图9A-9B)。此外，具有最强的MYH7B抑制的兔(5003)也显示最强的β-MHC(MYH7)减少。参见图9C和9D。

实施例7：核苷酸修饰对MYH7B ASO活性的影响

在多个位置修饰具有SEQ ID NO:146的ASO化合物以评估修饰对其活性的影响。修饰包括用相应的ENA核苷酸替换LNA核苷酸和其它碱基和糖修饰。图10A显示ENA对LNA的取代保留了靶向MYH7B的被动活性。同样地，用5'-甲基胞苷取代胞苷和用2'O-甲基经修饰的核苷酸取代LNA碱保持活性(图10B)。图10C显示主链修饰极大地影响化合物的被动活性。

实施例8：筛选另外的ASO

筛选了另外的反义寡核苷酸化合物当被动施用时它们的抑制潜力。将人iPS心肌细胞用5μM测试化合物被动处理48小时。在48小时使用实时PCR测量MYH7B mRNA的水平。许多ASO显示出对MYH7B水平的强抑制，而其他化合物显示对MYH7B水平没有影响。图11A-11D显示来自4个独立研究的结果。具体地，测试了以下ASO化合物。

表7

Claims

1.MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸具有8至18个核苷酸的长度，且其中所述反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO:6的序列基本上互补。

2.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO:6的核苷酸4300-4355的序列基本上互补。

3.权利要求2的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸具有12-18个核苷酸的长度，且所述反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO:6的核苷酸4300-4317的序列基本上互补。

4.权利要求2的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸抑制剂具有12-18个核苷酸的长度，且所述反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO:6的核苷酸4316-4333的序列基本上互补。

5.权利要求3的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸抑制剂具有14个核苷酸的长度，且所述反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO:6的核苷酸4302-4315的序列基本上互补。

6.权利要求4的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸具有14个核苷酸的长度，且所述反义寡核苷酸的序列与SEQ ID NO:6的核苷酸4318-4331的序列基本上互补。

7.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的核苷酸。

8.权利要求7的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述经修饰的核苷酸包括糖修饰、碱基修饰和/或主链修饰。

9.权利要求7的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述经修饰的核苷酸是锁定核苷酸。

10.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸含有一至六个锁定核苷酸。

11.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸含有5’端的至少三个锁定核苷酸。

12.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸含有3’端的至少三个锁定核苷酸。

13.权利要求11的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述5’端的至少三个锁定核苷酸是核糖核苷酸。

14.权利要求12的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述3’端的至少三个锁定核苷酸是核糖核苷酸。

15.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸含有至少一个脱氧核糖核苷酸。

16.权利要求15的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸含有二至八个脱氧核糖核苷酸。

17.权利要求8的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述糖修饰选自下组：2’-O、4’-C亚甲基桥、2’-O、4’-C乙烯基桥、2’-CH₂-NH-CH₂-4’桥、2'-脱氧、2'-O-烷基、和2'-卤素修饰。

18.权利要求8的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。

19.权利要求18的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸含有两个或更多个硫代磷酸酯连接。

20.权利要求19的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸是完全硫代磷酸酯连接的。

21.权利要求7的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述经修饰的核苷酸是5’-甲基胞苷。

22.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸包含选自表1-5的序列。

23.权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂，其中所述反义寡核苷酸包含5’-lTslTslGsdAsdTsdCsdTsdTsdGsdGsdCslCslTslC-3’(SEQ ID NO:146)或5’-lCslTslGsdCsdAsdGsdCsdTsdCsdCsdTslCslCslA-3’(SEQ ID NO:148)的序列。

24.药物组合物，其包含权利要求1-23中任一项的MYH7B的反义寡核苷酸抑制剂和药学上可接受的赋形剂。

25.权利要求24的药物组合物，其进一步包含第二治疗剂，其中所述第二治疗剂是miR-208a、miR-208b、miR-499、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195的反义寡核苷酸抑制剂或其混合物。

26.用于治疗或预防有此需要的受试者中病理性心脏肥大、心肌梗死、或心脏衰竭的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1的反义寡核苷酸抑制剂。

27.权利要求26的方法，其中所述病理性心脏肥大是肥厚型心肌病。

28.权利要求26的方法，其中所述受试者具有病理性心脏肥大的风险。

29.权利要求28的方法，其中所述具有风险的受试者具有β肌球蛋白重链基因中的突变。

30.权利要求26的方法，其中在施用所述抑制剂后所述受试者的心肌细胞中的MYH7B的表达或活性降低。

31.权利要求26的方法，其中在施用所述抑制剂后所述受试者的心脏细胞中的β肌球蛋白重链的表达降低。

32.权利要求26的方法，其中在施用所述抑制剂后所述受试者的心脏细胞中的miR-499的表达不是统计学不同的。

33.权利要求26的方法，其中所述反义寡核苷酸包含5’-lTslTslGsdAsdTsdCsdTsdTsdGsdGsdCslCslTslC-3’(SEQ ID NO:146)或5’-lCslTslGsdCsdAsdGsdCsdTsdCsdCsdTslCslCslA-3’(SEQ ID NO:148)的序列。

34.权利要求26的方法，其中所述方法进一步包括施用第二心脏治疗剂。

35.权利要求34的方法，其中所述第二心脏治疗剂是miR-208a、miR-208b、miR-499、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195的反义寡核苷酸抑制剂或其组合。

36.权利要求26的方法，其中所述受试者是人类。

37.用于治疗或预防有此需要的受试者中病理性心脏肥大、心肌梗死、或心脏衰竭的方法，其包括向所述受试者施用MYH7B的抑制剂。

38.权利要求37的方法，其中所述MYH7B的抑制剂是选自反义寡核苷酸、适体、核酶、小干扰RNA、或小发夹RNA的核酸抑制剂。

39.权利要求38的方法，其中所述核酸抑制剂是小干扰RNA或小发夹RNA，其包含约10至约30个核苷酸的双链区，所述双链区包含(i)具有与人Myh7b基因的序列至少70％相同的序列的第一RNA链和(ii)与所述第一RNA链部分、基本上或完全互补的第二RNA链。

40.权利要求39的方法，其中所述第一RNA链具有与5’-GAGGCCAAGATCAA-3’(SEQ IDNO:4)的序列至少70％相同的序列。

41.权利要求39的方法，其中所述第一RNA链具有与5’-TGGAGGAGCTGCAG-3’(SEQ IDNO:5)的序列至少70％相同的序列。